KR102364925B1 - 대용량 고속이미지 최적화용 세포배양 플레이트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고수율 및 약물 효능 평가가 가능한 대용량 고속이미지 최적화용 세포배양 플레이트에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 플레이트는 3차원 세포 분석이 가능하며, 고수율의 스페로이드/오가노이드 제작이 가능한 이점이 있다. 특히, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 플레이트는 대용량의 고속 HCS 용 커넥터를 포함하고 있어, 대용량의 고속이미지 촬영시 공차를 줄여 웰 플레이트 내의 이미지를 균일하게 촬영할 수 있으며, 메인 웰의 탄턱에 의하여, 배양되는 세포는 미디어 교체시 피페팅 작업에 의한 영향을 최소화할 수 있는 효과가 있다.

Description

대용량 고속이미지 최적화용 세포배양 플레이트 {Cell culture plate for large capacity high speed image optimization}
본 발명은 대용량 고속이미지 최적화용 세포배양 플레이트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고수율 및 약물 효능 평가가 가능한 대용량 고속이미지 최적화용 세포배양 플레이트에 관한 것이다.
신약개발에서 동물실험은 비임상/임상실험 및 초기 스크리닝에 사용되는데 한 건의 신약개발에 수행되는 동물실험은 수천억 원이 넘는 비용이 소요된다. 또한, 전세계적으로 윤리적인 이유를 들어 동물실험을 극심하게 반대 하고 있어 동물실험의 당위성은 점점 약화되고 있다. 따라서, 동물 혹은 인간의 세포를 이용한 체외실험을 통해 동물실험을 대체하려는 시도가 이루어지고 있다.
한편, 대한민국 등록특허 제10-1756901호(특허문헌 1)에는 3차원의 조직세포를 배양 가능한 세포배양 칩에 대해서 개시되어 있습니다. 상기 특허문헌 1은 세포배양 칩은 제1 배양부, 제2 배양부 및 제3 배양부를 각각 층별로 형성하고, 각 층별로 세포의 성장 진행 정도를 확인할 수 있습니다. 그러나, 특허문헌 1의 세포배양 칩은 현존하는 스페로이드(spheroid) 및 오가노이드(organoid)의 고수율 약물 효능 평가가 힘든 문제점이 있다. 아울러, 스페로이드 마이크로 플레이트(spheroid microplate)라 하여 96 well plate 기반의 스페로이드 제작이 가능하지만, 각 well 당 하나의 스페로이드 제작이 가능하여, 고수율의 약물 효능 평가가 불가능한 문제가 있다.
아울러, 3D 세포배양이 가능한 종래의 제품 중 "corning spheroid microplate" 에서는 spheroid 의 제작 및 분석이 가능하지만, 96개의 spheroid/organoid 제작만이 가능하여 고수율의 약물 효능 평가가 불가능하다. 또한, 종래의 ELISA 96 well plate 의 경우, 2-D 세포 배양을 통한 분석이 주가 되어, in vivo 형태를 표현하기 힘든 문제가 있다. 나아가, 현재 96 well plate 의 경우, 고수율의 약물 효능 평가를 위해서는 실험 및 분석을 수차례 이상 진행하여야 하므로, 시간 및 비용이 많이 소요된다.
나아가, 세포 배양시 배양액을 교체하는 피펫팅 작업을 하는 경우가 있는데, 상기 corning spheroid microplate의 경우, 세포 배양 중인 스페로이드 또는 오가노이드가 영향을 받아서, 피펫팅 작업시 빨려 올라가거나, 위치 변화 등이 발생하는 경우가 있어, 세포 배양 환경에 좋지 못한 문제가 있다.
따라서, 3차원의 세포 분석이 가능하며, 현재 96 well plate 보다 고수율의 spheroid/organoid 제작이 가능하고, 보다 in vivo 에 가까운 고수율의 분석이 가능한 세포배양 플레이트에 대한 연구가 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1756901호
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 고수율 및 약물 효능 평가가 가능한 대용량 고속이미지 최적화용 세포배양 플레이트를 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 일 실시예에서,
복수개의 메인 웰(main well)과, 메인 웰의 각각 하부에 형성되어 세포 배양액이 주입되며, 바닥면에 오목부를 포함하는 복수개의 서브 웰(sub well)을 포함하는 웰 플레이트(well plate); 및
웰 플레이트를 지지하는 대용량 고속 HCS(High contents screening)용 커넥터;를 포함하며,
상기 대용량의 고속 HCS(High contents screening)용 커넥터는, 웰 플레이트의 하단과 서로 착탈 가능하도록 고정수단이 구비된 베이스와 웰 플레이트의 상부에 위치하여, 베이스와 결합되는 커버를 포함하며,
상기 메인 웰은 소정부위 테이퍼지도록 단턱이 형성되며, 상기 단턱은 메인 웰의 벽을 기준으로 10 내지 60° 범위의 경사각(θ)을 갖는 세포배양 플레이트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 플레이트는 3차원 세포 분석이 가능하며, 고수율의 스페로이드/오가노이드 제작이 가능한 이점이 있다.
