JP2007185110A

JP2007185110A - 細胞培養容器

Info

Publication number: JP2007185110A
Application number: JP2006003516A
Authority: JP
Inventors: Kazuyoshi Chiba; 和義千葉; Junko Otsuki; 純子大月
Original assignee: Ochanomizu University
Current assignee: Ochanomizu University
Priority date: 2006-01-11
Filing date: 2006-01-11
Publication date: 2007-07-26

Abstract

【課題】ミネラルオイルを用いずに効率的に細胞を培養でき、培養する細胞を種類ごとに区別できると共に、個々にも区別しやすい細胞培養容器を提供すること。
【解決手段】上面が開口した容器本体１と、容器本体１の上面を覆う蓋とから成り、容器本体１中に複数のウェル４，４’を設け、少なくとも一部のウェル４の底面に複数の細胞培養穴５を形成する。細胞培養穴５は、底部に近づくに従って径小となるテーパー状に形成すると良い。細胞培養穴５は縦横複数列に配列し、ウェル４の底面中心に対して一側へ偏って配置することがある。各細胞培養穴５に臨んだ位置において、ウェル４の底部には、細胞培養穴５を特定する符号６をそれぞれ表示しても良い。
【選択図】図２

Description

本発明は、細胞培養容器に関する。

体外受精や顕微受精においては、容器中に培養液のドロップを作り、これをミネラルオイルでカバーし、培養液ドロップ中に卵・胚を入れて体外培養することが多い。
ミネラルオイルでカバーすることにより、培養液の蒸発を避け、ｐＨと浸透圧を安定させることが可能であり、顕微操作が容易となる他、マイクロドロップによる乏精子症患者の媒精、培養液の節約などの利点がある。
また、良好胚を選別するための卵の形態学的評価、前核期の核小体評価、多核胚評価を行うには、個々の卵を区別して培養しなければならないが、ミネラルオイルを用いると、容器の底部に形成された培養液のドロップが非常に小さくて済むので、各ドロップ間の間隔を広くすることができ、この結果、細胞が多少動いても混じりにくく、一つの容器で培養しても比較的容易に細胞同士を区別することができた。

ところが、メーカー保証のミネラルオイルであっても、品質管理が難しいためしばしば劣化し、ミネラルオイルの品質低下によって培養中の全胚が死滅することもある。
このことから、ミネラルオイルを使用せずに培養するほうが安全であるといえるが、ミネラルオイルを用いずに、一つの容器中で多数の細胞を培養しようとすると、細胞どうしが混じり合って互いに選別できなくなるのを避けるために、多数の容器に分けて培養しなければならず、また、培養液の蒸発を見込んで大量の培養液を必要とし、非常に効率が悪い。

従来、組織培養培地又は細胞培養挿入部を受け入れるための開口部を有する複数のウェルを有する培養容器アセンブリが知られている（特許文献１参照）。
しかし、この容器を用いてミネラルオイルで被覆せずに細胞を培養しようとすると、各細胞を個別に識別するためには、大きいウェル一つで一個の細胞を培養することしかできず、多数の細胞を培養する場合は多くの容器を必要とする。

また、一枚のプレートに複数列の小さいウェルを設けた組織培養デバイスが公知である（特許文献２参照）。
この組織デバイスによれば、一部のウェル中で細胞を培養し、他のウェルで洗浄を行うことができるが、全てのウェルが同じように配列されているので、培養される細胞の種類（採取状況、採取時期等）別に区画することができず、細胞の種類とウェルの位置との対応関係がわかり難い。
さらに、培養液が蒸発しやすく、浸透圧が安定し難い。

特開平１０―２６２６４８号公報特開２００４−１７３５９５号公報

本発明が解決しようとする課題は、ミネラルオイルを用いずに効率的に細胞を培養でき、培養する細胞を種類ごとに区別できると共に、個々にも区別しやすい細胞培養容器を提供することにある。

本発明の細胞培養容器は、上面が開口した容器本体と、該容器本体の上面を覆う蓋とから成り、前記容器本体中に複数のウェルを設け、少なくとも一部のウェルの底面に、複数の細胞培養穴を形成して成る。
一つの卵（胚）、一つの細胞を培養液と共に細胞培養穴へ投入して培養する。必要であれば一部のウェルには細胞培養穴を形成せず、細胞培養穴を形成していないウェルは、培養液を交換する場合などの洗浄用として利用する。

