CN112300938A - 生物培养芯片及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生物培养芯片，其包括：基质，所述基质由基质材料形成，所述基质材料具有约1.25‑1.75的平衡溶胀率；和微孔，所述微孔形成在所述基质的表面，并且所述微孔在所述基质的表面开口，其中，所述微孔限定出生物培养空间用于培养生物细胞材料。利用该生物培养芯片能有效实现单细胞培养。

Description

生物培养芯片及其制备和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及生物培养芯片及其制备和应用，更具体的，本发明涉及适于单细胞培养的生物培养芯片、用于制备该生物培养芯片的模板、制备该生物培养芯片的方法和利用该生物培养芯片进行细胞培养的方法。

背景技术

在当前的生物和医学研究中，首选的是进行细胞学试验对药物等进行检测，且多数情况下还是采用传统的细胞二维贴壁培养的方式进行，这与机体内真实的组织细胞的存在状态(三维状态且具有ECM环境)有本质的区别。生物体内的细胞是在三维的立体微环境中生长的，而二维细胞培养并不是细胞生长的天然状态，培养微环境与体内微环境差异太大，影响细胞的基因表达、信号转导等，导致所培养的细胞逐渐丧失其在生物体内的生物学特性及功能，失去研究及应用价值。而且二维细胞培养还有很多明显的缺陷，如细胞的分化不均一，不利于细胞分化研究所及其相关的研究；另外，二维培养时细胞数量较多，而其中有用细胞数目很难分选，且浪费试剂。

CN108102913A公开了基于软光刻技术的三维细胞培养芯片、其制备方法及应用。其中，基于软光刻技术的三维细胞培养芯片的制备方法，其特征在于包括：采用软光刻技术制作具有设定图案结构的掩模；以液态高分子化合物或高分子化合物溶液均匀覆盖所述掩模，并形成具有设定厚度的液层；使所述液层固化，之后移除掩模，获得印章，所述印章的印面具有设定立体结构；以所述印章的印面与修饰剂接触，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上；以所述印面与选定基底表面接触，之后将所述印章从选定基底上移离，从而使至少部分修饰剂脱离所述印面而附着在所述选定基底表面并形成图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案组成的阵列，所述图案至少能够吸附单细胞，从而获得所述三维细胞培养芯片。

然而，目前的用于生物细胞材料培养的芯片仍有待进一步改进，不仅要适于单细胞的2D阵列和3D培养，还要适应复杂的细胞生物学功能检测，比如抗体分泌、生长因子分泌生物学功能检测等。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种能够具有较好生物相容性、细胞培养介质相容性和机械张力至少之一优点的生物细胞培养芯片。

本发明是基于本发明人的下列发现而完成的：

发明人在对三维细胞培养芯片进行深入研究的过程中，现有的三维培养芯片在进行细胞培养或者生物材料的培养过程中，通常细胞难以展现在体内环境中的生物生理行为。为此，发明人进行了深入研究，意外地发现，现有的三维培养芯片的基质材料对细胞培养的效果尤其是单细胞分泌因子(包括抗体)的生物学功能实现有明显的负面影响。更进一步的，发现，现有的三维培养芯片中细胞与基质的接触的不同位置会存在与周围培养环境明显差异的情形，细胞的不同位置所获得的微环境又加大的差异和不均一性，例如在细胞与基质接触的位置，细胞无法接触充足的细胞外基质的支持。另外，现有的三维培养芯片大多采用硬质基质，因此，在细胞的培养过程中，硬质基质会对培养过程中的细胞形成一定的应力，从而影响细胞的生物行为。这些因素严重影响了单细胞因子或抗体分泌的能力和功能性检测。

为此，发明人对多种基质材料进行了优化和筛选，提出了本发明的用于生物材料培养的生物培养芯片。

在本发明的一个方面，本发明提出一种生物细胞培养芯片，根据本发明的实施例，该生物培养芯片包括：基质，所述基质由基质材料形成，所述基质材料具有约1.25-1.75的平衡溶胀率；和微孔，所述微孔形成在所述基质的表面，并且所述微孔在所述基质的表面开口，其中，所述微孔限定出生物培养空间用于培养生物细胞材料。

由于该基质材料具有一定的平衡溶胀率，因此，在采用该生物培养芯片进行培养生物材料例如单细胞的全部表面均能够处于较均一的液态或凝胶状培养基包围的状态下，从而在培养细胞的过程中，能够进一步改善细胞的生物活性，以利于细胞生物学功能(比如抗体和因子分泌)的实现和便于精准检测。

根据本发明的实施例，上述生物培养芯片还可以具有下列附加技术特征的至少之一：

根据本发明的实施例，所述基质材料具有40～45摄氏度的固液相变转化温度。

根据本发明的实施例，所述基质材料在37摄氏度下能够呈液态。

根据本发明的实施例，在细胞生长过程中，所述基质与所述细胞接触区域会发生凹陷。

根据本发明的实施例，所述凹陷的深度不低于所述细胞直径的5％。

根据本发明的实施例，所述基质材料包括选自胶原水凝胶、甲基化纤维素、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等的至少之一，或其中至少两项的不同比例的混合。

根据本发明的实施例，所述基质进一步与所述生物材料对应的细胞因子。

根据本发明的实施例，所述基质进一步包括选自FBS、蛋白A/G、胶原、gelatin和BSA的至少之一，或其中至少两项的不同比例的混合。

根据本发明的实施例，所述微孔的开口直径小于所述微孔的底部直径。

根据本发明的实施例，所述微孔的开口直径是所述微孔的所底部直径的至多80％，优选50％。

根据本发明的实施例，所述微孔的开口直径为8-25微米，深度为15-35微米。

根据本发明的实施例，所述生物细胞材料为B细胞，所述开口直径为8-12微米；或者

所述生物材料为杂交瘤细胞，中国仓鼠卵巢细胞CHO或者肿瘤细胞，所述开口直径为15-25微米。

根据本发明的实施例，包括：多个微孔，所述微孔构成预定图案，相邻两个微孔的距离为10-100微米。

根据本发明的实施例，进一步包括：定位标记，所述定位标记形成在所述基质上。

根据本发明的实施例，所述生物细胞材料为杂交瘤细胞，所述微孔的内壁表面设置有杂交瘤细胞培养因子；所述生物材料为MCF10A细胞，所述微孔的内壁表面设置有胰岛素；或所述生物材料为B细胞，所述微孔的内部表面设置有CD40L、IL2和IL10的至少之一，或其中至少两项的不同比例的混合。。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于制备前面所述的生物细胞培养芯片的模板。根据本发明的实施例，该模板包括：基板；和微柱，所述微柱设置在所述基板的表面，所述微柱的尺寸与所述微孔的尺寸匹配。

