BR112020014921A2 - Dispositivos de cultura de células, método para cultivar um ou mais tipos de células e método para fabricar um dispositivo de cultura - Google Patents

Abstract

um dispositivo de cultura de células e método de uso do mesmo são fornecidos. formas de realização do dispositivo de cultura de células incluem uma placa que tem pelo menos um poço com um orifício de passagem formado em uma parede inferior do mesmo e uma matriz de hidrogel disposta no orifício de passagem. o dispositivo de cultura de células também pode incluir uma placa opticamente transparente na parte inferior do orifício de passagem.

Description

“DISPOSITIVOS DE CULTURA DE CÉLULAS, MÉTODO PARA CULTIVAR UM OU MAIS TIPOS DE CÉLULAS E MÉTODO PARA FABRICAR UM DISPOSITIVO DE CULTURA” ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um dispositivo de cultura de células e a um método de usá-lo para estudar células e objetos multicelulares em 3D. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma placa de múltiplos poços com orifícios de passagem no fundo de cada poço com uma matriz de hidrogel gravada em relevo com ou sem poços de sub-microlitros dispostos no orifício de passagem.

[002] Inúmeros tipos de placas de múltiplos poços estão disponíveis comercialmente para cultura de células e realização de ensaios biológicos ou químicos. Tais placas de múltiplos poços são relativamente fáceis e baratas de fabricar e fornecem a integridade estrutural necessária para o manuseio manual ou automatizado.

[003] Placas de múltiplos poços são tipicamente fabricadas como uma matriz ordenada de poços individuais, cada um com paredes laterais e um fundo, de modo que a amostra líquida possa ser colocada dentro de cada poço. As placas de múltiplos poços podem ter uma contagem de poços que varia de 4 a 1536 macro poços.

[004] Os materiais utilizados na construção de placas de múltiplos poços são selecionados com base nas amostras a serem testadas e nas técnicas analíticas a serem utilizadas. Tais materiais são tipicamente quimicamente inertes aos componentes da amostra e podem ser impermeáveis à radiação ou aquecimento.

[005] Alguns usos de placas de múltiplos poços exigem um fundo de poço transparente para analisar amostras usando técnicas espectroscópicas ou microscópicas. Placas de poços de fundo transparente opticamente e transparentes ao ultravioleta estão disponíveis comercialmente e são tipicamente feitas de dois materiais poliméricos diferentes, um usado para as paredes laterais dos poços e outro para as paredes inferiores dos poços.

[006] Também são conhecidas placas de múltiplos poços que possuem fundos de poço feitos de vidro. O vidro é vantajoso por ser quimicamente inerte e ser opticamente superior aos polímeros. O vidro pode ser processado para fornecer uma superfície com extrema suavidade e muito pouco sinal de fundo. Além disso, o vidro é melhor para imagens de alta resolução de células.

[007] Embora o vidro seja opticamente superior aos polímeros, é extremamente difícil produzir placas de múltiplos poços a partir de vidro. Uma solução para o problema é unir uma porção superior plástica que forma as paredes laterais dos poços com uma porção inferior plana de vidro transparente formando as paredes inferiores dos poços. Um método comumente empregado para unir uma placa superior de plástico e uma placa inferior de vidro uma a outra é usar um adesivo.

[008] Embora essas placas híbridas sejam muito mais adequadas para estudos espectroscópicos ou microscópicos, elas são mais caras de produzir e podem falhar na costura que une as duas porções. Continua sendo necessário e seria altamente vantajoso ter placas de múltiplos poços com fundos transparentes e micro câmaras (por exemplo, micro-poços) adequadas para a cultura de células únicas e agregados celulares.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[009] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um dispositivo de cultura de células compreendendo uma placa de múltiplos poços tendo pelo menos um macro poço com um orifício de passagem formado no fundo do mesmo e uma matriz de hidrogel disposta no orifício de passagem.

[0010] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de cultura de um ou mais tipos de células compreendendo o fornecimento do dispositivo de cultura de células aqui descrito; semear um ou mais tipos de células dentro da câmara de picolitros para microlitros; e submeter o dispositivo de cultura de células a condições adequadas para a cultura de um ou mais tipos de células.

[0011] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para fabricar um dispositivo de cultura compreendendo fornecer uma placa com pelo menos um poço com um orifício de passagem formado em uma parede inferior do mesmo; encher o orifício de passagem com um hidrogel e gravar em relevo pelo menos uma câmara de cultura de células no hidrogel.

