JP2023538208A - 標準型オルガノイドの作製方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、標準型オルガノイドの作製方法を提供する。【選択図】図８
Description
本発明は、標準型オルガノイドの作製方法に関する。より詳細には、均一な大きさのオルガノイドを作製する方法に関する。
オルガノイド（ｏｒｇａｎｏｉｄ）は、「臓器もどき」又は「ミニ臓器」とも呼ばれるが、幹細胞や臓器由来細胞から分離した細胞を３次元培養法により再凝集、組換えして製造された臓器特異的な細胞塊である。オルガノイドは、モデルとする臓器特異的な細胞を含み、臓器を持つ特定の機能を再現し、実際の臓器と同様の形で空間的に組織化が可能である。患者由来腫瘍オルガノイド（ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｕｍｏｒ ｏｒｇａｎｏｉｄ）は、患者の癌細胞及び癌組織の特性をそのまま示し、かつ、患者の癌組織の遺伝的変異特性を再現できることが報告されている。
オルガノイドは、細胞治療、生体組織工学、新薬開発、毒性学、並びに精密医療分野まで用いられることができる。オルガノイドの活用度を高めるためには、大量に比較できるオルガノイドの定量化及びその解析方法が必要である。しかし、これまでオルガノイドを定量的に培養する方法がない。その理由は、オルガノイドを成長させる要素の中で最も重要な要素であるマトリゲルを底にドーム状に固化した後、その中でオルガノイドを成長させているので、オルガノイドが不規則に成長するからである。
また、このようにマトリゲル内で成長させたオルガノイドは、３次元支持体内で互いに重なり合って成長することもあるので、限界があることが明らかである。
また、最近では、初期創薬プログラム及び毒性スクリーニングに使用するために、より安定した生理学的な患者由来のオルガノイドと組み合わせたハイスループットスクリーニング（ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）技術が開発されている。
大韓民国登録特許第１０－１７５６９０１号（特許文献１）には、３次元の組織細胞を培養可能な細胞培養チップについて開示されている。前記特許文献１の細胞培養チップは、第１培養部、第２培養部及び第３培養部をそれぞれ層別に形成し、各層別に細胞の成長の進行度合いを確認することができる。しかしながら、特許文献１の細胞培養チップは、オルガノイドを高収率で得ることができないという問題点がある。
また、細胞培養時に培養液を交換するピペッティング作業を行う場合があるが、３次元細胞培養が可能なｃｏｒｎｉｎｇスフェロイドマイクロプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）の場合、細胞培養中のスフェロイド又はオルガノイドに影響を与えて、ピペッティング作業時にスフェロイド又はオルガノイドが吸い上がったり、位置が変わったりするといったことがあるので、細胞培養環境に好ましくない問題がある。
そこで、本発明者らは、細胞外マトリックスに基づいたハイドロゲル（例えば、マトリゲル）を用いない、又は使用を最小限に抑えながら均一な大きさを有する標準型オルガノイドについての研究を重ねて本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、標準型オルガノイドの作製方法を提供することである。
本発明の別の目的は、上記方法により作製された大きさが均一で、それぞれのオルガノイドの機能性が類似する標準型オルガノイドを提供することである。
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、上述した課題に限定されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当該技術分野における通常の技術者によって明確に理解されることができる。
上記課題を解決するために、本発明は、
細胞を３次元細胞培養プレートで培養し、オルガノイドを形成する工程を含むオルガノイドの作製方法であって、
前記オルガノイドの形成工程において、前記細胞培養プレートは、細胞外マトリックスに基づくハイドロゲルを０～２体積％含み、
前記３次元細胞培養プレートは、
複数個のメインウェル（ｍａｉｎ ｗｅｌｌ）と、メインウェルのそれぞれの下部に形成され、細胞培養液が注入され、底面に凹部を含む複数個のサブウェル（ｓｕｂ ｗｅｌｌ）とを含むウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）と、ウェルプレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタと、を含み、
前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、ウェルプレートの下端に互いに着脱可能に固定手段が備えられたベースと、ウェルプレートの上部に配置され、ベースと結合されるカバーとを含み、前記メインウェルは、所定の部位がテーパ状になるように段差が形成され、前記段差は、メインウェルの壁に対して１０～６０°範囲の傾斜角（θ）を有する。
細胞を３次元細胞培養プレートで培養し、オルガノイドを形成する工程を含むオルガノイドの作製方法であって、
前記オルガノイドの形成工程において、前記細胞培養プレートは、細胞外マトリックスに基づくハイドロゲルを０～２体積％含み、
前記３次元細胞培養プレートは、
