JP2021511823A - 細胞培養装置および方法 - Google Patents

Abstract

細胞培養装置、および同様物を使用する方法が提供される。細胞培養装置の実施形態は、底壁に形成された貫通孔を具備する少なくとも１つのウェルを有するプレート、および貫通孔に配置されたヒドロゲルマトリックスを含む。細胞培養装置はさらに、貫通孔の底部に光学的に透明なプレートを含み得る。【選択図】図３

Description

本発明は、細胞および３Ｄ多細胞物を研究するための、細胞培養装置、および同様物の使用の方法に関する。より詳細には、本発明は、各ウェルの底部にヒドロゲルマトリックスを配して貫通孔を有するマルチウェルプレートに関し、そのヒドロゲルマトリックスは、貫通孔内に配置されたサブマイクロリットルウェルがエンボス加工されていたり、されていなかったりする。

多種のマルチウェルプレートが、細胞を培養し、生物学的または化学的分析を行なうことために、市販されている。そのようなマルチウェルプレートは、製造が比較的簡単で安価であり、手動または自動での扱いに必要な構造的完全性を提供する。

マルチウェルプレートは一般に、各ウェル内に液体サンプルを配置できるように、側壁と底部を有する個々のウェルの、順序付けされたアレイ（ａｒｒａｙ）として作製される。マルチウェルプレートは、４から１５３６のマクロウェルに及ぶ、ウェル個数を有し得る。

マルチウェルプレートを構築するために使用される材料は、分析されるサンプル、および使用される分析技術に基づいて選択される。そのような材料は一般に、サンプルの成分に対して化学的に不活発で、放射線または熱に対して不透過であり得る。

マルチウェルプレートの使途の中には、分光または顕微技術を使用してサンプルを分析するために、透明なウェル底部を必要とする。底部が光学的に透明で紫外線を透過させるマルチウェルプレートが市販されており、一般に２つの異なるポリマー材料から作られており、一方はウェルの側壁に、そして他方はウェルの底壁に使用される。

ガラス製のウェル底部を有するマルチウェルプレートも知られている。ガラスは、化学的に不活発で、ポリマーよりも光学的に優れているという点で、有利である。ガラスは、極端になめらかで、背景信号がほとんどない表面を設けるように、処理され得る。さらに、細胞の解像度の高い画像化には、ガラスの方がよい。

ガラスはポリマーより光学的に優れているが、ガラスからマルチウェルプレートを作り出すのは極めて困難である。その問題に対する１つの解決策は、ウェルの側壁を形成するプラスチック上方部を、ウェルの底壁を形成する平坦で透明なガラス下方部に結合させることである。プラスチック上部プレートとガラス下方プレートを結合させる、一般に使用される１つの方法は、接着剤を使用することである。

そのようなハイブリッドプレートは、分光または顕微的研究にとってはるかにより良く適しているが、それらを作り出すのは高価であり、また、２つの部分を連結している継ぎ目において故障する可能性がある。

単一細胞および細胞集合体の培養に適した、透明な底部およびマイクロチャンバ（例えば、マイクロウェル）を備えた、マルチウェルプレートは未だ必要であり、それを有することは非常に有利であろう。

本発明の１つの態様によれば、底部に形成された貫通孔、および貫通孔に配置されたヒドロゲルマトリックスを備えた、少なくとも１つのマクロウェルを有するマルチウェルプレートを含む、細胞培養装置が提供される。

本発明の別の態様によれば、本明細書に説明される細胞培養装置を供する工程；ピコリットルからマイクロリットルのチャンバ内に１つ以上の細胞型を播種する工程；および、細胞培養装置を１つ以上の細胞型を培養するのに適した条件にさらす工程；を含む１つ以上の細胞型を培養する方法、が提供される。

本発明の別の態様によれば、底壁に形成された貫通孔を具備する少なくとも１つのウェルを有するプレートを供する工程；貫通孔をヒドロゲルで満たし、ヒドロゲル内の少なくとも１つの細胞培養チャンバにエンボス加工を施す工程；を含む培養装置を製造する方法、が提供される。

本発明の別の態様によれば、底壁に形成された貫通孔、および貫通孔に配置されたヒドロゲルマトリックスを備えた、少なくとも１つのウェルを有するプレートを含む、細胞培養のための装置が提供される。装置は、ヒドロゲルマトリックスの上部に配置されたリングをさらに含み、リングは、少なくとも１つのＥＣＭ成分を含むゲルで満たすことが可能である。

本明細書の教示のいくつかの実施形態の態様によれば、（ａ）底壁に形成された貫通孔を具備する少なくとも１つのウェルを有するプレートと；（ｂ）貫通孔に配置されたヒドロゲルマトリックスと、を含む細胞培養装置も提供される。

いくつかの実施形態において、装置はさらに、（ｃ）ヒドロゲルマトリックス中に形成された少なくとも１つのチャンバを含む。

いくつかの実施形態では、貫通孔は、ヒドロゲルマトリックスをそこに閉じ込めるように形作られる。

いくつかの実施形態では、ヒドロゲルマトリックスは、少なくとも１つのウェルの中へ広がる。

いくつかの実施形態では、装置は、プレートの下に位置する光学的に透明な支持部をさらに含み、ここで貫通孔に配置されたヒドロゲルマトリックスは、支持部の上面と接触する。

いくつかの実施形態では、貫通孔は、円すい台として形作られる。いくつかのそのような実施形態では、貫通孔は、２−３２ｍｍに及ぶ直径を有する。

いくつかの実施形態では、貫通孔の内面は、少なくとも１つの、アンダーカット（ｕｎｄｅｒｃｕｔ）領域を含む。いくつかのそのような実施形態では、アンダーカットは、０．５−２ｍｍの深さを有す。

いくつかの実施形態では、貫通孔の内面は、半径方向内側に向けられた突起を含む。いくつかのそのような実施形態では、突起は０．５−３．５ｍｍの長さである。

いくつかの実施形態では、装置は、ヒドロゲルマトリックスの中に形成された、複数の、ピコリットルからマイクロリットルのチャンバを含む。

いくつかの実施形態では、ピコリットルからマイクロリットルのチャンバは、逆になった角すい台として形作られる。

装置のいくつかの実施形態では、ピコリットルからマイクロリットルのチャンバの各々は、１−５０ナノリットルに及ぶ容積を有する。

いくつかの実施形態では、装置は、少なくとも１つのウェルの中に位置し得るリングをさらに含み、リングは、円周方向の内側溝を含む。いくつかのそのような実施形態では、リングは直径２−３２ｍｍである。

いくつかの実施形態では、装置は、少なくとも１つのウェルに位置し得るダブルリングインサート（ｄｏｕｂｌｅ ｒｉｎｇ ｉｎｓｅｒｔ）をさらに含み、ダブルリングインサートは、ダブルリングインサートの内側リングによって画定される中央開口、および、ダブルリングインサートの内側リングと外側リングとの間に画定される複数の区画を含む。

装置のいくつかの実施形態では、ダブルリングインサートは、内側リングの内壁内に少なくとも１つの円周方向の溝を含む。

本明細書の教示のいくつかの実施形態の態様によれば、ａ）本明細書の教示に従う細胞培養装置を供する工程と；ｂ）ピコリットルからマイクロリットルのチャンバ内に１つ以上の細胞型を播種する工程と；ｃ）細胞培養装置を１つ以上の細胞型を培養するのに適した条件にさらす工程と、を含む１つ以上の細胞型を培養する方法、が提供される。そのような方法のいくつかの実施形態では、チャンバは、各々が１つの細胞型を播種するためのものである、複数の区画内に形成される。

本明細書の教示のいくつかの実施形態の態様によれば、ａ）底壁に形成された貫通孔を具備する少なくとも１つのウェルを有するプレートを供する工程と；ｂ）貫通孔をヒドロゲルで満たす工程と；ｃ）ヒドロゲル内の少なくとも１つの細胞培養チャンバにエンボス加工を施す工程と、を含む培養装置を製造する方法、も提供される。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、（ｂ）の前に、ウェル内でダブルリングインサートの位置決めを行う工程を含む。

方法のいくつかの実施形態では、ダブルリングインサートは、ダブルリングインサートの内側リングによって画定される中央開口、および、ダブルリングインサートの内側リングと外側リングとの間に画定される複数の区画を含む。

方法のいくつかの実施形態では、ダブルリングインサートは、ヒドロゲルを閉じ込めるために、内側リングの内壁内に少なくとも１つの円周方向の溝を含む。

本明細書の教示のいくつかの実施形態の態様によれば、ａ）底壁に形成された貫通孔を具備する少なくとも１つのウェルを有するプレートと；ｂ）貫通孔に配置されたヒドロゲルマトリックスと；ｃ）ヒドロゲルマトリックスの上部に配置されたゲルと、を含む細胞培養装置、も提供される。

細胞培養装置のいくつかの実施形態では、ゲルは、少なくとも１つの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を含む。いくつかのそのような実施形態では、ゲルは、少なくとも１つの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を含み、それはゲルを閉じ込めるために、リングの内面に沿って連続している／セグメント化されている、円周方向の溝を含むリング内に配置される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を含むゲルは、少なくとも１つのウェルに位置するダブルリングインサート内に配置され、ダブルリングインサートは、ダブルリングインサートの内側リングによって画定される中央開口、および、ダブルリングインサートの内側リングと外側リングとの間に画定される複数の区画を含む。いくつかのそのような実施形態では、ダブルリングインサートは、少なくとも１つの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を含むゲルを閉じ込めるために、内側リングの内壁内に少なくとも１つの円周方向の溝を含む。

特に定義されていないないかぎり、本明細書に使用される技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を持つ。本明細書に説明されるものに類似する、または、等価である方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が以下に説明される。矛盾する場合には、定義を含む特許明細書が優位する。加えて、材料、方法および例は例示のみであり、限定的であるとは意図されていない。

