CN114423858A - 标准型类器官的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了标准型类器官的生产方法。
Description
技术领域
本发明涉及生产标准型类器官的方法。更具体地，本发明涉及生产具有均匀大小的类器官的方法。
背景技术
类器官也称为“器官类似物”或“类器官”，是通过3D培养方法将从干细胞或器官来源细胞中分离出来的细胞重新聚集和重组而产生的器官特异性细胞聚集体。类器官包括模型器官的特异性细胞，再现器官的特异性功能，并且可以以类似于实际器官的形式空间上组织。据报道，患者来源的肿瘤类器官代表患者癌细胞和组织的特征，因为它们可以再现患者的癌症组织的遗传变异特征。
类器官可用于细胞治疗、生物组织工程、新药开发、毒理学和精准医学等领域。需要大量可比较的定量类器官及其分析方法来提高类器官的利用率。然而，迄今为止还没有定量培养类器官的方法。其原因在于，作为最重要的类器官生长元素的基底胶在底部固化成圆顶状后，类器官就会在其中生长，从而使类器官单独生长。
此外，由于在基底胶中如此生长的类器官可以在3D载体中重叠的同时生长，因此限制是明确的。
此外，最近，已经开发出结合更稳定和生理患者来源的类器官的高通量筛选技术，用于早期药物发现程序和毒性筛查。
韩国专利第10-1756901号(专利文献1)公开了一种能够培养3D组织细胞的细胞培养芯片。在专利文献1的细胞培养芯片中，第1培养部、第2培养部和第3培养部在各层中形成，并且能够在各层确认细胞增殖的进展程度。但是，专利文献1的细胞培养芯片存在不能以高收率获得类器官的问题。
此外，存在在进行细胞培养的过程中更换培养液的移液作业的情况，在能够进行3D细胞培养的Corning球状体微孔板的情况下，细胞培养中的球状体或类器官会受到影响，使得因为存在在移液作业的过程中球状体或类器官会被吸起或位置发生变化的情况，而存在不利于细胞培养环境的问题。
因此，本发明人在不使用基于胞外基质的水凝胶(例如，基质胶)或最小化基于胞外基质的水凝胶的使用的情况下，对大小均一的标准型类器官进行了持续研究，从而完成了本发明。
[相关技术文献]
[专利文献]
1.韩国专利第10-1756901号
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供生产标准型类器官的方法。
本发明的另一目的是提供一种由上述方法制备的标准型类器官，其大小均一且各类器官的功能相似。
然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，本领域技术人员可以通过以下描述清楚地理解未提及的其他问题。
技术方案
为实现该目的，本发明是
一种生产类器官的方法，所述方法包括：
通过在3D细胞培养板中培养细胞形成类器官，
其中，在所述类器官的形成中，所述细胞培养板包含0至2体积％的基于胞外基质的水凝胶，以及
其中，3D细胞培养板包括：
孔板，所述孔板包括多个主孔和多个子孔(sub well)，所述多个子孔形成在主孔的下部以注入细胞培养液并且包括在其底表面上的凹入部；和支持所述孔板的用于大容量和高速高内涵筛选(HCS)的连接件，并且
用于高内涵筛选(HCS)的连接件包括配备有固定装置以与所述孔板的下端连接并且从所述孔板的下端分离的底座以及位于所述孔板的上部以连接到所述底座的盖，所述主孔具有形成为在预定位置逐渐变细的台阶，所述台阶相对于主孔的壁具有10°至60°的倾斜角(θ)。
细胞可以是正常细胞或癌细胞。
细胞可以是单细胞。
