CN115917005A - 用于纯化支持生物组织的凝胶液滴的方法和设备 - Google Patents

用于纯化支持生物组织的凝胶液滴的方法和设备 Download PDF

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Abstract

本发明描述了用于形成包括生物组织(例如细胞)的凝胶液滴的方法和设备,特别是用于从包括解离细胞(包括微有机球)的凝胶液滴中去除油的方法和设备。虽然在这些凝胶液滴的形成中使用油是有益的，特别是微有机球，但油可能会抑制凝胶液滴内细胞的生长和存活。本发明提供的方法和设备可以去除油并且可以提高所得凝胶液滴的存活率和质量。

Description

用于纯化支持生物组织的凝胶液滴的方法和设备
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年8月26日提交的专利申请号为63/070,334、标题为“用于支持生物组织的凝胶滴的纯化方法和装置”的美国临时申请，和2021年4月19日提交的专利申请号为17/233,950、标题为“用于支持生物组织的凝胶滴的纯化方法和装置”的美国非临时申请的优先权，其中的内容在此以全文引用的方式纳入。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物和专利申请在此通过引用被完整地纳入，其程度与每一份出版物或专利申请都具体而单独地指出将通过引用纳入一样。
技术领域
本发明所述的方法和装置涉及用于形成凝胶液滴的方法和装置，凝胶液滴包括生物组织（例如有机球、例如微有机球、类器官、微类器官等）。具体地说，本发明描述了用于形成这些凝胶液滴的方法和装置，包括除去可能以其他方式抑制或损害凝胶液滴内细胞的油。
背景技术
模型细胞和组织系统对生物学和医学研究很有用。最常见的做法是从组织中获得永生化细胞系，并在二维（2D）条件（例如，在培养皿或孔板中）下对其进行培养。然而，尽管2D细胞系对基础研究非常有用，但它与个体患者对治疗的反应并没有很好的相关性。特别是，三维细胞培养模型被证明在发育生物学、疾病病理学、再生医学、药物毒性和疗效测试以及个性化医疗方面特别有帮助。例如，椭球体和类器官是已经研究过的三维细胞集合体。
70年代初首次描述了多细胞肿瘤球体，并在非粘附条件下通过培养癌细胞株获得。球状体通常由癌细胞系形成，作为自由漂浮的细胞聚集在超低附着板中。球状体已被证明比2D细胞培养保持更多的干细胞相关特性。
类器官是体外衍生的细胞聚集物，包括可以分化成主要细胞系的干细胞群。类器官通常直径超过1毫米，并通过传代培养。类器官培养的生长和扩张通常比2D细胞培养慢。
近年来，微型类器官已被开发出来，可用于快速且可靠的筛查，特别是用于个性化药物，如进行药物反应的体外试验。与传统类器官或肿瘤球体相比，微型器官可能更小，形状和细胞数量更均匀，并且可能包含更少的细胞数量。
然而，为了方便起见，所有这些类型的类器官（传统类器官、球状体和微有机球），这里可以称为“有机球”，通常都使用油形成。例如，类器官可以通过将未聚合的基质材料（例如基质基底膜基质，如MATRIGEL）与解离的组织（如肿瘤组织）混合，然后将该混合物在不混溶的载体液（如油）流或浴中聚合成球体来形成。虽然油有助于形成球体，但油可能会抑制有机球内细胞的生长。油可以通过反复冲洗来被清洗，但是这样的冲洗并不能有效地去除所有的油，而且可能需要更长的时间，在此期间细胞仍然暴露在油中。
一种乳化失稳剂，如全氟辛醇(PFO)已被用于从有机球中去除油。PFO还可能破坏有机球内细胞的生长和活力。所需要的是从有机球，特别是从微有机球中去除油的方法和设备。本文所述的方法和设备可以解决这一需要。
发明内容
本文描述了形成含有生物组织的凝胶液滴的方法和装置。特别是，本文描述了用于在凝胶液滴形成后不久或立即从凝胶液滴中去除油的方法和装置。本文所述的方法和设备可以使用基于膜的破乳作用，例如，使用疏水膜从凝胶液滴中除去油。这些方法和设备可以非常快速有效地去除油（例如，凝胶液滴上或周围超过99%的油）。这些方法和设备可在不使用化学破乳剂（例如，全氟辛醇，PFO）的情况下进行，因此对凝胶液滴内细胞的毒性可大大降低。这些方法和设备已被证明为凝胶液滴提供了可存活的生物组织，具有极高的回收率（凝胶液滴损失小于5%），并且可以自动化。所得到的凝胶液滴可以培养和/或立即使用或在培养后用于进行一种或多种分析，包括筛选、药物毒性等分析。
通常，本文所述的方法和装置可包括形成包括生物组织的凝胶液滴。这些凝胶液滴在这里可被称为有机球，并且可以包括（但不限于）可能与油或在油中形成的任何凝胶液滴，例如特定的微有机球、微类器官、微球状体，以及在某些情况下类器官和/或球状体。本文描述的支持生物组织（例如，解离的细胞）的任何凝胶液滴可包含来自患者和/或组织培养的细胞。例如，细胞可从小的患者活检组织中提取（例如，用于快速诊断以指导治疗），从切除的患者组织中提取，包括切除的原发肿瘤或功能障碍器官的一部分（例如，用于高通量筛选），和/或从已经建立的PDMC中提取，包括患者来源的异种移植（PDX）。这些凝胶液滴可以由正常的原代细胞(例如，正常的器官组织)或肿瘤组织形成。例如，在某些变体中，这些方法和设备可能会从癌性肿瘤活检组织中形成凝胶液滴，从而能够使用所检查的特定肿瘤组织选择定制的治疗方法。
凝胶液滴可以是但不限于微有机球。例如，从患者活检组织分离的原代细胞可与流体基质材料（如基质基底膜基质(如MATRIGEL）)结合，以形成凝胶液滴（如微器官球）。微器官球可具有预先确定的大小范围（例如直径，例如在10μm至700μm之间以及在此范围内的任何子范围）和原代细胞的初始数量（例如，在1至1000之间，特别是较低数量的细胞，例如在1-200之间）。细胞数和/或直径可控制在例如+/- 5%、10%、15%、20%、25%、30%等范围内。这些微有机球，当按本文所述形成时，可以在很短的时间内稳定地用于使用和测试，包括在形成后的几分钟、几小时或几天内，特别是因为它们可以不含油和/或破乳剂（例如，PFO）。这可能使快速测试成为可能。本文描述的凝胶液滴可以更牢固地形成3D细胞结构，复制并对应于它们所取自的组织环境，例如三维（3D）肿瘤微环境。
特别地，本文描述了处理包括生物组织（例如，细胞）在内的凝胶液滴的方法，例如处理有机球或微有机球的方法。这些方法中的任何一种都可以包括:在油中形成多个凝胶液滴，其中凝胶液滴包括来自分散在基质材料的聚合球体内的解离组织样品的细胞，凝胶液滴具有分布在其中的细胞；以及将所述凝胶液滴与疏水膜接触，使所述油通过或进入所述疏水膜从所述凝胶液滴中除去。
所述的凝胶液滴可包括直径在50-500μm之间的微有机球。这些方法中的任何一种都可以包括当凝胶液滴与疏水膜接触时从凝胶液滴中去除至少99%的油。
例如，在疏水膜上接触凝胶液滴可包括使凝胶液滴通过一个至少部分由疏水膜形成的腔室(例如，管、通道等)。所述腔室可包括由所述疏水膜形成的通道或管。在任何这些方法中，负压(例如，可选地施加在膜的一侧的真空，和/或将包括凝胶液滴的溶液驱动到膜上。或者，在任何这些变型中，凝胶液滴可以仅仅是与疏水膜接触，而不需要施加力，包括施加负压。
例如，在一些变型中，将凝胶液滴与疏水膜接触包括将凝胶液滴洗脱到由疏水膜形成的漏斗中。所述凝胶液滴与疏水膜的接触可包括过滤所述凝胶液滴与疏水膜的接触。通常，凝胶液滴对疏水膜的接触可包括将包含凝胶液滴的溶液穿过疏水膜。
可以使用任何适当的多孔疏水表面，包括但不限于疏水“膜”。例如，疏水表面(例如，膜)的孔径可介于0.1至5μm之间(例如，介于约0.1至2μm之间，约0.2至4μm之间，约0.1至1μm之间，约0.3至3μm之间，等等)。多孔疏水表面的表面纹理可能是粗糙的而不是光滑的。
通常，将凝胶液滴与疏水膜接触可包括将凝胶液滴保留在水介质中。例如，凝胶液滴可与多孔疏水表面一侧的含水缓冲液/介质一起保留，而油则进入或通过多孔疏水表面。
如上所述，本文所述的用于形成和/或处理凝胶液滴的任何方法和设备可用于类器官、球状体或微器官球。例如，在某些变型中，每个凝胶液滴可包括分布在其中的1至200个细胞。