本発明は、添付の図面を参照して、例示のみによって、本明細書で説明される。ここで、特に図面を詳細に参照すると、示されている詳細は例であり、本発明の実施形態を例示的に説明することのみを目的としており、本発明の原理および概念的側面に関する、最も有用かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示されていることが、強調される。この点で、本発明の基本的な理解に必要なものよりも詳細に、本発明の構造詳細を示す試みは行われず、図面を伴う説明は、本発明のいくつかの形態が、実践においてどのように具現化され得るかを、当業者に対して明らかにする。
ＡとＢは、本装置の実施形態を概略的に示す。 本装置の実施形態のヒドロゲルマイクロチェンバを概略的に示す。 くぼみ／アンダーカットを有するマクロウェルの貫通孔を概略的に示す。 Ａ−Ｅは、ヒドロゲルマトリックスで満たされたマクロウェル内の、ヒドロゲルマイクロチャンバアレイの作製を、概略的に示す。 各マクロウェル底部に貫通孔と、側壁に耳の様なくぼみとを有する、６と２４のウェルプレート（それぞれ左図および右図）を、示す。 貫通孔の側壁における、耳の形をしたアンダーカット／くぼみを、示す。 Ａ−Ｂは、本発明の実施形態に従う、マイクロチャンバスタンピング装置を示す。Ａは、６と２４のアレイスタンピング装置（それぞれ上図と下図）を示し、Ｂは、各スタンプ用突起に切り込みを有するスタンピング装置を示す アレイスタンピング前の培養装置のインキュベーションを示す。 ６と２４のアレイスタンピング装置（それぞれ上図と下図）を使用する、ヒドロゲルマイクロチャンバアレイ（ＨＭＡ）スタンピングを示す。 形成アレイ側面概略図（上図）に対応する、ヒドロゲル充填貫通孔内の形成アレイの平面図（下図）を示す。 形成ＨＭＡを備えた６と２４のウェルプレートを示す。 スロット付きリングに囲まれた、形成ＨＭＡを示す。 ２つ以上の細胞集団／細胞型の共培養に適した本栽培装置の実施形態を示す。 スロット付きリングに囲まれた２つのＨＭＡを有する、単一のマクロウェル内における、３つの細胞型の培養を示す。 タモキシフェンを用いる用量依存性薬物処置後の、培養ＭＣＦ７乳癌スフェロイドにおける、成長比率、相対成長比率（対照群との比較）、およびＰＩ染色面積の％を示すグラフである。 本発明の装置で利用可能な、インサートの１つの実施形態の様々な見方を示す。 本発明の装置で利用可能な、インサートの１つの実施形態の様々な見方を示す。 スタンピングされたマイクロチャンバアレイに対する、図１６−１７のインサートの位置を示す。 本発明のインサートの別の実施形態を示す。

本発明は、細胞または３Ｄ多細胞物を培養するために使用され得る、細胞培養装置の実施形態に関する。具体的には、本発明の実施形態は、３Ｄ多細胞物（例えばスフェロイド）の形成に適した条件下で細胞を培養し、かつ、細胞／３Ｄ多細胞物浸潤能力、２つ以上の細胞集団間の相互作用、および細胞と３Ｄ多細胞物に対する薬物の影響を研究するために、使用され得る。

本発明の原理と働きは、図面およびそれに伴う説明を参照することで、一層よく理解され得る。

発明の少なくとも１つの実施形態について詳細に説明する前に、本発明がその適用において、以下の説明に規定される、または実施例によって実例を示されている詳細に、限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能である、または、様々な方法で実施または遂行されることが可能である。さらに、本明細書に使用される語法および用語は、説明を目的としたものであり、限定的であると見なされるべきでないことを理解されるべきである。

光学的に透明な底部を有するマルチウェルプレートが、当該技術分野で知られている。そのようなプレートは、光学的に透明なポリマー、またはガラスの底部を備えて作製される。そのようなプレートは、顕微的または分光学的技術を使用して、光学的に調査することが可能であるが、ポリマー底部プレートは、ウェル底部に使用されたポリマーの光学的性質による制限を受ける一方で、ガラス底部プレートは、コストおよびポリマー−ガラス界面の完全性による制限を受ける。

本発明者が以前に提出した特許出願は、ピコリットルのチャンバでエンボス加工されたヒドロゲルマトリックスを有する、マルチウェルプレートを開示した。これらの特許出願とその後の研究は、ヒドロゲルで形成されたピコリットルのチャンバが、スフェロイドなどの３Ｄ多細胞物の生成および研究に、大いに有効であることを示している。

本発明を実践に移すと同時に、本発明者は、光学的に透明であり、顕微的または分光的技術を用いて調査され得る、ヒドロゲルエンボス加工のナノリットルからマイクロリットルのチャンバ（例えばウェル）を有するプレートの考案に着手した。

本明細書の以下に、およびその後の実施例セクションにさらに説明されるように、本発明者は、各ウェルの底壁に形成された貫通孔内にエンボス加工されたヒドロゲルマトリックスを有する、マルチウェルプレートを構築した。貫通孔は、各ウェル、およびそこに形成される各サブマイクロリットルのチャンバに対し、必要とされる光学的透明性を提供し、マトリックスの凝固中に穴の内部に閉じ込められているヒドロゲル溶液を維持するように、設計された。

したがって、本発明の１つの態様によれば、細胞を培養するための装置が提供される。

本明細書に使用される場合、培養という用語は、細胞または３Ｄ多細胞物（例えば、細胞が組織に特異的な機能を保つ、スフェロイド均一凝集体またはスフェロイド不均一凝集体）を、細胞／３Ｄ多細胞物の研究に適した条件にさらすことを指す。そのような条件は、細胞または３Ｄ多細胞物の生存能力を維持し、および／または、複製、分化、運動性などを支持する。

本装置によって培養可能な細胞の実施例は、真核細胞および原核細胞を含むが、これらに限定されない。真核細胞の例は、ヒト細胞、動物細胞および植物細胞を含む。細胞は、ヒトおよび動物標本からの、分化または未分化の、正常または癌性の、細胞株または初代細胞であり得る。例として、幹細胞、癌幹細胞、循環腫瘍細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、正常な成人の細胞、癌細胞、形質転換細胞などが挙げられる。

ヒト細胞または動物細胞として、造血細胞、血液細胞、臍帯血細胞、免疫細胞、神経系細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞などの正常細胞、または、癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、肉腫、中枢神経系、中皮腫などの部類からの病原性細胞（例えば腫瘍／癌細胞）が挙げられる。

本発明の細胞培養装置の実施形態は、底壁（ウェルの「フロア」）に貫通孔を形成した、少なくとも１つのウェル（本明細書ではマクロウェルとも呼ばれる）を有するプレートを含み得る。貫通孔は、マルチウェルプレートの鋳造後にドリルで穿設／加工されることが可能であるが、代替的に、マルチウェルプレートは貫通孔と共に鋳造されることが可能である（貫通孔を有する予備成形プレート）。

プレートは、ポリスチレン、ポリプロピレンなどの透明または不透明なポリマーから作製された４−９６またはそれ以上のマクロウェルを有する、マルチウェルプレートであり得る。本発明の実施形態の最初の設計として使用され得るマクロウェルプレート構成としては、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄのＣＯＳＴＡＲ（登録商標）３５１６（６ウェルプレート）、３５１３（１２ウェルプレート）、３５２４（２４ウェルプレート）、３５４８（４８ウェルプレート）、３５９５（９６ウェルプレート）、またはＪｅｔ ＢＩＯＦＩＬ（登録商標）のＴＣＰ０１１００４（４ウェルプレート）、ＴＣＰ０１１００６（６ウェルプレート）、ＴＣＰ０１１０１２（１２ウェルプレート）ＴＣＰ０１１０２４（２４ウェルプレート）、ＴＣＰ０１１０４８（４８ウェルプレート）、ＴＣＰ０１１０９６（９６ウェルプレート）、または、Ｃｅｌｌｖｉｓの、インサートバージョン用のＰ０６−１４−０Ｎ、Ｐ０６−１４−１−Ｎ、Ｐ０６−１４−１．５−Ｎ、Ｐ０６−２０−１−Ｎ、Ｐ０６−２０−１．５−Ｎ（６マイクロウェルを有するガラス底部プレート）、Ｐ０６−１．５Ｈ−Ｎ（６ウェルを有するガラス底部プレート）、Ｐ１２−１．５Ｈ−Ｎ、Ｐ１２−１．５Ｐ（１２ウェルを有するガラス底部レート）、Ｐ２４−０−Ｎ、Ｐ２４−１．５Ｈ−Ｎ、Ｐ２４−１．５Ｐ（２４ウェルを有するガラス底部プレート）、Ｐ９６−０−Ｎ、Ｐ９６−１−Ｎ、Ｐ９６−１．５Ｈ−Ｎ、Ｐ９６−１．５Ｐ（９６ウェルを有するガラス底部プレート）などの、ガラス底部を具備する市販のプレートが挙げられる。マクロウェルは、円形（円筒状）、正方形、または直線的な側面または先細りの側面（例えば、下に向かって先細りになる）を具備する、マルチウェルプレートにおける使用に適した任意の形状であって良い。典型的なマクロウェル寸法は、直径６−３５ｍｍ、ウェル深さ１０−１８ｍｍであり得る。各ウェルの底壁は、厚さ１−２．５ｍｍ（ポリマー）、または０.０８５−０．１７５ｍｍ（ガラス）であり得る。

各マクロウェルの底部に配される貫通穴は、円形、正方形またはその他の形であり得る。貫通孔は、直線的な側面を有する、つまり円形状の穴の場合には円筒となる、または、下から上に先細る、つまり、円形上の穴の場合には円すいとなる、ことが可能である。貫通孔は、くぼみ、またはくぼみ側壁の突起、またはその側壁底部のアンダーカット、を含み得る。貫通孔のための典型的な寸法は、直径３−３１ｍｍ、および高さ０．６−２．６ｍｍであり得る。くぼみ／アンダーカット、または突起は、例えば、体積０．４−１００ｍｍ^３であって良く、貫通孔の側壁はざらついていて（粗くて）良い。

