KR20230057347A

KR20230057347A - 생물학적 조직을 지지하는 겔 액적의 정제를 위한 방법 및 장치

Info

Publication number: KR20230057347A
Application number: KR1020237005355A
Authority: KR
Inventors: 자오휘 왕; 실링 센
Original assignee: 듀크 유니버시티
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2021-08-26
Publication date: 2023-04-28
Also published as: CA3189614A1; CN115917005A; US20230364528A1; US11628382B2; MX2023002103A; WO2022046958A1; US20220062791A1; EP4168573A1; JP2023539242A; AU2021332279A1

Abstract

본원에서는 생물학적 조직(예를 들어, 세포)을 포함하는 액적을 형성하기 위한 방법 및 장치, 및 특히, 분리된 세포(마이크로-오르가노스피어 포함)를 포함하는 액적으로부터 오일을 제거하기 위한 방법 및 장치가 기재된다.
이들 액적, 특히 마이크로-오르가노스피어의 형성에 있어서 오일을 사용하는 것이 유리하지만 오일은 상기 액적 내에서 세포의 성장 및 생존을 억제할 수도 있다. 본원에 기재된 방법 및 장치는 오일을 제거하도록 하고 결과적인 겔 액적의 성장 및 질을 향상시킬 수 있다.

Description

생물학적 조직을 지지하는 겔 액적의 정제를 위한 방법 및 장치

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 "생물학적 조직을 지지하는 겔 액적의 정제를 위한 방법 및 장치"라는 명칭으로 2020년 8월 26일에 출원된 미국 임시출원 제63/070,334호 및 "생물학적 조직을 지지하는 겔 액적의 정제를 위한 방법 및 장치"라는 명칭으로 2021년 4월 19일에 출원된 미국 정규출원 제17/233,950호에 우선권을 주장하며 그 내용은 전체가 참조로 여기에 포함된다.

참조에 의한 편입

본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.

기술 분야

본원에 기재된 방법 및 장치는 생물학적 조직(예를 들어, 오르가노스피어, 예를 들어, 마이크로-오르가노스피어, 오르가노이드, 마이크로-오르가노이드 등)을 포함하는 겔 액적을 형성하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 구체적으로, 겔 액적 내의 세포를 억제하거나 손상시킬 수 있는 오일을 제거하는 것을 포함하는 이러한 겔 액적을 형성하기 위한 방법 및 장치가 본원에 기술되어 있다.

모델 세포 및 조직 시스템은 생물학 및 의학 연구에 유용하다. 가장 일반적인 관행은 조직에서 불멸화 세포주를 유도하고 2차원(2D) 조건(예: 페트리 접시 또는 웰 플레이트)에서 그것을 배양하는 것이다. 그러나 기본 연구에 매우 유용하지만 2D 세포주는 치료에 대한 개별 환자의 반응과 잘 연관되지 않는다. 특히, 3차원 세포 배양 모델은 발달 생물학, 질병 병리학, 재생 의학, 약물 독성 및 효능 시험, 및 맞춤 의학에 특히 도움이 되는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 스페로이드 및 오르가노이드는 연구되어 온 3차원 세포 집합체이다.

다세포 종양 스페로이드는 70년대 초반에 처음 기술되었으며 비부착 조건 하에서 암 세포주의 배양에 의해 얻어졌다. 스페로이드는 일반적으로 초저부착 플레이트에서 자유롭게 떠다니는 세포 응집체로서 암 세포주에서 형성된다. 스페로이드는 2D 세포 배양보다 더 많은 줄기 세포 관련 특성을 유지하는 것으로 나타났다.

오르가노이드는 주요 세포 계통의 세포로 분화할 수 있는 줄기 세포 집단을 포함하는 시험관내 유래 세포 집합체이다. 오르가노이드는 일반적으로 직경이 1mm 이상이며 계대(passages)를 통해 배양된다. 일반적으로 2D 세포 배양보다 오르가노이드 배양을 성장시키고 확장하는 것은 느리다.

최근에 신속하고 신뢰할 수 있는 스크리닝, 특히 약물 반응의 생체외 시험을 수행하는 것과 같은 맞춤형 의학을 위해 사용될 수 있는 마이크로-오르가노이드가 개발되었다. 마이크로-오르가노이드는 더 작을 수 있고 모양과 세포 수가 더 균질하며 종래의 오르가노이드 또는 종양 스페로이드보다 적은 수의 세포를 함유할 수 있다.

그러나 편의상 본원에서 "오르가노스피어(organospheres)"로 지칭될 수 있는 이러한 모든 유형의 오르가노이드(전통적 오르가노이드, 스페로이드 및 마이크로-오르가노스피어)는 모두 전형적으로 오일을 사용하여 형성된다. 예를 들어, 오르가노이드는 미중합 매트릭스 물질(예: MATRIGEL과 같은 기질 기저막 매트릭스)을 종양 조직과 같은 분리된 조직과 혼합한 다음 이 혼합물을 오일과 같은 비혼화성 담체 유체의 스트림 또는 배쓰(bath) 내에서 구체로 중합하여 형성할 수 있다. 상기 오일이 구 형성에 도움이 되지만, 상기 오일은 오르가노스피어 내에서의 세포 성장을 억제할 수 있다. 상기 오일은 반복적인 헹굼으로 세척될 수 있지만 이러한 헹굼은 모든 오일을 제거하는 데 그다지 효과적이지 않으며 세포가 오일에 노출된 상태로 유지되는 더 오랜 시간이 필요할 수도 있다.

퍼플루오로 옥탄올(PFO)과 같은 유화 불안정화제가 오르가노스피어로부터 오일을 제거하는 데 사용되어 왔다. PFO는 또한 상기 오르가노스피어 내에서 세포의 성장과 생존력을 방해할 수 있다. 필요한 것은 특히 마이크로-오르가노스피어를 포함하는 오르가노스피어로부터 오일을 제거하기 위한 방법 및 장치이다. 본 명세서에 기술된 방법 및 장치는 이러한 필요성을 해결할 수 있다.

개시내용의 요약

본원에서는 생물학적 조직을 함유하는 겔 액적을 형성하는 방법 및 장치를 기재한다. 특히, 겔 액적이 형성된 직후 또는 직후에 겔 액적으로부터 오일을 제거하기 위한 방법 및 장치가 본원에 기술되어 있다. 본 명세서에 기술된 방법 및 장치는 예를 들어 겔 액적으로부터 오일을 제거하기 위해 소수성 막을 사용하는 막 기반 해유화(demulsification)를 사용할 수 있다. 이러한 방법 및 장치는 오일을 매우 신속하고 효과적으로 제거할 수 있다(예: 겔 액적의 위 또는 주변에서 오일의 99% 이상). 이러한 방법 및 장치는 화학적 해유화제(예: 퍼플루오로 옥탄올, PFO)를 사용하지 않고 수행할 수 있으므로 겔 액적 내의 세포에 대한 독성이 상당히 낮을 수 있다. 이러한 방법 및 장치는 생존 가능한 생물학적 조직을 갖는 겔 액적을 제공하는 것으로 나타났으며 매우 높은 회수율(겔 액적의 5% 미만의 손실)을 가지며 자동화될 수 있다. 생성된 겔 액적은 스크리닝, 약물 독성 등의 검정을 포함하는 하나 이상의 검정을 수행하기 위해 즉시 또는 배양 후에 배양 및/또는 사용될 수 있다.

일반적으로, 본 명세서에 기술된 방법 및 장치는 생물학적 조직을 포함하는 겔 액적의 형성을 포함할 수 있다. 이들 겔 액적은 본 명세서에서 오르가노스피어로서 지칭될 수 있고, 특히 마이크로-오르가노스피어, 마이크로-오르가노이드, 미세-스페로이드, 및 경우에 따라 오르가노이드 및/또는 스페로이드와 같이 오일로써 또는 오일 중에 형성될 수 있는 임의의 겔 액적을 포함할 수 있다(다만 이에 한정되지 않음). 본원에 기재된 생물학적 조직(예를 들어, 분리된 세포)을 지지하는 임의의 겔 액적은 환자 및/또는 조직 배양물로부터 기원하는 세포를 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 작은 환자 생검(예: 치료를 안내하기 위한 빠른 진단을 위해)으로부터, 절제된 원발성 종양 또는 기능 장애 기관의 일부(예: 고처리량 스크리닝을 위해)를 포함하는 절제된 환자 조직으로부터, 및/또는 환자-유래 이종이식편(PDX)을 포함하여 이미 확립된 PDMC로부터 추출될 수 있다. 이러한 겔 액적은 정상인 일차 세포(예: 정상 기관 조직)으로부터 또는 종양 조직으로부터 형성될 수 있다. 예를 들어, 어떤 변형에서는, 이러한 방법 및 장치는 암성 종양 생검 조직으로부터 겔 액적을 형성하여 검사된 특정 종양 조직을 사용하여 선택할 수 있는 맞춤형 치료를 가능하게 할 수 있다.

상기 겔 액적은 미세 오르가노스피어일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 환자 생검으로부터 분리된 1차 세포는 기질 기저막 매트릭스(예: MATRIGEL)와 같은 유체 매트릭스 물질와 결합되어 마이크로-오르가노스피어와 같은 액적을 형성하고 겔화할 수 있다. 마이크로-오르가노스피어는 미리 정의된 크기 범위(예를 들어 10㎛ 내지 700㎛의 직경 및 그 내의 모든 하위 범위) 및 1차 세포의 초기 수(예를 들어 1 내지 1000, 및 특히 1-200과 같은 더 낮은 세포의 수)를 가질 수 있다. 세포의 수 및/또는 직경은 예를 들어 +/- 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 등 내에서 제어될 수 있다. 특히 오일 및/또는 해유화제(예: PFO)가 없기 때문에 형성 후 몇 분, 몇 시간, 또는 며칠 이내를 포함하여 매우 짧은 시간 내에 사용 및 시험에 안정적일 수 있다. 이를 통해 신속한 시험이 가능할 수 있다. 본원에 기술된 겔 액적은 3차원(3D) 종양 미세환경과 같이 이들이 취해진 조직 환경에 대해 복제하고 해당하는 3D 세포 구조를 보다 견고하게 형성할 수 있다.

특히, 오르가노스피어 또는 마이크로-오르가노스피어를 가공하는 방법과 같은 생물학적 조직(예를 들어, 세포)을 포함하는 겔 액적을 가공하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 이들 방법 중 임의의 것은 다음을 포함할 수 있다: 오일에 복수의 겔 액적을 형성하는 단계로서, 여기서 상기 겔 액적은 매트릭스 물질의 중합된 구체 내에 분포된 해리된 조직 샘플로부터의 세포를 포함하고, 상기 겔 액적은 내부에 분포된 세포를 가지는 단계; 및 오일이 소수성 막을 통해 또는 소수성 막 쪽으로 상기 겔 액적으로부터 제거되도록 소수성 막에 대해 상기 겔 액적을 접촉시키는 단계.

상기 겔 액적은 50-500㎛의 직경을 갖는 마이크로-오르가노스피어를 포함할 수 있다. 이들 방법 중 임의의 것은 소수성 막에 대해 겔 액적을 접촉할 때 겔 액적에서 적어도 99%의 오일을 제거하는 것을 포함할 수 있다.

예를 들어, 겔 액적을 소수성 막에 접촉시키는 단계는 소수성 막에 의해 적어도 부분적으로 형성된 챔버(예를 들어, 튜브, 채널 등)를 통해 겔 액적을 통과시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 챔버는 소수성 막에 의해 형성된 터널 또는 튜브를 포함할 수 있다. 임의의 이들 방법에서, 음압(예를 들어, 진공)이 선택적으로 막의 한쪽 면에 적용될 수 있고/있거나 겔 액적을 포함하는 용액이 상기 막에 대해 유도될 수 있다. 대안적으로, 이들 변형 중 임의의 것에서, 음압을 적용하는 것을 포함하여 힘을 가할 필요 없이 겔 액적을 소수성 막에 간단히 접촉시킬 수 있다.