细胞可以通过从正常组织、癌组织或已经产生的类器官中分离获得。由于制造组织细胞并将细胞分离成单细胞的方法是已知技术，因此将省略其具体描述。
细胞培养周期优选为1至14天。
基于胞外基质的水凝胶可以是基底胶(Matrigel)(产品名)。
类器官的大小可以是直径为300至500μm。
如本文所用，术语“标准型类器官”是指直径为300至500μm的大小均一的类器官。
本发明生产的类器官的大小范围为300至500μm，这是特别针对癌症疾病优化的大小。
如下文将详细描述的，当使用本发明的3D细胞培养板时，可以大量生产标准型类器官。
3D细胞培养板的子孔可以具有形成为朝向凹入部逐渐变细的倾斜表面，子孔的上端直径可以为3.0至4.5mm，凹入部的上端直径可以为0.45到1.5mm，子孔和凹入部之间的倾斜表面(θ2)可以在40到50°的范围内，并且子孔的直径与凹入部的直径的长度比可以为1:0.1至1:0.5。
3D细胞培养板的主孔的个体体积可以为100μl至300μl，凹入部的个体体积可以为20μl至50μl，主孔与凹入部的个体体积比可以平均为1:0.1至1:0.5。
主孔包括台阶和子孔之间的空间部，空间部的高度(ah)可以平均为2.0至3.0mm，子孔的高度(bh)可以平均为1.0到2.0mm，空间部与子孔的高度比(ah:bh)可以为1:0.3至1:1。
细胞可以100至300个细胞/孔接种在细胞培养板上。
在下文中，将详细描述本发明。
由于本发明可以以各种形式进行修改并且包括各种示例性实施方式，因此将在附图中示出具体的示例性实施方式并且在具体实施方式中进行详细描述。
但是，该描述并不旨在将本发明限制于具体的实施方式，并且应当理解，本发明的构思和技术范围所包含的所有变化、等同物和替代物均包含在本发明中。当确定在描述本发明时对相关公知技术的详细描述可能使本发明的主旨模糊不清时，将省略其详细描述。
本申请中使用的术语仅用于描述具体实施方式，并不旨在限制本发明。除非上下文另有明确说明，否则单数表达包括复数表达。
在本发明中，术语“包括”或“具有”意在表示说明书中描述的特征、数量、步骤、操作、构成要素、部分或其任意组合的存在，并且应理解为不排除存在或添加一种或多种其他特征或数量、步骤、操作、构成要素、部件或其任意组合的可能性。
一般来说，当培养类器官时，使用水凝胶来提供胞外基质的作用。例如，基底胶在细胞培养板底部固化成圆顶状后，类器官生长在其中，而类器官生长的大小和形状不同，功能发展也不同，因此存在难以使类器官标准化的问题。
本发明使用不包括或包括最少量的基于胞外基质的水凝胶的3D细胞培养板生产类器官。下面对本发明的3D细胞培养板进行具体说明。
在示例性实施方式中，本发明使用3D细胞培养板，所述3D细胞培养板包括：
孔板，所述孔板包括多个主孔和多个子孔，所述多个子孔形成在主孔的下部以注入细胞培养液并且包括在其底表面上的凹入部；和
支持所述孔板的用于大容量和高速高内涵筛选(HCS)的连接件，
其中，用于高内涵筛选(HCS)的连接件包括配备有固定装置以与所述孔板的下端连接并且从所述孔板的下端分离的底座以及位于所述孔板的上部以连接到所述底座的盖，
所述主孔具有形成为在预定位置逐渐变细的台阶，所述台阶相对于主孔的壁具有10°至60°的倾斜角(θ)。
相关技术中的96孔板存在的问题在于，为了评价高收率药物的功效，需要进行数次或更多的实验和分析，因此花费大量时间和成本。此外，在通常进行的细胞培养过程中更换培养液的移液作业的情况是存在的，在相关技术的Corning球状体微孔板的情况下，细胞培养中的球状体或类器官会受到影响，使得因为存在在移液作业的过程中球状体或类器官被吸起或位置发生变化的情况，而存在不利于细胞培养环境的问题。