複数個のメインウェル（ｍａｉｎ ｗｅｌｌ）と、メインウェルのそれぞれの下部に形成され、細胞培養液が注入され、底面に凹部を含む複数個のサブウェル（ｓｕｂ ｗｅｌｌ）とを含むウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）と、ウェルプレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタと、を含み、
前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、ウェルプレートの下端に互いに着脱可能に固定手段が備えられたベースと、ウェルプレートの上部に配置され、ベースと結合されるカバーとを含み、前記メインウェルは、所定の部位がテーパ状になるように段差が形成され、前記段差は、メインウェルの壁に対して１０～６０°範囲の傾斜角（θ）を有する。
前記細胞は、正常細胞又は癌細胞であってもよい。
前記細胞は単一細胞であってもよい。
前記細胞は、正常組織、癌組織、又は既に作製されたオルガノイドから分離することによって得ることができる。組織を細胞化して単一細胞に分離する方法は、公知の技術であるため、具体的な説明は省略する。
前記細胞外マトリックスに基づくハイドロゲルは、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、商品名）であってもよい。
前記オルガノイドの大きさは直径３００～５００μｍであってもよい。
本発明において「標準型オルガノイド」という用語は、オルガノイドの大きさが直径３００～５００μｍである均一なオルガノイドをいう。
本発明で作製されるオルガノイドの大きさは３００～５００μｍの範囲であるが、これは癌疾患に特に最適化した大きさである。
以下で詳細に説明するが、本発明の３次元細胞培養プレートを用いると標準型オルガノイドを大量産生することができる。
前記３次元細胞培養プレートのサブウェルは、凹部に向かってテーパ状になうように傾斜面が形成され、前記サブウェル１２０の上端径は、３．０～４．５ｍｍの範囲であり、前記凹部１２１の上端径は、０．４５～１．５ｍｍの範囲であり、前記サブウェルと凹部の傾斜面（θ２）は、４０～５０°の範囲であり、前記サブウェルの直径と凹部の直径に対する長さの比は、１：０．１～０．５の範囲であってもよい。
前記３次元細胞培養プレートの前記メインウェルの個々の体積は、１００～３００μｌの範囲であり、前記凹部の個々の体積は、２０～５０μｌの範囲であり、前記メインウェルと凹部の個々の体積比は、平均１：０．１～０．５であってもよい。
前記メインウェルは、段差とサブウェルとの間に空間部を含み、前記空間部の高さ（ａｈ）は平均２．０～３．０ｍｍの範囲であり、前記サブウェルの高さ（ｂｈ）は平均１．０～２．０ｍｍの範囲であり、前記空間部とサブウェルの高さの比（ａｈ：ｂｈ）は、１：０．３～１の範囲であってもよい。
前記体細胞は、前記細胞培養プレートのサブウェルに１００～１０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種することができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、様々な変更を加えることができ、様々な実施例を有することができるので、特定の実施例を図面に例示し、詳細な説明に詳細に説明する。
しかし、これは本発明を特定の実施形態に限定することを意図するものではなく、本発明の思想及び技術的範囲に含まれるすべての変更、均等物ないし代替物を含むことを理解しなければならない。本発明の説明において、関連する公知技術の詳細な説明が本発明の要旨を不明瞭にするおそれがあると判断される場合には、その詳細な説明は省略する。
本出願で使用される用語は、単に特定の実施例を説明するために使用されたものであり、本発明を限定することを意図するものではない。単数表現は、文脈上明らかに他に意味がない限り、複数表現を含む。
本発明において、「含む」又は「有する」などの用語は、明細書上に記載された特徴、数字、工程、動作、構成要素、部品、又はそれらを組み合わせたものが存在することを指定するためのものであって、１つ又はそれ以上の他の特徴や数字、工程、動作、構成要素、部品、又はそれらを組み合わせたものの存在又は付加の可能性を予め排除しないものと理解されるべきである。
一般に、オルガノイドを培養するとき、細胞外マトリックスの役割を担うためにハイドロゲルが使用された。例えば、マトリゲルを細胞培養プレートの底にドーム状に固化した後、その中でオルガノイドを成長させるが、オルガノイドが大きさと形が不規則に成長し、そのため、機能がバラバラに発現され、標準化することが難しい問題点がある。
本発明は、細胞外マトリックスに基づいたハイドロゲルを含まない、又は最小限の量を含む３次元細胞培養プレートを用いてオルガノイドを作製する。本発明の３次元細胞培養プレートについて具体的な説明は、以下の通りである。
本発明は、一実施例では、以下を含む３次元細胞培養プレートを用いる。
３次元細胞培養プレートは、複数個のメインウェル（ｍａｉｎ ｗｅｌｌ）と、メインウェルのそれぞれの下部に形成され、細胞培養液が注入され、底面に凹部を含む複数個のサブウェル（ｓｕｂ ｗｅｌｌ）とを含むウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）と、
ウェルプレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタと、を含み、
