CN118530833A

CN118530833A - 一种同步共分化的多组织或多类器官模型及其构建方法

Info

Publication number: CN118530833A
Application number: CN202410391097.7A
Authority: CN
Inventors: 陈璞; 黄雪梅; 赵稳
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2024-04-02
Filing date: 2024-04-02
Publication date: 2024-08-23

Abstract

本发明公开了一种同步共分化的多组织或多类器官模型及其构建方法，所述方法包括获得芯片：包括细胞培养板和设于所述细胞培养板的集成式培养元件，所述集成式培养元件包括中部设有凹槽的底部件、位于上层的中空件、设于所述中空件内的隔板，所述隔板将所述凹槽分隔成底部相互连通的第一和第二凹槽；后将干细胞接种至所述凹槽培养，待所述细胞沉降于所述凹槽底部后加入干细胞聚集体形成培养基；待干细胞聚集体将凹槽与隔板的空隙填满，两侧培养基不互通时；通过添加两种分化培养基在空间上调控所述凹槽内聚集体向不同组织或类器官共分化，获得多组织或多类器官模型。不同组织或类器官的共分化，促进了组织或器官的发育与成熟。

Description

一种同步共分化的多组织或多类器官模型及其构建方法

技术领域

本发明涉及干细胞分化和组织工程技术领域，特别涉及一种同步共分化的多组织或多类器官模型及其构建方法。

背景技术

胚胎发育过程中，器官发生开始于原肠胚形成，一直持续到出生。原肠胚分化的三个胚层的细胞(外胚层、内胚层和中胚层)分化形成了生物体内部的各个器官。除了器官自身信号调控外，各个器官间的相互作用(如旁分泌信号和机械线索)对细胞分化、组织重排和器官发生至关重要。

近年来，类器官被认为是体外模拟人体组织器官的优良体外模型，在器官发育和相关疾病研究中得到了广泛应用。类器官由干细胞自组织分化而来，具有与人类组织器官相似的多种细胞类型、结构和功能。然而，目前大多数类器官为单类器官，仅包含单一胚层来源的细胞类型，仅能模拟特定的单一组织或器官，缺乏器官间的相互作用，难以再现体内组织器官真实的发生过程。因此，迫切需要一种更仿生的多组织或多类器官模型模型来模拟组织发育与器官发生。目前，多组织或多类器官构建方法分为两大类：(1)融合类器官，通过融合预先构建的单类器官而成；(2)多类器官芯片，通过在芯片上共培养多个类器官而成。然而，融合类器官难以模拟器官发生早期过程中器官间的相互作用。多类器官芯片中只通过流体耦合各个类器官，缺少器官间机械线索的相互作用。此外，融合类器官和多类器官芯片的长期维持需要使用通用培养基，提供系统中所有细胞所需的营养物质，但长时间使用通用培养基会导致类器官活性降低和功能受损。因此，迫切需要构建一种多组织或类器官模型，用于器官发生和多器官疾病研究。

我们创新性地融合发育生物学和组织工程学原理构建了一种同步共分化两种及两种以上组织或器官命运的类器官模型。这种多组织或类器官类器官由同一个干细胞聚集体不同空间上同步共分化而来，具有组织和器官间的相互作用，进而促进组织和器官的发育和成熟。此外，我们通过工程化手段为各个组织和类器官的发育和成熟分别提供最适培养环境，避免通用培养基对不同组织和类器官活性产生的不良影响。总之，我们构建的同步共分化多组织或类器官为研究器官间相互作用以及多器官疾病提供了创新性平台。

发明内容

本发明目的是提供一种同步共分化的多组织或多类器官模型及其构建方法，可调控诱导拟胚体向不同方向的组织器官类型进行同步共分化，模拟胚胎发育过程中的早期器官形成。不同的组织或类器官处在最适培养环境中，防止使用通用培养基产生的类器官活性降低的问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种同步共分化的多组织或多类器官模型的构建方法，所述方法包括：

获得多组织或多类器官同步共分化芯片，所述多组织或多类器官同步共分化芯片包括细胞培养板和设于所述细胞培养板内的集成式培养元件，所述集成式培养元件包括位于下层的中部设有凹槽的底部件、位于上层的外形与所述底部件的外形相匹配的中空件、设于所述中空件内的隔板，所述隔板将所述凹槽分隔成底部相互连通的第一凹槽和第二凹槽；

使用干细胞聚集体形成培养基将消化的干细胞接种至所述第一凹槽和所述第二凹槽中培养，待所述细胞沉降于所述凹槽底部且细胞间形成连接后，加入干细胞聚集体形成培养基培养，待干细胞相互聚集，形成干细胞聚集体将两个凹槽与隔板的空隙填满两侧培养基不互通时；