利用该模板，能够有效地制备前面所述的生物细胞培养芯片。

根据本发明的实施例，所述微柱具有疏水表面。

根据本发明的实施例，所述微柱表面适于通过疏水作用力结合生物因子。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备前面所述的生物细胞培养芯片的方法，根据本发明的实施例，包括：(1)将液态的所述生物材料施加于前面所述的模板上，并使所述基质材料固化；和(2)使固化的所述生物材料与所述模板分离，以便获得所述生物细胞培养芯片。采用该方法，能够有效地制备前面所述的生物细胞培养芯片。

根据本发明的实施例，所述模板表面预先吸附有生物因子或者试剂。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种利用前面任一项所述的生物培养细胞芯片培养细胞的方法，其包括：将细胞置于所述微孔中；和将所述生物芯片置于预定的环境条件中。利用该方法，能够使得细胞在培养过程中，具有四周均一的细胞基质微环境，能够有效地提高单细胞3D培养效率，促进单细胞生物学功能的实现，如分泌因子或抗体等，并便于精准检测。

根据本发明的实施例，每个所述微孔中设置至多1个细胞。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的生物细胞培养芯片的结构示意图；

图2显示了根据本发明另一个实施例的生物细胞培养芯片的结构示意图；

图3显示了根据本发明另一个实施例的生物细胞培养芯片的结构示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例用于制备生物细胞培养芯片的模板的结构示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的筛选单克隆抗体的方法；

图6显示了根据本发明一个实施例的筛选配对抗体的方法；

图7显示了根据本发明一个实施例培养神经元细胞在悬浮培养和芯片培养条件下的干性比较。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

生物细胞培养芯片

下面参考附图描述根据本发明实施例的生物细胞培养芯片。

如图1～3所示，根据本发明实施例，本发明提出了一种生物细胞培养芯片，根据本发明的实施例，该生物细胞培养芯片包括：基质100和微孔200，其中，基质100由基质材料形成，该基质材料具有约1.25-1.75的平衡溶胀率，该微孔200形成在基质100的表面，并且微孔200在基质100的表面开口，其中，微孔200限定出生物培养空间用于培养细胞生物材料。

现有技术中，芯片基质与细胞培养介质之间的界面相容性较差。硬基质界面和细胞培养介质无法相容，会导致阵列的细胞三维培养微环境不均一，界面之间的液体层易导致两个界面的滑动，导致细胞阵列破坏，影响细胞生物学功能的实现，影响细胞检测信号的完全捕获和检测的灵敏性，如分泌蛋白的检测。

根据本发明的实施例，由于该基质材料具有一定的平衡溶胀率，因此，在采用该生物培养芯片进行培养时，生物材料例如单细胞的全部表面均能够处于被液态或凝胶状细胞外基质材料包围的状态下，为生物细胞材料的培养能够提供均一的微环境，从而在培养细胞的过程中，能够进一步改善细胞的生物活性，促使细胞实现生物学功能。

根据本发明的实施例，进一步的，本发明所采用的基质在生物细胞材料的培养过程中，能够依据细胞的生长，产生相应的形变。换言之，与传统使用的玻璃、硅片、塑料等硬基质相比，本发明所采用的基质材料属于软基质，从而能够减少基质与细胞，与细胞培养的细胞外基质生物材料之间的作用力，进一步提高细胞与基质，与细胞外基质之间的界面相容性。另外，根据本发明的实施例，在培养过程中，在细胞生长过程中，所述基质与所述细胞接触区域会发生凹陷。本领域技术人员能够理解的是，该凹陷是由于细胞的增长，抵触基质的表面从而使基质发生形变而形成的。本领域技术人员可以通过对基质的内表面进行显微观察，而确定是否形成凹陷。根据本发明的实施例，所述凹陷的深度能够最高达到不低于所述细胞直径的5％，例如10％，20％。在本文中所使用的术语“凹陷的深度”可以通过将未形成凹陷的基底界面图与形成凹陷的基底界面图进行比较来确定。这里的深度的数值定义为在所形成的凹陷中能够容纳的最大体积球体的直径。

由此，根据本发明的实施例，具有较好生物相容性、细胞培养介质相容性和机械张力的微孔软基质，可以更高效地捕获并培养细胞(包括单细胞和可控数量聚集的多细胞)，根据本发明的实施例，软基质易于与不同细胞外基质环境亲和与融合，为细胞提供一个均一又融合的三维培养空间，从而为二维阵列的细胞创造有利于存活、增殖、迁移、蛋白表达与分泌、干细胞分化等，以及有利于阵列细胞生物学功能检测的微环境。另外，考虑到基质为软基质，所以在从培养空间中分离单细胞时，也会容易实现，而不需要克服常规的基质材料与细胞之间的吸附力。

根据本发明的实施例，所述基质材料具有40～45摄氏度的固液相变转化温度。根据本发明的实施例，所述基质材料在37摄氏度下能够呈液态。需要说明的是，上述温度均是在1个大气压下进行测定的。由此，可以容易在适当高于室温的条件下使基质材料呈现液态，进一步通过降温固化为预定的形状。由于基质材料具有上述性质，因此，在该基质材料呈液态的状态时，可以容易添加细胞因子，而不会使得细胞因子失活。在加入培养基进行细胞培养的过程中，细胞培养芯片能够吸收这些液体培养基，从而进一步将这些细胞因子释放至培养空间中。由此，根据本发明的实施例，所述基质进一步与所述生物材料对应的细胞因子。根据本发明的实施例，所述基质进一步包括选自FBS、蛋白A/G、胶原、gelatin和BSA的至少之一，或其中至少两项的不同比例的混合。

需要说明的是，根据本发明的实施例，可以使用的基质材料的具体类型并不受特别限制，只要能够满足上述性能要求即可。考虑到更好的生物兼容性和性能的调节能力，所述基质材料包括选自胶原水凝胶、甲基化纤维素、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等的至少之一，或其中至少两项的不同比例的混合。本领域技术人员能够理解的是，可以通过调整这些材料的浓度来获得期望的软基质性能，例如固液相转换温度等。

另外，根据本发明的实施例，微孔的结构和尺寸并不受特别限制，只要能够为单细胞提供培养或者生长扩增空间即可。根据本发明的实施例，微孔可以呈现长方体、立方体、圆柱体等结构。另外，参考图2，根据本发明的实施例，微孔200的开口直径小于微孔200的底部直径。由此，可以方便捕获单细胞进行培养，而不会在培养的过程中，发生细胞逃逸的行为。具体的，根据本发明的实施例，所述微孔的开口直径是所述微孔的所底部直径的至多80％，优选50％。在本文中所使用的术语“直径”被定义为开口或者底部能够容纳的最大面积圆的直径。在本文中所使用的术语微孔的“深度”是指，微孔开口截面与底部截面之间的最短距离。根据本发明的实施例，微孔100的开口直径为8-25微米，深度为15-35微米。另外，发明人发现可以针对不同的细胞，设置不同的开口直径，例如根据本发明的实施例，所述生物材料为B细胞，所述开口直径为8-12微米；或者所述生物材料为杂交瘤细胞或者肿瘤细胞，所述开口直径为15-25微米。