細胞培養装置の実施形態は、各ウェルの底部に、光学的に透明なカバーを含み得る。そのようなカバーは、ガラス（例えば、Ｐａｕｌ Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ、Ｗａｌｄｅｍａｒ Ｋｎｉｔｔｅｌ Ｇｌａｓｂｅａｒｂｅｉｔｕｎｇｓ ＧｍｂＨ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｅｎｚｅｌ ＧｍｂＨ等によって作製された、カバーガラス厚ｎｏ．１）、または、ポリスチレン、ポリプロピレなどの光学的に透明なポリマーから製造され得る。支持プレートは、マルチウェルプレートの底部に、糊付けまたは他の方法で取り付けられる。上述の様な、ガラス底部を具備する市販のプレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ）も使用され得る。

各マクロウェルの底部の貫通孔は、寒天またはアルギン酸（藻類由来の天然炭水化物）、アガロース（海藻由来の天然炭水化物）、または合成ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）（ＰＥＧ）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））、または自然由来のタンパク質（例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、バーシカン、エラスチンなど（哺乳動物由来の天然ペプチド）、または、グリコサミノグリカン（ヘパリン／ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸（哺乳動物由来の天然炭水化物））、または２つ以上のヒドロゲルの混合物、から構成されているヒドロゲルマトリックスで満たされている。アガロースヒドロゲルマトリックスは、１−１０％のアガロース［例えば、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ ＵＳＡからの低融点アガロース（ＬＭＡ）]で構成されている場合がある。

ヒドロゲルは、高い割合の水で膨潤された、形状保持性のポリマーネットワークである（Ｔ．Ｋ．Ｍｅｒｃｅｒｏｎ ａｎｄ Ｓ．Ｖ．Ｍｕｒｐｈｙ，”Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ３Ｄ Ｂｉｏｐｒｉｎｔｉｎｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”ｉｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ ３Ｄ Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１５，ｐｐ．２４９−２７０．）。ヒドロゲルは、自然由来のタンパク質、またはグリコサミノグリカン（例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、ヒアルロン酸など）、アルギン酸および寒天（藻類由来の天然炭水化物）、アガロース、または、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）などの合成ポリマーで構成される場合がある。

これらの分子は、水溶液において、細胞および他の生物活性因子と混合され、または、事前培養された細胞に埋め込まれ、その後に、不溶性の、交差結合された網目構造を形成するように操作されることが可能であり、その結果、細胞を含むヒドロゲルをもたらす。モノマー／非交差結合の形態から、ポリマー／交差結合の形態への操作は、（ｐＨ、温度、およびイオン濃度などの）環境変化、酵素の発生、または光重合を通して、物理的または化学的結合を引き起こすことによって達成される。

ヒドロゲルは、その親水性、および細胞や生物活性分子を封入する能力のために、細胞培養のための魅力的な培地であり、そのため、天然ＥＣＭの多くの特性を模倣している（Ｊ．Ｍａｌｄａ，Ｊ．Ｖｉｓｓｅｒ，Ｆ．Ｐ．Ｍｅｌｃｈｅｌｓ，Ｔ．Ｊｕｎｇｓｔ，Ｗ．Ｅ．Ｈｅｎｎｉｎｋ，Ｗ．Ｊ．Ａ．Ｄｈｅｒｔ，Ｊ．Ｇｒｏｌｌ， ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ，”２５ｔｈ Ａｎｎｉｖｅｒｓａｒｙ Ａｒｔｉｃｌｅ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，”Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，ｖｏｌ．２５，ｎｏ．３６，ｐｐ．５０１１−５０２８，Ｓｅｐ．２０１３．）。さらに、それらは、酸素、栄養素、および代謝物質の拡散のための、優れた多孔性を有し；穏やかな、細胞にやさしい条件下で処理されることが可能で；刺激、炎症、または分解からの生成物を、ほとんどまたは全く発生させない（Ｆｅｄｏｒｏｖｉｃｈ ＮＥ，Ａｌｂｌａｓ Ｊ，Ｗｉｊｎ ＪＲ，Ｈｅｎｎｉｎｋ ＷＥ，Ｖｅｒｂｏｕｔ ＡＪ，Ｄｈｅｒｔ ＷＪ． Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ａｓ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｓｔａｔｅ−ｏｆ−ｔｈｅ−ａｒｔ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｏｒｇａｎ ｐｒｉｎｔｉｎｇ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．２００７；１３：１９０５−２５．）。

ヒドロゲルは、その場で注がれる、または、（単一または複数のウェルインサートとして）事前形成されることが可能である。後者の場合、１つ以上のマクロウェルのためのテンプレートを使用することで、その後にマルチウェルプレートの個々の貫通孔、または底部を持たないプレートに収まり得る、１つ以上のインサートを作製することができる。あるいは、貫通孔と４つ以上の円周方向のＶ字形の区画を有するインサートは、マルチウェルプレートのマクロウェル内に位置することが可能で、かつ、そこを通ってヒドロゲルが、その場で注がれ得る。インサートは図１６−１８に示され、以下に詳しく説明される。

マクロウェル底部内の貫通孔、またはインサート内の円周方向の溝の、くぼみ／突起／アンダーカット、またはざらついた側壁表面は、ゲル化後の、貫通孔からのヒドロゲルの転位／移動を防ぐために、ヒドロゲルを閉じ込め、保持できる。

ヒドロゲルマトリックスは、それが貫通孔を満たし、随意に貫通孔からマクロウェルの中に広がるように注がれ得る。インサートの場合、ヒドロゲルが貫通孔を満たし、Ｖ字形の円周方向の領域（その領域の１つずつで、２−８の異なる型の細胞を共培養するため）の間に障壁を作るように、インサート内の円周方向のチャネルを満たすように広がる。

ヒドロゲルマトリックスは、例えば専用のツールを使用してエンボス加工を行うことで中に形成される、複数のピコリットルからマイクロリットルのチャンバを含む。

以下の実施例のセクションは、ヒドロゲルマトリックスの上面にマクロウェルを作製するのに使用され得る、スタンピング／エンボス加工装置と、そのような作製のためにスタンピング／エンボス加工装置を使用する方法について説明する。

エンボス加工されたチャンバ（本明細書では、マイクロチャンバ、またはマイクロウェルと呼ばれる）は、単一細胞培養、および細胞集合体（例えば３Ｄ多細胞物）の形成のために必要な、条件および体積を提供する。各マトリックスは、単一のマイクロチャンバ、または４０−７４００のマイクロチャンバを有するマイクロチャンバのアレイ（本明細書で、マイクロチャンバのヒドロゲルアレイ、またはＨＭＡとも呼ばれる）を含み得る。マクロウェルサイズ、アレイ中のマイクロチャンバの数、および使用に応じたて、各マイクロチャンバの体積は、ナノリットル未満から何百マイクロリットル（例えば、０．５−５０ナノリットルから１−５００マイクロリットルまで）に及ぶ場合がある。例えば、９６のウェルプレート、４０のＨＭＣアレイ、１５０μｍＸ１５０μｍ平方の、上部が逆さまで、かつ先端が切り取られた角すいで、直径３ｍｍの領域にエンボス加工された底部のマイクロウェルサイズでは、各マイクロチャンバは、１６．５９ｎＬの容積を有する。

マイクロウェルは、培養に適している任意の形であり得る。使用され得る１つの形は、３２０−４３０μｍまたはそれより大きいベース（上部）と、３５−１５０μｍまたはそれより大きい角すい上部（マイクロウェル底部）とを有する、逆さまの角すい台である。マイクロウェルの高さは、エンボスのパターン、貫通孔の高さ、ヒドロゲルマトリックスが貫通孔の上からマクロウェルの中に広がるか否かによって決まる；典型的な高さは１９０μｍであり得る。

続く実施例セクションにさらに述べられているように、本培養装置は、個々の細胞を培養するため、３Ｄ多細胞物を形成するため、細胞または３Ｄ多細胞物に対する化合物（例えば薬物）の影響を調べる他、幹細胞のクローンを作り、分化させるために使用され得る。

本装置はまた、浸潤研究のため、またはあるセル型の、他に対する効果を研究するために、使用され得る。

そのような研究を促進するために、本装置は、ヒドロゲルマトリックス上部のマクロウェルに配置可能な、リングを含み得る。リングは、円周方向の、内側溝／スロットを含み得る。リングは、直径３−３１ｍｍ、高さ３−１０ｍｍ、そして厚み１−２ｍｍの、ポリスチレンおよびポリプロピレンなどの、ポリマーから作製され得る。内側溝／スロットは、（リングの側壁の中に向かって）深さ０．５−２ｍｍであり得る。スロットは、リングの側壁を完全に貫通しても良いし、しなくても良い。溝／スロットは、エンボス処理の間、ＨＭＣアレイ領域の周りのヒドロゲルマトリックスにおいて形成され得る。インサートの場合には、ＥＣＭを閉じ込め、ヒドロゲルに対してそれを保持するために、インサートの内部に、円周方向の、そして連続的な／セグメント化された、溝が作製され得る。

浸潤研究については、可溶型のＥＣＭマトリックスが、リング内、またはインサート内に注がれるか、あるいはＨＭＣアレイの上に直接注がれる。リング、インサート、またはＨＭＣアレイの周囲のヒドロゲルマトリックスにおけるスロット／溝は、ＥＣＭゲル化時に、ＥＣＭマトリックスをＨＭＣアレイに対する位置に留め置くのに役立ち、これにより、細胞と、ＥＣＭマトリックス内のＥＣＭ成分との間の接触が可能になる。