前記細胞培養穴は、底部に近づくに従って径小となるテーパー状に形成するのが望ましい。
前記細胞培養穴は縦横複数列に配列されると共に、ウェルの底面中心に対して一側へ偏って配置しても良い。
各細胞培養穴に臨んだ位置において、前記ウェルの底部には、前記細胞培養穴を特定する符号をそれぞれ表示すると良い。

請求項１に係る発明によれば、ウェルの底面に形成された複数の細胞培養穴において細胞培養を行うので、採取状況、採取時期等の細胞の種類をウェルごとに区分けできると共に、細胞培養穴によって細胞を個々に選別することができる。
また、ウェルの底面に設けた微小な細胞培養穴内で培養するため、培養液の蒸発が抑えられ、ミネラルオイルを用いなくても少量の培養液で培養することができ、ひいては、ミネラルオイルの酸化、過酸化によって細胞がダメージを受けるのを防ぐことが可能となる。

請求項２に係る発明によれば、細胞培養穴内に細胞及び培養液を投入しやすい。また、均一径の円筒形と比較して影や反射部分ができにくいので、顕微鏡下での観察が容易となる。
請求項３に係る発明によれば、細胞及び培養液を細胞培養穴へ投入する際に、ピペット等の器具を利き手で持って傾斜させ、その先端を細胞培養穴へ合わせることができるので、器具操作が容易となる。
請求項４に係る発明によれば、一目でどの細胞培養穴であるのかを識別できるので、培養されている細胞をいっそう簡単に区別できる。

本発明の細胞培養容器は、容器本体中に複数のウェルを設け、培養用のウェルの底面に、それぞれ１個の細胞と培養液を投入するための細胞培養穴を複数形成して成る。細胞培養穴を形成しないウェルは洗浄用として用いることができる。
細胞培養穴の寸法は、培養しようとする細胞の大きさに応じて変えることができ、細胞培養穴の数は、細胞培養穴とウェルの寸法によって任意に変更できる。
以下、本発明の実施例を図面に基づいて詳細に説明する。

図１〜図５は、本発明の実施例１を示す。
細胞培養容器は、図１に示すように、それぞれ透明プラスチックを素材とする容器本体１と、蓋７とから成る。
容器本体１は、角形の底面２の周縁に側壁３を起立して、上面が開口した箱型に形成され、容器本体１の上面は蓋７によって覆うようになっている。
図２に示すように、容器本体１の底面２には、４個のウェル４，４’が設けられる。ウェル４，４’は、それぞれ直径約１６ｍｍ、高さ１０ｍｍ程度で、上面が開口した円筒形に形成され、２個のウェル４は培養用であって、残り２個のウェル４’は洗浄用である。

図３及び図４に示すように、培養用のウェル４の底面には、それぞれ１６個の細胞培養穴５が形成される。
図５に示すように、細胞培養穴５は、直径約１．４ｍｍ、深さ約１．７ｍｍで、上面が開口した円筒形に形成される。
また、細胞培養穴５は、図３に示すように、縦４列横４列に配列され、細胞培養穴５の列群はウェル４の底面中心に対して偏った位置に配置されている。図２及び図３中、縦列における細胞培養穴５間の間隔は０．６ｍｍ、横列における細胞培養穴５間の間隔は０．４ｍｍであり、最も左側の縦列とウェル４の内周左端部との距離は３．２ｍｍ、最も右側の縦列とウェル４の内周右端部との距離は６．０ｍｍである。即ち、細胞培養穴５の列群は、ウェル４の底面中心に対して左側へ偏っている。

このように細胞培養穴５を一側へ偏って配置すると、ピペットを用いて細胞培養穴５へ細胞及び培養液を投入する際に、細胞培養穴５の列群が利き手と逆側に位置するよう容器本体１を設置し、利き手で持ったピペットを傾斜させてその先端を細胞培養穴５へ合わせることができるので、ピペットの先端を目で確認しながら、ピペットを安定して操作することが可能となる。