前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、ウェルプレートの下端と互いに着脱可能に固定手段が備えられたベースとウェルプレートの上部に配置し、ベースと結合されるカバーとを含み、
前記メインウェルは、所定の部位にテーパ状になるように段差が形成され、前記段差はメインウェルの壁に対して１０～６０°の範囲の傾斜角（θ）を有す。
ウェルプレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタと、を含み、
前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、ウェルプレートの下端と互いに着脱可能に固定手段が備えられたベースとウェルプレートの上部に配置し、ベースと結合されるカバーとを含み、
前記メインウェルは、所定の部位にテーパ状になるように段差が形成され、前記段差はメインウェルの壁に対して１０～６０°の範囲の傾斜角（θ）を有す。
従来の９６ウェルプレートの場合、高収率の薬剤の効能を評価するために、実験や解析を数回以上行う必要があったため、時間及びコストがかかるという問題があった。さらに、細胞培養時に培養液を交換するピペッティング作業を行うことがしばしばあるが、従来のＣｏｒｎｉｎｇスフェロイドマイクロプレートの場合、細胞培養中のスフェロイド又はオルガノイドに影響を与えて、ピペッティング作業時にスフェロイド又はオルガノイドが吸い上がったり、位置が変わったりするなどといったことがあり、細胞培養環境に好ましくない問題があった。
そこで、本発明は上述のような課題を解決するためになされたものであって、ウェルプレート内に形成された複数個のメインウェル内に複数個のサブウェルを含み、高収率のスフェロイド／オルガノイドを作製することが可能であり、プレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタを含み、大容量の高速画像撮影時の公差を狭めてウェルプレート内の画像を均一に撮影できる細胞培養プレートを提供する。さらに、メインウェルの段差によって、培養される細胞は、培地交換時のピペッティング作業による影響を最小限に抑えられる細胞培養プレートを提供する。
以下に添付の図面を参照して本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。説明に先立って、本明細書及び請求の範囲で使用される用語又は単語は、通常又は辞書の意味に限定されて解釈されるべきではなく、発明者は、自身の発明を最も最良の方法で説明するために用語の概念を適切に定義できるという原則に基づいて、本発明の技術的思想に合致する意味と概念として解釈されなければならない。
従って、本明細書に記載された実施例及び図面に示される構成は、本発明の最も好ましい一実施例に過ぎず、本発明の技術的思想をすべて代用するものではないので、本出願時点においてこれらを置き換えることができる様々な均等物と変形例があり得ることを理解すべきである。
図１（ａ）は、本発明の一実施例による細胞培養プレートの正面図であり、図１（ｂ）は、本発明の一実施例による細胞培養プレートの断面図であり、図２は、本発明の一実施例による細胞培養プレートに形成されたメインウェルを詳細に示す図であり、図３は、本発明の一実施例による細胞培養プレートのウェルプレート、ベース及びカバーを示す図である（（ａ）カバー、（ｂ）ベース、（ｃ）マイクロプレート及びベースの固定手段）。
以下、図１～図３を参照して本発明の一実施例による細胞培養プレートを詳細に説明する。
図１～図３に示すように、本発明の一実施例による細胞培養プレート１０は、複数個のメインウェル１１０とメインウェル１１０のそれぞれの下部に形成され、細胞培養液が注入され、底面に凹部１２１を含む複数個のサブウェル１２０を含むウェルプレート１００と、ウェルプレート１００を支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタ２００とを含んで構成される。
まず、図１及び図２を参照して、本発明の一実施例によるウェルプレート１００を詳細に説明する。
前記ウェルプレート１００は、モールドを介してプラスチック射出成形されたプレート状に形成される。このようなプラスチック射出用モールドは、メインウェル１１０をウェル構造物として繰り返しパターンを持たせることで、産生単価を下げ、微細加工による大きさの拡大化を容易にすることによって 製造することができる。これによって、細胞の大量産生が容易であり、使用者のニーズに合わせて様々な大きさに変形して使用することができる。
前記メインウェル１１０は、ウェルプレート１００に複数個形成されており、それぞれのメインウェル１１０は、段差１０１を含む。前記段差１０１は、メインウェル１１０の所定の部位に形成されるものであって、より詳細には、前記段差１０１は、メインウェル１１０の全長の１／３～１／２の位置に形成されてもよく、前記段差１０１は、メインウェル１１０の下端から１／３～１／２の位置に形成されてもよい。
従来、マイクロプレートで細胞培養時には培養液を交換するピペッティング作業を行う場合があるが、この場合、細胞培養中のスフェロイド又はオルガノイドに影響を与えて、ピペッティング作業時にスフェロイド又はオルガノイドが吸い上がったり、位置が変わったりするなどといったことがあったので、細胞培養環境に好ましくない問題があったが、前記段差１０１をこのような問題を防止するために設けた。