특히, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 플레이트는 대용량의 고속 HCS 용 커넥터를 포함하고 있어, 대용량의 고속이미지 촬영시 공차를 줄여 웰 플레이트 내의 이미지를 균일하게 촬영할 수 있다.
아울러, 메인 웰의 탄턱에 의하여, 배양되는 세포는 미디어 교체시 피페팅 작업에 의한 영향을 최소화할 수 있는 효과가 있다.
도 1(a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 플레이트의 정면도이며, 도 1(b)는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 플레이트의 단면도이다.
도 2는 본 발명의 일 실실예에 따른 세포배양 플레이트에 형성된 메인 웰을 상세하게 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실실예에 따른 세포배양 플레이트의 웰 플레이트, 베이스 및 커버를 보여주는 도면이다((a) 커버, (b) 베이스, (c) 마이크로 플레이트 및 베이스의 고정수단).
도 4는 실시예 1 및 비교예 1의 고속대량 이미징 결과를 보여주는 도면이다((a) 실시예 1, (b) 비교예 1).
도 5는 실시예 1 및 비교예 2의 고속대량 이미징 결과를 보여주는 도면이다((a) 실시예 1, (b) 비교예 2).
도 6(a)는 실시예 1의 고속대량 이미징 결과를 보여주는 사진이며, 도 6(b)는 실시예 1에서 배양한 오가노이드의 면적을 나타내는 그래프이다.
도 7(a)는 비교예 1의 고속대량 이미징 결과를 보여주는 사진이고, 도 7(b) 는 비교예 1에서 배양한 오가노이드의 면적을 나타내는 그래프이다.
도 8과 도 9는 실시예 1 내지 3의 고속대량 이미징 결과를 보여주는 사진과 그래프이다((a) 실시예 1, (b) 실시예 2, (c) 실시예 3).
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 대용량 고속이미지 최적화용 세포배양 플레이트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고수율 및 약물 효능 평가가 가능한 대용량 고속이미지 최적화용 세포배양 플레이트에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 플레이트는 3차원 세포 분석이 가능하며, 고수율의 스페로이드/오가노이드 제작이 가능한 이점이 있다. 특히, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 플레이트는 대용량의 고속 HCS 용 커넥터를 포함하고 있어, 대용량의 고속이미지 촬영시 공차를 줄여 웰 플레이트 내의 이미지를 균일하게 촬영할 수 있다. 아울러, 메인 웰의 탄턱에 의하여, 배양되는 세포는 미디어 교체시 피페팅 작업에 의한 영향을 최소화할 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 실시예에서,
복수개의 메인 웰(main well)과, 메인 웰의 각각 하부에 형성되어 세포 배양액이 주입되며, 바닥면에 오목부를 포함하는 복수개의 서브 웰(sub well)을 포함하는 웰 플레이트(well plate); 및
웰 플레이트를 지지하는 대용량 고속 HCS(High contents screening)용 커넥터;를 포함하며,
상기 대용량의 고속 HCS(High contents screening)용 커넥터는, 웰 플레이트의 하단과 서로 착탈 가능하도록 고정수단이 구비된 베이스와 웰 플레이트의 상부에 위치하여, 베이스와 결합되는 커버를 포함하며,
상기 메인 웰은 소정부위 테이퍼지도록 단턱이 형성되며, 상기 단턱은 메인 웰의 벽을 기준으로 10 내지 60° 범위의 경사각(θ)을 갖는 세포배양 플레이트를 제공한다.
종래의 96 well plated 의 경우, 고수율의 약물 효능 평가를 위해서는 실험 및 분석을 수차례 이상 진행하여야 하므로, 시간 및 비용이 많이 소요되는 문제가 있었다. 아울러, 세포 배양시 배양액을 교체하는 피펫팅 작업을 수행하는 경우가 종종 있는데, 종래의 corning spheroid microplate 의 경우에는 세포 배양 중인 스페로이드 또는 오가노이드가 영향을 받아서, 피펫팅 작업시 스페로이드 또는 오가노이드가 빨려 올라가거나, 위치 변화 등이 발생하는 경우가 있어, 세포 배양 환경에 좋지 못한 문제가 있었다.