另外，根据本发明的实施例，生物培养芯片可以包括多个微孔，所述微孔构成预定图案，相邻两个微孔的距离为10-100微米。由此，可以批量处理多个单细胞的培养。根据本发明的实施例，当微孔之间的距离在10～100微米时，微孔培养的细胞在微孔之间不会产生相互干扰，由此，可以提高批量处理均一性，可以提高细胞生物学功能检测的准确性和效率，便于细胞信号数据的高通量采集和分析。根据本发明的实施例，参考图3，生物培养芯片上的微孔可以构成阵列，例如，在一个芯片上有数万个微孔甚至几十万个以及更多个微孔的阵列。

根据本发明的实施例，生物细胞培养芯片上还可以进一步设置定位标记，所述定位标记形成在所述基质上。从而，可以通过这些定位标记对多个微孔进行定位。定位标记的形式并不受特别限制，根据本发明的实施例，可以通过设置荧光材料的定位标记，以便在显微镜下能够进行自动精准定位，也可以设置坐标线对每一个微孔进行定位，当观察到阳性细胞后，可以快速对每个阳性微孔进行定位和记录。从而进一步便于后续分离微孔中的阳性细胞或者其他成分。

另外，根据本发明的实施例，在微孔的内壁表面可以进一步设置有助于培养生物材料的试剂或者生物因子，根据本发明的实施例，所述生物材料为杂交瘤细胞，所述微孔的内壁表面设置有杂交瘤细胞培养因子；所述生物材料为MCF10A细胞，所述微孔的内壁表面设置有胰岛素；或所述生物材料为B细胞，所述微孔的内部表面设置有CD40L、IL2和IL10的至少之一，或其中至少两项的不同比例的混合。

根据本发明的实施例，本发明提出了基于固化水凝胶等软基质的生物细胞培养芯片(也可以称为细胞阵列芯片)，可以很好的解决细胞体外二维阵列和三维培养所出现的一系列问题，包括：细胞捕获、通量可控细胞阵列的形成、芯片材料的细胞相容性、芯片材料与细胞培养介质的相容性、阵列细胞的生物学功能实现和精准检测等。发明人可以通过在凝胶类软基质芯片上实现了不同直径和深度的微孔阵列，满足不同的需求。微孔的机械强度可以由凝胶软基质的浓度来决定，根据不同的细胞类型和不同的生物学功能检测目的来调整最佳的微孔机械强度；另外，微孔的直径和深度可控，以针对不同细胞的单细胞阵列或者可控细胞数量的多细胞在微孔中的聚集；微孔间距可控，间距的大小决定了芯片上细胞阵列的密度和单位面积芯片上的细胞阵列通量；凝胶类软基质可模拟细胞外基质特征，其细胞相容性较好，能为细胞提供水分、营养和柔软的空间，避免硬基质细胞芯片无法根据不同细胞而调整的僵硬机械强度，避免硬基质芯片上通常需要的化学修饰的化学分子残留；凝胶类软基质对细胞培养液或三维培养水凝胶类生物材料有极好的相容性，保证了阵列细胞周围均一的微环境，保证了细胞功能检测的完整性和精准性。

生物培养芯片的制备

在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于制备前面所述的生物细胞培养芯片的模板。参考图4，根据本发明的实施例，该模板包括：基板300；和微柱400，所述微柱400设置在所述基板300的表面，所述微柱300的尺寸与所述微孔200的尺寸匹配。根据本发明的实施例，通过在在模板上固化基质材料，可以有效地制备前面所述的生物培养芯片。

根据本发明的实施例，所述微柱具有疏水表面。由此，可以有效地剥离模板和所形成的生物细胞培养芯片。另外，根据本发明的实施例，所述微柱表面适于通过疏水作用力结合生物因子。由此，后续通过施加基质材料，可以将生物因子转移至基质材料上，作为微孔内表面所结合的生物因子。如前所述，根据不同的培养对象和目的，可以设置不同的生物因子。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备前面所述的生物细胞培养芯片的方法，根据本发明的实施例，包括：(1)将液态的所述生物材料施加于前面所述的模板上，并使所述基质材料固化；和(2)使固化的所述生物材料与所述模板分离，以便获得所述生物细胞培养芯片。采用该方法，能够有效地制备前面所述的生物细胞培养芯片。根据本发明的实施例，所述模板表面预先吸附有生物因子或者试剂。

具体的，根据本发明的实施例，制备前述生物细胞培养芯片的方法包括：

第一步：对模板进行修饰。使生物培养微环境中需要的细胞因子等物质通过疏水作用力结合到模板上。具体的，将需要修饰的材料按照1ug/ml的浓度配制为溶液(溶剂为PBS)；将模板浸泡在上述修饰溶液中，室温反应4个小时；取出后，先后用新鲜的PBS和去离子水润洗3遍，氮气吹干，干燥处保存，待用。

第二步，将融化的基质材料例如凝胶类基质覆盖于具有柱状阵列的模板上，待基质材料例如凝胶类基质冷却固化，将模板去除，形成有一定厚度、硬度的软基质微孔阵列芯片。具体的，可以将浓度为0.6％-1.2％的琼脂糖凝胶液体倾倒在模板上，室温放置5分钟；待凝固后去除模板，即可形成细胞芯片。且芯片中的每一个微孔中均含有微环境所需因子或者处理药物。

生物培细胞养芯片应用之培养方法

在本发明的第四方面，本发明提出了一种利用前面任一项所述的生物细胞培养芯片培养细胞的方法，其包括：将细胞置于所述微孔中；和将所述生物芯片置于预定的环境条件中。利用该方法，能够使得细胞在培养过程中，具有四周均一的细胞外基质类微环境，从而能够有效地维持细胞的活力，提高细胞培养效能，根据本发明的实施例，每个所述微孔中设置至多1个细胞。

根据本发明的实施例，芯片软基质与细胞培养介质具有较好的相容性，利于为高通量阵列细胞三维培养提供均一和适宜的微环境，有助于阵列细胞生物学功能实现，有助于细胞生化反应信号的完全捕获(比如分泌蛋白信号)和精准分析。

另外，根据本发明的实施例，软基质的芯片，可以更好的形成细胞-芯片的类细胞外基质界面效应，使细胞的三维培养更加贴近细胞在体内的生存环境，有助于细胞的存活和生物学功能实现。