这些方法中的任何一种都可以包括用水介质清洗疏水膜上的凝胶液滴。凝胶液滴（例如微有机球）可以通过在膜上添加水溶液（例如缓冲液，如PBS、培养基等）来清洗，或向液滴添加额外的水溶液并将其重新暴露在疏水膜上。在一些例子中，液滴可以与水溶液结合，在液滴与疏水膜接触之前进行冲洗，然后在疏水膜上使用额外的水溶液进行冲洗。另外，可以将水溶液添加到液滴中，液滴可能再次暴露在疏水膜上(或新的疏水膜，或同一疏水膜的新区域)。在某些例子中，可以进行多次冲洗/洗涤，并与一个或多个疏水膜接触。在这种情况下，可以使用不同性质的疏水膜。该方法可能包括在培养基中培养组织。
例如，一种处理凝胶液滴的方法可以包括：在油中形成多个凝胶液滴，其中凝胶液滴包括来自分散在基质材料球体内的解离组织样品的细胞，所述凝胶液滴直径在50至500μm之间，其中分布有1至200个细胞；以及将所述凝胶液滴与疏水膜接触，使所述油至少98%从所述凝胶液滴进入所述疏水膜上或内部；用水介质清洗疏水膜上的凝胶液滴；在一种培养基中培养组织。
本文所述的任何方法都可以包括将解离的原代组织细胞（包括但不限于癌症/异常组织、正常组织等）与液体基质材料结合以形成未聚合的材料，然后将未聚合的材料聚合以在油或油乳液中形成凝胶液滴（例如，微有机球）；然后，这些方法可以使用疏水表面或膜来去除凝胶液滴中的油。
本文还描述了配置为执行这些方法中的任何一种的设备。例如，本文描述了用于形成凝胶液滴的装置，该装置包括：包含多个通道的流体处理器，包括：配置为接收包含解离细胞和未聚合基质材料的解离组织样本的第一通道，和配置为接收油并与第一通道相交以形成悬浮在油中的聚合凝胶液滴的第二通道；破乳部分，包括与流体处理器流体连通的疏水膜，并配置为从凝胶液滴中除去油；以及洗脱通道，其配置为使用水溶液从所述破乳部分洗脱所述凝胶液滴。
当凝胶液滴是微有机球时，微有机球的直径通常小于约1000μm (例如，小于约900μm，小于约800μm，小于约700μm，小于约600μm，特别是小于约500μm)，游离的初级组织细胞分布在其中。如上所述，在任何这些凝胶液滴中，分离细胞的数量可以在预先确定的范围内(例如，约1至约500个细胞之间、约1-200个细胞之间、约1- 150个细胞之间、约100个细胞之间、约1-75个细胞之间、约1-50个细胞之间、约1-30个细胞之间、约1-10个细胞之间、约5-15个细胞之间、约20-30个细胞之间、约30-50个细胞之间、约40-60个细胞之间、约50-70之间、约60-80之间、约70-90之间、约80-100之间、约90-110之间等，包括约1间、约10间、约20间、约30间、约40间、约50间、约60间、约70间等)。这些方法中的任何一种都可以按照本文所述进行配置，以产生可重复大小的凝胶液滴(例如，具有狭窄的大小分布)。
解离的细胞可新鲜活检，并可以任何适当的方式解离，包括机械和/或化学解离(例如，通过使用一种或多种酶，如胶原酶、胰蛋白酶等进行酶解)。可选择性地对分离细胞进行处理、选择和/或修改。例如，可以对细胞进行分类或选择，以识别和/或分离具有一种或多种特征(例如，大小、形态等)的细胞。这些细胞可以被标记(例如，用一个或多个标记)，用于帮助选择。在一些变型中，可以通过已知的细胞分选技术对细胞进行分选，包括但不限于微流体细胞分选、荧光激活细胞分选、磁激活细胞分选等。或者，细胞可以在不进行分选的情况下使用。
在某些变型中，解离的细胞可通过一种或多种制剂处理而被修饰。例如，细胞可能经过基因改造。在某些变型中，细胞可能使用CRISPR-Cas9或其他基因编辑技术进行修饰。在某些变型中，细胞可以通过任何适当的方法转染(例如，电穿孔、细胞挤压、纳米颗粒注射、磁感染、化学转染、病毒转染等)，包括转染质粒、RNA、siRNA等。或者，细胞可以不进行修改的情况下使用。
一种或多种附加材料可与所述解离细胞和流体(例如，液体)基质材料结合以形成未聚合的混合物。例如，所述未聚合的混合物可包括附加的细胞或组织类型，包括支持细胞。附加的细胞或组织可能来源于不同的活检组织(例如，来自不同分离组织的原代细胞)和/或培养细胞。附加的细胞可以是，例如免疫细胞、基质细胞、内皮细胞等。所述附加材料可包括培养基(如生长培养基、冷冻培养基等)、生长因子、支持网络分子(如胶原蛋白、糖蛋白、细胞外基质等)等。在一些变型中，所述附加材料可包括药物组合物。在一些变型中，所述未聚合的混合物仅包括解离的组织样品(例如，原代细胞)和流体基质材料。
例如，在某些变型中，这些方法可以通过将未聚合的基质混合物与未聚合材料不混溶的油(例如液体材料)结合来执行。所述方法和装置可以通过至少部分地控制一种或多种未聚合基质混合物(例如，解离组织和流体基质)以及具有未聚合混合物的油的流动来控制凝胶液滴的大小和/或细胞密度。在聚合之后，通常在油内，凝胶液滴可以被清洗(例如，在水介质中，如缓冲盐水(例如，磷酸盐缓冲盐水)和/或在细胞培养基中)以去除一些油，和/或凝胶液滴可以暴露在多孔的疏水表面，特别是疏水膜的表面。所述油可以通过或进入多孔疏水表面(例如，进入或通过疏水膜)从凝胶液滴中除去。凝胶液滴可通过用缓冲溶液和/或介质漂洗、洗涤、冲洗等方法从疏水表面分离或除去。
在某些变型中，这些方法可以使用微流体装置来执行。在某些变型中，可以使用一个或多个微流体腔室和/或通道(包括流动通道)在油中形成多个凝胶液滴(例如，微有机球)。可以配置腔室、通道或其他部分以从凝胶液滴中除去油。例如，除油部分可以包括包含多孔疏水表面(例如膜)的通道或腔室，凝胶液滴可以放置在该多孔疏水表面上进行接触，包括通过流动与疏水表面接触。凝胶液滴可被驱动(例如，流过)在疏水表面上和/或允许在疏水表面上停留一段时间(例如，x秒或分钟，如1秒、2秒、3秒、5秒、10秒、30秒、60秒、120秒、3分钟、4分钟、5分钟等)。同一装置可以包括多个平行通道，包括用于除油的平行通道。
一旦从凝胶液滴中除去油，凝胶液滴可以立即使用，和/或可以存储(例如，冷冻)和/或可以允许生长，例如，通过培养。凝胶液滴可以在培养前或培养后进行测定和/或在培养前或培养后进行冷冻保存。凝胶液滴可以培养任何适当的时间长度，但具体地说，可以培养1天至10天之间(例如，1天至9天之间、1天至8天之间、1天至7天之间、1天至6天之间、3天至9天之间、3天至8天之间、3天至7天之间，等等)。所得到的凝胶液滴可以基本上不含油和/或不含破乳剂，如PFO。
所述基质材料可以是合成的或非合成的未聚合基膜材料。在某些变型中，未聚合的基底材料可包括聚合水凝胶。在某些变型中，流体基质材料可包括MATRIGEL。因此，所述解离组织样品与流体基质材料的结合可包括所述解离组织样品与基底膜基质的结合。组织样品可在从患者体内取出组织样本后6小时内或更短时间内与流体基质材料结合(例如，约5小时内、约4小时内、约3小时内、约2小时内、约1小时内，等等)。
在本文所述的任何方法和设备中，可以使用疏水材料(珠、表面等)来除去油，而不是或除了疏水膜之外。例如，液滴(例如，微有机球)可以被涂有疏水材料的表面接触以去除油，和/或包括由疏水材料形成的珠的弧形。
附图说明