예를 들어 어떤 변형에서는, 소수성 막에 대해 겔 액적을 접촉시키는 단계는 겔 액적을 소수성 막에 의해 형성된 깔때기 쪽으로 용출시키는 것을 포함한다. 소수성 막에 대해 겔 액적을 접촉시키는 단계는 소수성 막에 대해 겔 액적을 여과하는 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, 소수성 막에 대해 겔 액적을 접촉시키는 단계는 소수성 막 위로 겔 액적을 포함하는 용액을 통과시키는 것을 포함할 수 있다.

소수성 "막"을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 다공성 소수성 표면이 사용될 수 있다. 예를 들어, 소수성 표면(예를 들어, 막)은 0.1 내지 5㎛(예를 들어, 약 0.1 내지 2㎛, 약 0.2 내지 4㎛, 약 0.1 내지 1㎛, 약 0.3 내지 3㎛ 등)인 기공 크기를 가질 수 있다. 다공성 소수성 표면의 표면 질감은 부드럽기보다는 거칠 수 있다.

일반적으로, 소수성 막에 대해 겔 액적을 접촉시키는 단계는 겔 액적을 수성 매질에 보유하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 겔 액적은 다공성 소수성 표면의 한 면에서 수성 버퍼/매질로 보유될 수 있는 반면, 오일은 다공성 소수성 표면 쪽으로 또는 이를 통해 흡수(wicked)되거나 제거된다.

위에서 언급한 바와 같이, 본원에 기술된 겔 액적을 형성 및/또는 처리하기 위한 임의의 방법 및 장치는 오르가노이드, 스페로이드 또는 마이크로-오르가노스피어에 사용될 수 있다. 예를 들어, 어떤 변형에서는 상기 겔 액적은 각각 그 안에 분포된 세포를 1개에서 200개 사이에서 포함할 수 있다.

이들 방법 중 임의의 것은 소수성 막 상의 겔 액적을 수성 매질로 세척하는 것을 포함할 수 있다. 상기 겔 액적(예를 들어, 미세오르가노스피어)은 수용액(예를 들어, PBS와 같은 완충액, 배양 배지 등)을 막 위에 첨가함으로써, 또는 추가적인 수용액을 상기 액적에 가하고 이를 상기 소수성 막에 재노출시킴으로써 세척할 수 있다. 일부 예에서, 상기 액적은 소수성 막에 대해 액적을 접촉시키기 전 헹구기 위해 수용액과 결합될 수 있고, 이어서 추가 수용액으로 소수성 막 상에 있는 동안 헹굴 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 액적에 수용액이 첨가될 수 있고 소수성 막(또는 새로운 소수성 막, 또는 동일한 소수성 막의 새로운 영역)에 다시 노출될 수 있다. 일부 예에서, 수 회의 헹굼/세척 및 하나 이상의 소수성 막과의 접촉이 수행될 수 있다. 이 경우 상이한 성질을 갖는 소수성 막을 사용할 수 있다. 상기 방법은 형성체(organizer)를 배양 배지에서 배양하는 것을 포함할 수 있다.

예를 들어, 겔 액적을 가공하는 방법은 다음을 포함할 수 있다: 오일 중에 복수의 겔 액적을 형성하는 단계로서, 여기서 상기 겔 액적은 매트릭스 물질의 구체 내에 분포된 분리된 조직 샘플로부터의 세포를 포함하고, 상기 겔 액적은 1 내지 200개의 세포가 그 안에 분포된, 50 내지 500㎛의 직경을 갖는 것인 단계; 및 오일의 적어도 98%가 소수성 막 위 또는 내부로, 겔 액적로부터 제거되도록 소수성 막에 대해 겔 액적을 접촉시키는 단계; 상기 소수성 막 위의 겔 액적을 수성 매질로 세척하는 단계; 및 상기 형성체를 배양 배지 중에서 배양하는 단계.

본원에 기재된 임의의 방법은 분리된 1차 조직 세포(암/비정상 조직, 정상 조직 등을 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 미중합 물질을 형성하기 위해 액체 매트릭스 물질와 결합하고, 이후 미중합 물질을 중합하여 오일 또는 오일 에멀젼 내에 겔 액적(예를 들어, 마이크로-오르가노스피어)을 형성하는 단계를 포함할 수 있으며; 이러한 방법은 이후 소수성 표면 또는 막을 사용하여 겔 액적에서 오일을 제거할 수 있다.

또한 본 명세서에서는 이러한 방법 중 임의의 것을 수행하도록 구성된 장치가 설명된다. 예를 들어, 겔 액적을 형성하기 위한 장치가 본원에 기술되며, 이 장치는 분리된 세포 및 미중합 매트릭스 물질을 포함하는 분리된 조직 샘플을 수용하도록 구성된 제1 채널, 및 오일을 수용하고 제1 채널과 교차하여 오일 중에 현탁된 중합된 겔 액적을 형성하도록 구성된 제2 채널을 포함하는, 복수의 채널을 포함하는 유체 프로세서; 상기 유체 프로세서와 유체 소통하는 소수성 막을 포함하고 상기 겔 액적으로부터 오일을 제거하도록 구성된 해유화부(demulsifying portion); 및 수용액을 사용하여 상기 해유화부로부터 겔 액적을 용출하도록 구성된 용출 채널을 포함한다.

겔 액적이 마이크로-오르가노스피어인 경우, 상기 마이크로-오르가노스피어는 전형적으로 약 1000㎛ 미만(예를 들어, 약 900㎛ 미만, 약 800㎛ 미만, 약 700㎛ 미만, 약 600㎛ 미만, 특히 약 500㎛ 미만)의 직경을 가지며 여기에서 분리된 1차 조직 세포가 분포되어 있다. 임의의 이들 겔 액적에서, 분리된 세포의 수는 상기 언급된 바와 같이 미리 결정된 범위 내에 있을 수 있다(예를 들어, 약 1 내지 약 500개 세포, 약 1-200개 세포, 약 1-150개 세포, 약 100개 세포 사이, 약 1-75개 세포, 약 1-50개 세포, 약 1-30개 세포, 약 1-20개 세포, 약 1-10개 세포, 약 5-15개 세포, 약 20-30개 세포 , 약 30-50개 세포 사이, 약 40-60개 세포 사이, 약 50-70개 세포, 약 60-80개 세포, 약 70-90개 세포, 약 80-100개 세포, 약 90-110개 세포 등이며, 이는 약 1개 세포, 약 10개 세포, 약 20개 세포, 약 30개 세포, 약 40개 세포, 약 50개 세포, 약 60개 세포, 약 70개 세포 등을 포함함). 이들 방법 중 임의의 것은 반복 가능한 크기(예를 들어, 크기의 좁은 분포를 가짐)의 겔 액적을 생성하기 위해 본원에 기술된 바와 같이 구성될 수 있다.

상기 분리된 세포는 새롭게 생검될 수 있고 기계적 및/또는 화학적 분리(예를 들어, 콜라게나제, 트립신 등과 같은 하나 이상의 효소를 사용하는 효소적 분해)를 포함하는 임의의 적절한 방식으로 분리될 수 있다. 상기 분리된 세포는 임의로 처리, 선택 및/또는 개변될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 하나 이상의 특성(예: 크기, 형태 등)을 갖는 세포를 식별 및/또는 분리하기 위해 분류 또는 선택될 수 있다. 상기 세포는 선택을 돕기 위해 사용될 수 있는 (예를 들어, 하나 이상의 마커로) 표시될 수 있다. 어떤 변형에서는 상기 세포는 미세유체 세포 분류, 형광 활성화 세포 분류, 자기 활성화 세포 분류 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공지된 세포-분류 기술에 의해 분류될 수 있다. 대안적으로, 상기 세포는 분류 없이 사용될 수 있다.

일부 변형에서는, 상기 분리된 세포는 하나 이상의 제제로의 처리에 의해 개변될 수 있다. 예를 들어 상기 세포는 유전적으로 개변될 수 있다. 어떤 변형에서는 상기 세포는 CRISPR-Cas9 또는 기타 유전자 편집 기술을 사용하여 변형될 수 있다. 어떤 변형에서는 상기 세포는 임의의 적절한 방법(예를 들어, 전기천공법, 세포 압착, 나노입자 주입, 자기감염(magnetofection), 화학적 형질감염, 바이러스 형질감염 등)에 의해 형질감염될 수 있는데, 이는 플라스미드, RNA, siRNA 등으로의 형질감염을 포함한다. 대안적으로, 상기 세포는 개변 없이 사용될 수 있다.

하나 이상의 추가 물질이 분리된 세포 및 유체(예를 들어, 액체) 매트릭스 물질과 결합되어 미중합 혼합물을 형성할 수 있다. 예를 들어, 상기 미중합 혼합물은 지지 세포를 포함하는 추가적인 세포 또는 조직 유형을 포함할 수 있다. 상기 추가 세포 또는 조직은 상이한 생검(예를 들어, 상이한 분리된 조직으로부터의 1차 세포) 및/또는 배양된 세포로부터 기원할 수 있다. 상기 추가 세포는 예를 들어 면역 세포, 간질 세포, 내피 세포 등일 수 있다. 상기 추가 물질은 배지(예: 성장 배지, 동결 배지 등), 성장 인자, 지지 네트워크 분자(예: 콜라겐, 당단백질, 세포외 기질 등), 등등을 포함할 수 있다. 어떤 변형에서는 상기 추가 물질은 약물 조성물을 포함할 수 있다. 어떤 변형에서는 상기 미중합 혼합물은 분리된 조직 샘플(예: 1차 세포) 및 유체 매트릭스 물질만을 포함하다.

예를 들어, 일부 변형에서는 이들 방법은 미중합 매트릭스 혼합물을 미중합 물질과 섞이지 않는 오일(예를 들어, 액체 물질)과 결합함으로써 수행될 수 있다. 상기 방법 및 장치는 미중합 매트릭스 혼합물(예를 들어, 분리된 조직 및 유체 매트릭스) 및 오일 중 하나 이상의 유동을 미중합 혼합물로 적어도 부분적으로 제어함으로써 겔 액적의 크기 및/또는 세포 밀도를 제어할 수 있다. 중합 후에, 전형적으로 오일 내에서, 상기 겔 액적은 오일의 일부를 제거하기 위해 (예를 들어, 완충 식염수(예를 들어, 인산염 완충 식염수)와 같은 수성 매질에서 및/또는 세포 배양 배지에서) 세척될 수 있고/있거나 상기 겔 액적은 특히 소수성 막의 표면과 같은 다공성 소수성 표면에 노출될 수 있다. 상기 오일은 다공성 소수성 표면을 통해 또는 다공성 소수성 표면 쪽으로(예를 들어, 소수성 막 쪽으로 또는 이를 통해) 겔 액적으로부터 제거될 수 있다. 상기 겔 액적은 완충 용액 및/또는 매질을 사용한 헹굼, 세척, 플러싱 등에 의해 소수성 표면으로부터 분리 또는 제거될 수 있다.

일부 변형에서, 이들 방법은 미세유체 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 어떤 변형에서는, 하나 이상의 미세유체 챔버 및/또는 유동 채널을 포함하는 채널을 사용하여 오일에서 다수의 겔 액적(예를 들어, 마이크로-오르가노스피어)이 형성될 수 있다. 챔버, 채널 또는 다른 부분은 겔 액적에서 오일을 제거하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 오일 제거 부분은 소수성 표면에 대해 흐르는 것을 포함하여 겔 액적이 접촉하도록 위치할 수 있는 다공성 소수성 표면(예: 막)을 포함하는 채널 또는 챔버를 포함할 수 있다. 상기 겔 액적은 소수성 표면에 대해 유도(예를 들어, 유동)될 수 있고/있거나 일정 기간(예를 들어, x초 또는 분, 예를 들어 1초, 2초, 3초, 5초, 초, 10초, 30초, 60초, 120초, 3분, 4분, 5분, 등) 동안 소수성 표면에 대해 머물도록 할 수 있다. 동일한 장치는 오일 제거를 위한 병렬 채널을 포함하여 여러 개의 병렬 채널을 포함할 수 있다.