根据本发明的实施例，软基质芯片的细胞阵列形成不依赖芯片的化学修饰，靠细胞重力和添加到微孔中的细胞外基质等生物材料来吸引和稳定细胞。

根据本发明的实施例，软基质芯片有助于阳性细胞(单细胞或多细胞球)的玻璃吸针显微挑取，而硬基质芯片很难用玻璃吸针显微挑取，其坚硬的基质界面容易导致玻璃针破损或细胞破裂损伤。

生物细胞培养芯片应用之基于芯片的单细胞高通量筛选流程

在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选靶细胞的方法，所述靶细胞适于分泌目标分子。根据本发明的实施例，该方法包括：在适于分泌目标分子的条件下，在培养腔室中，对所述候选单细胞进行培养，其中，所述培养腔室中设置有信号筛选层，所述信号筛选层覆盖所述单细胞，所述信号筛选层含有特异性识别所述目标分子的信号分子；和基于所述信号筛选层中所述信号分子的信号，选择适于分泌所述目标分子的靶细胞。

本领域技术人员能够理解的是，上述培养腔室可以为前面所描述的生物培养芯片中的培养空间。从而前面所述的生物细胞培养芯片的优势和特征同样适用于该筛选方法，在此不再赘述。需要强调的是，根据本发明的实施例，信号筛选层可以作为液体或凝胶类培养基覆盖单细胞，也可以是作为固体或者半固体的基质。根据本发明的实施例，考虑到需要分离单细胞，可以选择机械强度低于基质的凝胶类材料，例如控制凝胶材料的浓度更低的材料作为信号筛选层。

所述信号筛选层含有标记的抗体、蛋白、多肽和探针的至少之一。

根据本发明的实施例，所述信号筛选层是由第一水凝胶形成的，所述培养腔室设置在生物培养芯片上，所述生物培养芯片包括：基质，所述基质由第二水凝胶形成；和微孔，所述微孔形成在所述基质的表面，并且所述微孔在所述基质的表面开口，并且所述微孔限定出所述培养腔室，其中，所述第一水凝胶的浓度小于所述第二水凝胶的浓度。由此，可以进一步提高筛选的效率。

需要说明的是，前面针对软基质芯片所描述的特征和优点同样适用于该方法，在此不再赘述。

由此，在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒，其包括：水凝胶；信号分子；和生物细胞培养芯片。利用该试剂盒，能够有效地实施上述方法，关于该方法的特征和优点同样适用该试剂盒，在此不再赘述。

进一步，本发明还提供了一种筛选抗体的方法，其包括：利用前面所述的方法，筛选目标细胞；使所述目标细胞进行扩增和表达抗体。

参考图5，本发明还提供了筛选单细胞来源单克隆抗体的方法，其包括：

将多个杂交瘤细胞分配在所述生物培养芯片上形成阵列，其中，每个所述腔室中每个所述培养腔室中含有至多一个所述杂交瘤细胞；根据前面所述的方法，将含有杂交瘤单细胞阵列的细胞芯片置于含有标记目的抗原(蛋白或多肽)的培养介质中，待发生抗原抗体反应，选择被标记的分泌目标抗体的阳性杂交瘤细胞；分离所述阳性杂交瘤细胞；对所述阳性杂交瘤细胞进行培养和抗体表达，以便获得单细胞来源的单克隆抗体。由此，利用该方法能够有效地分离能够表达单克隆抗体的杂交瘤细胞。

由此，本发明还提供了一种单细胞来源单克隆抗体，其是通过前面的方法获得的。

由此，本发明还提供了一种抗体-抗原复合物，其特征在于，所述抗体为前面所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体上连接有信号分子。利用该抗体-抗原复合物可以有效地用于筛选配对抗体，即与已知抗体识别相同抗原但识别位点不同的抗体。

进一步，参考图6，本发明还提供了一种高通量筛选针对同一个抗原但不同抗原决定簇的配对抗体(简称配对抗体)的方法，其特征在于，包括：

(1)在适于候选细胞表达抗体的条件下，将所述候选细胞置于培养腔室中培养预定时间；

(2)在所述培养腔室中，添加信号抗体-抗原复合物，所述信号抗体连接有信号分子，所述信号抗体为前面所述的单细胞来源单克隆抗体或其衍生物，包括其与抗原特定决定簇相结合的抗体片段，包括Fab(fragment of antigen bingding)，(Fab)2和Fv等；和在所述培养腔室中，添加不带标记的抗原，如果细胞分泌抗体，其分泌的抗体会与抗原形成抗体-抗原复合物，并被捕获在细胞的周围，之后，在细胞芯片的培养培养液中添加信号抗体，所述信号抗体连接有信号分子，所述信号抗体为前面所述的单细胞来源单克隆抗体或其衍生物，包括其与抗原特定决定簇相结合的抗体片段，包括Fab(fragment of antigenbingding)，(Fab)2和Fv等。

(3)基于所述信号分子的信号，确定所述候选细胞是否为目标细胞，所述目标细胞分泌与所述单细胞来源单克隆抗体具有不同抗原决定簇的抗体。如后面实施例中所证明的，采用本发明的方法，能够有效地提高筛选配对抗体以及表达该配对抗体的杂交瘤细胞的效率。

实施例1芯片制备

1.1软基质芯片的制备

选择如图4所示的具有柱状阵列的模板，按照适用于的细胞类型不同，分为下列两类：

A、适用于常规细胞(直径通常为15～20微米)，微柱的高度为35微米，截面直径为20微米，微柱间的间距为30微米。

B、适用于小型细胞(直径通常为8～10微米)，微柱的高度为20微米，截面直径为10微米，微柱间的间距为30微米。

以PBS为溶剂，配制修饰溶液，其含有：甲基化纤维素或者低熔点琼脂糖。

在室温下，将模板浸泡在修饰溶液中4小时，将模板取出，先后用新鲜的PBS和去离子水润洗3遍，氮气吹干，干燥处保存，待用。从而实现对芯片模板的修饰，使微环境中需要的细胞因子等物质通过疏水作用力结合到模板上。

将熔化的水凝胶基质覆盖在经过修饰处理的模板上(具有柱状阵列)，等待凝胶类基质冷却固化后，将模板去除，形成有厚度约为300-500um的软基质微孔阵列芯片。具体的，发明人将浓度为0.6％-1.2％的琼脂糖凝胶液体(溶胀率约1.25-1.75)倾倒在模板上，室温放置5分钟；待凝固后去除模板，即可形成细胞芯片。且芯片中的每一个微孔中均含有微环境所需因子或者处理药物。

下表中对软基质芯片的成分进行总结如下：

1.2硬基质芯片的制备

采用硬基质材料玻璃和硅片，分别制备硬基质芯片1和硬基质芯片2，参考CN108102913A基于软光刻技术的三维细胞培养芯片，其制备方法及应用中所描述的方法进行制备，在此不再赘述。