本发明的新颖性特征在下面的权利要求书中特别地阐述。通过参考以下详细的描述来更好地理解本发明的特征和优点，该详细描述列出了使用本发明原理的说明性实施例，以及其附带的附图: 图1显示聚合后不久的多个凝胶液滴(在本实施例中，患者来源的微有机球)，悬浮在含有油的通道内。 图2是用于形成凝胶液滴的装置的原型微流体组件的一部分图像，特别是微型有机球，说明了微型有机球的形成。 图3显示出聚合后不久，悬浮在油中的多个凝胶液滴。 图4A显示出凝胶液滴形成后不久油内的多个凝胶液滴的示例。图4B显示了使用抗静电枪除油的凝胶液滴，与其他除油 (例如破乳) 技术进行比较，显示了一些凝胶液滴，但有额外的油和相关碎片。星号表示由解离细胞组成的凝胶液滴。 图4C显示了使用10% PFO去除油后的凝胶液滴，如前所述。星号表示由分离细胞组成的凝胶液滴。 图4D显示了使用本文所述的多孔疏水表面(例如，膜)去除油后的凝胶液滴。星号表示由分离细胞组成的凝胶液滴。 图5图示了本文所述的用于处理凝胶液滴的方法的一个示例，包括使用多孔疏水表面从凝胶液滴中除去油。 图6图示地说明了如本文所述的配置为形成凝胶液滴的装置的一个示例，包括从凝胶液滴中除去油。在图6中，说明了使用多孔疏水表面的两种单独的技术和结构(例如漏斗和管)。 图7示出了本文所述的手动使用疏水表面从凝胶液滴中除去油的一种方法。 图 8A-8D 说明了在使用疏水膜破乳凝胶液滴后回收的新形成的凝胶液滴(例如,本实施例中的微有机球)的例子。图8A显示了在低倍率(4x)物镜下多个1细胞/液滴凝胶液滴的视图。图8B显示了在低倍率(4x)物镜下多个20个细胞/液滴的凝胶液滴的视图。图8C显示具有1个细胞/液滴的凝胶液滴的更高(例如,10x)放大倍数，使用疏水膜从中去除油。图8D显示了在如本文所述去除油后具有20个细胞/液滴的凝胶液滴的更高(例如,10x)放大倍数。 图9A和9B显示了与图8A-8B中所示相似的具有1个细胞/液滴(图9A)或20个细胞/液滴(图9B)的凝胶液滴的例子，在使用如本文所述的疏水膜去除油后两天。 图10A和10B 显示了与图8C-8D中所示相似的具有1个细胞/液滴(图10A)或20个细胞/液滴(图10B)的凝胶液滴的例子,在使用本文所述的疏水膜去除油后两天。 图11A和1IB显示了与图8C-8D中所示的那些相似的具有1个细胞/液滴(图 11A)或20个细胞/液滴(图11B) 的凝胶液滴的实例，在使用疏水性去除油后三天 如本文所述的膜。 图12A-12B分别以4x(图14A)或10x(图14B)放大倍率显示了由具有20个细胞/液滴的VERO细胞形成的凝胶液滴的实例。 图 13A-13B 分别以 4x(图 13A)或 10x(图 13B)放大倍率显示了由具有20 个细胞/液滴的 293T 细胞形成的凝胶液滴的例子。 图14A-14B 分别以 4 倍(图 14A)或 10 倍(图 14B)放大倍数显示了由具有 20 个细胞/液滴的 293 ACE2 细胞形成的凝胶液滴的例子。 图15A-15B分别在4x或10x(图15B)放大倍数下显示了由具有1个细胞/液滴(图15A)的CRC19-106细胞形成的凝胶液滴的例子。 图16A-16B分别在4x(图16A)或10x(图16B)放大倍数下显示由具有20个细胞/液滴的CRC-1916细胞形成的凝胶液滴的实例。 图17A-17B分别在 (图17A)或10x(图17B)放大倍数下显示由具有1个细胞/液滴的CRC19817细胞形成的凝胶液滴的实例。 图18A-18B分别以4x(图18A)或10x(图18B)放大倍率显示由具有20个细胞/液滴的CRC19187细胞形成的凝胶液滴的实例。 图19A-19B分别以4倍或10倍(图19B)的放大倍率显示了由具有20个细胞/液滴(图19A)的 CRC 19245 细胞形成的凝胶液滴的示例。 图20A-20B分别在4x或10x放大倍数下显示了由具有1个细胞/液滴(图20A)或20个细胞/液滴(图20B)的VERO细胞形成的凝胶液滴的例子。 图21A-21B分别在4x或10x放大倍数下显示了具有20个细胞/液滴(图21A)或20个细胞/液滴(图21B)的小鼠肠类器官形成的凝胶液滴的例子。 图22A-22C说明了使用本文所述的方法从诱导性多能干细胞(iPSC)形成的微有机球的实例。图22A显示了形成后不久的液滴(微有机球)。图22B显示了形成三天后的微有机球。图22C显示了第 7 天的 iPSC 微有机球。 图23A-23F图示了如本文所述从多种尸体(尸检)组织成功形成的微有机球(“凝胶滴”)。图23A显示可如本文所述用于形成微有机球的组织样本；在图23A中，组织是嗅觉组织。图23B显示了由图23A所示的组织形成的微有机球的例子。图23C显示了使用远端肺组织形成的微有机球的例子。图23D显示了使用气管组织形成的微有机球的例子。图23E显示了使用近端肺组织形成的微有机球的例子。图23F显示了使用鼻窦粘膜形成的微有机球的例子。 图23H显示了使用食道组织形成的微有机球的例子。图23I显示了使用肠组织形成的微有机球的例子。图23J和23J显示了使用肝组织形成的微有机球的例子。如本文所述，图23B-23K中所示的微有机球已在形成和去除油后培养7-20天。
详细说明
一般而言，本文描述的是用于制备凝胶液滴的方法和设备，包括例如微有机球，其包括构造成通过使用多孔表面从凝胶液滴中去除油的步骤和/或结构。
本文所述的凝胶液滴通常可以是由分布在基底材料内的解离原代细胞形成的球体。这些凝胶液滴的直径配置为例如约50 μm和约500 μm之间(例如，约50 μm和约400μm之间、约50 μm和约300 μm之间、约50 μm和约 250 μm等)，并且可包含分布在基底材料内的约1 至1000 个解离原代细胞(例如约 1 至 750、约 1 至 500、约 1 至 400、约 1 至 300、约1至200之间、约1至150之间、约1至100之间、约1至75之间、约1至50之间、约1至40之间、约1至30之间、约1至20之间等。)。
使用疏水表面(例如但不限于疏水膜)去除油，可以提供可立即使用或培养一段非常短的时间(例如14 天或更短时间、10 天或更短时间、7 天或更短时间、5 天或更短时间等)的凝胶液滴，并且可能允许凝胶液滴内的细胞存活，同时维持大部分(如果不是全部的话)组织的特征，包括从中提取它们的肿瘤组织。当使用多孔疏水表面(如膜)去除凝胶液滴中的油时，凝胶液滴内的细胞存活率非常高，凝胶液滴可通过多次传代培养数天(或数周)，在此过程中细胞将分裂、聚集并形成类似于亲本组织的结构。
本文描述的凝胶液滴(例如液滴形成的微有机球)可以例如从已经解离并悬浮在基底基质(例如MATRIGEL)中的源自患者的肿瘤样品形成。凝胶液滴可以图案化到微流体微孔阵列上，进行孵育，并与药物化合物一起给药。这种小型化检测最大限度地利用了肿瘤样本，并能够以更低的每个样本成本从核心活组织检查中筛选出更多的药物化合物。
本文件中阐述了当前公开主题的一个或多个实施例的细节。在研究了本文档中提供的信息之后，对本文档中描述的实施例和其他实施例的修改对于本领域的普通技术人员来说将是显而易见的。本文件中提供的信息，尤其是所描述的示例性实施例的具体细节，主要是为了清楚理解而提供的，不应从中理解不必要的限制。如有冲突，以本文的描述(包括定义)为准。
虽然本文使用的术语被认为是本领域的普通技术人员很好地理解，但本文规定了定义以方便解释目前公开的主题。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本公开主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法、装置和材料可用于实践或测试当前公开的主题，但现在描述代表性的方法、装置和材料。
术语“未聚合的混合物”在本文中用于指包含生物相关材料的组合物,包括解离的组织样品和第一液体基质材料。所述液体基质材料通常是一种可以聚合以形成分散在其内的解离组织(细胞)的支撑物或支撑物网络的材料。一旦聚合，所述聚合材料可形成水凝胶并且可形成或和/或可包括形成生物相容性介质的蛋白质，以及细胞。根据目前公开的主题使用的合适的生物相容性介质通常可以由任何生物相容性材料形成，该材料在室温下(例如25℃)，可用作细胞、组织、蛋白质和其他感兴趣的生物材料的三维底物。根据目前公开的主题，可用于形成生物相容性介质的示例性材料包括但不限于包含胶原蛋白、纤维蛋白、壳聚糖、MATRIGEL™(BD Biosciences, San Jose, CA)的聚合物和水凝胶、聚乙二醇、葡聚糖、包括可化学交联或可光交联的葡聚糖等，以及电纺生物、合成或生物-合成共混物。在一些实施例中，生物相容性介质由水凝胶组成。