对于所述第一凹槽的干细胞聚集体作如下培养：

应用第一组织或类器官的诱导分化条件，不同时期加入相关培养基，获得第一组织或类器官；

对于所述第二凹槽的干细胞聚集体作如下培养：

应用第二组织或类器官的诱导分化条件，不同时期加入相关培养基，获得第二组织或类器官；

进一步地，所述接种至所述第一凹槽和所述第二凹槽中培养中，使用干细胞聚集体形成培养基将消化的干细胞浓度调整至2×10⁴～10×10⁴个/μL细胞浓度后，取2倍两个凹槽总体积的干细胞悬液接种至所述第一凹槽和所述第二凹槽中培养。上述细胞接种密度若过小，无法在二维层面形成紧密连接，干细胞聚集体无法形成；细胞接种密度若过大，中间连接处的细胞无法正常获得养分而死亡。

进一步地，所述干细胞包括诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(embryonicstemcell,ESC)和成体干细胞。所述人胚胎干细胞是利用未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或获取的或者选自成熟且已商业化的干细胞品系。所述胚胎干细胞可购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库，人胚胎干细胞H9：目录号SCSP-307。

在本发明的第二方面，提供了所述方法制备得到的多组织或多类器官模型。

在本发明的第三方面，提供了所述多组织或多类器官模型在在模拟人类胚胎发生、器官形成和相互作用中的应用。

在本发明的第四方面，提供了一种多组织或多类器官同步共分化芯片，所述多组织或多类器官同步共分化芯片包括用于设于细胞培养板内的集成式培养元件，包括：

位于下层的中部设有凹槽的底部件、位于上层的外形与所述底部件外形相匹配的培养液分离件，

所述培养液分离件包括中空件、设于所述中空件内的隔板，所述隔板将所述凹槽分隔成底部相互连通的第一凹槽和第二凹槽。

进一步地，所述第一凹槽和第二凹槽内设有微柱。

进一步地，所述中空件内的隔板为多个，所述隔板将所述凹槽分隔成底部相互连通的多个小凹槽。

进一步地所述底部相互连通的第一凹槽和第二凹槽的底部，嵌入高通量微电极阵列和压力传感器；所述嵌入的高通量微电极阵列和压力传感器可原位实时检测组织或类器官机械和电生理功能。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1、本发明的同步共分化的多组织或多类器官模型的构建方法可调控诱导干细胞聚集体向两个或两个以上方向的组织器官类型进行同步共分化，模拟胚胎发育过程中的早期器官形成，为探究多组织或多器官早期发育过程提供研究模型。在发育生物学领域具有极高的应用潜力。

2、本发明的同步共分化的多组织或多类器官模型，组织或类器官间相互连接、相互作用，模拟组织或器官之间的相互交流，为探究器官间相互作用提供了一个良好的生理模型。

3、本发明的同步共分化的多组织或多类器官模型与单类器官模型相比，类器官发育更加成熟。

4、本发明的同步共分化的多组织或多类器官模型，可用于探究早期发育过程中器官发育或疾病对其他器官的影响及机制。

5、本发明培养的多组织或多类器官模型属于原位培养，在培养过程中可以原位实时观察类器官的生长发育情况和类器官间相互作用。

6、本发明可在空间上人为调控干细胞分化命运：干细胞分化命运复杂且难以调控，本发明通过工程化方法在空间上人为的调控干细胞的分化命运，且能够同时调控组织或类器官同时向不同方向分化。

7、本发明可实时检测具有电生理的组织或类器官发育过程及成熟产生的电生理信号。

8、本发明在多类器官培养中，换液和鉴定的操作简便快捷，便于相关领域人员操作，用户友好性高，便于产业化，具有巨大的应用前景和商业价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明中实施例1多组织或多类器官同步共分化芯片结构示意图；其中，附图标记为：1、细胞培养板；11、底板；12、盖板；13、孔室；2、培养液分离件；21、中空件；22、隔板；23、第一培养腔室；24、第二培养腔室；3、底部件；31、凹槽；311、第一凹槽；312、第二凹槽；313、中间连接处(连接通道)；

图2为本发明中实施例1多组织或多类器官同步共分化芯片各结构组装示意图；

图3为本发明中实施例8多组织或多类器官同步共分化芯片各结构组装示意图；

图4为本发明中实施例9多组织或多类器官同步共分化芯片各结构组装示意图；

图5为本发明中实施例12多组织或多类器官同步共分化芯片结构示意图；

图6为本发明中实施例13多组织或多类器官同步共分化芯片结构示意图以及明场成像；

图7为本发明中实施例1多组织或多类器官模型明场成像；

图8为本发明中实施例1多组织或多类器官模型的免疫荧光分析；

图9为本发明中实施例13多组织或多类器官模型电生理功能检测结果。

图10为本发明中实施例1同步共分化心脑多类器官模型(CN)与实施例14心脏单类器官(CC)在D13与D21心脏侧的心跳频率统计。

图11为本发明的多组织或多类器官同步共分化芯片结构示意图。

图12为本发明的多组织或多类器官同步共分化芯片结构示意图。

图13为本发明的多组织或多类器官同步共分化芯片结构示意图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

此外，在本申请的描述中，“多个”、“若干个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本申请的技术方案总体思路如下：

根据本发明的一种典型的实施方式，提供了一种多组织或多类器官同步共分化芯片，如图1所示，所述多组织或多类器官同步共分化芯片包括细胞培养板1和设于所述细胞培养板内的集成式培养元件，所述集成式培养元件包括：