实施例2软基质芯片和硬基质芯片在细胞培养方面的比较

2.1阵列形成效率比较

按照下列步骤采用软基基质芯片1、2和3培养小鼠杂交瘤细胞、人肿瘤细胞(MCF7)、人脐带间充质干细胞和小鼠B细胞，同时采用硬基质芯片1(玻璃基底)对上述细胞进行平行试验。培养条件为常规细胞培养方法(具体方法参考细胞与分子生物学实验指南)，培养15分钟后，确定阵列效率。阵列效率的检测方法如下：

观察并统计在单位面积内(1mm×1mm)的单细胞数量，并除以总的小室数量，从而得到单细胞阵列的获得效率。

为了实现每个小室中仅能容留一个细胞，我们通过控制了芯片规格而限定了小室的空间。另外，极少量由于不可控因素造成的双细胞，我们可以通过显微镜很容易的判断并排除在统计范围内。

上述检测结果汇总如下：

*在芯片(20μm/30μm，10μm/30μm)进行单细胞培养。第一个数字代表小室的直径，第二个数字代表相邻小室之间的距离。以上表格中，其中除了小鼠B细胞使用10μm/30μm规格的芯片外，剩余种类细胞均使用20μm/30μm规格的芯片。

上述数据可以看出，硬基质芯片不利于细胞阵列的形成，阵列效率约为32-50％。而软基质芯片的阵列效率非常高，约为91-98％，对于形成细胞阵列非常有效。

发明人认为上述差异的主要原因是硬基质芯片，例如如玻璃或硅片，由于其材料不具有空隙和透水性，因此其小腔室内的气体无法且很难完全去除干净，而导致后续接种的细胞无法通过重力沉降而占据适当位置。然而，对于软基质芯片，如水凝胶等生物材料，其具有一定的孔径和透水性，因此在接种细胞时，培养液可以从芯片四周渗入，致使小室内的气体完全排除，从而有利于细胞沉降形成阵列。由此，对于相同数量腔室的硬基质芯片和软基质芯片，有效用于形成细胞阵列的腔室比例差距很大，由此，在进行细胞筛选试验时，硬基质芯片的效率也会远低于软基质芯片。

2.2芯片上细胞生存活力比较

根据2.1的方法，采用硬基质芯片和软基质芯片分别进行细胞培养，同时按照下列方法进行细胞生存活力进行检测，

我们利用死活分析方法(Thermo，L34951)对芯片上的细胞活性情况进行鉴定。其中红色视为死细胞，而绿色视为活细胞。

结果汇总如下：

芯片类型	平均细胞存活率
		硬基质芯片	56.4％
软基质芯片	98.7％

上述数据可以看出，硬基质芯片不利用细胞的培养和存活，容易导致细胞的凋亡和坏死的发生，并且对于细胞的增殖是不利的。主要原因是硬基质的材料不具有物理弹性，在细胞培养过程中无法很好地为细胞全方位提供较均一的3D培养所需的细胞外基质微环境(类似于体内的存活空间特点)，从而改变了细胞的存活、增殖、衰老和凋亡通路导致衰老、凋亡或坏死。然而，软基质材料的可塑性较好，且有充足的水分和支架空间，可以随着细胞生存过程的空间需求的变化来进行调整，还可以与细胞3D培养的ECM培养基相亲和并融合，为细胞提供了均一适宜的微环境，有助于细胞存活和生物学功能的实现(如因子、抗体分泌等)。另外，在软基质芯片制作过程中，发明人可以适当添加适应不同细胞培养所需的各种因子或材料，从而构建适于细胞培养生存的微环境，极大的提高了细胞的存活增殖能力。但是硬基质材料很难做到这一点，一般为添加到培养基或化学修饰在材料表面，这样很难做到严格分散在细胞四周或者残留的化学物质对细胞会有毒害。

2.2芯片上挑取单细胞能力的比较

单细胞芯片的目的通常是为了获得并分析具有特殊意义的单细胞信息。因此，需要将目的单细胞分离出来进行后续的操作。为此，发明人尝试了在软基质芯片和硬基质芯片分别上进行单细胞挑取操作，采用毛细管挑针进行单细胞挑取。

对比结果展示如下：

发明人认为，在硬基质芯片挑取单细胞成功率低的原因主要是由于细胞是完全的悬浮培养，没有任何束缚，因此当挑针吸取细胞时，旁边的非目的细胞也很容易被吸取过来；另外，在挑针接近细胞时，目的细胞很容易被轻微的力量(挑针在液体中移动产生的力量)影响而脱离芯片或者推走，导致挑取失败。然而，软基质芯片的材料为水凝胶，就很容易和细胞之间产生适当的粘附作用，致使细胞不是完全处在一个悬浮培养的环境中，从而解决了硬基质的问题，提高了挑取的成功率。

另外，挑针作为耗材，如果发现存在污染，变形或其它问题，可以在细胞挑取过程中随时更换，从而提高效率。但是，如果因为操作不当导致的挑针断裂等问题，将会极大的影响的挑取效率。因为挑针的更换和位置的精准调校都需要时间进行操作。硬基质不具有弹性，在显微操作过程中，需要挑针和芯片保持很紧的距离甚至接触到芯片表面，这样才能保证让微弱的吸取力尽量释放到目的细胞上，成功挑取。但是，手动或者半自动的操作很难每次都精确的完成，从而挑针接触芯片导致变形或断裂的事情常常发生。而软基质由于具有很好的物力弹性，因此对于挑针的过度接触持有很高的耐受度，可以使操作人员及时发现并作出调整。

实施例3：筛选单克隆抗体

在本实施例中，采用实施例1的方法，制备软基质芯片筛选抗新冠病毒S1蛋白的单细胞来源单克隆抗体

3.1小鼠免疫

小鼠购买自上海斯莱克实验动物有限责任公司，为5周龄BALB/C雌性小鼠。获得小鼠后，在动物房饲养一周适应环境。取6周龄小鼠准备进行免疫。新冠病毒S1蛋白购自近岸蛋白质科技有限公司，溶解于PBS中，免疫前浓度调整在1mg/ml。抗原注射前利用注射器混合乳化法进行乳化。具体免疫方案及条件，如下：

免疫次数	时间	抗原用量	佐剂选择及用量	免疫方式
					一免	第0天	100ug	完全佐剂，100ul	腹腔
二免	第14天	50ug	不完全佐剂，100ul	腹腔
					三免	第28天	50ug	不完全佐剂，100ul	腹腔
加强	第35天	100ug	无佐剂	腹腔