术语“水凝胶”在本文中用于指包含聚合物链的三维网络的双组分或多组分凝胶，其中水充当分散介质并填充聚合物链之间的空间。根据目前公开的主题使用的水凝胶通常根据结构的预期用途选择用于特定应用，同时考虑将用于形成凝胶液滴的参数，以及所选择的水凝胶将对纳入到结构中的生物悬浮液中的生物材料(例如细胞)的行为和活性的影响。目前公开的主题材料的示例性水凝胶可以由聚合物材料组成，包括但不限于：藻酸盐、胶原蛋白(包括 I 型和 VI 型胶原蛋白)、弹性蛋白、角蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、聚乳酸、聚乙二醇、聚己内酯 、聚交酯、聚二恶烷酮、聚丙烯酸酯、聚氨酯、聚砜、肽序列、蛋白质和衍生物、寡肽、明胶、弹性蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白、聚甲基丙烯酸酯、聚乙酸酯、聚酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酸酐、聚氨基酸碳水化合物、多糖和改性多糖，以及它们的衍生物和共聚物以及无机材料，例如玻璃，如生物活性玻璃、陶瓷、二氧化硅、氧化铝、方解石、羟基磷灰石、磷酸钙、骨以及所有前述的组合。
进一步关于用于生产本文所述的微有机球的水凝胶,在一些实施例中，水凝胶由选自琼脂糖、藻酸盐、I型胶原蛋白、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(例如Pluronic® F127(BASF公司，新泽西州橄榄山))、硅树脂、多糖、聚乙二醇和聚氨酯。在一些实施例中，水凝胶由藻酸盐组成。
本文所述的凝胶液滴还可以包括与生物相关的材料。短语“生物相关的材料”可以描述能够包含在本文所定义的生物相容介质中并随后与生物系统相互作用和/或影响生物系统的材料。例如，在一些实施方案中，与生物相关的材料是磁珠(即本身具有磁性的磁珠或包含对磁场响应的材料的磁珠，例如铁颗粒)，可以作为未聚合材料的一部分组合以产生可用于所述方法和组合物(例如，用于凝胶液滴的分离和纯化)的凝胶液滴。作为另一个例子，在其他实施方案中，除了解离组织样本(例如，活检)材料外，生物相关的材料还可以包括额外的细胞。在未聚合的混合物中，解离的组织样本和其他生物相关的材料处于均匀混合物中或作为分布混合物(例如仅在凝胶液滴的一半或其他部分上，包括仅在核心中或仅在凝胶液滴的外部区域中) 形成的凝胶液滴)。在某些变型中，未聚合材料内的额外的生物相关的材料可与游离组织样品悬浮在一起，例如，在液滴聚合形成凝胶液滴之前悬浮。
在一些变型中，可包含在解离的组织样品(例如活检)材料中的生物学相关材料可包含多种细胞类型，包括前脂肪细胞、间充质干细胞(MSC)、内皮祖细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞和脂肪组织巨噬细胞，以及在基质血管部分中发现的小血管或微血管碎片。
一般而言，对于本文所述凝胶液滴中包括的游离组织样本(例如，活检)，这些组织可以是来自患者的任何适当组织，通常通过活检获得。虽然可以使用非活检组织，但一般来说，这些组织(以及由此产生的解离细胞)可能是上述从患者活检中提取的原代细胞，例如，通过穿刺活检。组织可以来自健康组织活检或癌变(如肿瘤)细胞活检。根据所述凝胶液滴的预期用途，所述分离细胞可被纳入目前公开的主题物质的凝胶液滴中。例如，相关组织(例如，分离活检组织)通常可能包括在该组织或器官(或肿瘤等)中常见的细胞。在这方面，可被纳入目前公开的主题物质凝胶液滴的示范性相关细胞包括神经元、心肌细胞、肌细胞、软骨细胞、胰腺腺泡细胞、朗格汉斯岛、骨细胞、肝细胞、库普弗细胞、成纤维细胞、成肌细胞、卫星细胞、内皮细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞、胆道上皮细胞等。这些类型的组织可以通过本领域已知的常规技术分离。合适的活检组织可以来源于：骨髓、皮肤、软骨、肌腱、骨骼、肌肉(包括心肌)、血管、角膜、神经、脑、胃肠、肾、肝、胰腺(包括胰岛细胞)、肺、垂体、甲状腺、肾上腺、淋巴、唾液、卵巢、睾丸、宫颈、膀胱、子宫内膜、前列腺、外阴和食管组织。正常或病变组织(如癌变组织)均可使用。在某些变型中，该组织可能来自肿瘤组织，包括起源于任何这些正常组织的肿瘤。
凝胶液滴一旦形成，就可以进行低温保存和/或培养。培养的凝胶液滴可以保持悬浮状态，可以是静态的(例如在井中、小瓶中等)，也可以是运动的(例如滚动或搅拌)。凝胶液滴可以使用已知的培养技术进行培养。除其他地方外，可以在以下地方找到典型的技术：Freshney，动物细胞培养，基本技术手册，第4版，Wiley Liss，John Wiley&Sons，2000；基本细胞培养：一种实用的方法，Davis主编，牛津大学出版社，2002；动物细胞培养：一种实用的方法，Masters主编，2000；美国专利第5,516,681号和第5,559,022号。
在某些变型中，凝胶液滴是通过在油中形成解离组织样品和流体基质材料的未聚合混合物(例如，在某些变型中为冷却混合物)的液滴而形成的。例如，凝胶液滴可通过将未聚合的物质流与所述油的一个或多个流结合形成液滴而形成。液滴中所述细胞的密度可由未聚合材料中所述解离物质(例如，细胞)的稀释程度决定。凝胶液滴的大小可能与所形成液滴的大小相关。一般来说，凝胶液滴是具有稳定几何形状的球形结构。
除非另有说明，否则本公开主题的实践可以采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分的解释。 参见，例如，分子克隆实验室手册(1989)，第2版，编辑。Sambrook、Fritsch和Maniatis编着，冷泉港实验室出版社，第16和17章；美国专利第4,683,195 号；DNA克隆,第一卷和第二卷，Glover编辑，1985年；寡核苷酸合成，M. J. Gait,ed.，1984； 核酸杂交，D. Hames&S. J. Higgins, eds.，1984；转录和翻译，B. D. Hames&S. J. Higgins, eds.，1984；动物细胞培养，R. I. Freshney，Alan R. Liss，Inc.，1987；固定化细胞和酶，IRL出版社，1986年；Perbal (1984)，分子克隆实用指南；参见酶学方法(Academic Press，Inc.，N. Y.)；哺乳动物细胞的基因转移载体，J. H. Miller 和 M. P.Calos 编辑，冷泉港实验室，1987 年；酶学方法， 154和155卷。Wu 等人编辑，AcademicPress Inc.，纽约；细胞和分子生物学中的免疫化学方法(Mayer和 Walker编辑，学术出版社，伦敦，1987年；实验免疫学手册，第 I-IV 卷，D. M. Weir 和 C. C. Blackwell编辑，1986 年。
如本文所使用的，药物组合物可以包括任何药物、药物稀释剂、药物配方、包括多种药物(例如，多种活性成分)的组合物、药物配方、药物形式、药物浓度、联合疗法等等。在某些变型中，药物配方是指由药物和一种或多种非活性成分混合而成的配方。
在培养过程中，来自凝胶液滴中分离的活检组织的细胞可以在凝胶液滴内聚集、成团或组装 细胞聚集体可能高度组织化并可能形成明确的形态，或者可能是聚集或粘附在一起的大量细胞。该组织可以反映起源组织。尽管在某型变化中，凝胶液滴可能包含单一细胞类型(同型)，但更典型的是这些凝胶液滴可能包含不止一种细胞类型(异型)。
如上所述，用于形成凝胶液滴的(例如，活检组织)组织(例如，分离组织)可来源于正常或健康的生物组织，或来源于受疾病或疾病折磨的生物组织，例如来源于肿瘤的组织或液体。凝胶液滴中使用的组织可能包括免疫系统的细胞，如T淋巴细胞、B淋巴细胞、多形核白细胞、巨噬细胞和树突状细胞。这些细胞可以是干细胞、祖细胞或体细胞。该组织可以是哺乳动物细胞，如人类细胞或来自动物的细胞，如小鼠、大鼠、兔子等。
通常，在形成凝胶液滴之前,首先将细胞解离或彼此分离。 细胞的解离可以通过本领域已知的任何常规方法来完成。优选地，对细胞进行机械和/或化学处理，例如通过用酶处理。通过“机械”，包括破坏相关细胞之间连接的含义，例如，使用手术刀或剪刀或使用均质器等机器。‘酶促地’包括用一种或多种酶处理细胞的含义，这些酶破坏相关细胞之间的连接，包括例如胶原酶、分散酶、脱氧核糖核酸酶和/或透明质酸酶中的任何一种。 可以在不同的反应条件下使用一种或多种酶，例如在37℃水浴中或在室温下温育。