エンボス加工された任意の数のマイクロチャンバを有する、任意のサイズのマルチウェルが、浸潤研究に使用され得る。例えば、１−３のエンボス加工がなされたＨＭＡを各マクロウェルに備えた６ウェルプレートが、浸潤分析に使用され得る。ＨＭＡの上に細胞懸濁液を静かに加え、１５分間で重力によって沈殿させることにより、細胞をマイクロチャンバ（ＭＣ）１つあたり５細胞未満の濃度でプレートに充填できる。次に、５０−５００μＬの新鮮な培地（６ウェルプレート用で合計２−４ｍＬ、２４ウェルプレートで合計１ｍｌになるが、これに限定されない）のアリコートが、ヒドロゲルアレイに沿ったマクロウェルのプラスチック底部の淵に追加されることが可能で、その後プレートは、３Ｄ多細胞物を形成するために、３７℃で２４−７２時間インキュベートされ得る。

３Ｄ多細胞物形成の後、培地はマクロウェルから取り除かれることが可能で、そして、ＥＣＭ成分（例えばコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、バーシカン、エラスチン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸等の、少なくとも１成分、または少数のＥＣＭ成分の混合物）が、３Ｄ多細胞物の上に静かに注がれ得る。スフェロイドから分泌され得る、酵素活性／タンパク質／ヌクレイン酸／エクソーム、および他の因子の測定のための、指標／ナノ粒子／ビーズは、ＥＣＭゲルと混ぜ合わされ得るか、または、ゲル化の前にマイクロチャンバに加えられ得る。ゲル化（コラーゲンＩ型については、プレートは３７°Ｃで１時間インキュベートされる）の後、ＥＣＭゲルは３Ｄ多細胞物を取り囲み／覆い、ゲル化すると、リング、インサート、またはヒドロゲルマトリックスに形成されるスロットによって閉じ込められる。

その後、プレートは数日間インキュベートされることが可能で、３Ｄ多細胞物全体の動き（形状変化）、または単一細胞の動き（スフェロイドから周囲のＥＣＭの中へ移動すること）を追跡するために、画像が取得され得る。

画像は、いずれのタイプの倒立顕微鏡（オリンパス、ニコン、ライカ等）、またはいずれのタイプのマイクロタイタープレート画像化ユニット（ｍｉｃｒｏ ｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｕｎｉｔ）（例えば、Ｃｅｌｉｇｏ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｍｉｃｒｏ−Ｗｅｌｌ Ｉｍａｇｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ， ＪｕＬＩ ｓｔａｇｅ， Ｃｙｔａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｍｕｌｔｉ ｍｏｄｅ ｒｅａｄｅｒ等）によって、ＨＭＡで満たされた貫通孔を覆う底部ガラスを通して、取得され得る。

画像は、専門家によって手作業で、または画像分析ソフトウェアを使用することによって自動で、分析され得る。

本装置はまた、細胞対細胞の相互作用研究のために、２つ以上の細胞型を共培養するのに使用され得る。

エンボス加工された２つのＨＭＡを有するマクロウェルは、（両方のＨＭＡを覆う）単一の成長培地を共有する２つの細胞集団の間の相互作用を研究するために使用されることが可能である。さらに、後の実施例セクションに説明されるように、リングが取り付けられたそのようなマクロウェルは、３つの異なる細胞集団を研究するために使用されることが可能で、第３の細胞集団は、リング外側および培養地内に播種される。

インサートの場合には、１から４（またはそれ以上）の異なる細胞型が、インサートによって作られた区画の中に播種され得る。それらの区画はＨＭＡのまわりに局在化し、５つの異なる細胞集団の研究を可能にする。

本装置の実施形態はまた、播種のための取り外し可能な障壁を配することによって、アレイの、異なる領域に細胞を播種することを可能にし得る。それらの障壁は、クッキー型のような形状をなすことが可能で、形状とサイズは播種されるＨＭＡの領域によって決まる。例えば、ＨＭＣアレイの１２×１２ｍｍの正方形のエンボス領域は、それぞれ４×１２ｍｍの三角形を有する３の別々のサブ領域に分割される。分割はプラスチックの隔壁を使用することによって行なわれる。例えば、円が４−８のセクターまたはセグメントに分割されるなど、他の形状も設計され得る。細胞を異なる領域に充填した後、ＥＣＭが各領域に加えられ、プラスチックの障壁が取り除かれ、２（またはそれ以上）の細胞型の間で直接の相互作用（例えば、癌細胞の間質細胞への浸潤）が可能となり、隣接する領域の共培養された細胞が、相互作用すること、および／または、自由に移動することを可能にする。

本装置の実施形態は、ＨＭＣアレイおよび画像化技術を使用して、３Ｄ多細胞物の各々の表現型を識別することによって、その表現型、つまり、薬物に対する反応、代謝パラメータ、免疫染色、浸潤能等、に照らして、１つ以上の３Ｄ多細胞物を回収するために使用され得る。回収された３Ｄ多細胞物は、分子および生化学的アプローチを使用して、さらに特徴付けられ得る。

本発明のＨＭＣアレイは、薬物処置、染色および他の操作の間中ずっと、３Ｄ多細胞物の転位の危険性を伴うこと無く、個々の３Ｄ多細胞物をモニタリングすること、および、特に個々の３Ｄ多細胞物を回収することを可能にする。

本発明の実施形態はさらに、特定の細胞の回収および富化を可能にする。例えば、浸潤分析を行なう場合、細胞は、３Ｄ多細胞物から、取り囲まれたＥＣＭの中へ浸潤する。そのような浸潤性の表現型を見せる細胞は、生化学的および分子的手法を使用して、さらに分析され得る。

３Ｄ多細胞物は、浸潤性研究のために使用されるＨＭＣアレイから回収することが可能で、ＥＣＭに浸潤細胞を残して行く。その後、細胞は、検査または富化のために、ＥＣＭから分離され得る（２度目にＨＭＣアレイに充填され、スフェロイドを生成、そしてＥＣＭに浸潤し回収される、これら全てを数ラウンド）。

したがって、本発明は、個々の細胞を播種し、細胞および集合体の進行および浸潤性を研究し、個々の細胞および集合体に対する薬物の影響を研究し、特定の表現型の細胞および３Ｄ多細胞物を単離し、浸潤性の表現型を有する細胞を識別および単離し、そして細胞間相互作用を研究するために使用され得る。

本明細書で（１０）とされる本装置のある実施形態が、図１のＡから図３に示される。装置（１０）の作製は、図４に示される。

図１のＡは、複数のマイクロチャンバ（１７）を有するヒドロゲルマトリックスアレイ（１５）で形成されたヒドロゲルマトリックス（１６）で満たされた貫通孔（１４）を有する、単一のマクロウェル（１２）の側面概略図である。図１のＢは、ヒドロゲルマトリックス（１６）に形成された、３つのマイクロチャンバ（１７）の平面概略図である。

これらの図に示されるように、装置（１０）のこれらの実施形態は、プレート（２０）のプラスチック底部（１８）を通る、円すい形の貫通孔（１４）を含む。貫通孔は、各々が逆さまの角すい台として形作られている複数のマイクロチャンバ（１７）がエンボス加工されている、ヒドロゲル（１６）で満たされている。各マイクロチャンバ（１７）の典型的な寸法は、図２に示される。ガラスなどの光学的に透明な材料で作られた支持部（２２）が、貫通孔（１４）の底部に取り付けられる。

図３は、貫通穴（１４）内にヒドロゲルマトリックス（１６）を閉じ込めるためのアンダーカット／くぼみ（２４）を備えた、貫通穴（１４）を示す。

アンダーカット／くぼみ（２４）は、貫通孔（１４）の外周に沿って、例えば（図３に示されるような）その底端、または側壁（２６）の別個の領域に配され得る。

図４のＡ−Ｅは、スタンピング／エンボス加工装置（３０）を有する、ＨＭＡ（１５）の形成を示す。

図４のＡは、形成された貫通孔（１４）、およびその下に位置する支持部（２２）を備えた、マクロウェル（１２）を示す。

液体のアガロースの滴が、貫通孔（１４）内の支持部（２２）の上部に配置される（図４のＢ）。スタンピング／エンボス加工装置（３０）は、マイクロチャンバ（１７）を形成し、かつ液体のアガロースがくぼみ（２４）の下に閉じ込められるよう、貫通孔（１６）内に液体のアガロースを広げるために、アガロースに押し付けられる（図４のＣ）。アガロースがゲル化後に固まる（図４のＤ）と、スタンピング／エンボス加工装置（３０）は引き抜かれ、後にＨＭＡ（１５）を残す（図４のＥ）。

スタンピング／エンボス加工装置（３０）（本明細書では「ＰＤＭＳスタンプ」とも呼ばれる）が、図７のＡに示される。装置（３０）は複数のストーク（ｓｔａｌｋ）／突起（３１）を含み、その各々は、その遠位面にマイクロチャンバアレイ形成テンプレート（３３）を携える。図７のＢは、スタンピング用の突起（３１）が切り込み（３５）を含む装置（３０）を示す。切り込み（３５）は、スタンピングされたマイクロチャンバアレイに並行する、チャネルを形成する。チャネルは、アレイ内で成長した細胞／スフェロイドをかく乱／転位させることなく、液体（例えば、成長培地）の提供と撤去を可能にする。切り込み（３５）は、細胞がアレイに充填される時に細胞がチャネルに進入することを回避するために、アレイ高さの約２ｍｍ上で開始するチャネルを生成するように構成される。

マクロウェルの底壁の再形成（模様付け／チャネル加工）を回避するために、マクロウェルの一般的形状（例えば、球体マクロウェル用には球体、正方形マクロウェル用には正方形）を有するインサート、および、ヒドロゲルのずれ／転位を防止する構造上の構成要素が、使用され得る。インサートは、ヒドロゲルからのＥＣＭの分離を防止するためのスロット／チャネルと、いくつかの細胞型を同時に培養するためのいくつかの区画とを含み得る。インサートはマクロウェル内に配置することが可能で、ヒドロゲルはそこを通って注がれ得る。