따라서, 본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 웰 플레이트 내에 형성된 복수개의 메인 웰 내에 복수개의 서브 웰을 포함시켜 고수율의 스페로이드/오가노이드 제작이 가능할 수 있으며, 플레이트를 지지하는 대용량 고속 HCS(High contents screening)용 커넥터를 포함시켜, 대용량의 고속이미지 촬영시 공차를 줄여 웰 플레이트 내의 이미지를 균일하게 촬영할 수 있는 세포배양 플레이트를 제공한다. 나아가, 메인 웰의 탄턱에 의하여, 배양되는 세포는 미디어 교체시 피펫팅 작업에 의한 영향을 최소화할 수 있는 세포배양 플레이트를 제공한다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하도록 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
도 1(a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 플레이트의 정면도이며, 도 1(b)는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 플레이트의 단면도이며, 도 2는 본 발명의 일 실실예에 따른 세포배양 플레이트에 형성된 메인 웰을 상세하게 나타낸 도면이고, 도 3은 본 발명의 일 실실예에 따른 세포배양 플레이트의 웰 플레이트, 베이스 및 커버를 보여주는 도면이다((a) 커버, (b) 베이스, (c) 마이크로 플레이트 및 베이스의 고정수단).
이하, 도 1 내지 도 3을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 플레이트를 상세히 설명한다.
도 1 내지 3 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 플레이트(10)는 복수개의 메인 웰(main well, 110)과, 메인 웰(110)의 각각 하부에 형성되어 세포 배양액이 주입되며, 바닥면에 오목부(121)를 포함하는 복수개의 서브 웰(sub well, 120)을 포함하는 웰 플레이트(well plate, 100); 및 웰 플레이트(100)를 지지하는 대용량 고속 HCS(High contents screening)용 커넥터(200)를 포함하여 구성된다.
먼저, 도 1과 도 2를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 웰 플레이트(100)를 상세히 설명하도록 한다.
상기 웰 플레이트(100)는 몰드를 통해 플라스틱 사출 성형된 플레이트 형상으로 만들어 진다. 이와 같이 플라스틱 사출을 위한 몰드 제작을 위해 미세 기계가공을 사용하여 생산단가를 낮추고, 쉽게 크기를 확대할 수 있도록 메인 웰(110)은 웰(well) 구조물로서 반복적인 패턴을 갖는다. 따라서, 세포의 대량 생산이 용이하며, 사용자의 요구에 맞추어 다양한 크기로 변형하여 사용이 가능하다.
상기 메인 웰(110)은 웰 플레이트(100)에 복수개 형성되며, 각각의 메인 웰(110)은 단턱(101)을 포함한다. 상기 단턱(101)은 메인 웰(110)의 소정부위에 형성되는 것으로, 보다 상세하게는 상기 단턱(101)은 메인 웰(110)의 전체 길이의 1/3 내지 1/2 위치에 형성될 수 있으며, 상기 단턱(101)은 메인 웰(110)의 하단으로부터 1/3 내지 1/2 위치에 형성될 수 있다.
종래에 마이크로 플레이트에서 세포 배양시에는 배양액을 교체하는 피펫팅 작업을 하는 경우가 있는데, 이러한 경우, 세포 배양 중인 스페로이드 또는 오가노이드가 영향을 받아서, 피펫팅 작업시 스페로이드 또는 오가노이드가 빨려 올라가거나, 위치 변화 등이 발생하는 경우가 있어, 세포 배양 환경에 좋지 못한 문제가 있었으나, 상기 단턱(101)은 이러한 문제를 방지하기 위함이다.
상기 단턱(101)은 피펫이 적용되는 공간일 수 있으며, 구체적으로, 메인 웰(110)의 벽을 기준으로 10 내지 60° 범위의 경사각(θ)을 가질 수 있다. 또는, 20 내지 50° 범위의 경사각을 가질 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 45°범위의 경사각을 가질 수 있다. 만일, 상기 단턱(101)의 경사각이 10°미만인 경우에는 메인 웰(110) 내에 경사각이 너무 작아 피펫을 적용할 수 있는 공간이 충분하지 않아, 메인 웰(110) 내의 배양액을 흡입할 때, 피펫이 서브 웰(120) 안쪽으로 미끄러져 스페로이드 또는 오가노이드가 빨려 올라가거나, 위치 변화 등이 발생할 수 있다. 아울러, 상기 경사각(θ)이 60°를 초과하는 경우에는 피펫을 적용할 수 있는 공간은 마련되나, 단턱(101)의 경사각이 너무 커서 배양액을 충분히 흡입하기 어려울 수 있으며, 서브 웰(120)에 세포를 시딩 할 때, 세포가 모든 서브 웰(120)에 들어가지 않고, 단턱(101)에 시딩되는 문제가 발생할 수 있다. 따라서, 상술한 범위의 경사각을 갖는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 메인 웰(110)은 단턱(101)과 후술하게 되는 서브 웰(120) 사이에 공간부(130)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 공간부(130)는 배양액이 주입되는 공간으로, 서브 웰(120) 내부의 세포들이 동일한 배양액을 공유할 수 있는 공간이다.