位于下层的中部设有凹槽31的底部件3、位于上层的外形与所述底部件3外形相匹配的培养液分离件2；

所述培养液分离件2包括中空件21、设于所述中空件21内的隔板22，所述隔板22将所述凹槽31分隔成底部相互连通的第一凹槽311和第二凹槽312；

所述集成式培养元件2设于所述细胞培养板1内。

进一步地，所述细胞培养板1包括底板11、盖板12、以及设于所述底板11内的孔室13，所述集成式培养元件2设于所述孔室13内，所述底部件3外形、所述中空件21的外形与所述孔室13相匹配。

进一步地，所述细胞培养板为细胞培养板中的6孔板、12孔板和24孔板，共聚焦小皿，细胞培养皿中的一种。

进一步地，所述中空件21的形状可以为长方形、正方形、圆形、椭圆形等，由于所述多组织或多类器官同步共分化芯片2是位于细胞培养板1内，因此只需要将所述中空件21的外形与所述细胞培养板1内的孔室13外形相匹配即可。

由于细胞培养板1内的孔室13外形通常为圆形，因此所述中空件21优选为中空环形件。若定制的细胞培养板1内的孔室13外形为其他形状，所述中空件21的外形与其相匹配即可。

作为一种具体的实施方式，所述中空环形件的内直径为6-33mm、外直径为7-35mm、高为4-8mm。这样设计的优点为中空环形件为所述隔板22提供支撑。

进一步地，所述凹槽31的外形不限，可以为长方形、正方形、圆形、椭圆形、哑铃型或者其他两边宽中间窄的任意形状，优选为哑铃形，哑铃形的两边宽中间窄，更适合干细胞由二维向三维自组织形成干细胞聚集体。

作为一种具体的实施方式，所述凹槽31的外形为哑铃型，即所述第一凹槽与所述第二凹槽均为圆形，所述第一凹槽与所述第二凹槽的直径的范围均为0.5mm～1.4mm，且所述第一凹槽与所述第二凹槽的两个圆形相交，所述相交形成的弦即为连接通道313(图1)，所述弦长(即连接通道313的宽度)的范围为0.1mm～1mm。

作为一种具体的实施方式，所述第一凹槽与第二凹槽均为圆形，所述第一凹槽与所述第二凹槽的两个圆形之间通过连接通道313相连通，所述第一凹槽与第二凹槽的直径的范围均为0.5mm～1.4mm。所述连接通道313为方形通道，宽度0.1mm～1mm，长度0～0.5mm。

在其他实施方式中，当所述凹槽31的外形为其他形状时，所述的第一凹槽与第二凹槽的面积需满足0.20mm²～1.54mm²。

无论所述凹槽31的外形选择什么形状，所述凹槽31分隔成第一凹槽312与第二凹槽313的中间连接处，即连接通道313的宽度的范围需满足0.1mm～1mm长度0～0.5mm。

所述底部件3的外形与所述中空件21的外形相匹配，所述底部件3与所述中空件21的形成腔室。当所述中空件21为中空环形件时，所述底部件3与所述中空件21的形成圆柱体腔室，所述底部件3的厚度的范围为1mm～4mm。所述第一凹槽与第二凹槽的深度范围为0.3mm～0.7mm。

进一步地，所述隔板22将所述中空件21分为左右两个分离的腔室，即为第一培养腔室23和第二培养腔室24。由于所述隔板22与所述中空件21的底部与所述设有凹槽31的底部件3相接触，所述底部件3中所述凹槽31为向内(底部)凹陷形成，由于所述凹槽31有一定的深度，所述第一凹槽和所述第二凹槽相互连通，此时，所述第一培养腔室23和第二培养腔室24通过所述第一凹槽和所述第二凹槽相互连通之处而相连通。

作为一种具体的实施方式，所述隔板22的长为6-33mm、宽(位于所述中空件21上的竖直高度)为4-8mm，厚度为0.1-0.5mm。

当干细胞细胞接种至所述第一凹槽和所述第二凹槽中培养，待所述细胞沉降于所述凹槽底部且细胞间形成连接后，加入干细胞聚集体形成培养基培养，干细胞自组织形成干细胞聚集体。干细胞聚集体依靠自身的收缩能力将所述第一凹槽和所述第二凹槽的连接处与所述隔板之间的空间填满，此时，所述第一培养腔室23和第二培养腔室24互不相通。

作为一种具体的实施方式，所述第一培养腔室23和第二培养腔室24均为半圆形圆柱储液空间。

作为一种可选的实施方式，所述第一凹槽和第二凹槽内设有微柱。所述微柱的设置位置可以为所述第一凹槽和所述第二凹槽的中心处，若所述第一凹槽和第二凹槽为圆形，则为圆心处。所述微柱的设置位置还可以为所述第一凹槽和第二凹槽的中间连接处。微柱的设置具有可固定组织和类器官的优点。

所述微柱的形状可以任意设置如果微柱的形状为圆柱体，微柱的尺寸设置范围为直径0.1mm-0.6mm。如果微柱的形状为长方体或其他形状，底面积在0.01πmm²-0.36πmm²的范围之间即可。所述微柱的高度和凹槽深度范围一致，也可以低于凹槽。