前記段差１０１は、ピペットが適用される空間であってもよく、具体的には、メインウェル１１０の壁に対して１０～６０°の範囲の傾斜角（θ）を有してもよい。又は、２０～５０°の範囲の傾斜角を有してもよく、好ましくは３０～４５°の範囲の傾斜角を有してもよい。もし、前記段差１０１の傾斜角が１０°未満である場合には、メインウェル１１０内に傾斜角が小さすぎてピペットを適用することができる空間が十分に確保できず、メインウェル１１０内の培養液を吸入した際、ピペットがサブウェル１２０の内側で滑り、スフェロイド又はオルガノイドが吸い上がったり、位置が変わったりするなどといったことがある。併せて、前記傾斜角（θ）が６０°を超えると、ピペットを適用できる空間は確保されるが、段差１０１の傾斜角が大きいすぎて培養液を十分に吸入することが困難な場合があり、サブウェル１２０に細胞を播種するとき、細胞がすべてのサブウェル１２０に入り込まず、段差１０１に播種されるという問題が発生するおそれがある。従って、上述した範囲の傾斜角を有することが好ましい。
なお、本発明の一実施形態によるメインウェル１１０は、段差１０１と後述するサブウェル１２０との間に空間部１３０を含むことができる。具体的には、前記空間部１３０は、培養液が注入される空間であり、サブウェル１２０内部の細胞が同じ培養液を共有できる空間である。
より具体的には、空間部１３０の高さ（ａｈ）は、平均２．０～３．０ｍｍの範囲であってもよく、２．２～２．８ｍｍの範囲であってもよく、又は平均２．３～２．７ｍｍの範囲であってもよい。さらに、サブウェル１２０の高さ（ｂｈ）は平均１．０～２．０ｍｍの範囲であってもよく、又は平均１．２～１．８ｍｍの範囲であってもよい。
例えば、前記空間部１３０の高さ（ａｈ）は、平均２．５ｍｍであり、サブウェルの高さ（ｂｈ）は平均１．５ｍｍであってもよい。
このとき、前記空間部とサブウェル１２０との高さの比（ａｈ：ｂｈ）は１：０．３～１の範囲であってもよく、より詳細には、空間部とサブウェル１２０との高さの比（ａｈ：ｂｈ）は、１：０．４～０．９又は１：０．５～０．８であってもよい。もし、サブウェル１２０の高さが空間部の高さに対して１：０．３未満である場合には、サブウェル１２０の媒体を交換する際、小さな力でも内部で培養中の細胞が抜け出すことがあり、サブウェル１２０の高さが空間部の高さに対して１：１を超えると、細胞に必要な培養液が十分に変換されず、アポトーシスが誘発される可能性がある。従って、空間部１３０とサブウェル１２０は、上述した高さ範囲と高さの比を有することが好ましい。
次に、サブウェル１２０は、メインウェル１１０のそれぞれの下部に形成されるものであって、底面に凹部１２１を含む。特定の態様として、前記サブウェル１２０は、メインウェル１１０の下部に複数個を含むことができる。
メインウェル１１０の下部に含まれるサブウェル１２０は、それぞれの大きさと形状が同じであり、これにより均一な条件のスフェロイド及びオルガノイドを生成することができる。
前記サブウェル１２０は、凹部１２１に向かってテーパ状になるように傾斜面を形成することができる。具体的には、前記サブウェル１２０の上端部は、垂直方向を基準に下降するほど水平幅が小さくなることがある。例えば、前記サブウェル１２０の上端部は、逆ピラミッド状からなることができる。図示の実施例では、サブウェル１２０の上端部がピラミッド状又は漏斗状のように、垂直方向に下降するほど水平幅が小さくなる形状からなることができる。特に、前記サブウェル１２０は、大きさと形状が同じであるように複数個含むことによって、前記細胞培養プレートは均一な条件で大量のスフェロイド又はオルガノイドを生成することができる。
特定の様態として、１つのメインウェル１１０には同じ大きさのサブウェル１２０を４～２５個含むことができ、全マイクロプレート１００には９６～１，７２８個のサブウェル１２０を含むことができる。これにより同一で、精密に大きさを制御することが可能である。
加えて、サブウェル１２０は、凹部１２１を含み、前記凹部の下端には前記凹部１２１は３Ｄスフェロイド又はオルガノイドを培養できるように空間が形成される。具体的には、前記凹部１２１は、「Ｕ字状」、「Ｖ字状」、又は「Ц字状」であってもよく、例えば、前記凹部１２１は「Ｕ字状」であってもよい。
前記サブウェル１２０の上端径は３．０～４．５ｍｍの範囲であってもよく、３．５～４．３ｍｍであってもよく、又は平均４ｍｍであってもよい。さらに、凹部１２１の上端径は０．４５～１．５ｍｍであってもよく、０．５～１．０ｍｍ又は平均０．５ｍｍであってもよい。
加えて、前記サブウェル１２０の直径と凹部１２１の直径に対する長さの比は、１：０．１～０．５の範囲であってもよく、好ましくは前記サブウェル１２０の直径と凹部１２１の直径に対する長さの比は１：０．１２であってもよい。
前記凹部１２１の上端径がサブウェル１２０の上端径１に対して０．１未満の場合に凹部１２１の細胞培養空間を十分に確保することができず、培養液交換時に、小さな力でも細胞が抜け出る問題が発生することがあり、凹部１２１の上端径がサブウェル１２０の上端径１に対して０．５を超えると、細胞に必要な十分な培養液を交換できず、安定的に培養することが難しい問題が発生するおそれがある。
一方、メインウェルの壁を基準にサブウェル１２０と凹部１２１の傾斜面は４０～５０°の傾斜角（θ２）を有してもよく、４２～４８°の範囲の傾斜角（θ２）、４３～４７°の範囲の傾斜角（θ２）又は平均４５°の傾斜角（θ２）を有してもよい。
上述したサブウェル１２０は、１００～１０００ｃｅｌｌs／ｗｅｌｌ以下の細胞培養が可能であり、安定的にスフェロイドの大きさを制御できる利点がある。