보다 구체적으로, 공간부(130)의 높이(ah)는 평균 2.0 내지 3.0 mm 범위일 수 있으며, 또는 2.2 내지 2.8 mm 범위일 수 있으며, 또는 평균 2.3 내지 2.7 mm 범위일 수 있다. 아울러, 서브 웰(120)의 높이(bh)는 평균 1.0 내지 2.0 mm 범위일 수 있으며, 또는 평균 1.2 내지 1.8 mm 범위일 수 있다.
예를 들면, 상기 공간부(130)의 높이(ah)는 평균 2.5 mm 이며, 서브 웰 의 높이(bh)는 평균 1.5 mm 일 수 있다.
이때, 상기 공간부와 서브 웰(120)의 높이비(ah:bh)는 1:0.3 내지 1 범위일 수 있으며, 보다 상세하게 공간부와 서브 웰(120)의 높이비(ah:bh)는 1:0.4 내지 0.9 또는 1: 0.5 내지 0.8 일 수 있다. 만일, 서브 웰(120)의 높이가 공간부의 높이 대비 1:0.3 미만일 경우에는 서브 웰(120)의 미디어를 교환 시, 조금의 힘으로도 내부에서 배양 중인 세포들이 튀어나올 수 있으며, 서브 웰(120)의 높이가 공간부의 높이 대비 1:1을 초과하는 경우에는 세포에 필요한 배양액이 충분하게 변환되지 않아, 세포의 죽음을 유발할 수 있다. 따라서, 공간부(130)와 서브 웰(120)은 상술한 높이 범위와 높이비율을 갖는 것이 바람직하다.
다음으로, 서브 웰(120)은 메인 웰(110)의 각각 하부에 형성되는 것으로, 바닥면에 오목부(121)를 포함한다. 특정 양태로서, 상기 서브 웰(120)은 메인 웰(110)의 하부에 복수개를 포함할 수 있다.
메인 웰(110)의 하부에 포함되는 서브 웰(120)은 각각의 크기와 모양이 동일하고, 이에 따라 균일한 조건의 스페로이드 및 오가노이드를 생성할 수 있다.
상기 서브 웰(120)은 오목부(121)를 향하여 테이퍼지도록 경사면이 형성될 수 있다. 구체적으로, 상기 서브 웰(120)의 상단부는 수직 방향을 기준으로 하강할수록 수평 넓이가 줄어들 수 있다. 예를 들면, 상기 서브 웰(120)의 상단부는 역피라미드 형상으로 이루어질 수 있다. 도시된 실시예에서는 서브 웰(120)의 상단부가 피라미드 형상이나, 깔대기 형상과 같이, 수직 방향으로 하강할 수록 수평의 넓이가 줄어드는 형상으로 구성될 수 있다.
특히, 상기 서브 웰(120)은 크기와 모양이 동일하도록 복수개를 포함함으로써, 상기 세포배양 플레이트는 균일한 조건에서 대량의 스페로이드 및 오가노이드를 생성할 수 있다.
특정 양태로서, 하나의 메인 웰(110)에는 동일한 크기의 서브 웰(120)을 4 내지 25개를 포함할 수 있으며, 전체 마이크로 플레이트(100)에는 96 내지 1,728 개의 서브 웰(120)을 포함할 수 있다. 이에 따라, 동일하고, 정밀하게 size 컨트롤이 가능하며, 약물 평가 및 각종 분석 시, 데이터의 정확도가 높아질 수 있다.
아울러, 서브 웰(120)은 오목부(121)를 포함하며, 상기 오목부의 하단에는 상기 오목부(121)는 3D 스페로이드 또는 오가노이드가 배양될 수 있도록 공간이 형성된다. 구체적으로, 상기 오목부(121)는 'U'자 형태, 'V' 자 형태 또는 'Ц'자 형태일 수 있으며, 예를 들면, 상기 오목부(121)는 'U'자 형태일 수 있다.