図１６−１８は、本明細書でインサート（１００）とされる、ウェル内のインサートの１つの実施形態を示す。

インサート（１００）は、スポーク（１０６）を介して外側リング（１０４）に取り付けられる内側リング（１０２）を備えた、ダブルリングとして形成され得る。内側リング（１０２）が中央開口（１０３）を画定する一方で、外側リング（１０４）は区画（１１４）（スポーク（１０６）によって分割される）を画定する。

内側リング（１０２）が、直径３−３１ｍｍ、および高さ３−１０ｍｍであり得る一方で、外側リング（１０４）は、直径６−３５ｍｍ、および高さ１−１０ｍｍであり得る。インサート（１００）はさらに、区画（１１４）に注がれ得るゲルを閉じ込めるためのスポーク（１０６）から伸びている「ウィング」（１０８）を含む。

内側リング（１０２）の、連続的またはセグメント化された、円周方向の溝（１１０）が、ＥＣＭの分離を防ぐために使用され得る一方で、第２の円周方向の溝（１１２）（連続的またはセグメント化されている）は、ヒドロゲルの転位を防ぐために使用され得る。円周方向の溝（１１０）は、深さ０．３−１ｍｍ、および高さ１−２ｍｍであることができ、その長さは、リング外周／直径によって決まる。第２の円周方向の溝（１１２）は、深さ０．３−２ｍｍ、および高さ１−３ｍｍであることができ、その長さは、リング外周／直径によって決まる。セグメント化された部分の円周方向の溝の長さ合計は、円周方向の長さのおよそ３分の１から４分の１であり得る。

各スポーク（１０６）の底部のチャネル（１１３）は（インサート（１００）を通って注がれる時）ヒドロゲルで充填可能で、区画（１１４）（４つ示されているが、２−８以上が可能）の間の障壁を作り出す。

図１８は、インサート（１００）の配置を示し、中央開口（１０３）がマクロウェル（ＭＷ）の上に位置し、エンボス加工されたマイクロウェルと区画（１１４）がマクロウェルを取り囲んでいる。

図１９は、外側リング（１０４）の外端の半円くぼみ（１２０）（半円状のドリル穴）、および、内側リング（１０４）の内端のセグメント化された溝／スロット（１１０）を含む、インサート（１００）の実施形態を示す。くぼみ（１２０）は、ヒドロゲルが注がれ、それによってチャネル（１１３）の完全充填を促進する時に、空気がチャネル（１１３）から逃げ出すことを可能にする。

本明細書に使用される場合、用語「約」は、±１０％を指す。

本発明の追加的な目的、利点、および新規の特徴は、以下の実施例の検討で、当業者には明らかになるであろうが、これらの実施例が限定的であるとは意図されていない。

ここで以下の実施例を参照するが、これらの実施例は、上記の説明と共に、本発明を非限定的に説明する。

実施例１
貫通孔を備えた、細胞培養プレートの作製

本デバイスを作成するために、６、１２、２４、４８、または９６のウェル（本明細書ではマクロウェルとも呼ばれる）を有し、寸法が約１２７．８ｍｍ×８５．５ｍｍである細胞培養プレートに、変更がなされた。

円すい形の開口部（貫通孔）は、各マクロウェルのプラスチックの底壁の中央で、４５°の角度でカットされた（図５）。円すい形の貫通孔が、ヒドロゲルの垂直移動（浮遊）を防止するために構成された。（以下にさらに説明される）アンダーカットなどの追加的な貫通孔要素も、ヒドロゲルの水平の移動を防ぎ、かつ貫通孔内のヒドロゲル閉じ込めをさらに強化するために使用された。

底部直径は、ガラスカバーのプレート底部への接着を可能にするために、少なくとも２ｍｍのリング（またはそれより広め）が各マクロウェルの外周に残るように、選択された。使用されるプレートによって、貫通孔の直径は、底部で６−３１ｍｍから上部で４−２８ｍｍへと、先細りにされた。貫通孔の深さは、マクロウェルの底壁の厚みによって決まり、例えば、１−２．５ｍｍであり得る。

いくつか（３−４）のアンダーカットが、底壁厚みの半分の深さ（２４ウェルプレートで１．２７ｍｍ／２＝０．６３５ｍｍ、および６ウェルプレートで１．８ｍｍ／２＝０．９ｍｍ）で、貫通孔の側面に機械加工された。図６は、貫通孔、および（カバーガラスの接着のための）２ｍｍのリム／リングを示す、耳形のアンダーカットの平面図である。

光学的に透明な支持部（ガラスプレート）は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を使用して、マクロウェルプレートの底部に付着され、そしてさらに、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはＮｏｒｌａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ （ＮＯＡ）を使用してマクロウェルプレートの底部に接着されたガラス端部に、Ｎｏｒｌａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ （ＮＯＡ）によって接着された。準備の整ったプレートは、過剰な接着剤モノマーを除去するために、大量の水の洗浄によって無毒化された。

実施例２
マイクロチャンバの作製

ヒドロゲルマトリックスが、スタンピングを使用して、複数のマイクロチャンバ（本明細書では、マイクロウェルまたはサブマイクロウェルとも呼ばれる）でエンボス加工された貫通孔の中へ、注がれた。

スタンピング／エンボス加工装置
ＰＤＭＳスタンプヘッドは、異なる直径でプレキシガラスから作製されたシリンダに接着された。シリンダの他方の端部は、プレキシガラスホルダ（Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ ｈｏｌｄｅｒ）に接着された。６ウェルプレートのためには、シリンダは直径１０ｍｍで、２４ウェルプレートのためには、シリンダは直径６ｍｍだった（図７のＡのそれぞれの平面図および底面図）。それに応じて、ＰＤＭＳスタンプヘッドのサイズが決められた。

プレキシガラスホルダは、（蓋／カバーの様に）マクロウェルプレートの上部開口にフィットするように、サイズが決められた。ホルダがマクロウェルプレートの中にフィットする場合、シリンダは各マクロウェルの真中へ延びる。ＰＤＭＳスタンプヘッドを含む各シリンダの長さは、選ばれた市販のプレートとその寸法によって決まる。ＰＤＭＳスタンプを備えたシリンダの長さは、マイクロチャンバの底部とガラスプレートとの間に間隙を残すように設計されており、この間隙は図２に示されるように、ヒドロゲルマトリックスで満たされる；７０−２００μｍのヒドロゲル層。

（プレキシグラスの代わりに）ステンレス鋼などの金属から作製された、代替のスタンピング／エンボス加工装置も使用された。（ＰＤＭＳの代わりに）金属シリンダ、および任意の金属スタンプヘッドの使用は、スタンピング装置を加熱／冷却するための、温度調節器の使用を可能にする。

マイクロチェンバ作製
６５−７０℃に予熱された低融点アガロース溶液（６％）の小滴（２４ウェルプレート用では±７０ｕｌ、６ウェルプレート用では±４００ｕｌ）が、ドライバス（ｄｒｙ ｂａｔｈ）で８０℃に予熱されたガラス底部の表面の貫通孔の中に、対称的に落とされた（図８）。

予熱されたＰＤＭＳスタンピング装置はその後、図９に示されるように、アガロースの滴の上に静かに置かれた。

アセンブリは、事前のゲル化、および事前の冷却のために、室温（ＲＴ）で５−１０分インキュベートされ、その後、アガロースの完全なゲル化まで４℃で２０分間インキュベートされた。

その後、スタンピング装置が剥がされ、マイクロチャンバ（ＭＣ）のパターンが付いたアガロースゲルが後に残った。

各マクロウェルとＭＣのさまざまな領域を示す概略側面図の参照と共に、形成されたＭＣの平面図が、図１０に示される。

ＭＣを含む、培養プレートは、ＵＶ殺菌された。マクロウェルはその後、無菌のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で満たされた。完全に準備されたプレートは、パラフィルムで覆われ、加湿された大気で４℃で保管された。

実施例３
浸潤分析のための培養プレートの作製

浸潤分析は、浸潤性を持つ細胞を特定するためにＥＣＭ成分を利用する。外周を持つプラスチックインサートリングが、マクロウェルの中の、マクロウェルプラスチック底部とヒドロゲルとの間の接合部に置かれる。このインサートは圧力によって保持されるか、あるいは、マクロウェルのプラスチック側、またはガラス底部に接着され得る。インサートはヒドロゲルアレイ構造を囲み、スロット（事前作製されている、または作製後のリング配置）は、培養培地がマクロウェルに追加される時の、ＥＣＭのヒドロゲル構造からの浮遊／移動／分離を防止するために、ヒドロゲルアレイ上に注がれたＥＣＭ成分を閉じ込める。

図１２は、浸潤分析プレートの作製を示す。ポリマーリングは、マクロウェルに置かれ、ウェル側面に接着される（１）。もしスロットが事前作製されていなければ、各リングは半田ごてを使用して取り付けられる（２）。ヒドロゲルはその後、各マクロウェルへ注がれ、ＨＭＣアレイを作成するようにエンボス加工され（３）、ゲル化（そして細胞が集合化）すると、ＥＣＭゲルが（リング内の）細胞上に注がれ、浸潤分析の準備ができる（４）。

実施例４
共培養分析のための、培養プレートの作製

共培養プレートは、ヒドロゲルで満たされた単一の貫通孔の中に、２つ以上のＭＣのアレイをエンボス加工することによって作製される。エンボス加工は、２つの並列するスタンプを有するＰＤＭＳスタンピング装置を使用して達成された。

図１３は、共培養浸潤分析のために、リングインサートがアレイの周囲に配置される、２つの並列する長方形のＭＣアレイを有するマクロのウェルを示す。そのようなプレートは、３つの異なる細胞型の播種を可能にする−第１がリング周囲、第２が第１のアレイ、そして第３が第２のアレイ。これにより、３つの細胞型間の（共有の培養培地を通した）相互作用を測定することができる。この２つのアレイプレートはまた、２つの細胞の共培養分析において、リング無しで使用され得る。