일단 오일이 겔 액적에서 제거되면, 겔 액적은 즉시 사용될 수 있고/있거나 저장될 수 있고(예를 들어, 냉동) 및/또는 예를 들어 배양에 의해 성장하도록 허용될 수 있다. 상기 겔 액적은 배양 전 또는 후에 분석될 수 있고/있거나 배양 전 또는 후에 동결보존될 수 있다. 상기 겔 액적은 임의의 적절한 시간 동안 배양될 수 있지만, 특히 1일 내지 10일 동안 배양될 수 있다(예를 들어, 1일 내지 9일, 1일 내지 8일, 1일 내지 7일, 1일 내지 6일, 3일 내지 9일, 3일 내지 8일, 3일 내지 7일, 등.). 생성된 겔 액적은 본질적으로 오일이 없고/없거나 PFO와 같은 해유화제가 없을 수 있다.

상기 매트릭스 물질은 합성 또는 비합성 미중합 기저막 물질일 수 있다. 어떤 변형에서는 미중합 기저 물질은 폴리머 히드로겔을 포함할 수 있다. 어떤 변형에서는 상기 유체 매트릭스 물질은 MATRIGEL을 포함할 수 있다. 따라서, 분리된 조직 샘플과 유체 매트릭스 물질을 결합하는 것은 분리된 조직 샘플을 기저막 매트릭스와 결합하는 것을 포함할 수 있다. 상기 조직 샘플은 환자로부터 조직 샘플을 제거한 후 6시간 이내 또는 그보다 더 빨리(예를 들어, 약 5시간 이내, 약 4시간 이내, 약 3시간 이내, 약 2시간 이내, 약 1시간 이내, 등) 유체 매트릭스 물질과 결합될 수 있다.

본 명세서에 기술된 임의의 방법 및 장치에서, 소수성 막 대신에, 또는 그에 더하여, 소수성 물질(비드, 표면, 등)을 오일을 제거하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 액적(예컨대, 미세 오르가노스피어)은 소수성 물질로 코팅된 표면과 접촉하여 오일을 제거할 수 있으며/있거나 소수성 물질로 형성된 비드를 포함하는 캠버에 접촉될 수 있다.

본 발명의 새로운 특징은 특히 후속 청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 장점에 대한 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시예를 설명하는 다음의 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조함으로써 얻어질 것이다:
도 1은 오일을 함유하는 채널 내에 현탁된, 중합 직후 복수의 겔 액적(이 예에서는 환자 유래 마이크로-오르가노스피어)을 보여주는 이미지의 한 예를 보여준다.
도 2는 특히 미세 오르가노스피어의 형성을 예시하는, 겔 액적, 및 특히 마이크로-오르가노스피어를 형성하기 위한 장치를 위한 프로토타입 미세유체 어셈블리의 일부의 이미지이다.
도 3은 중합 직후, 오일에 현탁된 본 명세서에 기재된 바와 같은 복수의 겔 액적을 도시한다.
도 4a는 겔 액적의 형성 직후 오일 내의 복수의 겔 액적의 예를 도시한다.
도 4b는 다른 오일 제거(예를 들어, 탈유화) 기술과 비교하기 위해 정전기 방지 건을 사용하여 오일이 제거된 겔 액적을 보여주며, 일부 겔 액적은 있지만 추가 오일 및 모여진 잔해물은 없는 것을 보여준다. 별표는 분리된 세포를 포함하는 겔 액적을 나타낸다.
도 4c는 이전에 설명한 바와 같이 10% PFO를 사용하여 오일을 제거한 후의 겔 액적을 보여준다. 별표는 분리된 세포를 함유하는 겔 액적을 나타낸다.
도 4d는 본원에 기술된 바와 같이 다공성 소수성 표면(예를 들어, 막)을 사용하여 오일을 제거한 후의 겔 액적을 보여준다. 별표는 분리된 세포를 함유하는 겔 액적을 나타낸다.
도 5는 본원에 기재된 바와 같이, 다공성 소수성 표면을 사용하여 겔 액적으로부터 오일을 제거하는 것을 포함하는 겔 액적을 가공하는 방법의 일례를 개략적으로 도시한다.
도 6은 본원에 기재된 바와 같이, 겔 액적으로부터 오일 제거를 포함하는, 겔 액적을 형성하도록 구성된 장치의 일례를 도식적으로 도시한다. 도 6에는 다공성 소수성 표면을 사용하기 위한 두 가지 별도의 기술 및 구조(예: 깔때기 및 튜브)가 예시되어 있다.
도 7은 본원에 기술된 바와 같은 겔 액적으로부터 오일을 제거하기 위해 소수성 표면을 수동으로 사용하는 한 가지 방법을 예시한다.
도 8a-8d는 겔 액적을 해유화하기 위해 소수성 막을 사용한 후 회수된 새로 형성된 겔 액적(예를 들어, 이 예에서 마이크로-오르가노스피어)의 예를 도시한다. 도 8a는 저배율(4x) 대물렌즈에서 복수의 1 세포/액적 겔 액적의 모습을 보여준다. 도 8b는 저배율(4x) 대물렌즈에서 복수의 20개 세포/액적 겔 액적의 모습을 보여준다. 도 8c는 소수성 막을 사용하여 오일이 제거된 1개의 셀/액적을 갖는 겔 액적의 고배율(예를 들어, 10x) 확대도를 나타낸다. 도 8d는 본원에 기술된 바와 같이 오일 제거 후 20 세포/액적을 갖는 겔 액적의 고배율(예를 들어, 10x) 확대도를 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 도 8a 및 8b에 도시된 것과 유사한 1 세포/액적(도 9a) 또는 20 세포/액적(도 9b)을 갖는 겔 액적의 예를 보여주며, 본 명세서에 기술된 바와 같이 소수성 막을 사용하여 오일을 제거한 지 2일 후이다.
도 10a 및 도 10b는 도 8c-8d에 도시된 것과 유사한 1 세포/액적(도 10a) 또는 20 세포/액적(도 10b)을 갖는 겔 액적의 예를 보여주며, 본 명세서에 기술된 바와 같이 소수성 막을 사용하여 오일을 제거한 지 2일 후이다.
도 11a 및 도 11b는 도 8c-8d에 도시된 것과 유사한 1 세포/액적(도 11a) 또는 20 세포/액적(도 11b)을 갖는 겔 액적의 예를 보여주며, 본 명세서에 기술된 바와 같이 소수성 막을 사용하여 오일을 제거한 지 3일 후이다.
도 12a-12b는 각각 4x(도 14a) 또는 10x(도 14b) 배율에서 20 세포/액적을 갖는 VERO 세포로부터 형성된 겔 액적의 예를 보여준다.
도 13a-13b는 각각 4x(도 13a) 또는 10x(도 13b) 배율에서 20 세포/액적을 갖는 293T 세포로부터 형성된 겔 액적의 예를 보여준다.
도 14a-14b는 각각 4x(도 14a) 또는 10x(도 14b) 배율에서 20 세포/액적을 갖는 293 ACE2 세포로부터 형성된 겔 액적의 예를 보여준다.
도 15a-15b는 각각 4x(도 15a) 또는 10x(도 15b) 배율에서 1 세포/액적을 갖는 CRC19-106 세포로부터 형성된 겔 액적의 예를 보여준다.
도 16a-16b는 각각 4x(도 16a) 또는 10x(도 16b) 배율에서 20 세포/액적을 갖는 CRC-1916 세포로부터 형성된 겔 액적의 예를 보여준다.
도 17a-17b는 각각 4x(도 17a) 또는 10x(도 17b) 배율에서 1 세포/액적을 갖는 CRC19817 세포로부터 형성된 겔 액적의 예를 보여준다.
도 18a-18b는 각각 4x(도 18a) 또는 10x(도 18b) 배율에서 20 세포/액적을 갖는 CRC19187 세포로부터 형성된 겔 액적의 예를 보여준다.
도 19a-19b는 각각 4x(도 19a) 또는 10x(도 19b) 배율에서 20 세포/액적을 갖는 CRC 19245 세포로부터 형성된 겔 액적의 예를 보여준다.
도 20a-20b는 각각 4x 또는 10x 배율에서 1 세포/액적(도 20a) 또는 20 세포/액적(도 20b) 배율을 갖는 VERO 세포로부터 형성된 겔 액적의 예를 보여준다.
도 21a-21b는 각각 4x 또는 10x 배율에서 20 세포/액적(도 21a) 또는 20 세포/액적(도 21b) 배율을 갖는 마우스 장 오르가노이드로부터 형성된 겔 액적의 예를 보여준다.
도 22a-22c는 본원에 기술된 방법을 사용하여 유도 만능 줄기 세포(iPSCs)로부터 본원에 기술된 바와 같이 형성된 마이크로-오르가노스피어의 예를 도시한다. 도 22a는 본 명세서에 기술된 바와 같이 오일을 제거한 후 형성 직후의 액적(미소-오르가노스피어)을 나타낸다. 도 22b는 형성 3일 후 마이크로-오르가노스피어를 보여준다. 도 22c는 7일째 iPSC 마이크로-오르가노스피어를 보여준다.
도 23a-23f는 다양한 사체(부검) 조직으로부터 본원에 기술된 바와 같이 성공적으로 형성된 마이크로-오르가노스피어("겔 액적")를 예시한다. 도 23a는 마이크로-오르가노스피어를 형성하기 위해 본 명세서에 기술된 바와 같이 사용될 수 있는 조직 샘플을 도시하며 도 23a에서 조직은 후각 조직이다. 도 23b는 도 23a에 도시된 조직으로부터 형성된 마이크로-오르가노스피어의 예를 도시한다. 도 23c는 원위 폐 조직을 사용하여 형성된 마이크로-오르가노스피어의 예를 보여준다. 도 23d는 기관 조직을 사용하여 형성된 마이크로-오르가노스피어의 예를 보여준다. 도 23e는 근위 폐 조직을 사용하여 형성된 마이크로-오르가노스피어의 예를 보여준다. 도 23f는 부비강 점막을 사용하여 형성된 마이크로-오르가노스피어의 예를 보여준다. 도 23h는 식도 조직을 사용하여 형성된 마이크로-오르가노스피어의 예를 보여준다. 23i는 장 조직을 사용하여 형성된 마이크로-오르가노스피어의 예를 보여준다. 도 23j 및 23k는 간 조직을 사용하여 형성된 마이크로-오르가노스피어의 예를 보여준다. 도 23b-23k에 도시된 마이크로-오르가노스피어는 본원에 기재된 바와 같이 오일 형성 및 제거 후 7-20일 동안 배양되었다.

일반적으로, 다공성 표면을 사용함으로써 겔 액적으로부터 오일을 제거하도록 구성된 단계 및/또는 구조를 포함하는, 예를 들어 마이크로-오르가노스피어를 포함하는 겔 액적을 제조하기 위한 방법 및 장치가 본원에 기재되어 있다.

본원에 기재된 겔 액적은 전형적으로 기재 물질 내에 분포된 분리된 1차 세포로부터 형성된 구체일 수 있다. 이들 겔 액적은 직경이 예를 들어 약 50 ㎛ 내지 약 500 ㎛(예를 들어, 약 50㎛ 내지 약 400㎛, 약 50㎛ 내지 약 300㎛, 약 50㎛ 내지 약 250㎛ 등)인 마이크로-오르가노스피어로서 구성될 수 있으며, 기본 물질 내에 분포된 약 1 내지 1000개의 분리된 일차 세포를 함유할 수 있다(예를 들어, 약 1 내지 750, 약 1 내지 500, 약 1 내지 400, 약 1 내지 300, 약 1 내지 200, 약 1 내지 150, 약 1 내지 100, 약 1 내지 75, 약 1 내지 50, 약 1 내지 40, 약 1 내지 30, 약 1 내지 20, 등).