小鼠二免和三免后，分别进行眼眶采血测定血清中抗体效价。根据效价情况，针对性的对三免或加强免疫的抗原用量进行调整。从而使小鼠对抗原的免疫应答达到最佳状态。

3.2细胞融合

根据加强免疫后3天的血清效价结果，选择效价最高的小鼠进行后续融合。融合前，采集小鼠全部血液并获取血清，待用。

提前准备好SP2/0细胞(3-5天，注意提前复苏)。提前将50ml空白1640培养基和500ml无菌水放置在培养箱中预热，过夜，为第二天的融合做好准备。融合过程中使用的PEG，要在取脾脏之前放置在培养箱中预热。

将免疫小鼠进行脱颈处死，泡在75％乙醇中3-5分钟进行灭菌处理。取脾过程在生物安全柜中操作。将灭菌后小鼠取出，沥干乙醇，放置在擦手纸上。腹部面朝上暴露。用剪刀在左上腹部剪开一小口(1cm)，用镊子取出脾脏(肝左叶后下方)。摘取过程中，小心不要刺破脾脏，且去掉多余的结缔组织。

将取出的脾脏放置在40um的筛网中，筛网放置在加满1640空白培养基的50ml离心管中。注意液体不要加的太满，防止在脾脏研磨过程中培养基溢出。研磨过程中，要使脾脏充分接触培养基。为了便于研磨分离出脾细胞，在研磨前用注射器针头扎些小眼，或者用剪刀划开几个小口。研磨，使脾脏内容物完全通过筛网，弃置剩余的结缔组织等。室温，1300rmp，离心8分钟，收集脾细胞。重复一次。去除上清后，添加10ml PBS重悬脾细胞。添加30ml红细胞裂解液，4摄氏度裂解15分钟，期间混匀2次。室温，1300rmp，离心8分钟，收集脾细胞。PBS重悬离心，反复2次，将裂解液去除干净。

对脾细胞和瘤细胞分别进行计数。将最终的脾细胞：瘤细胞比例调整为5:1左右。将两种细胞按照比例混合在50ml离心管中，室温，1300rmp，离心8分钟，收集细胞。完全去除上清(残留会影响融合效率)。用手怕打离心管底部，或者在安全柜通风网板上反复移动，目的是将沉淀的细胞打散，最终状态应该是匀浆状或细胞浆状。在37摄氏度水浴的条件下，使用37摄氏度预热的PEG进行融合，并用空白的1640培养基进行终止融合反应。具体的融合步骤如下：

滴加PEG，沿着管壁，枪尖尽量靠近细胞，1分钟之内滴加1ml，边滴加边旋转离心管，同时轻微摇动，保证细胞匀浆能充分均匀接触PEG；

室温静置1分钟；

滴加预热的空白1640培养基，1分钟内滴加1ml，边滴加边旋转离心管，同时轻微摇动，保证细胞能充分均匀接触培养基；

滴加预热的空白1640培养基，1分钟内滴加2ml。边滴加边旋转离心管，同时轻微摇动，保证细胞能充分均匀接触培养基；

滴加预热的空白1640培养基，1分钟内滴加5ml，边滴加边旋转离心管，同时轻微摇动，保证细胞能充分均匀接触培养基；

加预热的空白1640培养基，约21ml，边滴加边旋转离心管，同时轻微摇动，保证细胞能充分均匀接触培养基。融合完成，室温，1300rmp，离心8分钟，收集细胞；

用完全培养基(20％FBS，1％P/S，1×HAT，1×hybridoma growth factor(HGF))重悬融合后的细胞(注意吹打要轻微)，按照脾细胞的量添加培养基，1×10⁶脾细胞/ml。将重悬的细胞接种在培养皿中。融合后的细胞培养3-5天，期间换液一次。

3.3芯片制备

将模板准备好并修饰一层HGF(采用含有HGF的PBS溶液作为修饰溶液，有利于杂交瘤细胞的存活和增殖)，吸取约500微升芯片凝胶(注意无菌操作)，滴加到印章中心，室温静置10分钟(可以有效地防止过度干燥)，待凝固后，轻轻分离模板(有时也称为印章)和芯片，整个分离过程中要避免位移的产生，否则会破坏结构的完整性。芯片制作完成，放置在10cm直径的培养皿中保存待用。

4.4形成细胞阵列

收集4.3中得到的融合细胞，并用PBS或培养基洗1-2遍，去除多余的培养成分(培养上清中的抗体会导致检测的高背景)。建议细胞浓度调整为8×10⁵---1×10⁶/ml。将细胞悬液滴加到芯片表面，约500μl/芯片。培养箱中静置10分钟。先利用移液器回收多余的细胞悬液，之后吸取约300-500μl培养基，将芯片上下倾斜约30-45°，从上方慢慢滴加润洗多余细胞(不要让液体流出芯片)，再利用真空泵去除多余液体。显微镜下观察细胞阵列的情况，判断是否进行后续操作。

4.5原标记及阳性杂交瘤筛选

目前使用的是Thermo的蛋白标记试剂盒(A30006)，基本操作步骤按照说明书进行。

简言之，在等候细胞阵列形成的10分钟里，将冰盒取出，同时将标记的抗原以及自制的3D培养水凝胶取出并放置在冰盒中待用。准备1.5ml的无菌离心管，加入50μl完全培养基，并放置在冰盒中待用。待细胞阵列形成后，每个离心管中添加50μl的水凝胶，混匀。取70-80微升混匀的水凝胶，从芯片的一个角开始滴加，轻微晃动芯片，使液体完全覆盖结构区域。培养箱中静置5分钟,整个过程注意保持水平。利用注射器针头和镊子将芯片移至3.5cm直径的培养皿中，放置在培养箱中再添加筛选液(体积为2ml，荧光标记抗原：完全培养基＝1：200～1000)。静置至少3小时。

4.6单细胞挑取

待筛选3-5小时后，先在荧光显微镜下观察信号情况。确定阳性信号出现且比例达到要求，即可准备进行细胞挑取。

4.7单克隆培养及鉴定

细胞挑取出并释放在96孔板中，在1-2小时内进行镜检，判断每个孔中单细胞的存在。连续培养7-14天后，对稳定增殖的细胞孔上清进行ELISA测试，判断是否为分泌抗原特异性抗体，即为阳性克隆。将阳性克隆不断扩大培养并冻存，冻存前再次鉴定抗体分泌情况。

4.8筛选结果

通过筛选，本项目暂获得15株可以分泌特异性抗体的细胞株，其中单克隆细胞株14株。所有既得克隆均来源于不同小鼠或者相同小鼠的不同单杂交瘤细胞，因此，可以充分保证了克隆的多样性。