因此，本发明致力于解决上述问题，并提供一种细胞培养板，该细胞培养板通过在孔板的多个主孔中包括多个子孔，从而能够以高收率制造球状体/类器官，并且该细胞培养板通过包含支持孔板的用于大容量和高速高内涵筛选(HCS)的连接件，以减少捕获大容量和高速图像时的容差，从而能够均匀地捕获孔板中的图像。此外，本发明提供一种细胞培养板，该细胞培养板能够将更换培养基期间的移液作业对通过主孔的台阶培养的细胞的影响降至最低。
在下文中，将参考附图详细描述本发明的优选示例性实施方式。在描述之前，说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应被解释为限于一般或字典含义，而应根据发明人可以适当地定义术语的概念以便以最佳方法描述他/她自己的发明的原则，而解释为符合本发明的技术精神的含义和构思。
因此，由于本说明书中描述的示例性实施方式和附图中所示的构造仅是本发明的最优选的示例性实施方式并且不代表本发明的全部技术精神，因此应当理解，在提交本申请时，可以替换示例性实施方式和构造的各种等效物和修改示例是可能的。
图1(a)是根据本发明的示例性实施方式的细胞培养板的正视图；图1(b)是根据本发明的示例性实施方式的细胞培养板的截面视图；图2是示出在根据本发明的示例性实施方式的细胞培养板中形成的主孔的视图；图3是示出根据本发明的示例性实施方式的细胞培养板的孔板、底座和盖的视图((a)盖，(b)底座，和(c)微孔板和底座的固定装置)。
在下文中，将参照图1至图3详细描述根据本发明的示例性实施方式的细胞培养板。
如图1至图3所示，根据本发明的示例性实施方式的细胞培养板10包括：孔板100，孔板100包括多个主孔110和多个子孔，多个子孔形成在主孔110的下部以注入细胞培养液并且包括在其底表面上的凹入部121；和支持孔板100的用于大容量和高速高内涵筛选(HCS)的连接件200。
首先，将详细描述根据本发明的示例性实施方式的孔板100。
孔板100通过模具注塑成型制成板状。为了制造如上所述的用于注塑的模具，主孔110具有作为孔结构的重复图案，从而可以降低生产的单位成本并且可以通过精细加工容易地增加尺寸。因此，细胞容易量产，可以根据用户的要求将细胞转化成各种尺寸并使用。
孔板100中形成有多个主孔110，每个主孔110包括台阶101。台阶101在主孔110的预定位置处形成，更具体地，台阶101可以在主孔110总长度的1/3至1/2的位置处形成，台阶101可以在距主孔110下端的总长度的1/3至1/2的位置处形成。
在相关技术中，存在在进行的细胞培养过程中更换培养液的移液作业的情况，在这种情况下，细胞培养中的球状体或类器官会受到影响，使得因为存在在移液作业的过程中球状体或类器官被吸起或位置发生变化的情况，而存在不利于细胞培养的问题，但设置台阶101以防止该问题。
台阶101可以是放置移液器的空间，具体地，可以相对于主孔110的壁具有10°至60°的倾斜角(θ)。可替代地，台阶101的倾斜角可以在20°至50°的范围内，优选地在30°至45°的范围内。当台阶101的倾斜角小于10°时，主孔110内的倾斜角太小，以至于可放置移液器的空间不足，结果，当主孔110中的培养液被吸起时，移液器可能在子孔120内滑动，导致球状体或类器官被吸起，或者其位置等发生变化。此外，在倾斜角(θ)超过60°的情况下，虽然设置了可放置移液器的空间，但台阶101的倾斜角过大，以致于可能难以充分吸取培养液，并且在子孔120中接种细胞时，可能会出现细胞接种在台阶101上而没有进入所有子孔120的问题。因此，期望具有上述范围内的倾斜角。