소수성 막과 같은, 다만 이에 한정되지 않는 소수성 표면을 사용하여 오일을 제거하면 즉시 사용하거나 매우 짧은 기간(예: 14일 이하, 10일 이하, 7일 이하, 5일 이하, 등) 동안 배양할 수 있는 겔 액적을 제공할 수 있고 겔 액적 내의 세포가 이들이 추출된 종양 조직을 포함하는 조직의 특성의 전부는 아니더라도 대부분을 유지하면서 생존하도록 할 수 있다. 겔 액적에서 오일을 제거하기 위해 다공성 소수성 표면(예: 막)을 사용하는 경우 겔 액적 내 세포의 생존율이 현저하게 높으며 겔 액적은 여러 계대를 통해 며칠(또는 몇 주) 동안 배양될 수 있는데, 여기서 세포는 분할하고, 클러스터하며 모 조직과 유사한 구조를 형성한다.

본원에 기술된 겔 액적(예를 들어, 액적 형성된 마이크로-오르가노스피어)은 예를 들어 분리되고 기저 매트릭스(예를 들어, MATRIGEL)에 현탁된 환자 유래 종양 샘플로부터 형성될 수 있다. 상기 겔 액적은 미세유체 마이크로웰 어레이에 패턴화되어 배양되고 약물 화합물이 투약될 수 있다. 이 소형화된 어세이는 종양 샘플의 사용을 최대화하고 샘플당 훨씬 저렴한 비용으로 코어 생검으로부터 더 많은 약물 화합물을 스크리닝할 수 있게 하다.

현재 개시된 주제의 하나 이상의 구체예의 세부 사항이 이 문서에 설명되어 있다. 이 문서에 설명된 실시예 및 다른 실시예에 대한 개변은 이 문서에 제공된 정보를 연구한 후 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이 문서에 제공된 정보, 특히 설명된 예시적인 구체예의 특정 세부 사항은 주로 이해의 명확성을 위해 제공되며 그로부터 불필요한 제한이 있는 것으로 이해되어서는 안 된다. 모순이 있는 경우 정의를 포함하여 본 문서의 명세서가 우선이다.

본 명세서에 사용된 용어는 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 잘 이해되는 것으로 여겨지지만, 현재 개시된 주제의 설명을 용이하게 하기 위해 정의가 본 명세서에 제시되어 있다.

달리 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 현재 개시된 주제가 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 균등한 임의의 방법, 장치 및 물질이 현재 개시된 주제의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 이제는 대표적인 방법, 장치 및 물질이 설명된다.

용어 "미중합(unpolymerized) 혼합물"은 분리된 조직 샘플 및 제1 유체 매트릭스 물질을 포함하는 생물학적 관련 물질을 포함하는 조성물을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 상기 유체 매트릭스 물질은 전형적으로 그 안에 분산된 분리된 조직(세포)을 위한 지지체 또는 지지 네트워크를 형성하기 위해 중합될 수 있는 물질이다. 일단 중합되면, 중합된 물질은 히드로겔을 형성할 수 있고 형성될 수 있고/있거나 세포 이외에 생체적합성 매질을 형성하는 단백질을 포함할 수 있다. 현재 개시된 주제에 따라 사용하기에 적합한 생체적합성 매질은 일반적으로 겔, 반고체, 또는 실온(예를 들어, 25℃)에서 저점도 액체와 같은 액체인 임의의 생체적합성 물질로부터 형성될 수 있고 세포, 조직, 단백질, 및 기타 관심 있는 생물학적 물질의 3차원 기질로서 사용할 수 있다. 현재 개시된 주제에 따라 생체적합성 매질을 형성하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 물질은 콜라겐, 피브린, 키토산, MATRIGEL™(BD Biosciences, San Jose, CA), 폴리에틸렌 글리콜, 화학적 가교결합성 또는 광가교결합성 덱스트란을 포함하는 덱스트란, 뿐만 아니라 전기방사된 생물학적, 합성, 또는 생물학적-합성 블렌드를 포함하는 폴리머 및 히드로겔을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 생체적합성 매질은 히드로겔로 구성된다.

용어 "히드로겔"은 본원에서 중합체 사슬의 3차원 네트워크를 포함하는 2성분 또는 다성분 겔을 지칭하는 것으로 사용되며, 여기서 물은 분산 매질로서 작용하고 중합체 사슬 사이의 공간을 채운다. 현재 개시된 주제에 따라 사용되는 히드로겔은 겔 액적을 형성하기 위해 사용되는 매개변수뿐만 아니라, 선택된 히드로겔이, 구조물에 배치될 생물학적 현탁액에 혼입된 생물학적 물질(예: 세포)의 거동 및 활성에 영향을 미칠 선택된 효과를 고려하여 구조의 의도된 용도에 기초하여 특정 적용을 위해 일반적으로 선택된다. 현재 개시된 주제의 예시적인 히드로겔은 알긴산염, 콜라겐(콜라겐 유형 I 및 VI 포함), 엘라스틴, 케라틴, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 당단백질, 폴리락타이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리카프로락톤, 폴리콜라이드, 폴리디옥사논, 폴리아크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리설폰, 펩티드 서열, 단백질 및 유도체, 올리고펩티드, 젤라틴, 엘라스틴, 피브린, 라미닌, 폴리메타크릴레이트, 폴리아세테이트, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리무수물, 폴리아미노산 탄수화물, 다당류 및 개변된 다당류, 및 이들의 유도체와 공중합체 뿐만 아니라 생체활성 유리와 같은 유리, 세라믹, 실리카, 알루미나, 방해석, 수산화인회석, 인산칼슘, 뼈, 및 이들 모두의 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 중합체 물질로 구성될 수 있다.

본원에 기술된 마이크로-오르가노스피어를 생성하기 위해 사용되는 히드로겔과 더욱 관련하여, 일부 구체예에서, 상기 히드로겔은 아가로스, 알기네이트, 콜라겐 I형, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체(예: Pluronic® F127(BASF Corporation, Mount Olive, NJ)), 실리콘, 다당류, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리우레탄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 구성된다. 일부 구체예에서, 상기 히드로겔은 알기네이트로 구성된다.

본원에 기재된 겔 액적은 또한 생물학적 관련 물질을 포함할 수 있다. "생물학적 관련 물질"이라는 어구는 본원에서 정의된 바와 같은 생체적합성 매체에 포함될 수 있고 이후에 생물학적 시스템과 상호작용 및/또는 그것에 영향을 미칠 수 있는 물질을 기술할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 상기 생물학적 관련 물질은, 상기 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 겔 액적을 생성하기 위해(예를 들어, 겔 액적의 분리 및 정제를 위해) 미중합 물질의 일부로서 결합될 수 있는 자성 비드(즉, 그 자체가 자성이거나 철 입자와 같이 자기장에 반응하는 물질을 포함하는 비드)이다. 다른 예로서, 다른 구체예에서, 상기 생물학적 관련 물질은 분리된 조직 샘플(예를 들어, 생검) 물질에 더하여 추가적인 세포를 함유할 수 있다. 미중합 혼합물에 있어서, 분리된 조직 샘플 및 추가적인 생물학적 관련 물질이 균일한 혼합물 또는 분포된 혼합물로서(예를 들어, 겔 액적의 절반 또는 다른 부분 상에서이며, 형성된 겔 액적의 단지 코어 내에 또는 단지 외부 영역에서를 포함함). 어떤 변형에서는 미중합 물질 내의 추가적인 생물학적 관련 물질은 예를 들어 겔 액적을 형성하는 액적의 중합 이전에 현탁된 분리 조직 샘플과 함께 현탁될 수 있다.

일부 변형에서는, 분리된 조직 샘플(예를 들어, 생검) 물질에 포함될 수 있는 생물학적 관련 물질은 다수의 세포 유형을 함유할 수 있는데, 이에는 전지방세포, 중간엽 줄기 세포(MSC), 내피 전구 세포, T 세포, B 세포, 비만 세포, 및 지방 조직 대식세포 뿐만 아니라 간질 혈관 분획 내에서 발견되는 작은 혈관 또는 미세혈관 단편을 포함한다.

일반적으로, 본원에 기술된 겔 액적에 포함된 물질인 생검과 같은 분리된 조직 샘플과 관련하여, 이들 조직은 전형적으로 생검에 의해 채취된 환자로부터의 임의의 적절한 조직일 수 있다. 비-생검 조직이 사용될 수 있지만, 일반적으로 이러한 조직(및 생성된 분리 세포)은 예를 들어 바늘 생검에 의해 전술한 바와 같이 환자 생검에서 채취한 1차 세포일 수 있다. 조직은 건강한 조직 생검 또는 암성(예: 종양) 세포 생검에서 얻을 수 있다. 상기 분리된 세포는 겔 액적의 의도된 용도에 기초하여 현재 개시된 주제의 겔 액적에 혼입될 수 있다. 예를 들어 관련 조직(예: 분리된 생검 조직)은 해당 조직 또는 기관(또는 종양 등)에서 일반적으로 발견되는 세포를 전형적으로 함유할 수 있다. 이와 관련하여, 현재 개시된 주제의 겔 액적에 포함될 수 있는 예시적인 관련 세포는 뉴런, 심근세포, 근세포, 연골세포, 췌장 선포 세포, 랑게르한스 섬, 골세포, 간세포, 쿠퍼 세포, 섬유아세포, 근모세포, 위성 세포, 내피 세포, 지방 세포, 전지방 세포, 담도 상피 세포 등을 함유한다. 이러한 유형의 조직은 관련 업계에 공지된 통상적인 기술에 의해 분리할 수 있다. 적합한 생검 조직은 골수, 피부, 연골, 힘줄, 뼈, 근육(심장 근육 포함), 혈관, 각막, 신경, 뇌, 위장관, 신장, 간, 췌장(섬 세포 포함), 폐, 뇌하수체, 갑상선, 부신, 림프, 타액, 난소, 고환, 자궁경부, 방광, 자궁내막, 전립선, 외음부 및 식도 조직으로부터 유래할 수 있다. 정상 또는 질병(예: 암) 조직이 사용될 수 있다. 어떤 변형에서는 상기 조직은 이러한 정상 조직에서 발생하는 종양을 포함하여 종양 조직에서 발생할 수 있다.

일단 형성된 겔 액적은 동결보존 및/또는 배양될 수 있다. 배양된 겔 액적은 정지 상태로(예: 웰, 바이알 등) 또는 동적으로(예: 롤링 또는 요동) 유지될 수 있다. 상기 겔 액적은 공지된 배양 기술을 사용하여 배양될 수 있다. 예시적인 기술은 다른 곳들에서 찾을 수 있다: Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Techniques, 4th ed., Wiley Liss, John Wiley & Sons, 2000; Basic Cell Culture: A Practical Approach, Davis, ed., Oxford University Press, 2002; Animal Cell Culture: A Practical Approach, Masters, ed., 2000; and U.S. Pat. Nos. 5,516,681 and 5,559,022.

일부 변형에서, 상기 겔 액적은 분리된 조직 샘플과 유체 매트릭스 물질의 미중합 혼합물(예를 들어, 어떤 변형에서는 냉각된 혼합물)의 액적을 오일에 형성함으로써 형성된다. 예를 들어, 미중합 물질의 스트림(stream)을 오일의 하나 이상의 스트림과 결합하여 액적을 형성함으로써 겔 액적을 형성할 수 있다. 액적에 존재하는 세포의 밀도는 미중합 물질에서 분리된 물질(예를 들어, 세포)의 희석에 의해 결정될 수 있다. 겔 액적의 크기는 형성된 액적의 크기와 관련이 있을 수 있다. 일반적으로 겔 액적은 안정적인 기하학적 구조를 갖는 구형 구조이다.