可以对分离的组织进行处理以去除死亡和/或垂死的细胞和/或细胞碎片。此类死亡和/或垂死细胞的去除可通过本领域技术人员已知的任何常规方法来完成，例如使用珠和/或抗体方法。例如，已知磷脂酰丝氨酸在凋亡细胞或死亡细胞中从内到外的质膜小叶重新分布。使用膜联蛋白v -生物素结合，然后将生物素与链霉亲和素磁珠结合，使凋亡细胞与活细胞分离。类似地，细胞碎片的去除可以通过本领域的任何适当技术来实现，例如，包括过滤。
所述分离细胞在与所述流体基质材料结合之前可悬浮在载体材料中，和/或所述流体基质材料可称为载体材料。在某些变型中，载体材料可以是具有在聚合和凝胶液滴形成之前延迟细胞在细胞悬浮液中的沉积的粘度水平的材料。载体材料可具有足够的粘度以允许解离的活检组织细胞保持悬浮在悬浮液中直至聚合。技术人员可以通过监测不同粘度下的沉积速率来优化所需的粘度，并选择一个粘度，该粘度为将细胞悬浮液加载到通过聚合包括细胞在内的未聚合材料的液滴形成凝胶液滴的设备之间的预期时间延迟提供适当的沉积速率。在某些变型中，即使使用了粘度较低的材料，设备也可以流动或搅拌未聚合的材料，以保持细胞悬浮和/或按需要分布。
如上所述，在某些变型中，包括解离组织样品和流体基质材料在内的未聚合混合物可包括一种或多种组分，例如生物相关材料。例如，可包括的生物相关材料可包括以下任何一种：细胞外基质蛋白(如纤维连接蛋白)、药物(如小分子)、多肽或抗体(如调节细胞生存、增殖或分化的任何一种)；和/或特定细胞功能的抑制剂。例如，此类生物相关材料可用于通过减少细胞死亡和/或激活细胞生长/复制来增加细胞活力，或以其他方式模拟体内环境。生物相关材料可包括或可模拟以下一种或多种成分：血清、白介素、趋化因子、生长因子、葡萄糖、生理盐、氨基酸和激素。例如，生物相关材料可补充流体基质材料中的一种或多种制剂。在某些变型中，流体基质材料是合成凝胶(水凝胶)，并可由一种或多种生物相关材料补充。在某些变型中，流体基质是天然凝胶。因此，凝胶可由一种或多种细胞外基质成分组成，如胶原蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻璃质酸、纤维蛋白、海藻酸盐、琼脂糖和壳聚糖中的任何一种。例如，MATRIGEL包括对细胞活力、增殖、发育和迁移很重要的生物活性聚合物。例如，基质材料可以是包含从鼠尾获得的1型胶原蛋白等1型胶原蛋白的凝胶。凝胶可以是纯1型胶原蛋白凝胶，也可以是除其他成分(如其他细胞外基质蛋白)外还含有1型胶原蛋白的凝胶。合成凝胶可指自然界中不天然存在的凝胶。合成凝胶的例子包括由聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)、聚乙烯醇(PVA)、聚环氧乙烷(PEO)中的任何一种衍生的凝胶。
形成凝胶液滴
图1示出了通过将解离的组织细胞与油载体内的基质材料结合形成的多个凝胶液滴的一个示例，以允许基质材料聚合成球形凝胶液滴103，如图所示。例如，图1示出通道区域139的一个示例，该通道区域是透明的并且包含多个凝胶液滴103，每个凝胶液滴包含预定数量的细胞105。所述细胞可在例如如图2所示的微流体装置中形成。在图2中，微流体装置包括连接区域237，以便携带未聚合混合物211的通道与携带与未聚合混合物不混溶的油的一个或多个(例如，两个)通道209相交。由于未聚合的混合物被加压以以第一速率流出第一通道211，在交叉通道209、209 '中流动的油允许预定义量的未聚合混合物通过，然后将其掐掉以形成液滴203，该液滴203进入出口通道239。因此，在某些变型中，可以将切碎的(例如，分离的)临床(例如，活检或切除的)组织样本，例如直径小于1mm的组织，与温度敏感凝胶(即MATRIGEL，在4℃下)混合，以形成未聚合的混合物。可将该未聚合的混合物置于可产生体积和材料组成均匀的液滴(例如油包水液滴)的微流控装置中。同时，解离的肿瘤细胞可能被分配到这些液滴中。未聚合材料中的凝胶可在加热(例如，在37℃)时凝固，并且可形成所产生的凝胶液滴。这些凝胶液滴(如图所示为微有机球)与传统的3D细胞培养技术兼容。图3示出悬浮在油308中的多个如上所述形成的凝胶液滴305。
在上面所示的示例微流体芯片中，连接显示为T-或X –连接，其中微流体的流动聚焦形成了凝胶液滴的可控大小。在某些变型中，液滴可以通过机器人微移液形成，而不是微流体芯片，例如，形成不混溶流体和/或到固体或凝胶基底上。或者，在某些变型中，未聚合材料的液滴可通过微毛细管生成形成所需的尺寸和再现性。可替代地用于从未聚合材料形成指定尺寸范围和可再现性的凝胶液滴的技术的其他示例可包括胶体操作，例如，通过诸如声学、磁学、惯性、电润湿或引力等外力。
图4A示出如上所述在油中形成的凝胶液滴的示例。凝胶液滴可立即用于检测、培养和/或储存(例如，通过低温保存)。然而，已经发现，活力，特别是在培养中，含有油对凝胶液滴是负面影响。此外，油的存在可能使准确测定和/或操作凝胶液滴变得困难或不可能。例如，油内(或包括一些)的凝胶液滴可能会结块或聚集在一起，从而阻止对单个凝胶液滴的隔离和操作。因此，最好除去油。
图4B和4C示出了可用于从凝胶液滴中除去油的方法的示例；这些技术不太彻底和有效，实际上可能比本文所述的使用多孔疏水表面的方法更复杂。例如，图4B示出了使用抗静电枪对其除油的凝胶液滴。在本例中，如图4B所示，油没有被完全去除，并且，所产生的凝胶液滴(这里用星号表示)留下了油和碎片，可能是在破乳步骤中破坏了一些凝胶液滴。或者，图4C说明了化学破乳剂的使用，在这种情况下，PFO (10% PFO)用于从凝胶液滴中除去油。在这种情况下，破乳剂(例如，PFO)可以除去油，然而，破乳剂也可能对凝胶液滴具有相关的毒性。此外，相关的洗涤/漂洗步骤可能会增加纯化和处理步骤的额外时间和成本。在图4C中，凝胶液滴从油相中回收并重新悬浮，例如，通过PFO(全氟辛醇)和离心进入PBS。这可以将不混溶流体从凝胶液滴中分离出来。因此，这些凝胶液滴，包括基于肿瘤的有机球，可以成功生长。
图4D示出了使用本文所述的多孔疏水表面(例如，膜)处理以除去油的凝胶液滴。如图4D所示，所产生的凝胶液滴(也用星号表示)通常看起来“更干净”，具有更少的碎片，很少或没有残余油。
图5示出了使用多孔疏水表面形成和/或处理(包括除去油)凝胶液滴的一般方法的一个示例。在图5中，该方法可以选择性地从初级组织样本(或凝胶液滴中包括的其他细胞来源)开始；组织样本可以被解离和/或悬浮501。如上所述，在某些变型中，细胞可能被修改503。然后，所述解离的细胞可与未聚合的基质材料结合505，并流入油中以在所述油中形成凝胶液滴；然后，如上文所述，例如，通过增加温度，可将结合有分离细胞(以及任何其他组分)的基质材料聚合。这些步骤通常可以是形成凝胶液滴的一个或多个步骤507的一部分，并且这些步骤中的全部或部分可以自动化，例如通过装置实现。
如图5所示，然后可以使用多孔疏水表面(例如，膜)除去油502。在某些情况下，在暴露于多孔疏水表面之前，最好先从凝胶液滴中去除多余的油，作为去除大部分油的粗略方法。例如，可以通过旋转将凝胶液滴与部分油分离，然后通过移液去除油层(例如底层)。或者，悬浮在其中的油和凝胶液滴可直接放置与多孔疏水表面接触。在任何情况下，凝胶液滴可以使用多孔疏水膜去乳化，如下面的更详细描述。这一步可以去除全部或基本上所有的油(例如，大于99%)，并且可以快速和容易地执行。
一旦除去油，凝胶液滴可从多孔疏水表面(例如，膜)分离，例如，通过使用缓冲液和/或细胞培养基511洗涤和/或洗脱到容器中。在某些情况下，凝胶液滴可立即使用；或者，所有或部分凝胶液滴可以培养513，和/或冷冻保存。
本文还描述了可以执行这些方法中的任何一种的装置。例如，图6示出了装置的一个示例，该装置可以包括自动化所有或部分这些步骤的组件。例如，在图6中，所述装置可以包括微流体元件601，其可以包括多个通道(例如，作为微流体芯片的一部分)，并且可以进一步包括一个或多个用于接收未聚合基质、解离细胞和/或油的端口，以便它们可以参照上面图2所示进行组合。因此，所述装置可以包括包含多个通道的流控(例如微流控)处理器，包括配置为接收包含解离细胞和未聚合基质材料的解离组织样本的第一通道，以及配置为接收油并与第一通道相交以形成悬浮在油中的聚合凝胶液滴的第二通道。处理器还可以包括具有一个或多个微处理器的控制器，微处理器可以控制所述设备的操作并调节凝胶液滴的形成和处理。此外，该装置可包括除乳化部分603、605，其可包括与流体处理器流体通信的多孔疏水表面(例如，膜)609、607，并配置为除去油从凝胶滴。最后，所述设备可以包括洗脱通道，所述洗脱通道被配置为将凝胶液滴洗脱到一个或多个容器中，例如多孔板615。