상기 서브 웰(120)의 상단 직경은 3.0 내지 4.5 mm 범위일 수 있으며, 또는 3.5 내지 4.3 mm 일 수 있으며, 또는 평균 4 mm 일 수 있다. 아울러, 오목부(121) 상단의 직경은 0.45 내지 1.5 mm 일 수 있으며, 또는 0.5 내지 1.0 mm 또는 평균 0.5 mm 일 수 있다.
아울러, 상기 서브 웰(120)의 직경과 오목부(121)의 직경에 대한 길이 비가 1:0.1 내지 0.5 범위일 수 있으며, 바람직하게는 상기 서브 웰(120)의 직경과 오목부(121)의 직경에 대한 길이 비는 1: 0.12 일 수 있다.
상기 오목부(121)의 상단 직경이 서브 웰(120)의 상단 직경(1) 대비 0.1 미만인 경우에 오목부(121)의 세포 배양 공간을 충분히 마련하지 못해 배양액 교체시에, 조금마한 힘으로도 세포들이 빠져 나오는 문제가 발생할 수 있으며, 오목부(121)의 상단 직경이 서브 웰(120)의 상단 직경(1) 대비 0.5을 초과하는 경우, 세포에게 필요한 충분한 배양액을 교체하지 못하여 안정적으로 배양하기 어려운 문제가 발생할 수 있다.
한편, 메인 웰의 벽을 기준으로 서브 웰(120)과 오목부(121)의 경사면은 40 내지 50 ° 의 경사각(θ2)을 가질 수 있으며, 42 내지 48° 범위의 경사각(θ2), 43 내지 47° 범위의 경사각(θ2), 또는 평균 45°의 경사각(θ2)을 가질 수 있다.
상술한 서브 웰(120)은 100 cells/well 이하의 세포배양이 가능할 수 있으며, 100 cells/well 이하의 세포를 시딩 하였을 때, 안정적으로 제어할 수 있는 이점이 있다.
나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 메인 웰(110)의 개별 부피는 100 내지 300 ㎕ 범위이며, 오목부(121)의 개별 부피는 20 내지 50 ㎕ 범위이고, 상기 메인 웰(110)과 오목부(121)의 개별 부피비는 평균 1 : 0.07 내지 0.5 인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 일 실시예에 따른 메인 웰(110)의 개별 부피는 250 내지 300 ㎕ 범위이며, 상기 오목부의 개별 부피는 25 내지 35 ㎕ 범위일 수 있으며, 상기 메인 웰(110)과 오목부(121)의 개별 부피비는 평균 1 : 0.11 일 수 있다.
구체적으로, 메인 웰(110)의 개별 부피가 100 ㎕ 미만인 경우, 세포 배양시 충분한 배양액을 수용할 수 없는 문제가 발생할 수 있으며, 300 ㎕ 를 초과하는 경우에는 배양 효율이 떨어질 수 있다.
아울러, 오목부(121)는 실질적인 세포가 배양되는 공간으로, 그 부피가 20 ㎕ 미만인 경우에는 세포 배양 공간이 충분하지 않아 세포들이 빠져 나오는 문제가 발생할 수 있으며, 50 ㎕ 를 초과하는 경우 세포 등을 안정적으로 배양하기 어려운 문제가 발생할 수 있다. 따라서, 상기 메인 웰(110)과 오목부(121)는 상술한 범위의 부피를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 플레이트(10)는 웰 플레이트(100)를 지지하는 대용량 고속 HCS(High contents screening)용 커넥터(200)를 포함한다. 여기서, 대용량 고속 HCS(High contents screening)용 커넥터(200)라 함은 HCS(High contents screening) 시스템에 안착되는 커넥터(200)를 의미하는 것으로, 구체적으로, 상기 커넥터(200)는 본 발명에서는 베이스(210)와 커버(220)를 의미할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 대용량의 고속 HCS(High contents screening)용 커넥터는, 웰 플레이트(100)의 하단과 서로 착탈 가능하도록 고정수단(140, 240)이 구비된 베이스(210)와 웰 플레이트(100)의 상부에 위치하여, 베이스(210)와 결합되는 커버(220)를 포함한다. 그리고, 상기 베이스(210)의 상단 및 웰 플레이트(100)의 하단은 서로 착탈 가능하도록 고정이 가능한 고정수단(140, 240)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
이때, 상기 베이스는, 웰 플레이트(100)를 지지하기 위한 철(凸)부(240)를 포함하며, 상기 웰 플레이트(100)는 베이스(210)의 철부(240)에 대향되는 요(凹)부(140)를 포함할 수 있다. 상기 고정수단에 의해서 웰 플레이트(100)가 고정되어 스크리닝시 이미지가 균일하게 촬영될 수 있다. 이는, 마트리젤(matrigel)안에서 키운 그룹과 비교하였을 때 확연히 차이가 나는 것을 하기 실시예에서 증명하였다. 한편, 본 발명의 세포배양 플레이트(100)에서 오가노이드를 제작할 때 마트리젤을 사용할 수 있으나, 상기 마트리젤은 평균 2% 이하를 함유하여 오가노이드를 제작할 수 있다.