본 명세서에 개시된 보호 대상의 실시는 달리 나타내지 않는 한 관련 업계의 기술 범위 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재결합 DNA, 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapters 16 and 17; U.S. Pat. No. 4,683,195; DNA Cloning, Volumes I and II, Glover, ed., 1985; Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait, ed., 1984; Nucleic Acid Hybridization, D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984; Transcription and Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984; Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, 1986; Perbal (1984), A Practical Guide To Molecular Cloning; See Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 1987; Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155, Wu et al., eds., Academic Press Inc., N. Y.; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987; Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986를 참조할 것.

본원에서 사용되는 약물 조성물은 임의의 약물, 약물 희석제, 약물 제형, 다중 약물(예를 들어, 다중 활성 성분), 약물 제형, 약물 형태, 약물 농축을 포함하는 조성물, 병용 요법, 등등을 포함할 수 있다. 어떤 변형에서 약물 제형은 약물과 하나 이상의 불활성 성분의 혼합물을 포함하는 제형을 말한다.

배양 동안, 겔 액적 중에서 분리되고 생검된 조직으로부터의 세포는 겔 액적 내에서 응집, 클러스터 또는 조립할 수 있다. 세포 집합체는 고도로 조직화될 수 있고 정의된 형태를 형성할 수 있거나 클러스터로 되거나 함께 부착된 세포 덩어리일 수 있다. 구성화(organization)는 기원 조직을 반영할 수 있다. 어떤 변형에서는 겔 액적은 단일 세포 유형(동형)을 함유할 수 있지만 더 일반적으로 이러한 겔 액적은 하나 이상의 세포 유형(이형)을 포함할 수 있다.

언급한 바와 같이, 겔 액적(예를 들어, 분리된 조직)을 형성하기 위해 사용된 조직(예를 들어, 생검)은 정상 또는 건강한 생물학적 조직으로부터, 또는 질병 또는 병에 걸린 생물학적 조직, 예컨대 종양에서 파생된 조직 또는 체액으로부터 유래될 수 있다. 상기 겔 액적에 사용되는 조직은 T 림프구, B 림프구, 다형핵 백혈구, 대식세포 및 수지상 세포와 같은 면역계의 세포를 포함할 수 있다. 상기 세포는 줄기 세포, 전구 세포 또는 체세포일 수 있다. 상기 조직은 인간 세포와 같은 포유동물 세포 또는 마우스, 래트, 토끼, 등등과 같은 동물로부터의 세포일 수 있다.

일반적으로, 상기 세포는 겔 액적을 형성하기 전에 먼저 서로 분리되거나 분별된다. 세포의 분리는 관련 업계에 공지된 임의의 통상적인 수단에 의해 달성될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 효소로 처리하는 것과 같이 기계적 및/또는 화학적으로 처리된다. '기계적으로'는 예를 들어 메스나 가위를 사용하거나 균질화기와 같은 기계를 사용하여 모여진 세포 간의 연결을 방해하는 의미를 포함한다. '효소적으로'란 예를 들어 임의의 콜라게나제, 디스파제, DNAse 및/또는 히알루로니다제를 포함하는 모여진 세포 사이의 연결을 방해하는 하나 이상의 효소로 세포를 처리한다는 의미를 포함하다. 수조 내 37℃에서 또는 실온에서에서의 배양과 같은 상이한 반응 조건 하에서 하나 이상의 효소를 사용할 수 있다.

상기 분리된 조직은 죽은 및/또는 죽어가는 세포 및/또는 세포 잔해물을 제거하기 위해 처리될 수 있다. 이러한 죽은 및/또는 죽어가는 세포의 제거는 예를 들어 비드 및/또는 항체 방법을 사용하여 통상의 기술자에게 공지된 임의의 통상적인 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 포스파티딜세린은 세포사멸적(apoptotic) 또는 죽은 세포에서 내부 원형질막 첨판에서 외부 원형질막 첨판으로 재분배되는 것으로 알려져 있다. 아넥신 V-비오틴 결합을 사용한 후 비오틴을 스트렙타비딘 자기 비드에 결합하면 살아있는 세포에서 세포사멸 세포를 분별(separation)할 수 있다. 유사하게, 세포 전해물의 제거는 예를 들어 여과를 포함하는 관련 업계의 임의의 적합한 기술에 의해 달성할 수 있다.

상기 분리된 세포는 유체 매트릭스 물질과 결합하기 전에 담체 물질에 현탁될 수 있고/있거나 유체 매트릭스 물질은 담체 물질로 지칭될 수 있다. 어떤 변형에서는 상기 담체 물질은 겔 액적의 중합 및 형성 이전에 세포 현탁액에서 세포의 침강을 지연시키는 점도 수준을 갖는 물질일 수 있다. 담체 물질은 분리된 생검 조직 세포가 중합될 때까지 현탁액에 현탁된 상태로 유지될 수 있도록 충분한 점도를 가질 수 있다. 이를 달성하기 위해 요구되는 점도는 다양한 점도에서 침강 속도를 모니터링하고, 세포를 포함한 미중합 물질의 액적을 중합함으로써 세포 현탁액을 겔 액적을 형성하는 장치에 로딩하는 사이의 예상되는 시간 지연에 대해 적절한 침강 속도를 제공하는 점도를 선택함으로써 통상의 기술자에 의해 최적화될 수 있다. 어떤 변형에서는 세포를 원하는 대로 현탁 및/또는 분포 상태로 유지하기 위해 더 낮은 점도의 물질이 사용되는 경우에도 장치에 의해 상기 미중합 물질은 흐르거나 교반(agitated)될 수 있다.

위에서 언급한 바와 같이, 어떤 변형에서는 분리된 조직 샘플 및 유체 매트릭스 물질을 포함하는 미중합 혼합물은 하나 이상의 구성요소, 예를 들어 생물학적 관련 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 포함될 수 있는 생물학적 관련 물질은 다음 중 임의의 것을 포함할 수 있다: 세포외 기질 단백질(예: 피브로넥틴), 약물(예: 소분자), 펩티드 또는 항체(예: 세포 생존, 증식 또는 분화 중 임의의 것을 조절); 및/또는 특정 세포 기능의 억제제. 이러한 생물학적 관련 물질은 예를 들어 세포 사멸 및/또는 세포 성장/복제의 활성화를 감소시켜 세포 생존력을 증가시키거나 그렇지 않으면 생체 내 환경을 모방하기 위해 사용될 수 있다. 상기 생물학적 관련 물질은 다음 성분 중 하나 이상을 포함하거나 모방할 수 있다: 혈청, 인터루킨, 케모카인, 성장 인자, 포도당, 생리학적 염, 아미노산 및 호르몬. 예를 들어, 상기 생물학적 관련 물질은 유체 매트릭스 물질에서 하나 이상의 제제를 보충할 수 있다. 어떤 변형에서는 상기 유체 매트릭스 물질은 합성 겔(히드로겔)이며 하나 이상의 생물학적 관련 물질로 보충될 수 있다. 어떤 변형에서는 상기 유체 매트릭스는 천연 젤이다. 따라서, 상기 겔은 콜라겐, 피브리노겐, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 히알루론산, 피브린, 알기네이트, 아가로스 및 키토산 중 어느 것과 같은 하나 이상의 세포외 기질 성분으로 구성될 수 있다. 예를 들어, MATRIGEL은 세포 생존, 증식, 발달 및 이동에 중요한 생체 활성 폴리머를 포함한다. 예를 들어, 상기 매트릭스 물질은 래트 꼬리에서 얻은 콜라겐 1형과 같은 콜라겐 1형을 포함하는 겔일 수 있다. 상기 겔은 순수 콜라겐 1형 겔이거나 다른 세포외 매트릭스 단백질과 같은 다른 성분에 더하여 콜라겐 1형을 함유하는 것일 수 있다. 합성 겔은 자연에서 자연적으로 발생하지 않는 겔을 지칭할 수 있다. 합성 겔의 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리하이드록시에틸 메타크릴레이트(PHEMA), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)로부터 유래된 겔을 포함한다.

겔 액적 형성

도 1은 도시된 바와 같이 매트릭스 물질이 구형 겔 액적(103)으로 중합되도록 오일 담체 내의 매트릭스 물질과 분리된 조직 세포를 결합함으로써 형성된 복수의 겔 액적의 일례를 도시한다. 예를 들어, 도 1은 투명하고 미리 정해진 수의 세포(105)를 각각 포함하는 복수의 겔 액적(103)을 함유하는 채널 영역(139)의 일례를 도시한다. 상기 세포는 예컨대 도 2에 도시된 것과 같은 미세유체 장치 내에서 형성될 수 있다. 도 2에서, 상기 미세유체 장치는 접합 영역(237)을 포함하여, 미중합 혼합물(211)을 운반하는 채널이 미중합 혼합물과 섞이지 않는 오일을 운반하는 하나 이상(예를 들어, 2개)의 채널(209)과 교차한다. 미중합 혼합물이 제1 채널(211) 밖으로 제1 속도로 흐르도록 가압됨에 따라, 교차하는 채널(209, 209')에서 흐르는 오일은 미리 정의된 양의 미중합 혼합물이 떨어져나가기 전에 지나가도록 허용하여 출구 채널(239)로 지나가는 액적(203)을 형성한다. 따라서, 어떤 변형에서는, < 1 mm 직경과 같이 다진(예를 들어, 분리된) 임상적(예를 들어, 생검 또는 절제된) 조직 샘플은 온도에 민감한 겔(즉, 4도에서 MATRIGEL)과 혼합되어 미중합 혼합물을 형성할 수 있다. 이 미중합 혼합물은 부피와 물질 조성이 균일한 액적(예: 유중수 액적)을 생성할 수 있는 미세유체 장치에 배치될 수 있다.

동시에, 분리된 종양 세포는 이러한 액적으로 분할될 수 있다. 미중합 물질의 겔은 가열 시(예: 37℃에서) 고화될 수 있으며, 생성된 겔 액적이 형성될 수 있다. 이 겔 액적(여기서는 마이크로-오르가노스피어로 표시됨)은 기존의 3D 세포 배양 기술과 호환된다. 도 3은 오일(308) 중에 현탁되어, 전술한 바와 같이 형성된 복수의 겔 액적(305)을 도시한다.

위에 도시된 예시적인 미세유체 칩에서, 접합부는 미세유체의 흐름 집속이 겔 액적의 제어 가능한 크기를 형성하는 T- 또는 X-접합으로 도시된다. 어떤 변형에서는 미세유체 칩 대신에 액적이 예를 들어 비혼화성 유체 및/또는 고체 또는 겔 기질 상에 로봇 마이크로-피펫팅에 의해 형성될 수 있다.

대안적으로 어떤 변형에서는 미중합 물질의 액적은 마이크로 모세관 생성에 의해 필요한 치수 및 재현성으로 형성될 수 있다. 특정 크기 범위의 겔 액적을 형성하고 미중합 물질로부터의 재현성을 위해 대안적으로 사용될 수 있는 기술의 다른 예는 예를 들어 음향, 자기, 관성, 전기습윤, 또는 중력과 같은 외력을 통한 콜로이드 조작을 포함할 수 있다.

도 4a는 전술한 바와 같이 형성된 오일 내의 겔 액적의 예를 도시한다. 상기 겔 액적은 어세이에 즉시 사용되거나, 배양 및/또는 저장될 수 있다(예: 냉동 보존). 그러나, 특히 배양에서 생존력은 겔 액적에 오일을 포함함으로써 부정적인 영향을 받는 것으로 밝혀졌다. 또한 오일의 존재로 인해 겔 액적을 정확하게 어세이 및/또는 조작하는 것이 어렵거나 불가능할 수 있다. 예를 들어, 오일 내의(또는 일부 오일을 포함하는) 겔 액적은 서로 뭉치거나 클러스터화하여 개별 겔 액적의 단리 및 조작을 방지할 수 있다. 따라서 오일을 제거하는 것이 바람직하다.