进一步地，所述多组织或多类器官同步共分化芯片2的材料为光学透性材料，包括但不限于石英、玻璃、热塑性聚合物、固化型聚合物和溶剂挥发型聚合物等，例如：石英、PDMS、PMMA、PC、PET、树脂琼脂糖中的一种或多种联合使用。采用光学透性材料有利于后续的观察，比如：在培养过程中，如需要对培养的类器官进行观察，可以将培养芯片放置在显微镜下观察；待培养结束后，如果需要对芯片内的类器官进行后续测试，如免疫荧光鉴定，可在芯片内对类器官进行原位处理，并进行显微观察。

进一步地，所述第一培养腔室23和第二培养腔室24的底部(即所述底部件3位于所述第一培养腔室23和第二培养腔室24的部分)可嵌入高通量微电极阵列；待类器官培养成熟，可在芯片内原位实时检测类器官电生理功能。

在其他实施方式中，所述集成式培养元件包括：

位于下层的中部设有凹槽31的底部件3、位于上层的外形与所述底部件外形相匹配的培养液分离件2；

所述培养液分离件2包括中空件21、设于所述中空件21内的隔板22，所述隔板可为多个，

所述隔板22将所述凹槽31分隔成底部相互连通的多个小凹槽。凹槽及底部与隔板形成类器官培养腔室，每一个腔室可分化为一种类器官，多种组织或类器官相互连接同步共分化形成多组织或多类器官模型。

所述凹槽31的外形不限，优选为哑铃形；选择哑铃形时，所述凹槽的形状与隔板数量相匹配，如图11-图13所示，隔板数量增加与底部凹槽增加方式可为两种方式。第一种增加方式圆周方向增加，例如图11隔板增加为三个，底部凹槽增加为相互连通的三个。每个隔板分别分隔两个凹槽，凹槽与隔板形成三个培养腔室，可将同一个拟胚体同步分化为三种不同的类器官。以此类推，通过圆周方向增加隔板与凹槽，同步分化为四个(如图12)、五个等不同类器官。第三种增加方式水平方向增加方式，例如图13，凹槽水平面增加且相互连通，对应隔板水平面增加。凹槽与隔板形成三个培养腔室，可将同一个拟胚体同步分化为三种不同的类器官。以此类推，通过水平增加隔板与凹槽，同步分化为三个及三个以上不同的多类器官。

根据本发明另一种典型的实施方式，提供了一种同步共分化的多组织或多类器官模型的构建方法，所述方法采用所述一种多组织或多类器官同步共分化芯片，具体包括：

步骤S1、使用干细胞聚集体形成培养基将消化的干细胞(包括iPSC/ESC/成体干细胞)接种至所述第一凹槽和所述第二凹槽中培养，待所述细胞沉降于所述凹槽底部且细胞间形成连接后，加入干细胞聚集体形成培养基培养到干细胞聚集体依靠自身的收缩能力将所述第一凹槽和所述第二凹槽的连接处与所述隔板之间的空间填满时，获得两侧培养基不互通的干细胞聚集体；

步骤S2、对于所述第一凹槽的干细胞聚集体和所述第二凹槽的干细胞聚集体分别进行培养：

对于所述第一凹槽的干细胞聚集体作如下培养：

对于所述第二凹槽的干细胞聚集体作如下培养：

由于第一组织或类器官与第二组织或类器官由同一个干细胞聚集体分化而来，两者相互连接形成多组织多类器官模型。

作为一种具体的实施方式，所述干细胞聚体体为D3-D7代拟胚体。

作为一种可选的实施方式，所述第一组织或类器官与所述第二组织或类器官选自大脑类器官、心脏类器官、肾脏类器官、肝脏类器官、小肠类器官、骨骼肌组织、皮肤类器官、血管组织、胰腺类器官、胃类器官、卵巢类器官等，所述第一组织或类器官与所述第二组织或类器官为不同的组织或类器官。

作为一种具体的实施方式，所述第一组织或类器官为大脑类器官，所述第二组织或类器官为心肌类器官。

所述大脑类器官的分化条件为：加入脑类器官神经外胚层诱导培养基培养(优选为培养至D11)；后于大脑类器官分化侧加入Matrigel进行包被，将培养基更换为脑类器官神经扩张培养基培养(优选培养至D14)；后将培养基更换为脑类器官成熟培养基培养(优选培养至D28-D35)，获得大脑类器官；

所述心肌类器官的分化条件为：加入心肌祖细胞诱导培养基培养(优选为培养至D9)后将培养基更换为心肌细胞分化培养基培养至(优选培养至D13)；将培养基更换为心肌细胞维持培养基培养(优选培养至D28-D35)，获得心肌类器官。