実施例５
細胞を備えたプレート

細胞は、分析／実験およびプレートとＭＣの寸法によって決まる、異なる濃度でプレートに充填される。

単細胞実験、および自己再生／クローン形成実験については、１つの細胞だけが各ＭＣの内に播種され、そのため、より小さなＭＣが一般に使用される（３５Ｘ３５μｍ）ことは、重要である。

３Ｄ多細胞物生産実験については、１つを超える細胞が各ＭＣで播種される。各ＭＣに充填される細胞の数は、実験に必要な３Ｄ多細胞物のサイズによって決まる。通常、５−１００以上の細胞が、（９０Ｘ９０−１５０Ｘ１５０μｍ、またはより大きい）各ＭＣに播種される。充填される必要のある細胞の濃度は以下に基づいて計算される：１）セル／ＭＣの数；２）充填された培地の体積−体積は、エンボス加工されるＭＣアレイの面積および形状によって決まる。例えば：６ウェルプレートの、直径１０ｍｍの円形アレイについては、体積６０μｌが５００のＭＣに対して必要とされる。１つの細胞／１ＭＣで、５００細胞／６０μｌが必要とされるため、充填には８３３３細胞／ｍｌの濃度が使用される。

細胞／形成スフェロイドを有するプレートは、何日間か保存され、そしてエンドユーザーに輸送され得る。

実施例６
浸潤分析プロトコル

十分に培養された３Ｄスフェロイドが、６ウェル浸潤プレート上に調製される。プレートは氷上で１０分間冷やされ、３ＤスフェロイドはＤＱゼラチンＦＩＴＣ結合基材と混ぜ合わされたコラーゲンＩ型溶液（３ｍｇ／ｍｌ）（Ｃｕｌｔｒｅｘ、Ｒａｔ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ）と共に重ねられ、そして、完全にゲル化するまで３７℃で１時間インキュベートされる。

ＤＱゼラチンＦＩＴＣ結合基材は、高度な蛍光性を有するペプチドを産出するために、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９によって酵素的に効果的に切断された、強く蛍光標識された特定の非蛍光ゼラチン基材である。製品の蛍光強度（ＦＩ）は、ＭＭＰ酵素活性レベルを反映する。

スフェロイドの浸潤は、倒立顕微鏡を使用して、球状配置から逃げ出す細胞クラスター、および個々の浸潤細胞の、リアルタイムモニタリングによって分析される（以下でさらに説明される）。画像は、６時間の間隔で４８時間取得され、合計で８画像を取得する。実験の最後に、スフェロイドと浸潤細胞がマーカーのためにそのままの状態で染色され、ＨＭＣＡ（ハイドロゲルマイクロチャンバアレイ）内で固定され、スフェロイド体内の細胞に対する浸潤細胞の表現型を特徴付けるために、細胞内マーカーを目的として染色される。

各時点で抽出できるパラメータは、（ａ）時間０の時に示される、球の縁／境界から逃げ出す浸潤細胞の数；（ｂ）全浸潤面積（ピクセル数）；（ｃ）浸潤の最大距離； （ｄ）結合浸潤面積から分離された浸潤細胞の数；および（ｅ）ＤＱゼラチのＦＩ（ＭＭＰ活性）、を含み得る。

上記パラメータに基づいて、スフェロイドは、高浸潤性を有する細胞クラスター、または、低浸潤性を有する／非浸潤性の細胞クラスターに分類され得る。すべてのオブジェクト（スフェロイドおよび細胞）に関する形態的／蛍光性の、対応する読み出し情報は、浸潤性の表現型を定義するために利用されるだろう。

オートフォーカスシステムとフォーカスマップ機能を備えたフル電動の広角の倒立顕微鏡（ニコン、オリンパス、ライカ等）が、ＨＭＣＡ（ヒドロゲルマイクロチャンバアレイ）の一連の領域から事前定義された時間間隔で、画像を自動的に取得するために、使用され得る。取得画像の各セットは、明視野像で始まり、いくつかの蛍光画像が続き、その蛍光画像は、各蛍光プローブごとに１つずつ、異なる事前設定時点で取得される。

いくつかのアルゴリズムが、明視野像およびＦＩ分析を使用して、スフェロイド検知および形態パラメータ評価のために開発されている。細胞／スフェロイドは、改良されたソーベルエッジ検出、および形態的操作による関心領域（ＲＯＩ）として自動的に定義されることが可能で、また、その断面積は明視野像上に輪郭が描かれ得る。調査された蛍光視野画像上にそれらの輪郭をマッピングすることによって、各蛍光広角画像ごとに、ＲＯＩが決定され得る。背景除去法および閾値化後に、２つのパラメータが自動的に抽出され得る：各ＲＯＩについて取得された平均ＦＩ値（閾値境界内にある全てのピクセルの平均ＦＩ）、および蛍光シグナルの面積比率。

上記の分析スキームに基づいて、浸潤分析および薬物反応に関する、迅速なマルチパラメータ処理および分析のための、アルゴリズムのセットが開発され得る。このアルゴリズムのセットは、（ａ）ＭＣ中の細胞／球体と個々の浸潤細胞に関する、自動分割アルゴリズム、（ｂ）オブジェクトの特徴抽出：サイズ、形状、質感、および空間的位置、（ｃ）各蛍光性のマーカーのための、各オブジェクトのＦＩパラメータの抽出、（ｄ）各測定対象の蛍光画像データとそれに対応する明視野像についての、マルチパラメータ分析のための完全なフレームワークであって、各時点での各対象に関係する全測定パラメータと、実験過程におけるこれらのパラメータ変化を生成するもの、（ｅ）高浸潤性細胞／スフェロイド対非浸潤性細胞／スフェロイドの分類のためのクラスター分析、（ｆ）上記分類（ｅを参照）およびデータセット（ｄを参照）に基づく管理下での分類を使用した、異なる細胞表現型の定義、および（ｇ）浸潤細胞の表現型で強化されたスフェロイドの浸潤可能性、および処置に対するそれらの反応、を予測するための機械学習分析、を含み得る。

実施例７
ＰｒＣＳＣスフェロイド、前立腺癌関連線維芽細胞（ＰＣＡＦ）、および炎症細胞の共培養

癌間質細胞の主要成分は、腫瘍の動態を支援し、癌細胞を調節し、治療に対する耐性を維持し、かつ著しく影響を与えることが示されている（Ｓｈｉａｏ ＳＬ，Ｃｈｕ ＧＣ−Ｙ，Ｃｈｕｎｇ ＬＷＫ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｌｔｄ；２０１６；３８０：３４０−８．）、（Ｅｄｅｒ Ｔ，Ｗｅｂｅｒ Ａ，Ｎｅｕｗｉｒｔ Ｈ，Ｇｒｕｎｂａｃｈｅｒ Ｇ，Ｐｌｏｎｅｒ Ｃ，Ｋｌｏｃｋｅｒ Ｈ，Ｓａｍｐｓｏｎ Ｎ，Ｅｄｅｒ ＩＥ．Ｃａｎｃｅｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ Ｍｏｄｉｆｙ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ａｎｄｒｏｇｅｎ ａｎｄ Ａｎｔｉ−Ａｎｄｒｏｇｅｎｓ ｉｎ Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｓｐｈｅｒｏｉｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１６；１７：１−１５．）、および（Ｍａｏｌａｋｅ Ａ，Ｉｚｕｍｉ Ｋ，Ｓｈｉｇｅｈａｒａ Ｋ，Ｎａｔｓａｇｄｏｒｊ Ａ．Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＬ２２−ＣＣＲ４ ａｘｉｓ ｃａｎｃｅｒ．２０１７；８：９７３９−５１．）。

前立腺癌幹細胞（ＰｒＣＳＣ）スフェロイドは、ＰＣＡＦおよび炎症細胞（マクロファージ様の細胞）と並行して、共培養プレート（ＣＣＰ）の中で共培養され得る。

Ｍ２マクロファージ細胞は、疾患の様々な段階で、前立腺癌（ＰｒＣ）組織において、組織学的に同定された（Ｔｈａｐａ Ｄ，Ｇｈｏｓｈ Ｒ．Ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１５［ｃｉｔｅｄ ２０１５ Ｎｏｖ １］；９４：５３−６２．）、および（Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ Ｍ，Ｍａｓｉｅｒｉ Ｌ，Ｒａｓｐｏｌｌｉｎｉ ＭＲ，Ｍｉｎｅｒｖｉｎｉ Ａ，Ｍａｒｉ Ａ，Ｃｏｍｉｔｏ Ｇ，Ｇｉａｎｎｏｎｉ Ｅ，Ｃａｒｉｎｉ Ｍ，Ｃｈｉａｒｕｇｉ Ｐ，Ｓｅｒｎｉ Ｓ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｍ１ ａｎｄ Ｍ２ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ ｔｕｍｏｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｆｔｅｒ ｒａｄｉｃａｌ ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１４；２０１４：４８６７９８．）。それらは、ＰｒＣの生存、付着、浸潤、転移を促進し、ＰｒＣ微小環境におけるサイトカイン、成長因子、および活性酸素種のレベルを調整することによって、腫瘍の進行を相互に支援する（Ｔｈａｐａ Ｄ，Ｇｈｏｓｈ Ｒ．Ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１５［ｃｉｔｅｄ ２０１５ Ｎｏｖ １］；９４：５３−６２．）、（Ｐｉｎａｔｏ ＤＪ．Ｃａｎｃｅｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１４［ｃｉｔｅｄ ２０１５ Ｎｏｖ １］；１２０：３２７２−４．）、および（Ｓｈｉａｏ ＳＬ，Ｃｈｕ ＧＣ−Ｙ，Ｃｈｕｎｇ ＬＷＫ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｌｔｄ；２０１６；３８０：３４０−８．）。Ｕ９３７−Ｍ細胞がＰｒＣの増殖および浸潤を促進し（Ｌｉｎｄｈｏｌｍ ＰＦ，Ｌｕ Ｙ，Ａｄｌｅｙ ＢＰ，Ｖｌａｄｉｓｌａｖ Ｔ，Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ Ｂ，Ｓｉｖａｐｕｒａｐｕ Ｎ，Ｙａｎｇ ＸＪ，Ｋａｊｄａｃｓｙ−Ｂａｌｌａ Ａ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１０［ｃｉｔｅｄ ２０１５ Ｎｏｖ １］；７０：１６７２−８２．）、ＣＳＣの成長を支援するニッチ（ｎｉｃｈｅ）として機能すること（Ｍａｏｌａｋｅ Ａ，Ｉｚｕｍｉ Ｋ，Ｓｈｉｇｅｈａｒａ Ｋ，Ｎａｔｓａｇｄｏｒｊ Ａ．Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＬ２２−ＣＣＲ４ ａｘｉｓ ｃａｎｃｅｒ．２０１７；８：９７３９−５１．）、および（Ｌａｕ ＥＹ−Ｔ，Ｈｏ ＮＰ−Ｙ，Ｌｅｅ ＴＫ−Ｗ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１７；２０１７：１−１１．）は、以前に実証されている。