同时，根据本发明的示例性实施方式的主孔可以包括下文将描述的在台阶101和子孔120之间的空间部130。具体而言，空间部130是注入培养液的空间，是子孔120内的细胞能够共享同一培养液的空间。
更具体地，空间部130的高度(ah)可以平均为2.0mm至3.0mm，或2.2mm至2.8mm，或者2.3mm至2.7mm。此外，子孔120的高度(bh)可以平均为1.0mm到2.0mm，或者平均为1.2mm到1.8mm。
例如，空间部130的高度(ah)可以平均为2.5mm，并且子孔的高度(ah)可以平均为1.5mm。
在这种情况下，空间部与子孔120的高度比(ah:bh)可以为1:0.3到1:1，更具体地，空间部与子孔120的高度比(ah:bh)可以为1:0.4至1:0.9或1:0.5至1:0.8。当空间部的高度与子孔120的高度之比小于1:0.3时，在更换子孔120的培养基过程中，即使用很小的力，培养中的细胞也可能从内部逸出，当空间部的高度与子孔120的高度之比超过1:1时，细胞所需的培养液不能得到充分更换，从而可能导致细胞死亡。因此，空间部130和子孔120优选具有上述范围的高度和高度比。
接下来，子孔120在每个主孔110的下部形成并且包括在其底表面上的凹入部121。作为特定方面，子孔120可以包括在主孔110的下部的多个凹入部。
包括在主孔110的下部的子孔120具有相同的尺寸和形状，从而能够在均匀的条件下生产球状体和类器官。
子孔120可以具有形成为朝向凹入部121逐渐变细的倾斜表面。具体地，子孔120的上部的水平面积可以随着其沿垂直方向下降而变小。例如，子孔120的上部可以形成为倒金字塔形。在图示的示例性实施方式中，子孔120的上部可以形成为诸如金字塔形或漏斗形的形状，其中子孔120的上部的水平面积随着其沿垂直方向下降而变小。
特别地，细胞培养板可以通过包括具有相同的尺寸和形状的多个子孔120，而在均匀的条件下生产大量的球状体或类器官。
作为特定方面，一个主孔110可以包括4至25个相同尺寸的子孔120，整个微孔板100可以包括96至1,728个子孔120。因此，可以以相同的精确方式控制尺寸。
此外，子孔120包括凹入部121，并且在凹入部的下部形成空间，使得可以在凹入部121中培养3D球状体或类器官。具体地，凹入部121可以是字母“U”、“V”或“Ц”的形式，例如，凹入部121可以是字母“U”的形式。
子孔120的上端直径可以为3.0mm至4.5mm，或3.5mm至4.3mm，或平均为4mm。此外，凹入部121的上端直径可以为0.45mm至1.5mm，或0.5mm至1.0mm，或平均为0.5mm。
此外，子孔120的直径与凹入部121的直径的长度比可以为1:0.1至1:0.5，优选地，子孔120的直径与凹入部121的直径的长度比可以为1:0.12。
当凹入部121的上端直径与子孔120的上端直径1相比小于0.1时，不能充分提供凹入部121的细胞培养空间，这可能引起在更换培养液的过程中，即使用很小的力细胞也会逸出的问题，而当凹入部121的上端直径与子孔120的上端直径1相比超过0.5时，无法更换细胞所需的足量培养液，这可能引起难以稳定培养细胞的问题。
同时，子孔120和凹入部121之间的倾斜表面相对于主孔的壁的倾斜角(θ2)可以为40°至50°、42°至48°、43°至47°，或者倾斜角(θ2)平均为45°。
上述子孔120具有能够以100～1000个细胞/孔以下培养细胞和能够稳定地控制球状体尺寸的优点。