図３に示すように、培養用のウェル４の底面には、各細胞培養穴５に臨んだ位置に、細胞培養穴５を特定する数字、英文字等の符号６をそれぞれ表示してある。
従って、一目見ただけで細胞培養穴５を識別でき、細胞培養穴とそこで培養されている細胞との対応関係を明らかにしておけば、簡単に個々の細胞を区別できる。
なお、容器本体１の底面２或いは側壁３の上面において、各ウェル４，４’に臨んだ位置には、ウェル４，４’を特定する符号６’をそれぞれ表示すると良い。

この細胞培養容器を用いて細胞を培養するには、ミネラルオイルを用いずに、細胞と培養液をウェル４の細胞培養穴５に投入する。この時、細胞の採取状況、採取時期等の種類ごとにウェル４を分け、一つの細胞培養穴５には基本的に一つの細胞を投入して、各細胞を区別する。
培養後、或いは、培養液の交換時には、細胞を細胞培養穴５から取り出して洗浄用のウェル４’に移動し、適宜培養液等を用いて洗浄する。

図６及び図７は、本発明の実施例２を示す。
細胞培養装置において、培養用のウェル４の底面に設けられた細胞培養穴５は、底部に近づくに従って径小となるテーパー状に形成される。細胞培養穴５の上面開口部の直径は約１．４ｍｍ、底部の直径は約０．８ｍｍ、高さは約１．７ｍｍである。
細胞培養穴５を上面開口部が径大なテーパー状としたので、小さい細胞培養穴５であっても細胞及び培養液を投入しやすい。また、均一な太さの円筒形に比べて影や反射する部分が生じ難いので、培養中の細胞を顕微鏡で観察しやすい。
その他の構成、及び、培養方法は実施例１とほぼ同様なので、詳細な説明は省略する。

図８及び図９は、本発明の実施例３を示す。
この細胞培養容器は、顆粒膜細胞のついた卵のような比較的大きい細胞を培養するのに適しており、培養用のウェル４の底面には、４個の細胞培養穴５が縦横２列に設けられる。これらの細胞培養穴５は、底部に近づくに従って径小となるテーパー状に形成される。細胞培養穴５の上面開口部の直径は約５．０ｍｍ、底部の直径は約４．０ｍｍ、高さは約２．０ｍｍである。
また、細胞培養穴５は大きいので、ピペット操作のために一側へ偏らせる必要は無く、隣接する細胞培養穴５間の距離は１０ｍｍ、縦列及び横列からこの列に直交するウェル内径端部までの距離は２５ｍｍとしてある。
その他の構成は実施例１及び２とほぼ同様である。

この細胞培養容器を用いて顆粒膜細胞のついた卵を培養するには、卵を培養用ウェル４の細胞培養穴５に一つずつ投入する。そして、精子を加えて受精させた後、精子が出す酵素によって顆粒膜細胞が溶かされるまで、ミネラルオイルで被覆せずに培養する。
次に、胚を細胞培養穴５から取り出し、洗浄用のウェル４’に移動して洗浄してから、実施例１又は実施例２に記載した細胞培養容器の細胞培養穴５へ移し変え、培養液を交換してミネラルオイルを用いずに培養する。

実施例１を示す細胞培養容器の斜視図。実施例１に係る容器本体の平面図。実施例１に係る培養用ウェルの平面図。実施例１に係る培養用ウェルの斜視図。実施例１に係る細胞培養穴の斜視図。実施例２に係る培養用ウェルの斜視図。実施例２に係る細胞培養穴の斜視図。実施例３に係る培養用ウェルの平面図。実施例３に係る細胞培養穴の斜視図。

符号の説明

１容器本体
２底面
３側壁
４培養用ウェル
４’ 洗浄用ウェル
５細胞培養穴
６，６’ 符号
７蓋

Claims

上面が開口した容器本体と、該容器本体の上面を覆う蓋とから成り、前記容器本体中に複数のウェルを設け、少なくとも一部のウェルの底面に、複数の細胞培養穴を形成したことを特徴とする細胞培養容器。
前記細胞培養穴は、底部に近づくに従って径小となるテーパー状に形成されている請求項１に記載された細胞培養容器。
前記細胞培養穴は縦横複数列に配列されると共に、ウェルの底面中心に対して一側へ偏って配置されている請求項１又は２に記載された細胞培養容器。
各細胞培養穴に臨んだ位置において、前記ウェルの底部には、前記細胞培養穴を特定する符号がそれぞれ表示されている請求項１〜３のいずれかに記載された細胞培養容器。