상기 베이스는, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스타이렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리아미드, 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리우레탄, 폴리카보네이트, 폴리염화비닐리덴, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에테르에테르케톤 또는 폴리에테르이미드 소재로 이루어진다.
상기 웰 플레이트는, 폴리디메틸실리콘, 고지방 변성 실리콘, 메틸클로로페닐 실리콘, 알킬변성실리콘, 메틸페닐실리콘, 실리콘폴리에스터, 또는 아미노변성실리콘 소재로 이루어진다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명에 대해 설명하고자 한다. 다만, 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 하기 실시예로 한정하는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 플레이트를 이용하셔 오가노이드를 제작하였다. 구체적으로, 실제 조직으로부터 배양한 대장과 대장암 세포를 세포배양 플레이트의 서브 웰에 약 100 cells/well 씩 시딩 하였으며, 총 14일 동안 배양하였다. 이때, 배양액은 DMEM/F12 base의 배양액이며, 해당 배양액 안에는 B27, N2, GlutaMAX, penicillin streptomycin, Nictoiamide, N-acetyl, gastrin, A-83-01, EGF, noggin, R-spondin1, WNT3A 들어가며, 배양 조건은 마트리젤을 배양액에 2% 함유하여 배양하였다.
실시예 2.
세포를 서브 웰에 약 200 cells/well 에 시딩한 것을 제외하곤, 실시예 1과 동일한 방법으로 세포를 배양하였다.
실시예 3.
세포를 서브 웰에 약 300 cells/well 에 시딩한 것을 제외하곤, 실시예 1과 동일한 방법으로 세포를 배양하였다.
<비교예>
비교예 1.
실시예 1과 동일한 방법으로 세포를 배양하고 고속대량 이미징을 진행하였다. 다만, 비교예 에서는 통상적으로 사용하는 세포배양 플레이트인, 'U'자 형태의 96 well plate 를 사용하였으며, 메트리겔에 세포를 시딩하여 오가노이드를 제작하였다.
<실험예>
실험예 1. 고속대량 이미징(High throughput imaging)
실시예 1과 비교예 1에서 배양한 세포를 촬영 하였으며, 세포구의 크기를 비교하였다. 오가노이드를 자동화 플레이트 기기에서 이미징을 진행하며, 이때 자동으로 기기가 초점을 잡아 진행하도록 한다. 이미지의 크기 분석은 imageJ 라는 프로그램의 매크로 프로그램을 이용하여 진행하였다.
그리고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는 실시예 1 및 비교예 1의 고속대량 이미징 결과를 보여주는 도면이다((a) 실시예 1, (b) 비교예 1)
도 4를 참조하면, 실시예 1의 경우에는 본 발명의 세포배양 플레이트에 배양한 세포의 직경이 거의 균일한 것을 확인하였다. 구체적으로, 세포를 각각의 서브 웰에 평균 100 cell/well 씩 시딩하였을 경우, 비교분석 가능한 균일한 오가노이드를 제작할 수 있었다. 이때, 오가노이드 크기에 대한 오차범위는 20 ㎛ 내외였다.
반면, 종래의 웰 플레이트를 사용한 비교예 1의 경우 세포구의 크기가 상이하게 형성됨을 확인할 수 있었다. 이는 하나의 메트리겔의 dome 형태 안에서 여러 개의 세포가 자라기 때문에 생성된 오가노이드 크기의 오차범위가 150 ㎛ 이상의 편차가 나타나고 겹쳐 자라기도 하여 균일한 고속대량 이미징 및 실험이 불가능하였다.
실험예 2. 고속대량 이미징(High throughput imaging)
실시예 1 및 비교예 1에서 형성한 세포 스페로이드의 형상을 관찰하였다. 그리고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 실시예 1 및 비교예 1의 세포 스페로이드 형성 결과를 보여주는 사진이다((a) 실시예 1, (b) 비교예 1)
도 5를 참조하면, 실시예 1에서 배양한 세포 스페로이드의 크기 및 형상이 거의 균일한 것을 볼 수 있다.
이는, 본 발명의 베이스 및 웰 플레이트가 서로 고정하기 위하여 각각 철(凸)부와 요(凹)부를 포함하는데, 상기 철부와 요부가 서로 결합되어 베이스가 웰 플레이트를 단단하게 고정할 수 있어, 웰 플레이트 내의 이미지를 균일하게 촬영할 수 있음을 보여준다.