此外，根据本发明的示例性实施方式的主孔110的个体体积可以为100μl至300μl，凹入部121的个体体积可以为20至50μl，以及主孔110与凹入部121的个体体积比可以被表征为平均为1:0.07至1:0.5。优选地，根据示例性实施方式的主孔的个体体积可以为250至300μl，凹入部的个体体积可以为25至35μl，以及主孔110与凹入部121的个体体积比可以平均为1:0.11。
具体而言，当主孔110的个体体积小于100μl时，会出现在细胞培养过程中不能容纳足够的培养液的问题，当个体体积超过300μl时，培养效率可能会降低。
另外，凹入部121是实质上培养细胞的空间，当体积小于20μl时，细胞培养空间不足，这可能会导致细胞逸出的问题，当体积超过50μl时，可能会出现难以稳定培养细胞等问题。因此，主孔110和凹入部121优选具有在上述范围内的体积。
由于本发明的细胞培养板的上述构造，细胞以不包括水凝胶的球状体的形式维持，即，在细胞培养板不涂水凝胶的情况下，细胞重编程为诱导性多能干细胞的效率很高，并且即使在重编程后，其形态和功能也能持续保持。
根据本发明的示例性实施方式的细胞培养板10包括支持所述孔板100的用于大容量和高速高内涵筛选(HCS)的连接件200。在此，用于大容量和高速高内涵筛选(HCS)的连接件200是指连接到高内涵筛选(HCS)系统的连接件200，具体地，在本发明中，连接件可以指底座210和盖220。
更具体地，用于大容量和高速高内涵筛选(HCS)的连接件包括配备有固定装置140和240以与孔板100的下端连接并且从孔板100的下端分离的底座210以及位于孔板100的上部以连接到底座210的盖220。另外，底座210的上端和孔板100的下端被表征为，包括可以固定的固定装置140和240以使彼此可连接并且分离。
在这种情况下，底座包括用于支持孔板100的凸起部240，孔板100可以包括面对底座210的凸起部240的凹陷部140。孔板100可以通过固定装置被固定以在筛选期间均匀地捕获图像。
底座可由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酰胺、聚酯、聚氯乙烯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚偏二氯乙烯、聚四氟乙烯、聚醚醚酮或聚醚酰亚胺材料形成，但不限于此。
孔板可以由聚二甲基硅酮、高脂改性硅酮、甲基氯苯基硅酮、烷基改性硅酮、甲基苯基硅酮、硅酮聚酯或氨基改性硅酮材料形成，但不限于此。
有益效果
本发明的生产类器官的方法是经济的，因为可以最小化基底胶的使用。另外，根据本发明的生产类器官的方法提供大量生产标准型类器官的效果。
通过本发明，在进行大规模的药物筛选时，与常规类器官不同，形成了大小均一、相互可比的类器官，从而使药物的效果和定量分析成为可能。这使得选择适合每种变异基因的特异性的药物成为可能，从而可以实现更有效的药物治疗。
附图说明
图1(a)是根据本发明的示例性实施方式的细胞培养板的正视图；图1(b)是根据本发明的示例性实施方式的细胞培养板的截面视图。
图2是详细示出在根据本发明的示例性实施方式的细胞培养板中形成的主孔的视图。
图3是示出根据本发明的示例性实施方式的细胞培养板的孔板、底座和盖的视图((a)盖、(b)底座、和(c)微孔板和底座的固定装置)。
图4是表示实施例1和比较例1((a)实施例1、(b)比较例1)的高速大量成像结果的图。
图5示出了培养根据本发明的示例性实施方式的包含2体积％的基底胶的类器官以及不使用基底胶的类器官的结果。
图6示出了根据本发明的示例性实施方式的包含2体积％的基底胶的类器官以及不使用基底胶的类器官的免疫荧光染色的结果。