さらに、本発明の一実施例によるメインウェル１１０の個々の体積は１００～３００μｌの範囲であり、凹部１２１の個々の体積は２０～５０μｌの範囲であり、前記メインウェル１１０と凹部１２１の個々の体積比は平均１：０．０７～０．５であることを特徴とする。好ましくは、前記一実施例によるメインウェル１１０の個々の体積は２５０～３００μｌの範囲であり、前記凹部の個々の体積は２５～３５μｌの範囲であってもよく、前記メインウェル１１０と凹部１２１の個々の体積比は平均１：０．１１であってもよい。
具体的には、メインウェル１１０の個々の体積が１００μｌ未満の場合、細胞培養時に十分な培養液を収容できない問題が発生するおそれがあり、３００μｌを超えると培養効率が低下する可能性がある。
併せて、凹部１２１は実質的な細胞が培養される空間であって、その体積が２０μｌ未満の場合には細胞培養空間が十分でないため、細胞が抜け出る問題が発生することがあり、５０μｌを超えると細胞等を安定して培養することが困難な問題が発生するおそれがある。従って、前記メインウェル１１０と凹部１２１は、上述した範囲の体積を有することが好ましい。
前述の本発明の細胞培養プレートの構成により、ハイドロゲルを含まなくても、即ち、ハイドロゲルを細胞培養プレートにコーティングしなくても細胞がスフェロイド状に維持され、人工多能性幹細胞へのリプログラミングが高効率で起こり、リプログラミング後に持続的にその形態と機能が維持される。
本発明の一実施例による細胞培養プレート１０は、ウェルプレート１００を支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタ２００を含む。ここで、ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタ２００とは、ＨＣＳ（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）システムに装着するコネクタ２００を意味するものであり、具体的には、前記コネクタ２００は本発明ではベース２１０とカバー２２０を意味することができる。
より具体的には、前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、ウェルプレート１００の下端と互いに着脱可能な固定手段１４０、２４０が備えられたベース２１０とウェルプレート１００の上部に配置し、ベース２１０と結合されるカバー２２０を含む。また、前記ベース２１０の上端及びウェルプレート１００の下端は、互いに着脱可能に固定可能な固定手段１４０、２４０を含むことを特徴とする。
このとき、前記ベースは、ウェルプレート１００を支持するための凸部２４０を含み、前記ウェルプレート１００は、ベース２１０の凸部２４０に対向する凹部１４０を含むことができる。前記固定手段によってウェルプレート１００を固定し、スクリーニング時に画像を均一に撮影することができる。
前記ベースは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルエーテルケトン又はポリエーテルイミド材料からなることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
前記ウェルプレートは、ポリジメチルシリコーン、高脂肪変性シリコーン、メチルクロロフェニルシリコーン、アルキル変性シリコーン、メチルフェニルシリコーン、シリコーンポリエステル、又はアミノ変性シリコーン材料からなることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
本発明のオルガノイドの作製方法は、マトリゲルの使用を最小限に抑えられるため経済的である。また、本発明によるオルガノイドの作製方法は、標準型オルガノイドを大量産生する効果を提供する。
本発明により、大容量薬物スクリーニングを行う際、従来と異なり互いに比較できる均一な大きさでオルガノイドが形成されるため、薬物の効果及び定量的解析が可能となる。これにより、各修飾遺伝子特異に適した薬物を選択することができ、より効果的な薬物治療が可能である。
本発明は、様々な形態に変更することができ、様々な実施形態を有することができるが、以下に特定の実施例を図に例示し、詳細な説明にて詳細に説明する。しかしながら、これは本発明を特定の実施形態に限定することを意図するものではなく、本発明の精神及び技術的範囲に含まれるすべての変形、等価物から代替物を含むことを理解されなければならない。本発明の説明において、関連する公知技術の具体的な説明が本発明の要旨を不明瞭にすると判断される場合、その詳細な説明は省略する。
実験方法
１：オルガノイドの作製