반면, 비교예 1에서 배양한 세포 스페로이드의 크기 및 형상이 균일하지 않음을 볼 수 있다. 이는 플레이트 베이스가 없을 경우, 이미징의 초점편차가 커지기 때문에 이미지의 분석이 힘들어지는 것으로 보인다.
실험예 3. 고속대량 이미징(High throughput imaging)
실시예 1과 비교예 1에서 배양한 세포를 고속대량 이미지 하였다.
실시예 1과 비교예 1에서 제조한 오가노이드는 자동화 플레이트 기기에서 이미징을 진행하였으며, 이때 자동으로 기기가 초점을 잡아 진행하도록 하였다. 이미지의 크기 분석은 imageJ 라는 프로그램의 매크로 프로그램을 이용하여 진행하였다.
그리고, 그 결과를 도 6과 도 7에 나타내었다.
도 6(a)는 실시예 1의 고속대량 이미징 결과를 보여주는 사진이며, 도 6(b)는 실시예 1에서 일정 기간 동안 배양한 오가노이드의 면적을 나타내는 그래프이며, 도 7(a)는 비교예 1의 고속대량 이미징 결과를 보여주는 사진이고, 도 7(b) 는 비교예 1에서 일정 기간 동안 배양한 오가노이드의 면적을 나타내는 그래프이다.
도 6을 참조하면, 실시예 1에서 제조한 오가노이드를 자동 이미지 할 경우에 이미징 높이가 균일하여 큰 오차 없이 이미징이 가능하고, 이로 인해 실제 면적을 측정하였을 때 오차범위가 매우 적은 것을 확인할 수 있다.
특히, 본 발명의 세포배양 플레이트를 이용하여 오가노이드를 배양하는 경우, 오가노이드가 균일한 크기로 배양되기 때문에 초점이 자동으로 잡히며 커넥터 구조에 의해서 측정 높이에 대한 편차를 최소화하게 되었다. 이에 따라, 스크리닝 이미지 측정시 편차가 20 ㎛ 내외로 아주 적게 나타나는 것으로 판단된다.
도 7을 참조하면, 비교예 1의 경우, 오가노이드가 서로 겹치게 자라는 것을 확인할 수 있으며, 오가노이드의 크기와 분포 위치가 서로 달라 스크리닝 이미지 측정시 오차범위가 최대 150 ㎛로 내외로 크게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
이는 종래 방법으로 오가노이드를 배양하게 되면, 오가노이드가 메트리젤 내에서 랜덤으로 자라기 때문에, 원하는 오가노이드를 균일하게 배양하기 힘들며, 또한 측정 높이도 가변적이라서 오가노이드 스크리닝 이미징에 적용하기가 어려운 한계가 있음. 따라서 일정 기간 동안 배양된 오가노이드의 면적을 분석해보면 편차가 매우 크게 나타나는 것으로 판단된다.
실험예 4. 고속대량 이미징(High throughput imaging)
실시예 1 내지 3에서 배양한 세포를 고속대량 이미징 하였다.
그리고, 그 결과를 도 8과 도 9에 나타내었다.
도 8은 실시예 1 내지 3의 고속대량 이미징 결과를 보여주는 사진으로, 도 8은 실시예 1 내지 3에서 대장암 세포를 14일 간 배양하였을 때의 이미징 결과를 보여준다((a) 실시예 1, (b) 실시예 2, (c) 실시예 3).
도 8(a)를 참조하면, 세포를 각각의 서브 웰에 평균 100 cells/well 씩 시당하였을 경우, 비교분석 가능한 균일한 오가노이드를 제작할 수 있었다(오차범위: 20 ㎛ 내외).
반면, 도 8(b) 및 도 8(c) 를 참조하면, 세포를 서브 웰에 100 cells/well 이상 시딩하는 경우, 오가노이드가 상기 서브웰로부터 넘쳐 흘러, 균일하지 않은 오가노이드가 생성되는 것을 확인할 수 있다.
도 9는 실시예 1 내지 3의 고속대량 이미징 결과를 보여주는 그래프로, 도 9은 실시예 1 내지 3에서 대장암 세포를 7일 또는 14일 간 배양하였을 때의 결과를 보여준다((a) 실시예 1, (b) 실시예 2, (c) 실시예 3).