通常，除乳化部分可以包括任何适当的多孔疏水表面，例如疏水膜，特别是具有孔径在0.1 μm至500 μm之间的膜(例如，在0.1μm至400 μm之间，在0.1μm至300μm之间，在0.1μm至250 μm之间，在0.1 μm至200 μm之间，在0.01 μm至150μm之间，在0.01 μm至100μm之间，等等)。在图6中，除乳化部分显示，在顶部，形成漏斗的多孔疏水膜609，可用于将凝胶液滴的溶液(例如，含油溶液)施加到其上或内部，以便通过吸收到膜或通过膜来去除油。图6还显示了除乳化部分的替代实施例，该部分包括通道605，在该通道内设置多孔疏水膜607区域。包括油在内的凝胶液滴溶液可以涂在通道的第一端，并且包括凝胶液滴在内的溶液可以流过通道(例如，柱等)，该通道可以相对于水平略有角度(在1度至30度之间)，以便在去除油的过程中流体可以沿通道/柱向下流动。在某些变型中，可以改变疏水表面的角度(在图6的底部形成隧道605)。
例如，图7示出了从多个凝胶液滴中除去油的一个示例。在图7中，将疏水膜薄片，例如孔径为0.45 μm的PVDF转移膜，放置在已形成多个凝胶液滴(“基质液滴”)的表面(例如工作台的表面)和500 pL的油上。油中的凝胶液滴被施加到膜的表面，使油被吸收到膜中并通过膜，而凝胶液滴留在膜的顶部。在实践中，然后可以通过将缓冲液或介质直接施加到膜上的凝胶液滴一次或多次(例如，3次)来选择性地清洗凝胶液滴。在某些变型中，凝胶液滴可以通过洗涤移动到膜的另一部分，以允许疏水膜进一步去除油。然后将凝胶液滴冲洗到容器中，在本例中显示为多孔板715。对这种方法的分析表明，几乎所有(例如，大于99%)的油都是通过这种方式去除的。此外，这种类型的处理不会对凝胶液滴产生负面影响。
事实上,在不使用化学反乳化剂的情况下用疏水膜去除凝胶液滴中的油后不久对新鲜凝胶液滴的分析表明，处理过的凝胶液滴中细胞的整体活力高于通过其他技术(如图4B-4C所示)处理以去除油。一般来说,留在凝胶液滴上的残留油越多，凝胶液滴中细胞的生长就越少。此外，本文所述的方法通常显着更快，需要更少的洗涤和洗涤/漂洗步骤的重复。此外，所得凝胶液滴往往看起来更清晰，凝胶液滴/细胞碎片更少。
例如，图8A-8D说明了通过本文所述的处理方法形成的凝胶液滴的一个示例，并允许在低(4X，图8A、8B)和更高(10X，图8C和8D)之间进行比较。在图8A和8C中，每个凝胶液滴包括一个细胞并且凝胶液滴已经被清洁以去除所有的油，如图所示。类似地，图8B和8D显示每个具有20个细胞的凝胶液滴。
如上所述，与除乳化技术或不除乳化技术相比，本文所述形成的凝胶液滴在培养过程中随着时间的推移具有显着增加的活力。如图9A-11B所示，随着时间的推移，这些方法也可能特别有效。例如，图9A-9B说明了包括使用本文所述的疏水膜(多孔疏水膜)从凝胶液滴中除去油的方法的示例。在图9A- 9c中，具有 1(图9A)或20(图9B)个细胞(平均)的凝胶液滴在形成后两天以低放大率(例如4x)显示。可以看出，生成的凝胶液滴非常“干净”，包括周围的介质。图10A-10B显示了培养2天后类似凝胶液滴的略微放大图。
最后，图11A-11B说明了培养三天后类似的凝胶液滴，显示凝胶液滴内广泛且强健的生长。图11A-1B中所示的凝胶液滴也以10倍放大率显示。如前所述，凝胶液滴已在疏水膜上洗涤以去除油。在形成微凝胶液滴后，可以相对快速地去除这种油，以防止对微有机圈内的细胞造成伤害。
本文所述的方法和装置通常可用于可形成凝胶液滴的几乎任何细胞类型。例如，图12A-12B、13A-13B、14A-14B、15A-15B、16A-16B、17A-17B、18A-18B、19A-19B、20A-20B和21A-21B都显示了用于提取凝胶液滴的不同细胞或组织类型，对于这些细胞或组织类型，可以遵循本文所述的从凝胶液滴中去除油脂的方法。例如，图12A-12B所示为VERO细胞(20个细胞/凝胶液滴)，图13A-13B所示为293T细胞，图14A-14B所示为包括293ACE2细胞的凝胶液滴，显示出低量级(4x，左)和高量级(10x，右)。图15A-15B显示了包含具有1个细胞/凝胶液滴的CRC19-106细胞的凝胶液滴，图16A-16B也显示了具有20个细胞/凝胶液滴的CRC19-106细胞，图17A-17B显示了具有1个细胞/凝胶液滴的CRC19817细胞，图18A-18B所示的凝胶液滴包括具有20个细胞/凝胶液滴的CRC19178细胞，均使用如本文所述的疏水膜去除油。图19A-19B显示了1个细胞/凝胶液滴的CRC19245细胞，图20A-20B为20个细胞/凝胶液滴的CRC19245细胞。最后，图21A-21B分别为小鼠肠道类器官包括20个细胞/凝胶液滴的低倍放大和高倍放大。
在本文所述的任何示例中，所述方法可以是从已从组织中培养或分离(例如，通过解离)的细胞中形成有机球(例如，微有机球)的方法。样品可以接受处理，并可以以非常温和的方式进行处理，包括使用自动化或半自动化系统。例如，可以以冷冻、温度调节的方式接收和处理样品，例如，通过将样品(包括细胞保持在其中的任何介质)和液体基膜材料的温度冷却至细胞处理温度或温度范围(如冷却到25℃以下、20℃以下、19℃以下、18℃以下、17℃以下、16℃以下、15℃以下、14℃以下、13℃以下、12℃以下、11℃以下、10℃以下、9℃以下、8℃以下、7℃以下、约5-25℃之间、约5-20℃之间等)。因此，细胞可以悬浮在维持在细胞加工温度(或温度范围)的水溶液中。液体基底膜材料也可以保持在相同的细胞处理温度范围内。然后将细胞与液体基底膜基质(例如，但不限MATRIGEL)结合。所述液体基底膜材料可通过组合稀释至预定浓度。
然后，液体基底膜材料中的细胞可通过挤压成油而形成液滴。所述液滴可通过将结合细胞和液体基底膜材料以预定量(和/或以预定流速)流入所述油中而形成。油可能是池或流。液滴可由液体基底膜基质中的细胞形成，使得每个液滴包括预定数量的细胞(例如，1-500个细胞之间、1-400个细胞之间、1-300个细胞之间、1-200个细胞之间、1-100个细胞之间等)。在油中形成的液滴可以通过提高温度进行聚合。例如，可以将温度提高到聚合反应(例如，到30℃或更高、32℃或更高、35℃或更高、30-38℃之间、32-37℃之间等)以聚合凝胶液滴。可以通过提高油的温度来提高温度。在一些例子中，将细胞液滴和液体基底膜材料结合在具有相同初始温度的油中，并在液滴形成后提高周围油的温度可能是有益的。在一些例子中，包括所述细胞在内的基底膜材料的液滴可以添加到温度高于所述细胞加工温度(或细胞加工温度范围)的油中。例如，油可以保持在聚合温度。加热结合细胞和液基膜基质的液滴，可使所述液基膜基质材料在油内聚合。此后，可以如本文所述将油除去，并且可以培养所述细胞以形成所述有机球(例如，微有机球)。例如，如上所述，可以将液滴与疏水膜接触，以便在添加水(例如，培养)介质之前，在水培养基中冲洗后，或在添加水培养基时，通过疏水膜将油从凝胶液滴中除去或进入疏水膜。
这一过程已被证明在增加所产生的有机球(例如，微有机球)内细胞的活力方面极其有效。例如，与其他去油方法相比，即使是最敏感的细胞类型的存活率也增加了20-50%以上。
例如，图22A-22C示出了如上所述由诱导多能干细胞形成的有机球(例如，微有机球)的示例。诱导多能干细胞(iPSCs)可能非常脆弱。在图22A中，微有机球是由上述iPSCs在油中形成的，通过与疏水膜接触微有机球来去除油，在本例中，疏水聚偏氟乙烯(PVDF)薄片形成一个表面(例如，通道，漏斗等)，在添加水(例如，介质)溶液之前或之后(或期间)，微有机球可以通过该表面流动。到第3天(如图22B所示)，产生的大多数微有机球都是可活的，微有机球内的iPSCs的大小和数量都有所增加。图22C显示了第7天相同的微有机球。这些微有机球能够形成“微型大脑”结构。