既存の大腸癌オルガノイドをプレートにてピペッティングで培地１ｍｌと共に１５ｍｌチューブに入れ、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上澄み液を除去した後、ＰＢＳ洗浄過程を一度行い、同様に２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。その後、アキュターゼ（ａｃｕｕｔａｓｅ）で７分間処理をし、単一細胞に完全に分離させた。この単一細胞を細胞培養プレートのサブウェルに約１００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、合計１４日間培養し、オルガノイドを作製した。この時、培養液はＤＭＥＭ／Ｆ１２に基づく培養液であり、当該培養液中にはＢ２７、Ｎ２、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ペニシリンストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、ニコチンアミド（Ｎｉｃｔｏｉａｍｉｄｅ）、 Ｎ－アセチル（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ）、ガストリン（ｇａｓｔｒｉｎ）、Ａ－８３－０１、ＥＧＦ、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１、ＷＮＴ３Ａが含まれ、培養条件は、マトリゲルを含有しない、又は２体積％含有した条件でオルガノイドを作製した。
２：オルガノイドの大きさと数の測定
オルガノイドの大きさの解析はＩｍａｇｅ Ｊプログラムを用いた。具体的には、位相画像から関心領域を選択し、Ｉｍａｇｅ Ｊプログラムでしきい値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を適用し、不要な部分を白く上書きし、適切に描画されていない部分は黒く塗りつぶした。黒で塗りつぶされたしきい値が適用される面積は外周を使って求めた。
３：免疫蛍光染色方法
免疫蛍光染色によりオルガノイドの幹細胞であるＬＧＲ５を染色し、確認した。まず、本発明による標準型オルガノイドを４％パラホルムアルデヒド溶液で常温で１時間保存した後、ＰＢＳで染色した。その後、１５％スクロースで１日、３０％スクロースで１日冷蔵保存した上、液体窒素を用いて凍結ブロック（ｃｒｙｏ－ｂｌｏｃｋ）を作製した。作製された凍結ブロックを用いて、１０μｍ厚に切断し、切断した面をスライドガラスに貼り付けた。ｔｒｉｔｏｎＸ ０．１％を１０分間処理した後、ＰＢＳで２回洗浄した。３％ＢＳＡで１時間常温で保存した後、２回のＰＢＳ洗浄後、ＬＧＲ５一次抗体を２時間常温で保持する。ＰＢＳ洗浄後、二次抗体を常温で２時間処理し、マウント溶液を入れて蛍光顕微鏡で測定した。
図１０の場合、培養した標準型オルガノイドを取り出し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ蛍光染色を行う。蛍光染色の場合、カルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ）１ｍＭは１ｍｌあたり２μｌ、ＥｔｄＨ－１ ２ｍＭは１ｍｌあたり１μｌで３０～６０分間インキュベーターに保管した後、蛍光顕微鏡で測定するようにする。
（実施例）
実施例１．
上記実験方法１にて述べた方法によりオルガノイドを作製した。マトリゲルを培養液に２体積％含有する条件（実施例１－１）と、マトリゲルを含まない条件（実施例１－２）でオルガノイドを作製した。
実施例２．
細胞をサブウェルに約２００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに播種したことを除いては、実施例１－１と同様の方法で細胞を培養した。
実施例３．
細胞をサブウェルに約３００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに播種したことを除いては、実施例１－１と同様の方法で細胞を培養した。
比較例１．
従来、広く使われている方法であるマトリゲル内にオルガノイドを培養し、高速大量イメージングを行った。ただし、比較例では通常使用する細胞培養プレートである９６ウェルプレートを用い、マトリゲル内に細胞を播種してオルガノイドを作製した。
（実験例）
実験例１．オルガノイド画像の解析
実施例１－１と比較例１にて培養した細胞を撮影し、細胞球の大きさを比較した。スフェロイドを自動化プレート機器でイメージングを行い、この時、自動に機器が焦点を合わせて行うようにした。画像の大きさの解析は、ｉｍａｇｅＪプログラムのマクロプログラムを用いて行った。
また、その結果を図４に示した。実施例１－１及び比較例１の高速大量イメージング結果を示す図である（（ａ）実施例１－１、（ｂ）比較例１）。
図４を参照すると、実施例１－１の場合、本発明の細胞培養プレートに培養した細胞の直径がほぼ均一であることが確認された。具体的には、細胞を各サブウェルに平均１００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌずつ播種した場合、比較解析可能な均一なオルガノイドを作製することができた。このとき、オルガノイドの大きさに対する誤差範囲は２０μｍ内外であった。これにより、本発明によるオルガノイド培養方法を用いると、標準オルガノイドの作製が可能であることが分かる。
反面、従来のウェルプレートを用いた比較例１の場合、細胞球の大きさが異に形成されることが確認できた。これは、１つのマトリゲルのドーム(dome) 状内で複数個の細胞が成長するため、生成されたオルガノイドの大きさの誤差範囲が１５０μｍ以上のばらつきが現れ、細胞が重なり合って成長することもあって、均一な高速大量イメージング及び実験が不可能であった。
本発明のベースとウェルプレートとを互いに固定するために、それぞれの凹部と凸部を含むが、前記凹部と凸部とが互いに結合されてベースがウェルプレートをしっかりと固定することができ、ウェルプレート内の画像を均一に撮影できることを示す。
反面、比較例１で培養されたオルガノイドの大きさ及び形状が均一でないことが分かる。これは、プレートベースがない場合、イメージングの焦点のずれが大きくなるため、画像の解析が難しくなるものと思われる。