浮遊しているＵ９３７細胞は、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（１０ｎｇ−１μｇ／ｍＬ）で処置することが可能で、付着性のマクロファージ様の細胞（Ｕ９３７−Ｍ）が取得できる。その後、Ｍ２−タイプは、ＰｒＣ細胞の、条件培地での培養によって選択されることが可能（Ｍａｏｌａｋｅ Ａ，Ｉｚｕｍｉ Ｋ，Ｓｈｉｇｅｈａｒａ Ｋ，Ｎａｔｓａｇｄｏｒｊ Ａ．Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＬ２２−ＣＣＲ４ ａｘｉｓ ｃａｎｃｅｒ．２０１７；８：９７３９−５１．）で、ＨＭＣアレイ周囲のプラスチック底部の、マクロウェルの外部境界において生育される得る（図１４を参照）。Ｍ−サブタイプは、ＣＣＲ７およびＣＤ１６３（それぞれ、Ｍ１およびＭ２）の染色によって、識別され得る。

前立腺癌に関連する繊維芽細胞（ＰｒＣＡＦ）は、ＥＣＭの再モデル化（Ｔｕｘｈｏｒｎ ＪＡ，Ａｙａｌａ ＧＥ，Ｓｍｉｔｈ ＭＪ，Ｓｍｉｔｈ ＶＣ，Ｄａｎｇ ＴＤ，Ｒｏｗｌｅｙ ＤＲ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｔｒｏｍａ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２；８：２９１２−２３．）、腫瘍増殖（Ｓｈａｗ Ａ，Ｇｉｐｐ Ｊ，Ｂｕｓｈｍａｎ Ｗ．Ｔｈｅ Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｐａｔｈｗａｙ ｓｉｍｕｌａｔｅｓ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｐａｒａｃｒｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｍａｃｍｉｌｌｉａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ；２００９；２８：４４８０−９０．）、および（Ｓｃｈａｕｅｒ ＩＧ，Ｒｏｗｌｅｙ ＤＲ．Ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｔｒｏｍａ ｉｎ ｂｅｎｉｇｎ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．２０１１；８２：２００−１０．）、血管形成（Ｗｅｂｂｅｒ ＪＰ，Ｓｐａｒｙ ＬＫ，Ｓａｎｄｅｒｓ ＡＪ，Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ Ｒ，Ｊｉａｎｇ ＷＧ，Ｓｔｅａｄｍａｎ Ｒ，Ｗｙｍａｎｔ Ｊ，Ｊｏｎｅｓ ＡＴ，Ｋｙｎａｓｔｏｎ Ｈ，Ｍａｓｏｎ ＭＤ，Ｔａｂｉ Ｚ，Ｃｌａｙｔｏｎ Ａ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｓｔｒｏｍａｌ ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｃａｎｃｅｒ ｅｘｏｓｏｍｅｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０１５；３４：２９０−３０２．）、およびＰｒＣ細胞における薬物感受性（Ｃｈｅｔｅｈ ＥＨ，Ａｕｇｓｔｅｎ Ｍ，Ｒｕｎｄｑｖｉｓｔ Ｈ，Ｂｉａｎｃｈｉ Ｊ，Ｓａｒｎｅ Ｖ，Ｅｇｅｖａｄ Ｌ，Ｂｙｋｏｖ ＶＪ，Ｏｓｔｍａｎ Ａ，Ｗｉｍａｎ ＫＧ．Ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ；２０１７；８：ｅ２８４８．）、を調節する。ｈＴＥＲＴ ＰＦ１７９Ｔ ＣＡＦ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−３２９０ＴＭ）不死化細胞は、ＰｒＣ研究に適切な間質モデルを提示する（Ｍａｄａｒ Ｓ，Ｂｒｏｓｈ Ｒ，Ｂｕｇａｎｉｍ Ｙ，Ｅｚｒａ Ｏ，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ Ｉ，Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｈ，Ｋｏｇａｎ Ｉ，Ｇｏｌｄｆｉｎｇｅｒ Ｎ，Ｋｌｏｃｋｅｒ Ｈ，Ｒｏｔｔｅｒ Ｖ．Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＷＦＤＣ１ ｄｕｒｉｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２００９；３０：２０−７．）。これらのＰＣＡＦは、３Ｄ構成の間質細胞がＰｃＲ細胞の表現型をより浸潤的にさせるので、ヒドロゲルマイクロチャンバ内でスフェロイドとして生育され得る（Ｗｉｎｄｕｓ ＬＣ，Ｇｌｏｖｅｒ ＴＴ，Ａｖｅｒｙ ＶＭ．Ｂｏｎｅ−ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｕｍｏｕｒｉｇｅｎｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ａ ｔｕｍｏｕｒ−ｓｔｒｏｍａｌ ３Ｄ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ；２０１３；１２：１１２．）。

培地成分、インキュベーションおよび培養時間、初期細胞密度、腫瘍細胞に対する間質細胞の比率、細胞播種順序（同時播種／順次播種）、培地交換、および細胞成長の期間を含む、相互環境下での、ＣＣＰの異なる区画内の全細胞集団を維持するための培養条件は、確立されることが可能である。

実施例９
薬物スクリーニング

試験された薬物の細胞毒性の可能性および細胞成長阻害効果は、本明細書に説明されるヒドロゲルマイクロチャンバプレートを使用して評価され得る。

細胞懸濁液が上述のようにＨＭＡの上部に充填されることが可能で、その後、新しい細胞培地が追加され得る。個々の細胞または形成スフェロイドが、試験され得る。試験された薬物、または薬物候補は、異なる濃度、異なる時点で、そして異なるインキュベーション期間（薬物曝露の異なる用量と時間）で、プレートウェルの細胞培地に追加され得る。

細胞／スフェロイドは、試験薬物への暴露前、および薬物添加（数時間−数日）後の異なる時点で、画像化および測定されてよく、同じ条件下で培養された未処置の細胞／スフェロイドと比較され得る。その後、（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの蛍光染色、またはトリパンブルーなどの比色分析染色を使って）細胞生存率の排除試験が行なわれ得る。

いくつかのパラメータが、以下を含めて評価され得る：（ｉ）成長比率（スフェロイド断面積の比率、または個々のスフェロイドの、２つの時点で計算されたスフェロイド体積の比率）−このパラメータは、実験のどの時点でも試験されている。（ｉｉ）ＩＣ５０の値−スフェロイド成長を５０％阻害する薬物濃度。（ｉｉｉ）（死細胞を示す）スフェロイド染色領域−このパラメータは、実験の最終時点でのみ試験される。

上記プロトコルを使用して、ＭＣＦ７乳癌スフェロイド成長に対する、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）の効果が試験された。ＭＣＦ７スフェロイドは、２４ウェルＨＭＡに基づいたイメージングプレートで、生成、および４８時間生育された。４−ＯＨＴの異なる濃度（０−１００μＭ）が、異なる期間（１−５日）に、プレートウェルに添加された。５日目に、スフェロイドはＰＩ（２．５μｇ／ｍｌ）で染色された。実験は３度行なわれた；成長比率、（対照群との比較による）相対成長比率、およびＰＩ染色領域の％が測定され、図１５のグラフに示される。

実施例１０
ＰｒＴＭＩＣの回収、富化および分子分析

前立腺癌幹細胞（ＰｒＣＳＣ）および前立腺腫瘍転移性始原細胞（ＰｒＴＭＩＣ）は、前立腺癌（ＰｒＣ）、転移、およびこの表現型を除去するための有効な処置の開発を理解するのに重要である。

本ＨＭＣアレイの実施形態は、ＰｒＴＭＩＣ集団を回収し、かつＴＭＩＣ表現型を富化および拡張するために使用され得る。

ＰｒＣＳＣスフェロイドと浸潤された細胞の両方がヒドロゲル層内に埋め込まれているため、ＰｒＣスフェロイド、および転移の可能性のある浸潤細胞のプールを、分離および回収するために、２段階のプロトコルを使用して、純粋なＴＭＩＣ集団の回復が達成された。対象のスフェロイドの比較的大きな構造は、毛細血管先端を備えたマイクロマニピュレータを使用して、手動で持ち上げられることができ、ヒドロゲル内に浸潤された細胞のプールを残す。この技術は、コラーゲンゲル内に封入されたクローンを回収するために、うまく使用されてきた（Ｇｕａｎ Ｚ，Ｊｉａ Ｓ，Ｚｈｕ Ｚ，Ｚｈａｎｇ Ｍ，Ｙａｎｇ ＣＪ．Ｆａｃｉｌｅ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｃｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｇｅｌ Ａｒｒａｙ ｆｏｒ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ ３Ｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｉｒａｔｉｏｎ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０１４；８６：２７８９−９７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃ５０００８８ｍ．）。単離されたＰｒＣスフェロイドはその後、ＰｒＣＳＣ回復能力および遺伝子分析を分析するために、さらに使用され得る。