作为一种具体的实施方式，所述第一组织或类器官为心房组织，所述第二组织或类器官为心室组织。

作为一种具体的实施方式，所述第一组织或类器官为中脑组织，所述第二组织或类器官为前脑组织。

在其他实施方式中，所述第一组织或类器官与所述第二组织或类器官选自其他组织或类器官，按照其相应的培养条件诱导培养。

优选地，所述接种至所述第一凹槽和所述第二凹槽中培养中，使用拟胚体形成培养基将消化的iPS/ESC细胞浓缩至每10μL含有2×10⁵～5×10⁵个细胞浓度后，取10μL接种至所述第一凹槽和所述第二凹槽中培养。使用干细胞聚集体形成培养基将消化的干细胞浓度调整至2×10⁴～10×10⁴个/μL细胞浓度后，取2倍两个凹槽总体积的干细胞悬液接种至所述第一凹槽和所述第二凹槽中培养。上述细胞接种密度若过小，无法在二维层面形成紧密连接，拟胚体无法形成；细胞接种密度若过大，中间连接处的细胞无法正常获得养分而死亡。

下面将结合附图对本申请的一种同步共分化的多组织或多类器官模型和培养方法进行详细说明。

实施例1、同步共分化的心脑多类器官模型及其构建方法

一、同步共分化的心脑多类器官模型的构建方法

步骤1、对于不同的类器官大小，依据其尺寸通过CAD软件设计相应的多组织或多类器官同步共分化芯片上、下层元件；

步骤2、用激光雕刻技术加工PMMA制作上层培养液分离板，圆环支撑部分；内直径为19mm、外直径为21mm、高6mm。培养液分离板长为19mm、宽为6mm、厚度为0.2mm；

步骤3、用CNC数控机床雕刻PMMA获得下层类器官培养腔室PMMA模板，第一凹槽与第二凹槽的直径为2mm、深度为0.7mm、中间连接处(连接通道313)的宽度为0.8mm。本发明实施例中所述凹槽31的外形为哑铃型，第一凹槽与第二凹槽的两个圆形相交形成的弦即为连接通道313，弦长为所述连接通道313的宽度；

步骤4、向下层类器官培养腔室PMMA模板倾倒2％的琼脂糖获得基底为琼脂糖的模板；

步骤5、向琼脂糖基底的模板倾倒PDMS获得PDMS基底的下层类器官培养腔室；

步骤6、将上层培养液分离板与下层类器官培养腔室的结构对齐，使用PDMS将两者粘合组装成集成式培养元件，最后将集成式培养元件粘贴至细胞培养板底板上形成多组织或多类器官同步共分化芯片。

步骤7、将多组织或多类器官同步共分化芯片紫外灭菌48h；

步骤8、配制拟胚体形成培养基；EB形成培养基(50mL)：ncTarget 50mL、Y-2763210ng/mL、bFGF 4ng/mL；。

步骤9、消化ESC细胞(胚胎干细胞购买自中国科学院干细胞库货号SCSP-307)

使用拟胚体形成培养基将消化的ESC细胞浓缩至使用干细胞聚集体形成培养基将消化的干细胞浓度调整至3×10⁴个/μL细胞浓度后，取2倍两个凹槽总体积的干细胞悬液接种至所述第一凹槽和所述第二凹槽中培养，轻柔吹打保证两个凹槽连接处充满细胞无气泡产生；

步骤10、待接种的细胞沉降于底部，细胞间形成一定连接后，缓慢加入EB形成培养基；

步骤11、待拟胚体培养到D5时，拟胚体依靠自身的收缩能力将与培养基分离板之间的空间填满。往第一培养腔室的加液池加入入脑类器官神经外胚层诱导培养基培养。每日换液，培养至D11。

步骤12、D12第一培养腔室中的类器官加入100％ Matrigel 10μL进行包被，并将培养基更换为脑类器官神经扩张培养基培养至D14。

步骤13、D15第一培养腔室将培养基更换为脑类器官成熟培养基培养至D28-D35，获得大脑类器官。

步骤14、第二培养腔室为心肌分化侧加入中胚层细胞诱导培养基。每日换液，培养至D7。

步骤15、D7第二培养腔室更换为心房祖细胞诱导培养基。每日换液，培养至D9。

步骤16、D9第二培养腔室培养基更换为心房细胞分化培养基。每日换液，培养至D12。

步骤15、D12第二培养腔室培养基更换为心房细胞维持培养基。每日换液，培养至D35。

上述培养基的配方如下:

干细胞聚集体形成培养基；ncTarget 50mL、Y-27632 10ng/mL、bFGF 4ng/mL。

脑类器官神经外胚层诱导培养基；DMEM/F12 48mL、N2-supplement 1×、Glutamax1×、Heparin 50μg/mL、NEAA 1×、P/S1×。

脑类器官神经扩张培养基；DMEM/F12 24mL、Neuralbasal 24mL、B27 withoutvitami n-supplement 1×、N2-supplement 1×、Glutamax 1×、NEAA 1×、β-Me 55μM、Insuli n 4μg/mL、P/S1×。

脑类器官成熟培养基：(DMEM/F12 24mL、Neuralbasal 24mL、B27 with vitamin-supplement 1×、N2-supplement 1x、Glutamax 1×、NEAA 1×、β-Me 55μM、Insulinμg 4μg/mL、P/S 1×)。

中胚层细胞诱导培养基、心房祖细胞诱导培养基、心房细胞分化培养基、心房细胞维持培养基购买自商家为STEMdiff^TMAtrial Cardiomyocyte Differentiation Kit货号(05010)。