また、図５に示すように、マトリゲルを含有しなくても本発明の細胞培養プレートを用いると、オルガノイドが良好に形成されたことが確認された。
図６は、培養したオルガノイドが正常に形成されたことを確認するために、大腸癌オルガノイドの形成に最も重要なマーカーであるＬＧＲ５を染色して発現レベルが確認されたものである。また、Ｆ－アクチン染色により形成された低濃度マトリゲル群又はマトリゲル非添加群の大腸癌オルガノイド中に結腸特異的構造が存在することが確認された。
実験例２．標準型オルガノイドの作製
実施例１－１と比較例１で培養した細胞を高速大量イメージングした。
実施例１－１と比較例１で作製されたオルガノイドは自動化プレート機器でイメージングを行い、このとき自動的に機器が焦点を合わせて行うようにした。画像の大きさの解析は、ｉｍａｇｅＪプログラムのマクロプログラムを用いて行った。
実施例１－１と比較例１で作製されたオルガノイドは自動化プレート機器でイメージングを行い、このとき自動的に機器が焦点を合わせて行うようにした。画像の大きさの解析は、ｉｍａｇｅＪプログラムのマクロプログラムを用いて行った。
そして、その結果を図７と図８に示す。
図７（ａ）は実施例１－１の高速大量イメージング結果を示す写真であり、図７（ｂ）は実施例１において一定期間培養したオルガノイドの面積を示すグラフであり、図８（ａ）は比較例１の高速大量イメージング結果を示す写真であり、図８（ｂ）は比較例１において一定期間培養したオルガノイドの面積を示すグラフである。
図７を参照すると、実施例１－１において作製されたオルガノイドを自動画像化した場合にイメージングの高さが均一で大きな誤差なくイメージングが可能であり、これにより実際の面積を測定したとき誤差範囲が非常に少ないことが確認された。
特に、本発明の細胞培養プレートを用いてオルガノイドを培養する場合、オルガノイドは均一な大きさで培養される。即ち、標準化が可能である。標準化の結果、画像測定時に焦点を自動に合わせ、コネクタ構造によって測定の高さのずれを最小化した。これにより、スクリーニング画像の測定時のずれが２０μｍ内外で非常に少なくなる。
図８を参照すると、比較例１の場合、オルガノイドが互いに重なり合って成長することが確認でき、オルガノイドの大きさと分布位置が互いに異なり、標準化が不可能であることがわかった。従って、スクリーニング画像を測定する時、誤差範囲が最大で１５０μｍ内外と大きいことが示された。
このような結果は、従来の方法でオルガノイドを培養すると、オルガノイドがマトリゲル内でランダムに成長し、所望のオルガノイドを均一に培養することが難しく、また測定の高さも可変的であるため、オルガノイドスクリーニングイメージングに適用することが難しい限界があるからである。従って、一定期間培養されたオルガノイドの面積を解析してみると、ばらつきが非常に大きく示される。
図９の場合、全体的に作製された標準型オルガノイドにおいて、Ｉｍａｇｅ Ｊプログラムを用いて各オルガノイドの直径を測定した。合計８６４個のウェルを高速大量イメージングを行い、これをＩｍａｇｅＪでそれぞれ解析して均一な直径が得られることが確認された。
図９は、実施例１－１の大腸癌細胞を１４日間培養したときのイメージング結果とオルガノイドの大きさを示す。オルガノイドの大きさが３００～５０μｍに均一であるので、標準的なオルガノイドの作製が可能であることが分かる。
図１０は、実施例１－１及び１－２によるオルガノイドを経時的に示す画像写真（左）及び実施例１－１によるオルガノイド生存率である（右）。図１０の場合、培養されたオルガノイドをＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色を行い、実際に培養されたオルガノイドがどの程度維持されているかが確認された。まず培養した標準型オルガノイドをＰＢＳで洗浄した後、アキュターゼで１０分程インキュベーションを行った。そして、単一細胞に断片化し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ試薬であるカルセインとＥｔｄＨ－１をインキュベーターで約３０～６０分ほど保管した後、Ｃ－Ｃｈｉｐに入れて蛍光顕微鏡でそれぞれどの程度存在するかを確認した結果を示したものである。
図１０を通じてマトリゲルがなくてもオルガノイドが非常にうまく形成されることが分かり、１４日間培養する場合、オルガノイド生存率が非常に高いことが分かる。
図１１は実施例１－１、２及び３の高速大量イメージング結果を示す写真であり、図９は実施例１－１、２及び３で大腸癌細胞を１４日間培養したときのイメージング結果を示す（（ａ）実施例１－１、（ｂ）実施例２、（ｃ）実施例３）。
図１１（ａ）を参照すると、細胞をそれぞれのサブウェルに平均１００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌずつ播種した場合、比較解析可能な均一なオルガノイドを作製することができた（誤差範囲：２０μｍ内外）。
反面、図１１（ｂ）及び図１１（ｃ）を参照すると、細胞をサブウェルに１００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ以上播種する場合、オルガノイドが前記サブウェルからオーバーフローし、均一でないオルガノイドが生成されることが確認できる。
図１２は実施例１－１、２及び３の高速大量イメージング結果を示すグラフであり、図１２は実施例１－１、２及び３で大腸癌細胞を７日又は１４日間培養したときの結果を示す（（ａ）実施例１－１、（ｂ）実施例２、（ｃ）実施例３）。