与传统方法(有限稀释法)相比，本发明的方法都具有非常显著的优势，具体如下：

筛选方法	时间	克隆数量	96孔板数量	人员情况
					有限稀释	3-4个月	2-5个	上百个	3个人以上
本专利申请方法	1.5-2个月	至少15-50个	1-2个	单人

由此，根据和传统的有限稀释法对比，本发明的方法无论在筛选效率还是筛选成本上，都占据绝对优势。在整体成本降低了约90％的同时筛选效率却至少提高了10倍。这还是没有完全展开筛选的条件下，而我们可以根据项目的急迫程度，更加合理搭配人员和安排时间，相信可以有效地将筛选效率在此基础提高至30倍以上。

实施例5：筛选配对抗体

5.1标记抗体的获得及荧光标记

根据实施例4中的筛选结果，选取一株抗体效价高的单克隆细胞株。制备腹水，流程如下：

①每组细胞准备2只小鼠，8-10周龄，B/C，雌性。不完全弗氏佐剂腹腔注射至敏，500ul/只。

腹腔接种细胞5×10⁵。注意：注射细胞少，腹水形成慢但效价会更高；杂交瘤细胞在注射前，需检测抗体效价；在接种前，细胞需要用无血清的培养基反复清洗2-3次。每只小鼠约0.2-1ml。

②接种后第2天开始密切观察小鼠的腹水及存活情况。约7天后，如果活力佳，有明显移动性腹水，可以放腹水2次左右；一旦发现小鼠活动受限，要立即处死放腹水。

活体抽取腹水：用酒精棉球擦拭要进针的位置(大概是在腹部中线偏右侧处)，而后先让注射器中留点空气而后进针再将注射器慢慢往后推，腹腔中有压力慢慢腹水会往外流，进针时要轻轻向上提一下，感觉无阻碍就好。

处死收取腹水：先用剪刀镊子轻轻在小鼠腹腔外皮剪一个小口，而后用两把止血钳轻轻两边拉开，使露出腹部，而后用另一把剪刀、镊子剪开内皮，注意不要全部剪开，用枪或玻璃直管即可取腹水。

正常情况下，每只小鼠每次可以收集2-3ml腹水，如果小鼠状态良好，可以隔天收集腹水。抗体浓度为0.5-5mg/ml。

③收集腹水到15ml离心管中，800rpm，30min(2000r/min，5分钟)离心，去除细胞和油脂。刚采集的腹水含有大量的油脂、巨噬细胞、杂交瘤细胞、腹腔内的上皮细胞、血液中的细胞成分等杂质，尤其是细胞成分，如果不除去将可能在腹水的长期保存中慢慢破裂，细胞内的蛋白质成分会释放到腹水肿，增加了腹水中的杂质，使纯化变得困难。因此腹水在采集后，不管是长期保存还是立即纯化，都应该先离心去除细胞成分，同时也可以去掉油脂(油脂的密度比较小，一般都漂浮在腹水表面，用枪吸出即可)。

抗体纯化及荧光标记制备标记抗体，使用Thermo的试剂盒(89953A30006)操作，具体流程参照说明书。

5.2配对抗体筛选

具体步骤同实施例4中描述。其中的荧光标记抗原替换为抗原和标记抗体复合物。添加比例为抗原：荧光第一抗体＝2:1。

在此步骤中，另一个变通的方法同样可以达到同样的筛选目的和效果，即，具体步骤同实施例4中的描述。其中在杂交瘤单细胞2D阵列芯片上，添加含有抗原的3D培养基，孵育2小时，使抗原与单细胞分泌的抗体充分结合后，去掉液态的3D培养基，再添加含有荧光标记第一抗体的3D培养基，孵育2-3小时。

5.3筛选结果

我们选取实施例4中筛选到的两株分泌高效价针对新冠病毒S1蛋白抗体的克隆作为第一抗体，分别为S1-6S和RBD-10S。经过上述筛选，我们最终得到的结果如下：

目前，发明人筛选得到针对S1蛋白的抗体对4组，针对RBD蛋白的抗体对3组。其中配对抗体分别来源于不同小鼠或者同一小鼠的不同杂交瘤细胞，因此，保证了抗体对的多样性。

实施例6：利用软基质芯片筛选分泌特定因子的单细胞

参考实施例4和5，筛选稳定表达VEGFA因子的CHO细胞为例。具体步骤，如芯片制备、单细胞2D阵列、单细胞的抗原抗体反应、阳性单细胞的鉴定和挑取等同实施例4或5中描述。其中不同的是，本实施例中是VEGF因子蛋白的分泌，用于免疫荧光反应的荧光标记抗原替换为荧光标记的特异抗体。筛选结果如下：

发明人同时利用了两个不同来源的VEGFA抗体进行了试验。在杀压结束后，我们分别挑取出了58个和49个阳性细胞(分泌因子)，通过后期培养和验证，最终分别获得了52个和42个能够稳定表达并分泌VEGFA的CHO细胞株，阳性率分别高达89.6％和85.7％。传统稳转CHO细胞株的筛选分离仍采取有限稀释的方法，如前所述，因此在时间、物料消耗及人员耗费上，我们的技术也体现了巨大的优势。

另外，发明人还参考实施例4和5，筛选能够分泌其他因子的单细胞，例如包括所有表达分泌蛋白的各种细胞包括：HEK293、CHO、Hela、MCF10A、HFF等细胞，因子包括各种可分泌到细胞外的生长因子和细胞因子包括VEGF、SDF-1a、PEDF、FGF等，与细胞分泌的蛋白特异相结合的标记蛋白包括分泌蛋白相应的特异抗体和受体结合结构域，在此不再赘述。

实施例7：小鼠神经干细胞成球培养

神经干细胞(neural stem cell)是指存在于神经系统中，具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群。因此，如何能更好的将神经干细胞在体外培养是进行科学研究的基础和根本。

(1)胎鼠神经干细胞提取。取孕期为14天的C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75％的酒精中，之后剪开腹部，取出一串胎鼠(剪断脐带)置于盛有预冷PBS的培养皿中。用镊子剥开胎盘，取出胎鼠，置于新的盛有预冷PBS的培养皿中(一般一只孕鼠有8-11只胎鼠，少的6只，多的可达13只)。将胎鼠的头拧下，置于新的盛有PBS的培养皿中(每次取2只胎鼠进行操作)。体视显微镜下取出大脑皮层，注意去除嗅球、脑膜等与大脑皮层连接的脑组织。将大脑皮层至于15mL离心管中，用巴斯德吸管反复吹打至无肉眼可见组织块的悬液，800rpm离心2min。将上清液取出备用，沉淀中加入新的PBS缓冲液吹打成悬液后，再次800rpm离心2min。将上清液吸出，并与第一次离心吸出的上清液混合，1200rpm离心2min。弃上清，沉淀用增殖培养基吹散得到NPC悬液，用孔径40μm的滤膜过滤，除去未分散开的团块。将NPC悬液吸出置于T25的培养瓶中悬浮培养。培养开始前两天不要晃动培养瓶，根据细胞球的大小一般在第6或7天开始传代。收集细胞，800rpm离心2min，去上清。加入PBS缓冲液将沉淀吹散，800rpm离心2min以去除残存的培养基。去上清，加入1-2ml Accutase or TryplE细胞消化液，于37℃培养箱中消化5-10min，中间可用手弹一弹。加入5倍体积的无Ca/Mg2+的PBS终止消化(或者是预热的培养基4-5mL重悬)，反复吹打，1200rpm离心2min。弃上清，加入1mL增殖培养基(可以多加些，以免下一步过滤损失较多)，将沉淀吹打至混悬液。用孔径40μm的滤膜过滤，除去未消化完全的细胞球，得到NPC悬液。用血球计数板计数NPC混悬液的细胞浓度，接种10×10^6个细胞置于新的T25培养瓶中培养。