二、同步共分化的心脑多类器官模型

本发明中实施例1心脑多类器官模型明场成像如图7所示，可知拟胚体向心脑多类器官同步共分化，同一个心脑多类器官模型中一侧具有大脑类器官的明场结构神经花环，另一侧具有心脏类器官特征发生跳动。

本发明中实施例1心脑多类器官模型的免疫荧光分析方法为抗原抗体反应，结果如图7所示，可知心脑多类器官既具有神经干细胞标志物Nestin和神经元标志物Tuj1的表达，也具有心肌细胞标志物Nkx2.5和CTNT的表达。

本发明实施例1心脑多类器官模型中，心脑在发育过程中，大脑类器官促进心脏类器官的发育。结构如图10所示；本发明中实施例1同步共分化心脑多类器官模型(CN)与实施例13心脏单类器官(CC)在D13与D21心脏侧的心跳频率统计，同步共分化的心脑多类器官中心脏类器官跳动频率高于心脏单类器官。

实施例2、同步共分化的多组织心脏类器官模型及其构建方法

一、同步共分化的多组织心脏类器官模型的构建方法

步骤7、将多组织或多类器官同步共分化芯片紫外灭菌48h；

步骤8、配制拟胚体形成培养基；EB形成培养基(50mL)：ncTarget 50mL、Y-276 3210ng/mL、bFGF 4ng/mL。

步骤9、消化ESC细胞(胚胎干细胞购买自中国科学院干细胞库货号SCSP-307)，使用拟胚体形成培养基将消化的ESC细胞浓缩至使用干细胞聚集体形成培养基将消化的干细胞浓度调整至3×10⁴个/μL细胞浓度后，取2倍两个凹槽总体积的干细胞悬液接种至所述第一凹槽和所述第二凹槽中培养，轻柔吹打保证两个凹槽连接处充满细胞无气泡产生；

步骤11、待拟胚体培养到D5时，拟胚体依靠自身的收缩能力将与培养基分离板之间的空间填满。往培养基分隔板两个培养腔室加液池加入中胚层细胞诱导培养基培养。每日换液，培养至D7。

步骤12、D7第一培养腔室培养基更换为心房祖细胞诱导培养基。每日换液，培养至D9。

步骤13、D7第二培养腔室培养基更换为心室祖细胞诱导培养基。每日换液，培养至D9。

步骤14、D9第一培养腔室培养基更换为心房细胞分化培养基。每日换液，培养至D12。

步骤15、D9第二培养腔室培养基更换为心室细胞分化培养基。每日换液，培养至D12。

步骤16、D12第一培养腔室培养基更换为心房细胞维持培养基。每日换液，培养至D35。

步骤17、D12第二培养腔室培养基更换为心室细胞维持培养基。每日换液，培养至D35。

上述培养基的配方如下:

中胚层细胞诱导培养基、心室祖细胞诱导培养基、心室细胞分化培养基、心室细胞维持培养基购买自商家为。STEMdiff^TMVentricular Cardiomyocyte Differentiation Kit货号(100-0215)。

二、同步共分化的多组织心脏类器官模型

本发明中实施例2多组织心脏类器官模型第一培养腔室分化为心房组织，第二培养腔室分化为心室组织。心房与心室组织由同一个拟胚体分化而来，相互连接形成具有心房心室多组织的心脏类器官。

实施例3、同步共分化的多脑区大脑类器官模型及其构建方法

一、同步共分化的多脑区大脑类器官模型的构建方法

步骤7、将多组织或多类器官同步共分化芯片紫外灭菌48h；

步骤8、配制拟胚体形成培养基；EB形成培养基(50mL)：ncTarget 50mL、Y-2763210ng/mL、bFGF 4ng/mL。

步骤9、消化ESC细胞(胚胎干细胞购买自中国科学院干细胞库货号SCSP-307)使用拟胚体形成培养基将消化的ESC细胞浓缩至使用干细胞聚集体形成培养基将消化的干细胞浓度调整至3×10⁴个/μL细胞浓度后，取2倍两个凹槽总体积的干细胞悬液接种至所述第一凹槽和所述第二凹槽中培养，轻柔吹打保证两个凹槽连接处充满细胞无气泡产生；

步骤11、待拟胚体培养到D4时，拟胚体依靠自身的收缩能力将与培养基分离板之间的空间填满。

步骤12、D4第一培养腔室培养基更换为中脑类器官形成培养基。每日换液，培养至D9。

步骤13、D4第二培养腔室培养基更换为SMADi神经诱导培养基。每日换液，培养至D9。

步骤14、D9第一培养腔室培养基更换为中脑类器官扩张培养基。每日换液，培养至D28。

步骤15、D9第二培养腔室培养基更换为前脑神经分化培养基。每日换液，培养至D15。

步骤16、D29第一培养腔室培养基更换为中脑类器官分化培养基。每日换液，培养至D46。

步骤17、D15第二培养腔室培养基更换为前脑神经成熟培养基。每日换液，培养至D60。

步骤18、D46第一培养腔室培养基更换为中脑类器官成熟培养基。每日换液，培养至D60。

上述培养基的配方如下:

中脑类器官形成培养基、中脑类器官扩张培养基、中脑类器官分化培养基、中脑类器官成熟培养基购买自商家为STEMdiff^TMMidbrain Organoid Differentiation Kit货号(100-1096)。

SMADi神经诱导培养基、前脑神经分化培养基、前脑神经成熟培养基购买自商家为STEMdiff^TMForebrain Neuron Differentiation Kit货号(08600)。STEMdiff^TMSMADiNeural Induction Kit货号(05835)

二、同步共分化的多脑区大脑类器官模型

本发明中实施例3同步共分化的多脑区大脑类器官模型第一培养腔室分化为中脑组织，第二培养腔室分化为前脑组织。中脑与前脑组织由同一个拟胚体分化而来，相互连接形成具有中脑前脑多组织的多脑区大脑类器官。

实施例4

本发明实施例4中，集成式培养元件高度为4mm，其他操作同实施例1。

实施例5

本发明实施例5中，集成式培养元件中的培养液分离板厚度为0.5mm，其他步骤均同实施例1。

实施例6

本发明实施例6中，多组织或多类器官同步共分化芯片中的第一凹槽与第二凹槽的中间连接宽度为1mm，其他步骤均同实施例1。

实施例7

本发明实施例7中，多组织或多类器官同步共分化芯片中的第一凹槽与第二凹槽的直径为0.5mm，其他步骤均同实施例1。

实施例8

本发明实施例8中，多组织或多类器官同步共分化芯片中的第一凹槽与第二凹槽的圆心处各添加一个0.2mm直径与凹槽深度一致高度的微柱，其他步骤均同实施例1。

实施例9

本发明实施例9中，多组织或多类器官同步共分化芯片中的第一凹槽与第二凹槽的中间连接处添加一个0.2mm直径与凹槽深度一致高度的微柱，其他步骤均同实施例1。

实施例10

本发明实施例10中，接种细胞悬液浓度为2×10⁴个/μL，其他步骤均同实施例1。

实施例11

本发明实施例11中，接种细胞悬液密度为9×10⁴个/μL，其他步骤均同实施例1。

实施例12

本发明实施例12中，集成式培养元件的细胞培养板为共聚焦小皿，其他步骤均同实施例1。

实施例13

本发明实施例13中，集成式培养元件的细胞培养板为高通量微电极阵列芯片，第一凹槽与第二凹槽底部具有高通量微电极阵列，其他步骤均同实施例1。本发明中实施例13多组织或多类器官同步共分化芯片结构示意图以及明场成像如图6所示，可知类器官同步分化为心脑多类器官，且类器官底部与记录电极接触。本发明中实施例13多组织或多类器官模型电生理功能检测结果如图6所示，可知心脑多类器官可实时原位检测到心脏类器官的电信号且与人体心电图相似。

实施例14

本发明实施例14中，两侧类器官培养方法皆使用心脏类器官培养方法，构建两侧均为心脏类器官的心脏单谱系类器官，其他步骤均同实施例1。

对比例1

该对比例中，集成式培养元件中的隔板的厚度为1mm，其他步骤均同实施例1。

对比例2

该对比例中，集成式培养元件中的隔板的厚度为1.5mm，其他步骤均同实施例1。

对比例3

该对比例中，多组织或多类器官同步共分化芯片中的第一凹槽与第二凹槽的中间连接宽度为1.5mm，其他步骤均同实施例1。

对比例4

该对比例中，多组织或多类器官同步共分化芯片中的第一凹槽与第二凹槽的中间连接宽度为2mm，其他步骤均同实施例1。

对比例5

该对比例中，多组织或多类器官同步共分化芯片中的第一凹槽与第二凹槽的直径为1.5mm，其他步骤均同实施例1。

对比例6

该对比例中，多组织或多类器官同步共分化芯片中的第一凹槽与第二凹槽的直径为2mm，其他步骤均同实施例1。

对比例7

该对比例中，接种细胞悬液浓度为1×10⁴个/μL，其他步骤均同实施例1。

对比例8

该对比例中，接种细胞悬液浓度为20×10⁴个/μL，其他步骤均同实施例1。

实验例1

对上述实施例1-13和对比例1-8的每两天明场拍照观察并对D4天类器官两侧培养基分离效果进行统计，如表1所示，其中检测培养基分隔效果的方式为将两侧培养基吸干，一侧添加培养基，检测从中间连接通道溢出到另一侧培养基的体积。计算方法为：(溢出到另一侧后添加侧培养基的剩余体积÷添加培养基体积)×100％；检测培养基分隔效果大于等于95％为合格，50％为完全不分隔培养基。

表1

由表1的数据可知：

对比例1中，隔板22的厚度为1mm，大于本发明实施例0.1mm～0.5mm的范围。两个类器官连接处与培养基接触面积少，导致培养到D4天类器官连接处无法获得足够养分而死亡；

对比例2中，隔板22的厚度为1.5mm，大于本发明实施例0.1mm～0.5mm的范围。两个类器官连接处与培养基接触面积少，导致培养到D3天类器官连接处无法获得足够养分而死；