图7(a)是示出实施例1的高速大量成像结果的照片，图7(b)是示出实施例1中培养的类器官的面积的图。
图8(a)是示出比较例1的高速大量成像结果的照片，图8(b)是示出比较例1中培养的类器官的面积的图。
图9示出了当根据本发明的示例性实施方式的结肠直肠癌细胞培养14天时的成像结果(左)和类器官大小分布(右)。
图10示出了通过培养根据本发明的示例性实施方式的结肠直肠癌细胞14天获得的类器官染色图像(左)和类器官存活率(右)。
图11和图12是分别表示实施例1至3((a)实施例1、(b)实施例2、(c)实施例3)的高速大量成像结果的照片和图。
具体实施方式
由于本发明可以被修改为各种形式并且包括各种示例性实施方式，因此将在附图中示出具体的示例性实施方式并且在具体实施方式中进行详细描述。然而，该描述并不旨在将本发明限制于具体的示例性实施方式，并且应当理解，属于本发明的精神和技术范围的所有变化、等同物和替代物都包含在本发明中。当确定在描述本发明时对相关公知技术的详细描述可能使本发明的主旨模糊不清时，将省略其详细描述。
实施例
实验方法
1.类器官的生产
将现有的大肠癌类器官通过移液器从板中放入15ml试管中，以2000rpm离心3分钟，去除上清液，然后进行一次PBS洗涤过程，再将试管以2000rpm离心3分钟。然后，细胞用细胞消化酶(Accutase)处理7分钟并完全分离成单细胞。将这些单细胞以约100个细胞/孔接种在细胞培养板的子孔中，通过总共培养单细胞14天生产类器官。在这种情况下，培养液是基于DMEM/F12的培养液，并且B27、N2、GlutaMAX、青霉素链霉素、烟酰胺、N-乙酰基、胃泌素、A-83-01、EGF、noggin、R-spondin1和WNT3A包含在相应的培养液中，并且在不含有基底胶或含有2体积％基底胶的培养条件下生产类器官。
2：类器官的大小和数量的测量
ImageJ程序用于类器官的大小分析。具体来说，通过在相位图像中选择感兴趣区域并在ImageJ程序中应用阈值，将不需要的部分覆盖，将未正确绘制的部分填充为黑色。使用外周对应用了用黑色填充的阈值的区域进行计算。
3：荧光染色方法
LGR5是一种类器官干细胞，其通过免疫荧光染色进行染色和确认。首先，将本发明的标准型类器官在室温下于4％多聚甲醛溶液中保存1小时，然后用PBS染色。然后，将标准型类器官在15％蔗糖中冷藏1天和在30％蔗糖中冷藏1天后，使用液氮制造冷冻块(cryo-block)。使用制造的冷冻块，将块切割成10μm的厚度，并将切下的横截面贴在载玻片上。载玻片用0.1％TritonX处理10分钟，然后用PBS洗涤两次。载玻片在3％BSA中于室温下保存1小时后，用PBS清洗载玻片两次，然后将LGR5一抗在室温下维持2小时。用PBS清洗后，将二抗在室温下处理2小时，加入封固液，在荧光显微镜下进行测定。
在图10的情况下，取出培养的标准型类器官，进行死/活(Live/Dead)荧光染色。在荧光染色的情况下，将1mM钙黄绿素和2mM EtdH-1分别以2μl/1ml和1μl/1ml在培养箱中保存30至60分钟，然后在荧光显微镜下进行测量。
[实施例]
实施例1.
由实验方法1中描述的方法生产类器官。在培养液中在含有2体积％的基底胶的条件下(实施例1-1)和不含有基底胶的条件下(实施例1-2)生产类器官。
实施例2.
以与实施例1-1中相同的方式培养细胞，不同之处在于将细胞以约200个细胞/孔接种在子孔中。
实施例3.
以与实施例1-1中相同的方式培养细胞，不同之处在于将细胞以约300个细胞/孔接种在子孔中。
比较例1.