図１２を参照すると、細胞を平均１００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ平均１４日間培養した場合、最も好ましいオルガノイドを作製できることを示す。即ち、平均１００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ以下の細胞を１４日培養したとき、最適なオルガノイドが分化及び成長することができるものとみられる。一方、サブウェルに播種する細胞を増やし、培養日数を減らす場合には、オルガノイドの性能が低下することが確認できた。
参考までに、図１２の破線は、本発明の細胞培養プレートのサブウェルの最大空間を意味するものであり、細胞を培養できる空間を意味する。これは、平均１００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ以下の細胞を培養することができると判断される。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に説明したが、この技術分野における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい実施形態に過ぎず、これにより本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義される。
１００：ウェルプレート
１０１：段差
１１０：メインウェル
１２０：サブウェル
１２１：凹部
１３０：空間部
１４０：落とし込み部
２００：ハイコンテントスクリーニング用コネクタ
２１０：ベース
２２０：カバー
２４０：凸部
１０１：段差
１１０：メインウェル
１２０：サブウェル
１２１：凹部
１３０：空間部
１４０：落とし込み部
２００：ハイコンテントスクリーニング用コネクタ
２１０：ベース
２２０：カバー
２４０：凸部
Claims (10)
- オルガノイドの作製方法であって、
細胞を３次元細胞培養プレートで培養してオルガノイドを形成する工程を含み、
前記オルガノイド形成工程において、前記細胞培養プレートは、細胞外マトリックスに基づくハイドロゲルを０～２体積％含み、
前記３次元細胞培養プレートは、
複数個のメインウェル（ｍａｉｎ ｗｅｌｌ）と、前記メインウェルのそれぞれの下部に形成され、細胞培養液が注入され、底面に凹部を含む複数個のサブウェル（ｓｕｂ ｗｅｌｌ）と、を含むウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）と、
前記ウェルプレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタと、を含み、
前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、
前記ウェルプレートの下端に互いに着脱可能に固定手段が備えられたベースと、前記ウェルプレートの上部に配置され、前記ベースと結合されるカバーと、を含み、前記メインウェルは、所定の部位がテーパ状になるように段差が形成され、
前記段差は、前記メインウェルの壁に対して１０～６０°範囲の傾斜角（θ）を有する、
オルガノイドの作製方法。 - 前記細胞外マトリックスに基づくハイドロゲルは、マトリゲルである、請求項１に記載のオルガノイドの作製方法。
- 前記細胞は、正常細胞又は癌細胞であり、
前記培養期間は１～１４日である、請求項１に記載のオルガノイドの作製方法。 - 前記オルガノイドの大きさは、直径３００～５００μｍである、請求項１に記載のオルガノイドの作製方法。
- 前記サブウェルは、前記凹部に向かってテーパ状になるように傾斜面が形成されることを特徴とする、請求項１に記載のオルガノイドの作製方法。
- 前記サブウェルは、前記凹部に向かってテーパ状になるように傾斜面が形成され、
前記サブウェル（１２０）の上端径は、３．０～４．５ｍｍの範囲であり、
前記凹部（１２１）の上端径は、０．４５～１．５ｍｍの範囲であり、
前記サブウェルと前記凹部の前記傾斜面（θ２）は４０～５０°の範囲であり、
前記サブウェルの直径と前記凹部の直径に対する長さの比は、１：０．１～０．５の範囲であることを特徴とする、請求項１に記載のオルガノイドの作製方法。 - 前記メインウェルの個々の体積は、１００～３００μｌの範囲であり、
前記凹部の個々の体積は、２０～５０μｌの範囲であり、
前記メインウェルと前記凹部の個々の体積比は、平均１：０．１～０．５であることを特徴とする、請求項１に記載のオルガノイドの作製方法。 - 前記メインウェルは、前記段差と前記サブウェルとの間に空間部を含み、
前記空間部の高さ（ａｈ）は、平均２．０～３．０ｍｍの範囲であり、
前記サブウェルの高さ（ｂｈ）は、平均１．０～２．０ｍｍの範囲であり、
前記空間部と前記サブウェルの高さの比（ａｈ：ｂｈ）は、１：０．３～１の範囲であることを特徴とする、請求項１に記載のオルガノイドの作製方法。 - 前記細胞は、前記細胞培養プレートに１００～３００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種されるものである、請求項１に記載のオルガノイドの作製方法。
- 請求項１～９のいずれか一項に記載の前記オルガノイドの作製方法に従って作製された直径３００～５００μｍの大きさを有する、オルガノイド。
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