도 4b 및 4c는 겔 액적에서 오일을 제거하기 위해 사용될 수 있는 방법의 예를 도시하는데 이러한 기술은 다공성 소수성 표면을 사용하는 본원에 기술된 방법보다 덜 완벽하고 효과적이며 사실상 더 복잡할 수 있다. 예를 들어, 도 4b는 오일을 제거하기 위해 정전기 방지 건이 사용된 겔 액적을 예시한다. 이 예에서는 도 4b에서 볼 수 있는 바와 같이, 오일은 완전히 제거되지 않았고, 또한 생성된 겔 액적(여기에서 별표로 표시됨)이 오일 및 잔해물과 함께 남아 있으며, 이는 아마도 해유화 단계 동안 일부 겔 액적의 파괴로 인한 것일 수 있다. 대안적으로, 도 4c는 화학적 해유화제의 사용을 예시하며, 이 경우 겔 액적에서 오일을 제거하는 데 PFO(10% PFO)가 사용되었다. 이 경우, 해유화제(예를 들어, PFO)는 오일을 제거할 수 있지만, 해유화제는 또한 겔 액적에 대해 관련된 독성을 가질 수 있다. 또한, 연관된 세척/헹굼 단계는 정제 및 가공 단계에 추가적인 시간과 비용을 추가할 수 있다. 도 4C에서, 상기 겔 액적은 유상으로부터 회수되고 예를 들어 PFO(퍼플루오로 옥탄올) 및 원심분리를 통해 PBS로 재현탁된다. 이것은 겔 액적에서 비혼화성 유체를 분별할 수 있다. 따라서 종양 기반 오르가노스피어를 포함한 이러한 겔 액적은 성공적으로 성장할 수 있다.

도 4d는 본원에 기재된 바와 같은 다공성 소수성 표면(예를 들어, 막)을 사용하여 오일을 제거하기 위해 가공된 겔 액적을 도시한다. 도 4에 도시된 바와 같이. 생성된 겔 액적(별표로도 표시됨)은 일반적으로 잔해물이 적고 잔여 오일이 거의 또는 전혀 없는 '더 깨끗한' 것으로 나타난다.

도 5는 다공성 소수성 표면을 사용하여 겔 액적을 형성/및 또는 처리(오일 제거 포함)하는 일반적인 방법의 일례를 도시한다. 도 5에서, 상기 방법은 선택적으로 1차 조직 샘플(또는 겔 액적에 포함될 세포의 다른 소스)로 시작할 수 있고; 상기 조직 샘플은 분리 및/또는 현탁될 수 있다(501). 전술한 바와 같이, 어떤 변형에서는 세포는 개변시킬 수 있다(503). 상기 분리된 세포는 이후 미중합 매트릭스 물질(505)과 결합될 수 있고, 오일 내에서 겔 액적을 형성하기 위해 오일 쪽으로 스트리밍하게 할 수 있고; 결합된 분리 세포(및 임의의 추가 성분)를 갖는 매트릭스 물질은 예를 들어 온도를 증가시킴으로써 상기 기재된 바와 같이 이후에 중합될 수 있다. 이들 단계는 일반적으로 겔 액적(507)을 형성하기 위한 하나의 단계 또는 복수의 단계의 일부일 수 있고, 이러한 단계의 전부 또는 일부는 예를 들어 장치에 의해 자동화될 수 있다.

도 5에 도시된 바와 같이, 상기 오일은 다공성 소수성 표면(예를 들어, 막)(502)을 사용하여 제거될 수 있다. 어떤 경우에는 대부분의 오일을 제거하기 위한 대략적인 방법으로 다공성 소수성 표면에 노출되기 전에 겔 액적으로부터 과잉의 오일을 먼저 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 상기 겔 액적은 회전에 의해 오일의 일부로부터 분리된 후 피펫팅에 의해 오일층(예: 바닥층)을 제거할 수 있다.

대안적으로, 그 안에 현탁된 오일 및 겔 액적은 다공성 소수성 표면과 접촉하도록 직접 배치될 수 있다. 어쨌든, 상기 겔 액적은 아래에서 더 자세히 설명되는 바와 같이 다공성 소수성 막을 사용하여 탈유화될 수 있다. 이 단계는 모든 오일 또는 실질적으로 모든 오일(예: 99% 이상)을 제거할 수 있으며, 빠르고 쉽게 수행할 수 있다.

일단 오일이 제거되면, 상기 겔 액적은 예를 들어 완충제 및/또는 세포 배양 배지(511)를 사용하여 용기로 세척 및/또는 용출함으로써 다공성 소수성 표면(예를 들어, 막)으로부터 분리될 수 있다. 경우에 따라 상기 겔 액적은 즉시 사용할 수 있고; 대안적으로 겔 액적의 전부 또는 일부를 배양(513), 및/또는 동결보존할 수 있다.

또한 본 명세서에서는 이러한 방법 중 임의의 것을 수행할 수 있는 장치에 대해 설명한다. 예를 들어, 도 6은 이들 단계의 전부 또는 일부를 자동화하기 위한 구성요소를 포함할 수 있는 장치의 일례를 도시한다. 예를 들어, 도 6에서, 상기 장치는 복수의 채널을 (예를 들어, 미세유체 칩의 일부로서) 포함할 수 있는 미세유체 구성요소(601)를 포함할 수 있고 미중합 매트릭스, 분리된 세포, 및/또는 오일을 수용하기 위한 하나 이상의 부품(port)을 더 포함할 수 있고 따라서 이들은 상기 도 2를 참조하여 도시되고 설명된 바와 같이 결합할 수 있다. 따라서, 상기 장치는 분리된 세포 및 미중합 매트릭스 물질을 포함하는 분리된 조직 샘플을 수용하도록 구성된 제1 채널, 및 오일을 수용하도록 구성되고 제1 채널과 교차하여 오일 중에 현탁된 중합 겔 액적을 형성하도록 구성된 제2 채널을 포함하여 복수의 채널들을 포함하는 유체 (예컨대, 미세유체) 프로세서를 포함할 수 있다. 상기 프로세서는 또한 장치의 작동을 제어하고 겔 액적의 형성 및 가공을 조절할 수 있는 하나 이상의 마이크로프로세서가 있는 제어기를 포함할 수 있다. 또한, 상기 장치는 유체 프로세서와 유체 연통하고 겔 액적로부터 오일을 제거하도록 구성된 다공성 소수성 표면(예를 들어, 막)(609, 607)을 포함할 수 있는 탈유화 부분(603, 605)을 포함할 수 있다. 마지막으로, 상기 장치는 겔 액적을 다중-웰 플레이트(615)와 같은 하나 이상의 용기로 용출하도록 구성된 용출 채널을 포함할 수 있다.

일반적으로, 상기 탈유화 부분은 소수성 막, 특히 0.1㎛ 내지 500㎛(예를 들어, 0.1㎛ 내지 400㎛, 0.1㎛ 내지 300㎛, 0.1㎛ 내지 250㎛, 0.1㎛ 내지 200㎛, 0.01㎛ 내지 150㎛, 0.01㎛ 내지 100㎛, 등등)의 기공을 갖는 막과 같이 임의의 적합한 다공성 소수성 표면을 포함할 수 있다. 도 6에서, 상기 탈유화 부분은 막으로 또는 막을 통한 흡수에 의해 오일을 제거하기 위하여 겔 액적의 용액(예를 들어, 오일 함유 용액)을 그 위에/그 쪽으로 적용하는 데 사용될 수 있는 깔대기로 형성된 다공성 소수성 막(609)을 상부에 나타낸다. 도 6은 또한 다공성 소수성 막(607)의 영역이 그 안에 배열된 채널(605)을 포함하는 탈유화 부분의 대안적인 구체예를 도시한다. 오일을 포함하는 겔 액적의 용액은 채널의 제1 말단에 적용될 수 있고, 겔 액적을 포함하는 상기 용액은 채널(예를 들어 컬럼 등)을 통해 흐를 수 있는데 이는 수평에 대해 약간(1도 내지 30도) 각도를 이루어 오일을 제거하는 동안 유체가 채널/컬럼 아래로 흘러내릴 수 있다. 어떤 변형에서는 소수성 표면(도 6의 바닥에서 터널(605)로 형성됨)의 각도는 변경될 수 있다.

예를 들어, 도 7은 복수의 겔 액적으로부터 오일을 제거하는 일례를 도시한다. 도 7에서, 0.45㎛의 기공 크기를 갖는 PVDF 전달 막과 같은 소수성 막의 시트가 표면(예를 들어, 테이블의)에 위치하고 다수의 겔 액적("Matrigel 액적 ")가 형성된 오일 500μL이다. 오일의 겔 액적은 막의 표면에 적용되어 오일이 막 쪽으로 및 막을 통해 흡수되도록 하는 반면 상기 겔 액적은 상단에 남는다. 실무상으로는, 상기 겔 액적은 이후 막 상의 겔 액적에 직접 완충액 또는 매질을 1회 이상(예를 들어, 3회) 적용함으로써 선택적으로 세척할 수 있다. 어떤 변형에서는 상기 겔 액적은 세척을 통해 막의 다른 부분으로 이동되어 소수성 막에 의해 오일을 추가로 제거하도록 할 수 있다. 그런 다음 상기 겔 액적은 이 예에서 다중 웰 플레이트(715)로서 표시된 용기 내로 헹굴 수 있다. 이 방법을 분석한 결과 거의 모든 오일(예: 99% 이상)이 이러한 방식으로 제거되는 것으로 나타났다. 또한 이러한 유형의 취급은 겔 액적에 부정적인 영향을 미치지 않는다.

실제로, 화학적 해유화제를 사용하지 않고 겔 액적으로부터 오일을 제거하기 위해 소수성 막으로 가공한 직후의 새로운 겔 액적의 분석은 오일을 제거하기 위해 다른 기술(도 4b-4c에 도시된 것과 같은 것)에 의해 가공된 겔 액적의 경우보다 가공된 겔 액적 내에서의 세포의 전체 생존율이 더 크다는 것을 보여준다. 일반적으로 겔 액적에 남아있는 잔류 오일이 많을수록 겔 액적 중에서 세포의 성장이 적다. 또한, 본원에 기술된 방법은 일반적으로 훨씬 더 빨랐고, 세척 및 세척/헹굼 단계의 반복이 덜 필요했다. 또한 생성된 겔 액적은 겔 액적/세포 잔해가 적고 더 선명하게 보이는 경향이 있다.

예를 들어, 도 8a-8d는 본원에 기술된 가공 방법에 의해 형성된 겔 액적의 일례를 도시하고, 저배율(4X, 도 8a, 8b) 및 고배율(10X, 도 8c 및 8d) 사이의 비교를 가능하게 한다. 도 8a 및 8c에서, 각각의 겔 액적은 하나의 세포를 포함하고 겔 액적은 도시된 바와 같이 모든 오일을 제거하기 위해 세정되었다. 마찬가지로, 도 8b 및 8d는 각각 20 세포를 갖는 겔 액적을 보여준다.

위에서 언급한 바와 같이, 본원에 기술된 바와 같이 형성된 겔 액적은 탈유화 기술 또는 탈유화하지 않는 것과 비교하여 배양에서 시간이 지남에 따라 현저하게 증가된 생존력을 갖는 것으로 나타났다. 이들 방법은 또한 도 9a-11b에 도시된 바와 같이 배양에서 시간 경과에 따라 특히 효과적일 수 있다. 예를 들어, 도 9a-9b는 겔 액적로부터 오일을 제거하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 소수성 막(다공성 소수성 막)의 사용을 포함하는 방법의 예를 도시한다. 도 9a-9c에서, (평균적으로) 1개(도 9a) 또는 20개(도 9b) 세포를 갖는 겔 액적은 형성 2일 후에 저배율(예를 들어, 4x)에서 보여진다. 볼 수 있는 바와 같이, 생성된 겔 액적은 주변 매질을 포함하여 매우 '깨끗'하다. 도 10a-10b는 배양 2일 후 유사한 겔 액적의 약간 확대된 모습을 보여준다.