在基底胶中培养类器官，这是相关技术中广泛使用的方法，并进行了高速大量成像。但是，在比较例中，使用了作为通常使用的细胞培养板的96孔板，通过在基底胶中接种细胞来生产类器官。
<实验例>
实验例1.类器官图像分析
对实施例1-1和比较例1中培养的细胞进行拍照，比较细胞球的大小。通过自动板装置对球状体进行成像，并且在这种情况下，允许该装置通过自动聚焦来进行成像。使用ImageJ程序的宏程序进行图像大小分析。
此外，结果示于图4中。图4是表示实施例1-1和比较例1((a)实施例1-1、(b)比较例1)的高速大量成像结果的图。
参考图4，证实了在实施例1-1的情况下，在本发明的细胞培养板上培养的细胞的直径几乎均一。具体而言，当细胞以平均100个细胞/孔接种到每个子孔中时，可以制造出可以进行比较分析的均一的类器官。在这种情况下，类器官大小的误差范围约为20μm。由此可知，使用本发明的类器官培养方法，可以生产标准型类器官。
相反，可以确认在使用现有技术的孔板的比较例1的情况下，细胞球形成为具有不同的大小。一个基底胶的圆顶形态中，由多个细胞生长生成的类器官的大小误差范围出现150μm以上的偏差，细胞在生长的同时重叠，因此不可能进行均匀的高速大量成像和实验。
本发明的底座和孔板包括分别相互固定的凸起部和凹陷部，凸起部和凹陷部可以相互连接，从而使底座牢固地固定孔板，表明可以均匀地捕获孔板中的图像。
相比之下，可以看出比较例1中培养的类器官的大小和形状不均匀。这似乎使图像分析变得困难，因为在没有板底座的情况下，成像的焦点偏差会增加。
此外，参考图5，确认了使用本发明的细胞培养板时，即使不含有基底胶，也能良好地形成类器官。
图6通过对作为结直肠癌类器官形成的最重要标志物的LGR5染色来确认表达水平，从而确认培养的类器官是否成功形成。此外，通过F-肌动蛋白染色，证实了在低浓度基底胶组或未使用基底胶组的结肠直肠癌类器官中存在结肠特异性结构。
实验例2.标准型类器官的制造
对实施例1-1和比较例1中培养的细胞进行高速大量成像。
将实施例1-1和比较例1中生产的类器官通过自动板装置进行成像，在这种情况下，使该装置通过自动对焦进行成像。使用ImageJ程序的宏程序进行图像大小分析。
此外，结果示于图7和8中。
图7(a)是示出实施例1-1的高速大量成像结果的照片，图7(b)是示出实施例1中培养一定时间的类器官的面积的图。图8(a)是示出比较例1的高速大量成像结果的照片，图7(b)是示出比较例1中培养一定时间的类器官的面积的图。
参考图7，可以确认，当对实施例1-1中制备的类器官进行自动成像时，由于成像高度是均一的，可以在没有大误差的情况下进行成像，由于这个事实，测量实际面积时的误差范围非常小。
特别地，当使用本发明的细胞培养板培养类器官时，类器官被培养成均一的大小。也就是说，标准化是可能的。作为标准化的结果，在图像测量期间自动确定焦点，并且通过连接器结构将测量高度的偏差最小化。因此，在测量筛选图像时，偏差为20μm左右，显示为非常小。
参考图8可知，可以确认在比较例1的情况下，类器官相互重叠地生长，可知类器官的大小和分布位置不同，因此无法标准化。因此，在测量筛选图像的过程中，误差范围高达150μm，这是很大的。
上述结果是因为当通过相关领域的方法培养类器官时，由于类器官在基底胶中随机生长，难以均匀培养所需的类器官，并且测量的高度也是可变的，因此，存在难以将测量的高度应用于类器官筛选成像的限制。因此，当对培养一定时间的类器官的面积进行分析时，偏差显得非常大。
在图9的情况下，在作为整体而生产的标准型类器官中，使用ImageJ程序测量了每个类器官的直径。共对864个孔进行了高速大量成像，通过ImageJ分析每个图像，证实获得了均一的直径。
图9示出了实施例1-1的结直肠癌细胞培养14天时的成像结果和类器官的大小。可以看出，可以制造标准类器官，因为类器官的大小均匀，为300至50μm。
图10是一组图像照片，示出了根据实施例1-1和1-2的类器官随时间的变化(左)和一组根据实施例1-1的类器官的活力(右)。在图10的情况下，通过对培养的类器官进行活/死(Live/Dead)染色，确认了有多少培养的类器官实际上得以维持。首先，将培养的标准型类器官用PBS洗涤，然后用细胞消化酶(Accutase)温育约10分钟。
然后，将标准型类器官分裂成单细胞，活/死(Live/Dead)试剂钙黄绿素和EtdH-1在培养箱中保存约30至60分钟后，通过将试剂分别放入C-Chip中在荧光显微镜下确认各试剂有多少出现，其结果示于图10。