本文所述的方法对于各种不同的细胞，包括培养的和分离的(例如，解离的)细胞，通常是成功的。例如，图23A-23J说明了本文所述方法在从人体解剖组织中分离的各种不同类型细胞上的结果。图23 A显示了作为解剖的一部分被移除的组织(嗅觉组织)样本的示例。该组织被处理，如本文所述，分离嗅觉细胞，并形成一种或多种嗅觉细胞类型的微有机球。例如，图23B示出了由本文所述分离的嗅觉细胞形成的微有机球的一个示例。本文所述的其他类似分离和加工形成微有机球的细胞类型包括远端肺细胞(图23C)、气管细胞(图23D)、近端肺细胞(图23E)、鼻窦细胞(图23F)、食管细胞(图23G)、肠细胞(图23H)和肝细胞(图23 I-23J)。
虽然本文所述的方法和装置是在包括(和支持)生物组织的凝胶液滴的上下文中描述的，例如分离细胞，包括肿瘤细胞，但应该理解，这些方法和装置可用于任何凝胶液滴，凝胶液滴中含有或不含生物组织。特别是，这些方法和设备可能用于从凝胶液滴上或周围去除油，凝胶液滴内有或没有生物组织，包括但不限于小凝胶液滴(例如，有一个直径约2mm或更少(如1.5mm或更少、1.0mm或更少、0.9mm或更少、0.8mm或更少、0.7mm或更少、0.6mm或更少、0.5mm或更少等等、在50 – 500μm之间、大约50 – 600μm、大约50 - 750μm、大约50 -900 μm、大约50 μm到1mm等等)。
此处描述的任何方法(包括用户界面)可以实现为软件、硬件或固件，并且可以描述为存储一组能够由处理器(例如，计算机、平板电脑、智能手机等)执行的指令的非临时计算机可读存储介质，当由处理器执行时，导致处理器控制执行任何步骤，包括但不限于:显示、与用户通信、分析、修改参数(包括定时、频率、强度等)、确定、报警等。
当一个特征或元素在这里被称为“在”另一个特征或元素上时，它可以直接在另一个特征或元素上，或者也介入特征和/或元素中间。相反，当一个特征或元素被称为“直接在”另一个特征或元素上时，不介入特征或元素中间。还应理解，当一个特征或要素被称为“连接”、“附加”或“耦合”到另一个特征或要素时，它可以直接连接、附加或耦合到另一个特征或要素，或可能介入特征或要素中间。相反，当一个特征或元素被称为“直接连接”、“直接连接”或“直接耦合”到另一个特征或元素时，并不介入特征或元素中间。尽管就一个实施例进行了描述或显示，如此描述或显示的特征和要素可以应用于其他实施例。本领域技术人员还将理解，涉及被布置为“相邻”另一个特征的结构或特征的引用可能具有重叠或位于相邻特征之下的部分。
此处使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不打算限制本发明。例如，如本文所使用的，单数形式“a”、“an”和“the”也包括复数形式，除非上下文另有明确指示。需要进一步理解的是，术语“包括”和/或“组成”，当在本规范中使用时，指定所述特征、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作、元素、组件和/或其组。如在此使用，术语“和/或”包括一个或多个相关列出项目的任何和所有组合，并可以缩写为“/”。
空间相对术语，如“在……下面”，“在……以下”，“下方”，“在……上面”，“在……上方”等，可以在这里使用，以方便描述一个元素或特征与图中所示的另一个元素或特征的关系。可以理解的是，空间相对项旨在包括除图中所描述的方向之外的使用或操作中的设备的不同方向。例如，如果图中的设备是倒置的，那么被描述为在其他元素或特征 “下面”或“下方”的元素将被定向到在其他元素或特征的“上面”或上方。因此，示例性术语“在……下面”可以包含上面和下面的方向。该装置可以以其他方式定向(旋转90度或在其他方向)，并且在此使用的空间相对描述符相应地解释。同样，术语“向上”、“向下”、“垂直”、“水平”等在此仅用于解释的目的，除非另有特别说明。
虽然术语“第一”和“第二”可用于描述各种功能/元素(包括步骤)，但这些功能/元素不应受这些术语的限制，除非上下文另有指示。这些术语可以用来区分一个特性/元素与另一个特性/元素。因此，下面讨论的第一个特征/元素可以被称为第二个特征/元素，同样，下面讨论的第二个特征/元素可以被称为第一特征/元素而不脱离本发明的教学。
在整个说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，“包括”一词以及诸如“包含”和“由……组成”的变体意味着可以在方法和物品中共同使用各种组件(例如，组合物和设备，包括设备和方法)。例如，术语“包括”应理解为包括任何所述要素或步骤，但不排除任何其他要素或步骤。
通常，在此描述的任何装置和方法应被理解为包含的，但组件和/或步骤的全部或子集可以是排他性的，并且可以表示为“由”或“基本上由“各种组件、步骤、子组件或子步骤组成”。
正如在说明书和权利要求中使用的，包括在示例中使用的，除非另有明确规定，所有数字都可以读作好像以单词“大约”或“大概”开头，即使术语没有明确出现。短语“大约”或“大概”可用于描述幅度和/或位置，以表明所描述的值和/或位置在合理的预期值和/或位置范围内。例如，一个数值的值可能是设定值(或值范围)的+/- 0.1%、设定值(或值范围)的+/- 1%、设定值(或值范围)的+/- 2%、设定值(或值范围)的+/- 5%，设定值(或值范围)的+/- 10%等等。此处给出的任何数值也应理解为包括大约或近似该值，除非上下文另有指示。例如，如果值“10”被公开，那么“大约10”也被公开。此处所列举的任何数值范围旨在包括其中所包含的所有子范围。还应理解，当一个值被披露时，“小于或等于”该值，“大于或等于该值”以及值之间的可能范围也将被披露，如本领域技术人员所适当理解的那样。例如，如果披露了值“X”，则“小于或等于X”以及“大于或等于X”(例如，其中X是数值)也会被披露。在整个申请中，数据以多种不同的格式提供，并且这些数据表示端点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果披露了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则可以理解为大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及在10和15之间被视为披露。另据了解，两个特定数之间的每个数也被披露。例如，如果公开了10和15，那么也公开了11、12、13和14。
尽管上面描述了各种说明性实施例，但可以对各种实施例进行许多更改中的任何更改，而不脱离权利要求书所描述的本发明的范围。例如，在可供选择的实施例中，所描述的各种方法步骤的执行顺序可以经常被改变，并且在其他可供选择的实施例中，可以完全跳过一个或多个方法步骤。各种设备和系统实施例的可选特性可以包括在一些实施例中，而不包括在其他实施例中。因此，上述描述主要是为示范目的而提供的，不应被解释为限制本发明的范围，因为它是在权利要求书中提出的。
本文包括的示例和插图通过说明而不是限制的方式显示了主题可以在其中实施的具体实施例。如上所述，可以利用其他实施例并从中派生，这样可以在不脱离本公开的范围的情况下进行结构和逻辑上的替换和更改。发明主题的这种实施例在这里可以单独地或集体地被术语“发明”提到，仅仅是为了方便，而不是有意自愿地将本申请的范围限制到任何单一的发明或发明概念，如果实际上公开了不止一个。因此，尽管在此已经说明和描述了具体的实施例，但为达到相同目的而计算的任何布置都可以替代所示的具体实施例。本披露旨在涵盖任何和所有的改编或 各种实施例的变化。上述实施例的组合，以及在此未具体描述的其他实施例，对于本领域技术人员在审查上述描述时将是明显的。

Claims (25)

1.一种处理含有细胞的凝胶液滴的方法，所述方法包括：在油中形成多个凝胶液滴，其特征在于所述凝胶液滴包括来自在基质材料的聚合球体内的解离组织样品的细胞，所述凝胶液滴具有分布在其中的细胞；以及