마지막으로, 도 11a-11b는 배양 3일 후의 유사한 겔 액적을 나타내며, 이는 겔 액적 내에서 광범위하고 강력한 성장을 보여주는 것이다. 도 11a-11b에 나타낸 겔 액적도 10x 배율로 표시된다. 언급한 바와 같이, 상기 겔 액적은 오일을 제거하기 위해 소수성 막에서 세척되었다. 이 오일은 마이크로-오르가노스피어 내의 세포에 대한 손상을 방지하기 위해 Micro-Gel 액적을 형성한 후 비교적 빠르게 제거할 수 있다.

본원에 기술된 방법 및 장치는 겔 액적이 형성될 수 있는 거의 모든 세포 유형에서 일반적으로 작동할 수 있다. 예를 들어, 도 12a-12b, 13a-13b, 14a-14b, 15a-15b, 16a-16b, 17a-17b, 18a-18b, 19a-19b, 20a-20b 및 21a-21b는 모두 겔 액적을 형성하기 위하여 사용되는 상이한 세포 또는 조직 유형을 나타내며, 상기 겔 액적을 위해 겔 액적으로부터 오일을 제거하기 위한, 본원에 기재된 방법이 후속적으로 사용되는 것이다. 예를 들어, 도 12a-12b는 VERO 세포(20 세포/겔 액적)를 도시하고, 도 13a-13b는 293T 세포를 도시하고, 도 14a-14b는 저배율(4x, 왼쪽) 및 고배율(10x, 오른쪽)를 모두 나타내는 293 ACE2 세포를 함유하는 겔 액적을 도시한다. 도 15a-15b는 1 세포/겔 액적에서 CRC19-106 세포를 함유하는 겔 액적을 도시하고, 도 16a-16b는 또한 CRC19-106 세포를 나타내지만, 20개 세포/겔 액적이고, 도 17a-17b는 1 세포/겔 액적을 갖는 CRC19817 세포를 나타내고, 도 18a-18b는 20 세포/겔 액적을 갖는 CRC19178 세포를 함유하는 겔 액적을 예시하는데, 전부 본원에 기재된 바와 같이 소수성 막을 사용하여 오일이 제거된 것이다. 도 19a-19b는 1 세포/겔 액적의 CRC19245 세포를 나타내고, 도 20a-20b는 20 세포/겔 액적의 CRC19245 세포를 나타낸다. 마지막으로, 도 21a-21b는 각각 20 세포/겔 액적을 포함하는 마우스 장 오르가노이드의 저배율 및 고배율을 보여준다.

본원에 기재된 임의의 예에서, 상기 방법은 조직으로부터 배양되거나 단리된 (예를 들어, 분리에 의해) 세포로부터 오르가노스피어 (예를 들어, 미세오르가노스피어)를 형성하는 방법일 수 있다. 샘플은 가공을 위해 수용될 수 있으며 자동화 또는 반자동 시스템을 사용하는 것을 포함하여 매우 온화한 방식으로 가공될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 냉각된, 온도 조절 방식으로 수용 및 가공될 수 있는데, 예컨대 샘플(세포가 유지되는 임의의 매체 포함) 및 액체 기저막 물질의 온도를 세포 가공 온도 또는 온도 범위로 냉각함으로써(예컨대, 25℃ 미만, 20℃ 미만, 19℃ 미만, 18℃ 미만, 17℃ 미만, 16℃ 미만, 15℃ 미만, 14℃ 미만, 13℃ 미만, 12℃ 미만, 11℃ 미만, 10℃ 미만, 9℃ 미만, 8℃ 미만, 7℃ 미만, 약 5-25℃, 약 5-20℃로 냉각), 행하는 것이다. 따라서, 세포는 세포 가공 온도(또는 온도 범위)에서 유지되는 수용액에 현탁될 수 있다. 액체 기저막 물질은 또한 동일한 세포 가공 온도 범위 내에서 유지될 수 있다. 그런 다음 세포를 액체 기저막 매트릭스(MATRIGEL과 같은 것이지만 이에 제한되지 않음)와 결합시킬 수 있다. 액체 기저막 물질은 결합에 의해 소정의 농도로 희석할 수 있다.

액체 기저막 물질의 세포는 이후 오일로 압출함으로써 액적으로 형성할 수 있다. 상기 액적은 결합된 세포 및 액체 기저막 물질의 소정의 양(및/또는 미리 결정된 유속으로)을 오일로 흐르게 함으로써 형성할 수 있다. 상기 오일은 풀(pool) 또는 스트림(stream)일 수 있다. 액적은 액체 기저막 매트릭스의 세포로부터 형성될 수 있으므로 각 액적은 소정량의 세포(예: 1-500개 세포, 1-400개 세포, 1-300개 세포, 1-200개 세포, 1-100 세포, 등등)를 포함한다. 오일 중에 형성된 액적은 이후 온도를 증가시켜 중합할 수 있다. 예를 들어 겔 액적을 중합하기 위하여 상기 온도는 증가시켜 중합에 이르게 할 수 있다(예를 들어, 30℃ 이상, 32℃ 이상, 35℃ 이상, 30-38℃, 32-37도, 등등). 오일의 온도를 높임으로써 온도를 높일 수 있다. 일부 예에서, 동일한 초기 온도에 있고 액적 형성 후에 주변 오일의 온도를 증가시키는 오일에서 세포의 액적과 액체 기저막 물질을 결합하는 것이 유익할 수 있다. 일부 예에서, 세포를 함유하는 기저막 물질의 액적은 세포 가공 온도(또는 세포 가공 온도 범위)보다 높은 온도에 있는 오일에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 오일은 중합 온도에서 유지될 수 있다. 결합된 세포의 액적과 액체 기저막 매트릭스를 가온하면 오일 내의 액체 기저막 매트릭스 물질을 중합할 수 있다. 그 후, 본 명세서에 기술된 바와 같이 오일을 제거할 수 있고, 세포를 배양하여 오르가노스피어(예를 들어, 미세오르가노스피어)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 수성(예를 들어, 배양) 배지를 첨가하기 전에, 수성 배양 배지에서 헹군 후, 또는 위에 기술된 바와 같이 수성 배양 배지를 첨가하는 동안에, 소수성 막을 통해 또는 소수성 막 쪽으로 겔 액적로부터 오일이 제거되도록 액적이 소수성 막과 접촉하도록 배치될 수 있다.

이 과정은 생성된 오르가노스피어(예를 들어, 미세오르가노스피어) 내에서 세포의 생존력을 증가시키는 데 매우 효과적인 것으로 입증되었다. 예를 들어, 오일을 제거하는 다른 방법과 비교하여, 가장 민감한 세포 유형조차 생존력이 20-50% 이상 증가했다.

예를 들어, 도 22a-22c는 유도 만능 줄기 세포로부터 전술한 바와 같이 형성된 오르가노스피어(예를 들어, 미세오르가노스피어)의 예를 도시한다. 유도 만능 줄기 세포(iPSCs)는 매우 약할 수 있다. 도 22a에서, 미세오르가노스피어는 상기 기술된 바와 같이 iPSC로부터 오일에서 형성되었고, 미세오르가노스피어를 소수성 막, 이 예에서는 표면(예를 들어, 채널, 깔때기, 등등) 쪽으로 형성된 폴리비닐리덴 디플로라이드(PVDF)의 시트와 접촉시킴으로써 상기 오일을 제거했는데, 상기 표면을 통해, 수성(예: 매질) 용액을 첨가하기 전이나 후에(또는 도중에) 미세오르가노스피어가 흐를 수 있는 것이다. 3일까지(도 22b에 나타냄) 생성된 미세오르가노스피어의 대부분이 생존 가능했고, 미세오르가노스피어 내의 iPSC는 크기와 수가 증가했다. 도 22c는 7일째 동일한 미세오르가노스피어를 보여준다. 이러한 미세오르가노스피어는 "미니브레인" 구조를 형성할 수 있었다.

본원에 기재된 방법은 배양 및 단리된(예를 들어, 분리된) 세포를 함유하는 다양한 상이한 세포에 대해 일반적으로 성공적이었다. 예를 들어, 도 23a-23j는 인간 부검 조직으로부터 분리된 다양한 상이한 세포 유형에 대해 본원에 기술된 방법의 결과를 예시한다. 도 23a는 부검의 일부로서 제거된 조직 샘플(후각 조직)의 예를 보여준다. 이 조직은 후각 세포를 분리하기 위해 및 하나 이상의 후각 세포 유형으로부터 미세오르가노스피어를 형성하기 위해 본 명세서에 기술된 바와 같이 가공되었다. 예를 들어, 도 23b는 본원에 기술된 바와 같이 단리된 후각 세포로부터 형성된 미세오르가노스피어의 한 예를 보여준다. 본원에 기술된 바와 같이 유사하게 단리되고 가공되어 미세오르가노스피어를 형성하는 다른 세포 유형에는 원위 폐 세포(도 23c), 기관 세포(도 23d), 근위 폐 세포(도 23e), 부비동 세포(도 23f), 식도 세포(도 23g), 장 세포(도 23h) 및 간 세포(도 23i-23j)가 포함된다.

본원에 기술된 방법 및 장치는 종양 세포를 함유하는 분리된 세포와 같은 생물학적 조직을 포함(및 지지)하는 겔 액적의 맥락에서 기술되지만, 이러한 방법 및 장치는 액적 내에 생물학적 조직 유무에 무관하게 임의의 겔 액적을 위해 사용할 수 있음을 이해해야 한다. 특히, 이들 방법 장치는 작은(예를 들어, 직경이 약 2mm 또는 이하(예를 들어, 1.5mm 이하, 1.0mm 이하, 0.9mm 이하, 0.8mm 이하, 0.7mm 이하, 0.6mm 이하, 0.5mm 이하 등등, 50-500㎛, 약 50-600㎛, 약 50-750㎛, 약 50-900㎛, 약 50㎛ 내지 1mm, 등등) 겔 액적을 포함하지만 이에 제한되지 않는 액적 내에서 생물학적 조직 유무에 무관하게 겔 액적 상에서 또는 그 주변에서 오일을 제거하기 위해 유용할 수 있다.

본 명세서에 기술된 임의의 방법(사용자 인터페이스 포함)은 소프트웨어, 하드웨어 또는 펌웨어로 구현될 수 있으며, 프로세서(예: 컴퓨터, 태블릿, 스마트폰, 등등)에 의해 실행될 수 있는 명령어 세트를 저장하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 저장 매체로 기술될 수 있는데, 이는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서가 다음을 포함하되 이에 국한되지 않는 모든 단계를 수행하도록 제어하는 것이다: 디스플레이잉, 유저와의 소통, 분석, 파라미터 개변(타이밍, 빈도, 강도, 등등 포함), 결정, 경고(alerting), 등등.

특징 또는 요소가 본 명세서에서 다른 특징 또는 요소 "상에" 있는 것으로 언급될 때, 그것은 다른 특징 또는 요소 상에 직접 있을 수 있거나 중간에 개입하는 특징 및/또는 요소가 또한 존재할 수 있다. 대조적으로, 특징이나 요소가 다른 특징이나 요소에 "직접" 있는 것으로 언급되는 경우 중간에 개입하는 특징이나 요소가 없다. 또한 특징 또는 요소가 다른 특징 또는 요소에 "연결된", "부착된" 또는 "커플링된" 것으로 언급될 때 다른 특징 또는 요소에 직접 연결, 부착 또는 결합될 수 있거나 또는 개입하는 특징이나 요소가 있을 수 있다. 대조적으로, 특징이나 요소가 다른 특징이나 요소에 "직접 연결된", "직접 부착된" 또는 "직접 커플링된" 것으로 언급될 때, 중간에 개입하는 특징이나 요소가 없다. 하나의 구체예에 대해 기술되거나 도시되었지만, 그렇게 기술되거나 도시된 특징 및 요소는 다른 실시예에 적용될 수 있다. 또한, 다른 특징에 "인접" 배치된 구조 또는 특징에 대한 언급이 상기 인접한 특징과 겹치거나 그 아래에 있는 부분을 가질 수 있음을 통상의 기술자는 이해할 것이다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 구체예를 설명하기 위한 것이며 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 단수형 "한", "하나의" 및 "그"는 문맥상 명백하게 다르게 나타내지 않는 한 복수형도 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 사용된 "포함하다" 및/또는 "포함하는"이라는 용어는 명시된 특징, 단계, 동작, 구성요소 및/또는 구성원의 존재를 특정하지만, 하나 이상의 다른 특징, 단계, 작업, 구성요소, 구성원 및/또는 이들의 군의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다는 것이 더 이해될 것이다. 본 명세서에서 "및/또는"이라는 용어는 관련된 하나 이상의 나열된 항목들의 임의의 및 모든 결합을 포함하며 "/"로 약칭될 수 있다.