(2)接种芯片。具体方法参照实施例4或5中所述，本实施例中涉及的芯片规格为12μm/30μm，软基质中添加因子种类为EGF和bFGF，终浓度分别为20ng/mL和10ng/mL。

(3)结果分析。通过将传统培养方法和本发明方法比较，具体试验数据如下所示，由此，可以看出软基质芯片培养有助于提高细胞的存活率，同时能够很好的维持细胞干性。

实施例8：肿瘤细胞成球培养(MCF7)

肿瘤生长和药物敏感性的研究在很大程度上依赖于体外单层肿瘤模型(2D cellculture)，这种模型缺乏许多疾病的特征，如缺氧、细胞间接触的改变和新陈代谢的改变。通过多年的研究，科学家认为3D肿瘤模型的表型更接近真实癌组织，可以为药物筛选提供更加准确的模型和数据。

(1)MCF7细胞培养及芯片接种。MCF7细胞培养在包含10％FBS和1％P/S的DMEM培养基中。待培养面积达到培养皿表面积80％的时候，消化并接种芯片。接种芯片具体步骤，参照实施例4或5中所述内容。

(2)连续培养。将包含细胞的芯片置于培养箱中连续培养3-5天，期间不断观察细胞具体增殖情况。经过培养，我们在芯片上实现了单MCF7细胞来源的细胞球的阵列。

这种肿瘤细胞的三维培养(或“细胞团”培养)，能够接近真实地复制原始肿瘤的许多关键属性。同时阵列培养适用于大规模药物筛选，以检测与基因变化相关的药物敏感性，为个性化治疗方法建立实验基础，并可以优化癌症患者的临床结果。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。在本发明的描述中，第一特征在第二特征“之上”或“之下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。

在本发明的描述中，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (22)

1.一种生物细胞培养芯片，其特征在于，包括：

基质，所述基质由基质材料形成，所述基质材料具有约1.25-1.75的平衡溶胀率；和

微孔，所述微孔形成在所述基质的表面，并且所述微孔在所述基质的表面开口，其中，所述微孔限定出生物培养空间用于培养生物细胞。

2.根据权利要求1所述的生物细胞培养芯片，其特征在于，所述基质材料具有40～45摄氏度的固液相变转化温度。

3.根据权利要求1所述的生物细胞培养芯片，其特征在于，所述基质材料在37摄氏度下能够呈液态。

4.根据权利要求1所述的生物细胞培养芯片，其特征在于，在细胞生长过程中，所述基质与所述细胞接触区域会发生凹陷。

5.根据权利要求1所述的生物细胞培养芯片，其特征在于，所述凹陷的深度不低于所述细胞直径的5％。

6.根据权利要求1所述的生物细胞培养芯片，其特征在于，所述基质材料包括选自胶原水凝胶、甲基化纤维素、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等的至少之一，或其中至少两项的不同比例的混合。

7.根据权利要求1所述的生物细胞培养芯片，其特征在于，所述基质进一步与所述生物材料对应的细胞因子。

8.根据权利要求1所述的生物细胞培养芯片，其特征在于，所述基质进一步包括选自FBS(胎牛血清)、蛋白A/G、胶原、gelatin(明胶)和BSA(牛血清白蛋白)的至少之一，或其中至少两项混合。

9.根据权利要求1所述的生物细胞培养芯片，其特征在于，所述微孔的开口直径小于所述微孔的底部直径。

10.根据权利要求9所述的生物细胞培养芯片，其特征在于，所述微孔的开口直径是所述微孔的所述底部直径的至多80％，优选50％。

11.根据权利要求1所述的生物细胞培养芯片，其特征在于，所述微孔的开口直径为8-25微米，深度为15-35微米。

12.根据权利要求1所述的生物细胞培养芯片，其特征在于，所述生物细胞材料为B细胞，所述开口直径为8-12微米；或者

所述生物细胞材料为杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞CHO或者肿瘤细胞，所述开口直径为15-25微米。

13.根据权利要求11或12所述的生物细胞培养芯片，其特征在于，包括：

多个微孔，所述微孔构成预定图案，相邻两个微孔的距离为10-100微米，优选10～50微米。

14.根据权利要求13所述的生物细胞培养芯片，其特征在于，进一步包括：

定位标记，所述定位标记形成在所述基质上。

15.根据权利要求1所述的生物细胞培养芯片，其特征在于，所述生物细胞材料为杂交瘤细胞，所述微孔的内壁表面设置有杂交瘤细胞培养因子；

所述生物材料为MCF10A细胞，所述微孔的内壁表面设置有胰岛素；或

所述生物材料为B细胞，所述微孔的内部表面设置有CD40L、IL2和IL10的至少之一或全部。

16.一种用于制备权利要求1～15任一项所述的生物细胞培养芯片的模板，其特征在于，包括：

基板；和

微柱，所述微柱设置在所述基板的表面，所述微柱的尺寸与所述微孔的尺寸匹配。

17.根据权利要求16所述的模板，其特征在于，所述微柱具有疏水表面。

18.根据权利要求16所述的模板，其特征在于，所述微柱表面适于通过疏水作用力结合生物因子。

19.一种制备权利要求1～15任一项所述的生物细胞培养芯片的方法，其特征在于，包括：

(1)将液态的所述生物材料施加于权利要求16～18任一项所述的模板上，并使所述基质材料固化；和

(2)使固化的所述生物材料与所述模板分离，以便获得所述生物细胞培养芯片。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述模板表面预先吸附有生物因子或者试剂。

21.一种利用权利要求1～15任一项所述的生物细胞培养芯片培养细胞的方法，其特征在于，包括：

将细胞置于所述微孔中；和

将所述生物芯片置于预定的环境条件中。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，每个所述微孔中设置至多1个细胞。

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