使凝胶液滴与疏水膜接触，使得油通过或进入疏水膜，从而从凝胶液滴中被去除。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝胶液滴包含直径在50-500微米之间的微有机球。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述凝胶液滴与疏水膜接触包括从所述凝胶液滴中除去至少99%的油。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述凝胶液滴与疏水膜接触包括使类器官通过一个至少部分由疏水膜形成的腔室。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述腔室包括由疏水膜形成的隧道或管。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述凝胶液滴与疏水膜接触包括将所述凝胶液滴洗脱到由疏水膜形成的漏斗中。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述凝胶液滴与疏水膜接触包括将所述凝胶液滴过滤到疏水膜上。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述凝胶液滴与疏水膜接触包括使包含凝胶液滴的溶液从疏水膜上面通过。
9.如权利要求1的方法，其特征在于，所述疏水膜的孔径介于 0.1 和 5微米之间。
10.如权利要求1的方法，其特征在于，使所述凝胶液滴与疏水膜接触包括将所述凝胶液滴保留在水介质中。
11.如权利要求1的方法，其特征在于，每个所述凝胶液滴包含分布在其中的1至200个细胞。
12.如权利要求1的方法，其特征在于，用水介质洗涤疏水膜上的所述凝胶液滴。
13.如权利要求1的方法，其特征在于，包括在培养基中培养所述凝胶液滴。
14.一种处理凝胶液滴的方法，该方法包括：在油中形成多个凝胶液滴，其特征在于所述凝胶液滴包括来自在基质材料的聚合球体内的解离组织样品的细胞，所述凝胶液滴的直径为50至500微米，其中分布有1至200个细胞；以及
使所述凝胶液滴与疏水膜接触，使得至少98%的油从凝胶液滴中到疏水膜上或进入到疏水膜中从而被去除；用水介质洗涤疏水膜上的所述凝胶液滴；在培养基中培养凝胶液滴。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述凝胶液滴包含直径在50-500微米之间的微有机球。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，使所述凝胶液滴与疏水膜接触包括从所述凝胶液滴中除去至少99%的油。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，使所述凝胶液滴与疏水膜接触包括使类器官通过一个至少部分由疏水膜形成的腔室。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述腔室包括由疏水膜形成的隧道或管。
19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，使所述凝胶液滴与疏水膜接触包括将所述凝胶液滴洗脱到由疏水膜形成的漏斗中。
20.如权利要求14所述的方法，其特征在于，使所述凝胶液滴与疏水膜接触包括将所述凝胶液滴过滤到疏水膜上。
21.如权利要求14所述的方法，其特征在于，使所述凝胶液滴与疏水膜接触包括使包含凝胶液滴的溶液从疏水膜上面通过。
22.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述疏水膜的孔径介于 0.1 和 5微米之间。
23.如权利要求14所述的方法，其特征在于，使所述凝胶液滴与疏水膜接触包括将凝胶液滴保留在水介质中。
24.如权利要求14所述的方法，其特征在于，包括用水介质洗涤疏水膜上的凝胶液滴。
25.一种用于形成凝胶液滴的装置，该装置包括：
包含多个通道的流体处理器，其中，通道包括：配置为接收包含解离细胞和未聚合基质材料的解离组织样本的第一通道，和配置为接收油并与第一通道相交以形成悬浮在油中的聚合凝胶液滴的第二通道；
破乳部分，包括疏水膜，所述疏水膜与流体处理器流体连通并且配置为从凝胶液滴中去除油；以及
洗脱通道，其配置成使用水溶液从破乳部分洗脱凝胶液滴。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110997900A (zh) * 2017-07-14 2020-04-10 多伦多大学管理委员会 用于快速产生用于化合物筛选的类器官/球状体的微流体平台

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114702688B (zh) * 2022-03-13 2023-12-12 浙江大学 一种离心式水凝胶液滴的制备方法
WO2023212732A2 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Xilis, Inc. Methods and apparatuses for testing hepatocyte toxicity using microorganospheres
WO2024040145A1 (en) * 2022-08-17 2024-02-22 Xilis, Inc. Methods of delivering components to microorganospheres
US20240118187A1 (en) * 2022-10-11 2024-04-11 Xilis, Inc. Measurement and control of droplet sizes

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5266480A (en) 1986-04-18 1993-11-30 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional skin culture system
WO2014152906A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Research Institute At Nationwide Children's Hospital, Inc. Tissue engineered intestine
WO2016145242A1 (en) 2015-03-11 2016-09-15 Agenus Inc. Methods and compositions for high throughput screening of biomolecules using gel microdrops
WO2017036533A1 (en) 2015-09-03 2017-03-09 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Three-dimensional hydrogels for culturing adult epithelial stem cells and organoids
EP3538653B1 (en) 2016-11-08 2021-07-28 Nanna Therapeutics Limited Tagless encoded chemical library

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110997900A (zh) * 2017-07-14 2020-04-10 多伦多大学管理委员会 用于快速产生用于化合物筛选的类器官/球状体的微流体平台

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