도 9를 참조하면, 세포를 평균 100 cells/well 평균 14일 배양하였을 때, 가장 바람직한 오가노이드를 제작할 수 있음을 보여준다. 즉, 평균 100cells/well 이하의 세포를 14일 배양하였을 때, 최적의 오가노이드가 분화 및 생장할 수 있을 것으로 보인다. 반면, 서브웰에 시딩하는 세포를 늘리고, 배양일 수를 줄일 경우에는 오가노이드 성능이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
참고로, 도 9의 점선은 본 발명의 세포배양 플레이트의 서브웰의 최대 공간을 의미하는 것으로, 세포를 배양할 수 있는 공간을 의미한다. 이는 평균 100 cells/well 이하의 세포를 배양할 수 있을 것으로 판단된다.
100: 웰 플레이트
101: 단턱 110: 메인 웰
120: 서브 웰 121: 오목부
130: 공간부 140: 요부
200: 대용량의 고속 HCS용 커넥터
210: 베이스 220: 커버
240: 철부

Claims (12)

  1. 복수개의 메인 웰(main well)과, 메인 웰의 각각 하부에 형성되어 세포 배양액이 주입되며, 바닥면에 오목부를 포함하는 복수개의 서브 웰(sub well)을 포함하는 웰 플레이트(well plate); 및
    웰 플레이트를 지지하는 대용량 고속 HCS(High contents screening)용 커넥터;를 포함하며,
    상기 대용량의 고속 HCS(High contents screening)용 커넥터는, 웰 플레이트의 하단과 서로 착탈 가능하도록 고정수단이 구비된 베이스와 웰 플레이트의 상부에 위치하여, 베이스와 결합되는 커버를 포함하며,
    상기 메인 웰은 소정부위 테이퍼지도록 단턱이 형성되며, 상기 단턱은 메인 웰의 벽을 기준으로 10 내지 60° 범위의 경사각(θ)을 가지고, 상기 단턱과 서브 웰 사이에 공간부를 포함하고,
    상기 서브웰은, 오목부를 향하여 테이퍼지도록 경사면이 형성되고 상기 서브웰과 오목부의 경사면(θ2)은 40 내지 50°범위를 가지는 것인, 세포배양 플레이트.
  2. 제1항에 있어서,
    세포배양 플레이트는, 대용량 고속이미지 최적화용 세포배양 플레이트인 것을 특징으로 하는 세포배양 플레이트.
  3. 제1항에 있어서,
    세포배양 플레이트는, 3차원(3D) 세포배양 또는 오가노이드 배양이 가능한 것을 특징으로 하는 세포배양 플레이트.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    오목부의 하단부는 'U'자 형태, 'V' 자 형태 또는 'Ц'자 형태인 것을 특징으로 하는 세포배양 플레이트.
  6. 제1항에 있어서,
    서브 웰(120)의 상단 직경은 3.0 내지 4.5 mm 범위이고,
    오목부(121) 상단의 직경은 0.45 내지 1.5 mm 범위이며,
    상기 서브 웰의 직경과 오목부의 직경에 대한 길이 비가 1:0.1 내지 0.5 범위인 것을 특징으로 하는 대용량 고속이미지 최적화용 세포배양 플레이트.
  7. 제1항에 있어서,
    메인 웰의 개별 부피는 100 내지 300 ㎕ 범위이며,
    오목부의 개별 부피는 20 내지 50 ㎕ 범위이고,
    상기 메인 웰과 오목부의 개별 부피비는 평균 1 : 0.1 내지 0.5 인 것을 특징으로 하는 세포배양 플레이트.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    공간부의 높이(ah)는 평균 2.0 내지 3.0 mm 범위이며,
    서브 웰의 높이(bh)는 평균 1.0 내지 2.0 mm 범위이고,
    상기 공간부와 서브 웰의 높이비(ah:bh)는 1:0.3 내지 1 범위인 것을 특징으로 하는 세포배양 플레이트.
  10. 제1항에 있어서,
    베이스는, 웰 플레이트를 지지하기 위한 철(凸)부를 포함하며,
    웰 플레이트는, 베이스의 철부에 대향되는 요(凹)부를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양 플레이트.
  11. 제1항에 있어서,
    베이스는, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스타이렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리아미드, 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리우레탄, 폴리카보네이트, 폴리염화비닐리덴, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에테르에테르케톤 또는 폴리에테르이미드 소재로 이루어지며,
    웰 플레이트는, 폴리디메틸실리콘, 고지방 변성 실리콘, 메틸클로로페닐 실리콘, 알킬변성실리콘, 메틸페닐실리콘, 실리콘폴리에스터, 또는 아미노변성실리콘 소재로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포배양 플레이트.
  12. 제1항에 있어서,
    각각의 서브 웰은, 100 cells/well 이하의 세포배양이 가능한 것을 특징으로 하는 세포배양 플레이트.
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