アガロースおよびＥＣＭの酵素分解は、β−アガラーゼ（アガロース４−グリカノヒドロラーゼ）をヒドロゲルに添加し、ゲルが液化するまで３７℃でインキュベートすること、および、コラーゲンの分解のためのコラゲナーゼ（またはＥＣＭ分解のための他の酵素）を添加することによって、浸潤細胞集団を回復させるために使用され得る（Ｂａｔｅｓ Ｍ．Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｓｉｎｇ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｆｉｌｌｅｄ Ｓｃａｆｆｏｌｄ．ＴＩＳＳＵＥ Ｅｎｇ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１３［ｃｉｔｅｄ ２０１５ Ｎｏｖ ２． Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｗｗｗ．ｍｓｏｅ．ｅｄｕ／ｓｅｒｖｌｅｔ／ＪｉｖｅＳｅｒｖｌｅｔ／ｄｏｗｎｌｏａｄＢｏｄｙ／４２６２−１０２−１−５４８６／Ｐａｐｅｒ＿ＭＢａｔｅｓ．ｐｄｆ）。溶解した溶液はその後、収集、そして遠心分離され得る。β−アガラーゼ／コラゲナーゼ処置は、哺乳類細胞の生存率または機能適合性に、影響を与えない（Ｃａｒｌｓｓｏｎ Ｊ，Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ Ｍ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇａｒａｓｅ ｏｎ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．１９７７［ｃｉｔｅｄ ２０１５ Ｎｏｖ ２］；１３：４１７−２２．ｄｏｉ：１０．１００７／ＢＦ０２６１５１０１）。単離された被浸潤細胞集団はその後、浸潤分析モデルに基づいて、ＨＭＣＡ内のサイクル手順にかけられ得る。細胞プールは新鮮な培地に懸濁され、かつスフェロイド形成の第２の手順のために、追加的なＨＭＣに再播種され、その後に浸潤分析がなされた。このサイクル戦略は、富化されたＰｒＴＭＩＣ集団を作り出せる。２から４ラウンドの再播種および浸潤の後、収集された細胞はさらに、分子表現型分析および機能的特性評価にかけられ得る。

実施例１１
乳癌の多細胞３Ｄ構造、形成、およびインビトロ成長に対する、環境剛性の影響

生体組織は通常さまざまなレベルの剛性を有しており、それらの生理学的機能のパフォーマンスに貢献する。組織剛性の変化は、正常状態から病的状態への形態変化を反映している可能性がある。腫瘍内の癌細胞は、微小環境の機械的条件に影響され、そのことが細胞の運命を決め得る。本ＨＭＣアレイの実施形態は、３Ｄ乳癌オブジェクト／構造形成および成長のために、インビトロにおいて望ましい周囲剛性を模倣するために、使用され得る。非接着、非拘束の３Ｄオブジェクトが、ヒドロゲルアレイ内の単一細胞から生成され、アガロース包埋の手順によって作成された様々な機械的条件下で培養され、そしてアガロースの機械的および光学的に有利な特性を利用して、単一オブジェクトの解像度で測定された。この研究は、様々な剛性条件下における３Ｄ乳癌微小組織の、インビトロでの成長における差を実証する。個々の３Ｄ乳癌構造は、オブジェクトの成長比率、環境剛性の程度に関連する形態と重要な特徴、包埋が実施された時点、および播種された細胞の初期数、における有意差を明らかにした。６個未満の細胞から開始された３Ｄオブジェクトは、それ以上のセルから開始された３Ｄオブジェクトとは著しく異なり、周囲剛性に左右されない成長比率を実証する。その上、低剛性条件下で自由に生育された３Ｄオブジェクトの対照培養は、より剛性の高い環境で発達した浸潤前の表現型の特定のサブセットを持たない。

明確さを目的として、別個の実施形態という文脈で説明される本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態に組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔さを目的として、単一の実施形態という文脈で説明される本発明の様々な特徴はまた、別々に、または任意の適切なサブの組み合わせで、提供され得る。

本発明をその特定の実施形態に関連して説明してきたが、多くの代替、修正、および変形が当業者には明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内にある、そのような代替、修正、および変形のすべてを包含することが意図されている。本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、本発明書を参照することによって、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における任意の参考文献の引用または特定は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの了解として解釈されるべきではない。

Claims (29)

1. 細胞培養装置であって：
   （ａ）底壁に形成された貫通孔を具備する少なくとも１つのウェルを有するプレートと；
   （ｂ）前記貫通孔に配置されたヒドロゲルマトリックスと
   を含む、細胞培養装置。
2. （ｃ）前記ヒドロゲルマトリックスに形成された少なくとも１つのチャンバ
   をさらに含む、請求項１に記載の細胞培養装置。
3. 前記貫通孔が、その中に前記ヒドロゲルマトリックスを閉じ込めるように形作られている、請求項１に記載の細胞培養装置。
4. 前記ヒドロゲルマトリックスが、前記少なくとも１つのウェルの中に広がる、請求項１に記載の細胞培養装置。
5. 前記プレートの下に位置する光学的に透明な支持部をさらに含み、ここで、前記貫通孔に配置された前記ヒドロゲルマトリックスが前記支持部の上面に接触する、請求項１に記載の細胞培養装置。
6. 前記貫通孔が、円すい台として形作られている、請求項１に記載の細胞培養装置。
7. 前記貫通孔が、２−３２ｍｍに及ぶ直径を有する、請求項６に記載の細胞培養装置。
8. 前記貫通孔の内面が、少なくとも１つのアンダーカット領域を含む、請求項３に記載の細胞培養装置。
9. 前記アンダーカットが、０．５−２ｍｍの深さを有する、請求項８に記載の細胞培養装置。
10. 前記貫通孔の内面が、半径方向内側に向けられた突起を含む、請求項３に記載の細胞培養装置。
11. 前記突起が、長さ０．５−３．５ｍｍである、請求項１０に記載の細胞培養装置。
12. 前記ヒドロゲルマトリックスに形成された、複数のピコリットルからマイクロリットルのチャンバを含む、請求項２に記載の細胞培養装置。
13. 前記ピコリットルからマイクロリットルのチャンバが、逆さまの角すい台として形作られる、請求項１に記載の細胞培養装置。
14. 前記ピコリットルからマイクロリットルのチャンバの各々が、１−５０ナノリットルに及ぶ容積を有する、請求項１３に記載の細胞培養装置。
15. 前記少なくとも１つのウェルに位置し得るリングをさらに含み、前記リングが円周方向の内側溝を含む、請求項１に記載の細胞培養装置。
16. 前記リングが、直径２−３２ｍｍである、請求項１５に記載の細胞培養装置。
17. 前記少なくとも１つのウェルに位置し得るダブルリングインサートをさらに含み、前記ダブルリングインサートが、前記ダブルリングインサートの内側リングによって画定される中央開口、および、前記ダブルリングインサートの前記内側リングと外側リングとの間に画定される複数の区画を含む、請求項１に記載の細胞培養装置。
18. 前記ダブルリングインサートが、前記内側リングの内壁内に、少なくとも１つの円周方向の溝を含む、請求項１７に記載の細胞培養装置。
19. １つ以上の細胞型を培養する方法であって：
    （ａ）請求項１２に記載の細胞培養装置を供する工程と；
    （ｂ）前記ピコリットルからマイクロリットルのチャンバ内に、１つ以上の細胞型を播種する工程と；
    （ｃ）細胞培養装置を，前記１つ以上の細胞型を培養するのに適した条件にさらす工程と
    を含む、方法。
20. 前記チャンバが、各々が１つの細胞型を播種するためのものである複数の区画内に形成される、請求項１９に記載の方法。
21. 培養装置を製造する方法であって：
    （ａ）底壁に形成された貫通孔を具備する少なくとも１つのウェルを有するプレートを供する工程と；
    （ｂ）前記貫通孔をヒドロゲルで満たす工程と；
    （ｃ）前記ヒドロゲルの中の少なくとも１つの細胞培養チャンバにエンボス加工する工程と
    を含む、方法。
22. （ｂ）の前に、前記ウェル内にダブルリングインサートを配置する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ダブルリングインサートが、前記ダブルリングインサートの内側リングによって画定される中央開口、および、前記ダブルリングインサートの前記内側リングと外側リングとの間に画定される複数の区画を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ダブルリングインサートが、前記ヒドロゲルを閉じ込めるために、前記内側リングの内壁内に、少なくとも１つの円周方向の溝を含む、請求項２３に記載の方法。
25. 細胞培養装置であって：
    （ａ）底壁に形成された貫通孔を具備する少なくとも１つのウェルを有するプレートと；
    （ｂ）前記貫通孔に配置されたヒドロゲルマトリックスと；
    （ｃ）前記ヒドロゲルマトリックスの上部に配置されたゲルと
    を含む、細胞培養装置。
26. 前記ゲルが、少なくとも１つの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を含む、請求項２５に記載の細胞培養装置。
27. 少なくとも１つの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を含む前記ゲルが、前記ゲルを閉じ込めるために、リングの内面に沿って連続している／セグメント化されている、円周方向の溝を含むリング内に配置されている、請求項２６に記載の細胞培養装置。
28. 少なくとも１つの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を含む前記ゲルが、前記少なくとも１つのウェルに位置するダブルリングインサート内に配置され、前記ダブルリングインサートが、前記ダブルリングインサートの内側リングによって画定される中央開口、および、前記ダブルリングインサートの前記内側リングと外側リングとの間に画定される複数の区画を含む、請求項２５に記載の細胞培養装置。
29. 前記ダブルリングインサートが、少なくとも１つの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を含む前記ゲルを閉じ込めるために、前記内側リングの内壁内に少なくとも１つの円周方向の溝を含む、請求項２８に記載の細胞培養装置。

Images