通过图10，可以看出，在没有基底胶的情况下，类器官的形成非常好，结直肠癌细胞培养14天时类器官的活力非常高。
图11是示出实施例1-1、2和3的高速大量成像结果的一组照片。图9示出实施例1-1、2和3((a)实施例1-1、(b)实施例2、(c)实施例3)中培养14天的结肠癌细胞的成像结果。
参考图11(a)，当细胞以平均100个细胞/孔接种在每个子孔中时，可以制造出可以分析和比较的均一的类器官(误差范围：约20μm)。
相比之下，参考图11(b)和11(c)，可以确认，当细胞以超过100个细胞/孔接种在子孔中时，类器官从子孔溢出，因此产生了不均一的类器官。
图12是示出实施例1-1、2和3的高速大量成像结果的图。图12示出实施例1-1、2和3((a)实施例1-1、(b)实施例2、(c)实施例3)中培养7天或14天的结肠细胞的结果。
参考图12，示出了当细胞以平均100个细胞/孔培养14天时，可以制造出最理想的类器官。也就是说，认为当细胞以平均100个细胞/孔或更少培养14天时，可以分化和生长出最佳的类器官。相反，可以确认当子孔中接种的细胞的数量增加并且培养天数减少时，类器官性能下降。
作为参考，图12中的虚线表示本发明的细胞培养板的子孔的最大空间，表示可以培养细胞的空间。这被认为能够以平均100个细胞/孔或更少来培养细胞。
尽管已经详细描述了本发明的特定部分，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，这样的具体描述只是一个优选实施方式，本发明的范围不受此限制。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同物来定义。
附图标记和符号的说明
100：孔板
101：台阶
110：主孔
120：子孔
121：凹入部
130：空间部
140：凹陷部
220：用于大容量和高速HCS的连接件
210：底座
220：盖
240：凸起部
Claims (10)
1.一种生产类器官的方法，所述方法包括：
通过在3D细胞培养板中培养细胞形成类器官，
其中，在所述类器官的形成中，所述细胞培养板包含0至2体积％的基于胞外基质的水凝胶，以及
其中，所述3D细胞培养板包括：
孔板，所述孔板包括多个主孔和多个子孔，所述多个子孔形成在主孔的下部以注入细胞培养液并且包括在其底表面上的凹入部；和支持所述孔板的用于大容量和高速高内涵筛选(HCS)的连接件，并且
用于高内涵筛选(HCS)的连接件包括配备有固定装置以与所述孔板的下端连接并且从所述孔板的下端分离的底座以及位于所述孔板的上部以连接到所述底座的盖，
所述主孔具有形成为在预定位置逐渐变细的台阶，所述台阶相对于主孔的壁具有10°至60°的倾斜角(θ)。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述基于胞外基质的水凝胶是基底胶。
3.权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是正常细胞或癌细胞，并且
细胞培养周期为1至14天。
4.权利要求1所述的方法，其中，所述类器官的大小是直径为300μm至500μm。
5.权利要求1所述的方法，其中，所述子孔具有形成为朝向所述凹入部逐渐变细的倾斜表面。
6.权利要求1所述的方法，其中，所述子孔具有形成为朝向所述凹入部逐渐变细的倾斜表面，
所述子孔的上端直径为3.0mm至4.5mm，
所述凹入部的上端直径为0.45mm至1.5mm，
所述子孔和所述凹入部之间的倾斜表面(θ2)为40°至50°，并且
所述子孔的直径与所述凹入部的直径的长度比为1:0.1至1:0.5。
7.权利要求1所述的方法，其中，所述主孔的个体体积为100μl至300μl，
所述凹入部的个体体积为20μl至50μl，主孔与凹入部的个体体积比平均为1:0.1至1:0.5。
8.权利要求1所述的方法，其中，所述主孔包括所述台阶和所述子孔之间的空间部，
所述空间部的高度(ah)平均为2.0mm至3.0mm，
所述子孔的高度(bh)平均为1.0mm到2.0mm，并且
所述空间部与所述子孔的高度比(ah:bh)为1:0.3至1:1。
9.权利要求1所述的方法，其中，所述细胞以100至300个细胞/孔接种在所述细胞培养板的所述子孔中。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法生产的类器官，其直径为300μm至500μm。
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