"아래", "밑", "하부", "위", "상부" 등과 같은 공간적으로 상대적인 용어는 도면에 도시된 다른 요소(들) 또는 특징(들)에 대한 하나의 요소 또는 특징의 관계성을 쉽게 기술하기 위하여 본 명세서에서 사용될 수 있다. 공간적으로 상대적인 용어는 도면에 묘사된 배향성에 더하여 사용 또는 작동 중인 장치의 다른 방향을 포함하도록 의도된 것임을 이해할 것이다. 예를 들어, 도면의 장치가 뒤집힌 경우, 다른 요소 또는 특징 "아래" 또는 "밑"으로 설명된 요소는 다른 요소 또는 특징 "위"에 배향될 것이다. 따라서 예시적인 용어 "아래"는 "위"와 "아래"의 배향성을 모두 포함한다. 상기 장치는 다른 방향으로 향할 수 있으며(90도 회전 또는 다른 배향으로) 본 명세서에서 사용되는 공간적으로 상대적인 설명자는 이에 따라 해석된다. 유사하게, "위로", "아래로", "수직", "수평" 등의 용어는 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 설명의 목적으로만 본원에서 사용된다.

"제1" 및 "제2"라는 용어가 본 명세서에서 다양한 특징/요소(단계 포함)를 설명하기 위해 사용될 수 있지만, 이러한 특징/요소는 문맥상 달리 나타내지 않는 한 이러한 용어에 의해 제한되지 않아야 한다. 이러한 용어는 하나의 기능/요소를 다른 기능/요소와 구별하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 아래에서 논의되는 제1 특징/요소는 제2 특징/요소로 지칭될 수 있고, 유사하게 아래에서 논의되는 제2 특징/요소는 본 발명의 교시로부터 벗어남이 없이 제1 특징/요소로 지칭될 수 있다.

문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 이어지는 청구범위 전체에서, "포함하다"라는 단어 및 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 다양한 구성요소가 상기 방법 및 물품에서 연합하여 사용될 수 있음을 의미한다(예를 들어, 장치 및 방법을 내포하는 조성물 및 장치). 예를 들어, "포함하는"이라는 용어는 임의의 언급된 요소 또는 단계의 포함을 암시하지만 임의의 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

일반적으로, 본 명세서에 기술된 임의의 장치 및 방법은 포괄적인 것으로 이해되어야 하지만, 구성원 및/또는 단계의 전부 또는 서브세트는 대안적으로 배타적일 수 있고, 다양한 구성원, 단계, 하위 구성원 또는 하위 단계로 "구성된" 또는 대안적으로 "필수적으로 구성된"으로 표현될 수 있다.

실시예에 사용된 것을 포함하여 본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 그리고 달리 명시되지 않는 한, 모든 숫자는 "약" 또는 "대략"이라는 단어가 비록 명시적으로는 나타나 있지 않더라도 그 앞에 붙은 것처럼 읽을 수 있다. 문구 "약" 또는 "대략"은 크기 및/또는 위치를 설명할 때 설명된 값 및/또는 위치가 값 및/또는 위치의 합리적인 예상 범위 내에 있음을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 숫자 값은 명시된 값(또는 값 범위)의 +/- 0.1%, 명시된 값(또는 값 범위)의 +/- 1%, 명시된 값(또는 값 범위)의 +/- 2%, 명시된 값(또는 값 범위)의 +/- 5%, 명시된 값(또는 값 범위)의 +/- 10% 등인 값일 수 있다. 또한 임의의 수치값은 문맥에서 달리 나타내지 않는 한 약 또는 대략 그 해당 값을 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어 값 "10"이 개시되었다면 "약 10"도 또한 개시된 것이다. 본원에 인용된 임의의 수치 범위는 그 안에 포함된 모든 하위 범위를 포함하도록 의도된 것이다. 또한, 통상의 기술자가 적절하게 이해하는 바와 같이, 어떤 값이 그 값 "보다 작거나 같음"으로 개시될 때, "그 값보다 크거나 같음" 및 값들 사이의 가능한 범위도 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 값 "X"가 개시되면 "X보다 작거나 같음"뿐만 아니라 "X보다 크거나 같음"(예: 여기서 X는 숫자 값)도 개시된 것이다. 또한 응용 프로그램 전반에 걸쳐 데이터가 다양한 형식으로 제공되며 이 데이터는 끝점과 시작점, 데이터 포인트의 임의의 결합의 범위를 제공한다는 것을 또한 이해해야 한다. 예를 들어, 특정 데이터 포인트 "10" 및 특정 데이터 포인트 "15"가 개시된 경우, 10 내지 15와 마찬가지로 10 및 15에 초과, 이상, 미만, 이하, 및 동일하게 개시된 것으로 고려된다고 이해된다. 또한 2개의 특정 단위 사이의 각 단위가 또한 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 10과 15가 개시된다면 11, 12, 13, 및 14도 또한 개시된 것이다.

위에서 다양한 예시적인 구체예가 설명되었지만, 청구범위에 의해 기술된 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 구체예에 임의의 다수의 변경이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 설명된 다양한 방법 단계가 수행되는 순서는 대안적인 구체예에서 종종 변경될 수 있고, 다른 대안적인 실시예에서는 하나 이상의 방법 단계가 모두 생략될 수 있다. 다양한 장치 및 시스템 구체예의 선택적 특징은 일부 구체예에 포함될 수 있고 다른 구체예에는 포함되지 않을 수 있다.

따라서, 전술한 설명은 주로 예시적인 목적으로 제공된 것이며 청구범위에 기재된 바와 같이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 명세서에 포함된 실시예 및 예시는 대상이 실시될 수 있는 특정 구체예를 한정이 아닌 예시로서 보여준다. 언급한 바와 같이, 본 개시의 범위를 벗어나지 않고 구조적 및 논리적 대체 및 변경이 이루어질 수 있도록 다른 구체예가 이용되고 그것으로부터 파생될 수 있다. 본 발명의 요지의 그러한 구체예는 본원에서 단지 편의를 위해 그리고 임의의 단일 발명, 또는 사실상 하나 초과로 개시되었다면 발명 개념에 대한 본 출원의 범위를 자발적으로 제한하려는 의도 없이 "발명"이라는 용어에 의해 개별적으로 또는 집합적으로 언급될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서는 특정 구체예가 도시되고 설명되었지만, 동일한 목적을 달성하기 위해 계산된 임의의 배열이 나타낸 특정 구체예를 대체할 수 있다.

본 개시내용은 다양한 구체예의 임의의 및 모든 적용 또는 변형을 커버하는 것으로 의도된 것이다. 상기 구체예의 조합 및 여기에 구체적으로 설명되지 않은 기타 구체예들은 상기 설명을 검토할 때 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

Claims

오일 중에 복수의 겔 액적을 형성하는 단계로서, 여기서 상기 겔 액적은 매트릭스 물질의 중합된 구체 내에 분포된 분리된 조직 샘플 유래의 세포를 함유하고, 상기 겔 액적은 그 안에 분포된 세포를 가지는 것인 단계; 및
오일이 소수성 막을 통해 또는 소수성 막 쪽으로 제거되도록 소수성 막에 대해 겔 액적을 접촉시키는 단계
를 포함하는, 세포를 함유하는 겔 액적을 가공하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 겔 액적은 직경이 50 - 500㎛인 마이크로-오르가노스피어를 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 소수성 막에 대해 상기 겔 액적을 접촉시키는 단계는 상기 겔 액적으로부터 상기 오일의 99% 이상을 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 소수성 막에 대해 상기 겔 액적을 접촉시키는 단계는 상기 소수성 막에 의해 적어도 부분적으로 형성된 챔버를 통해 오르가노이드를 통과시키는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 챔버는 소수성 막에 의해 형성된 터널 또는 튜브를 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 소수성 막에 대해 겔 액적을 접촉시키는 단계는 상기 겔 액적을 상기 소수성 막에 의해 형성된 깔대기 쪽으로 용출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 소수성 막에 대해 상기 겔 액적을 접촉시키는 단계는 상기 소수성 막에 대해 상기 겔 액적을 여과하는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 소수성 막에 대해 상기 겔 액적을 접촉시키는 단계는 상기 소수성 막 위로 상기 겔 액적을 포함하는 용액을 통과시키는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 소수성 막은 0.1 내지 5㎛의 기공 크기를 갖는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 소수성 막에 대해 상기 겔 액적을 접촉시키는 단계는 겔 액적을 수성 매질에 보유하는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 겔 액적은 각각 그 안에 분포된 1 내지 200개의 세포를 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 소수성 막 상의 상기 겔 액적을 수성 매질로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 겔 액적을 배양 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
오일 중에 복수의 겔 액적을 형성하는 단계로서, 여기서 상기 겔 액적은 매트릭스 물질의 구체 내에 분포된 분리된 조직 샘플 유래의 세포를 포함하고, 상기 겔 액적은 1 내지 200개의 세포가 그 안에 분포된, 50 내지 500㎛의 직경을 갖는 것인 단계; 및
상기 오일의 적어도 98%가 상기 소수성 막 위 또는 내부로, 상기 겔 액적로부터 제거되도록 소수성 막에 대해 상기 겔 액적을 접촉시키는 단계; 상기 소수성 막 위의 겔 액적을 수성 매질로 세척하는 단계; 및 상기 겔 액적을 배양 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 겔 액적을 가공하는 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 겔 액적이 직경이 50 - 500㎛인 마이크로-오르가노스피어를 포함하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 소수성 막에 대해 상기 겔 액적을 접촉시키는 단계는 상기 겔 액적으로부터 오일의 99% 이상을 제거하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 소수성 막에 대해 상기 겔 액적을 접촉시키는 단계는 상기 소수성 막에 의해 적어도 부분적으로 형성된 챔버를 통해 오르가노이드를 통과시키는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 챔버는 상기 소수성 막에 의해 형성된 터널 또는 튜브를 포함하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 소수성 막에 대해 상기 겔 액적을 접촉시키는 단계는 상기 소수성 막에 의해 형성된 깔대기 쪽으로 상기 겔 액적을 용출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 소수성 막에 대해 상기 겔 액적을 접촉시키는 단계는 상기 소수성 막에 대해 상기 겔 액적을 여과하는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 소수성 막에 상기 겔 액적을 접촉시키는 단계는 상기 겔 액적을 포함하는 용액을 상기 소수성 막 위로 통과시키는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 소수성 막은 0.1 내지 5㎛의 기공 크기를 갖는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 소수성 막에 대해 상기 겔 액적을 접촉시키는 단계는 상기 겔 액적을 수성 매질에 보유하는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 소수성 막 상의 상기 겔 액적을 수성 매질로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
분리된 세포 및 미중합 매트릭스 물질을 포함하는 분리된 조직 샘플을 수용하도록 구성된 제1 채널, 및 오일을 수용하고 제1 채널과 교차하여 상기 오일 중에 현탁된 중합된 겔 액적을 형성하도록 구성된 제2 채널을 포함하는, 복수의 채널을 포함하는 유체 프로세서;
상기 유체 프로세서와 유체 소통하는 소수성 막을 포함하고 상기 겔 액적으로부터 오일을 제거하도록 구성된 해유화부(demulsifying portion); 및
수용액을 사용하여 상기 해유화부로부터 상기 겔 액적을 용출하도록 구성된 용출 채널을 포함하는, 겔 액적을 형성하기 위한 장치.