对比例3中，集成式培养元件中的第一凹槽311与第二凹槽312的中间连接宽度为1.5mm，中间连接宽度大于本发明实施例0.1mm～1mm的范围；中间连接处宽度大，D5两个类器官依靠自身的收缩能力无法将两个凹槽连接处与培养基分离板之间的空间填满。两侧培养基分隔效率为60％远远低于实施例的99.％，无法实现类器官多谱系分化。

对比例4中，多组织或多类器官同步共分化芯片中的第一凹槽311与第二凹槽312的中间连接处的宽度为2mm，中间连接宽度大于本发明实施例0.1mm～1mm的范围；中间连接处宽度大，D4两个类器官依靠自身的收缩能力无法将两个凹槽连接处与培养基分离板之间的空间填满。两侧培养基分隔效率为50％远远低于实施例的99.％，完全无法分隔培养基，无法实现类器官多谱系分化；

对比例5中，多组织或多类器官同步共分化芯片中的第一凹槽311与第二凹槽312的直径为1.5mm，大于本发明实施例0.5mm～1.4mm(面积为0.20mm²～1.54mm²)的范围。由于凹槽直径较大，细胞接种后无法从二维聚集成三维拟胚体结构，容易从凹槽内脱离，无法正常生长；

对比例6中，多组织或多类器官同步共分化芯片中的第一凹槽311与第二凹槽312的直径为2mm，大于本发明实施例0.5mm～1.4mm(面积为0.20mm²～1.54mm²)的范围。由于凹槽直径较大，细胞接种后无法从二维聚集成三维拟胚体结构，容易从凹槽内脱离，无法正常生长；

对比例7中，接种细胞悬液浓度为1×10⁴个/μL，小于本发明实施例2×10⁴个/μL～10×10⁴个/μL的范围。细胞接种浓度过小，无法在二维层面形成紧密连接，拟胚体无法形成；

对比例8中，接种细胞悬液浓度为20×10⁴个/μL，大于本发明实施例2×10⁴个/μL～10×10⁴个/μL的范围。细胞接种浓度过大，中间连接处细胞无法正常获得养分而死亡。

本发明实施例1-实施例13获得的类器官都能够正常生长且同步分化为多组织或多类器官模型。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种同步共分化的多组织或多类器官模型及其构建方法，其特征在于，所述方法包括：

使用干细胞聚集体形成培养基将消化的干细胞接种至所述第一凹槽和所述第二凹槽中培养，待所述细胞沉降于所述凹槽底部且细胞间形成连接后，加入干细胞聚集体形成培养基培养，待干细胞相互聚集，形成干细胞聚集体将两个凹槽与隔板的空隙填满使得两侧培养基不互通时；

对于所述第一凹槽的干细胞聚集体作如下培养：

对于所述第二凹槽的干细胞聚集体作如下培养：

应用第二组织或类器官的诱导分化条件，不同时期加入相关培养基，获得第二组织或类器官。

2.根据权利要求1所述同步共分化的多组织或多类器官模型的构建方法，其特征在于，所述隔板的厚度为0.1mm～0.5mm。

3.根据权利要求1所述同步共分化的多组织或多类器官模型的构建方法，其特征在于，所述第一凹槽与第二凹槽的中间连接处的宽度为0.1mm～1mm，所述第一凹槽与第二凹槽的面积为0.20mm²～1.54mm²。

4.根据权利要求1所述同步共分化的多组织或多类器官模型的构建方法，其特征在于，所述干细胞接种至所述第一凹槽和所述第二凹槽中培养，使用干细胞聚集体形成培养基将消化的干细胞浓度调整至2×10⁴～10×10⁴个/μL细胞浓度后，取2倍两个凹槽总体积的干细胞悬液接种至所述第一凹槽和所述第二凹槽中培养。

5.根据权利要求1所述同步共分化的多组织或多类器官模型的构建方法，其特征在于，所述干细胞包括诱导多能干细胞、胚胎干细胞和成体干细胞。

6.一种采用权利要求1-5任一项所述方法制备得到同步共分化两种及两种以上组织或器官命运的类器官模型。

7.权利要求6所述的同步共分化两种及两种以上组织或器官命运的类器官模型在模拟人类胚胎发生、器官形成、器官相互作用、多器官疾病病理机制及药物筛选中的应用。

8.一种多组织或多类器官同步共分化芯片，其特征在于，所述多组织或多类器官同步共分化芯片包括用于设于细胞培养板内的集成式培养元件，包括：

位于下层的中部设有凹槽的底部件、位于上层的外形与所述底部件外形相匹配的培养液分离件，所述培养液分离件包括中空件、设于所述中空件内的隔板，所述隔板将所述凹槽分隔成底部相互连通的第一凹槽和第二凹槽。

9.根据权利要求8所述的一种多组织或多类器官同步共分化芯片，其特征在于，所述中空件内的隔板为多个，所述隔板将所述凹槽分隔成底部相互连通的多个小凹槽。

10.根据权利要求9所述的一种多组织或多类器官同步共分化芯片，其特征在于，所述底部相互连通的第一凹槽和第二凹槽的底部,嵌入高通量微电极阵列和压力传感器。