[0012] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um dispositivo para cultura de células compreendendo uma placa com pelo menos um poço com um orifício de passagem formado em uma parede inferior do mesmo e uma matriz de hidrogel disposta no orifício de passagem. O dispositivo inclui ainda um anel disposto no topo da matriz de hidrogel, sendo o anel preenchível com um gel incluindo pelo menos um componente de ECM.

[0013] De acordo com um aspecto de algumas formas de realização dos ensinamentos aqui apresentados, também é fornecido um dispositivo de cultura de células que compreende: a) uma placa que tem pelo menos um poço com um orifício de passagem formado em uma parede inferior do mesmo; e (b) uma matriz de hidroge! disposta no orifício de passagem.

[0014] EM algumas formas de realização, o dispositivo compreende ainda: (c) pelo menos uma câmara formada na matriz de hidrogel.

[0015] Em algumas formas de realização, o orifício de passagem é moldado de modo a reter a matriz de hidrogel dentro dela.

[0016] Em algumas formas de realização, a matriz de hidrogel se estende para dentro de pelo menos um poço.

[0017] EM algumas formas de realização, o dispositivo compreende ainda um suporte opticamente transparente posicionado sob a placa, em que a matriz de hidrogel disposta no orifício de contato entra em contato com uma superfície superior do suporte.

[0018] Em algumas formas de realização, o orifício de passagem é moldado como um cone truncado. Em algumas dessas formas de realização, o orifício de passagem tem um diâmetro variando de 2 a 32 mm.

[0019] Em algumas formas de realização, uma superfície interna do orifício de passagem inclui pelo menos uma região rebaixada. Em algumas dessas formas de realização, o rebaixamento tem uma profundidade de 0,5 a 2 mm.

[0020] Em algumas formas de realização, a superfície interna do orifício de passagem inclui saliências direcionadas radialmente para dentro. Em algumas dessas formas de realização, as saliências são de 0,5 a 3,5 mm de comprimento.

[0021] EM algumas formas de realização, o dispositivo compreende uma pluralidade de câmaras de picolitro a microlitro formadas na matriz de hidrogel.

[0022] Em algumas formas de realização, a câmara de picolitro a microlitro é formada como uma pirâmide truncada invertida.

[0023] Em algumas formas de realização do dispositivo, cada uma das câmaras de picolitro a microlitro tem um volume que varia de 1 a 50 nanolitros.

[0024] EM algumas formas de realização, o dispositivo compreende ainda um anel posicionável em pelo menos um poço, o anel incluindo uma ranhura interna circunferencial. Em algumas dessas formas de realização, o anel tem 2 a 32 mm de diâmetro.

[0025] EM algumas formas de realização, o dispositivo compreende ainda uma inserção de anel duplo posicionável em pelo menos um poço, a inserção de anel duplo incluindo uma abertura central definida por um anel interno da inserção de anel duplo e uma pluralidade de compartimentos definidos entre o anel interno e uma anel externo da inserção de anel duplo.

[0026] Em algumas formas de realização do dispositivo, a inserção de anel duplo inclui pelo menos uma ranhura circunferencial dentro de uma parede interna do anel interno.

[0027] De acordo com um aspecto de algumas formas de realização dos ensinamentos aqui apresentados, também é fornecido um método para cultivar um ou mais tipos de células compreendendo: a) fornecer um dispositivo de cultura celular de acordo com os ensinamentos aqui apresentados; b) semear um ou mais tipos de células dentro da câmara de picolitro a microlitro; e c) submeter o dispositivo de cultura de células a condições adequadas para a cultura dos um ou mais tipos de células. Em algumas formas de realização de tal um método, a câmara é formada dentro de uma pluralidade de compartimentos, cada um deles destinado a semear um tipo de célula.

[0028] De acordo com um aspecto de algumas formas de realização dos ensinamentos deste documento, também é fornecido um método para fabricar um dispositivo de cultura compreendendo: a) fornecer uma placa com pelo menos um poço com um orifício de passagem formado em uma parede inferior do mesmo; b) encher o orifício de passagem com um hidrogel; e c) gravar em relevo pelo menos uma câmara de cultura de células no hidrogel.

[0029] Em algumas formas de realização, o método compreende ainda o posicionamento de uma inserção de anel duplo dentro do poço antes de (b).

[0030] Em algumas formas de realização do método, a inserção de anel duplo inclui uma abertura central definida por um anel interno da inserção de anel duplo e uma pluralidade de compartimentos definidos entre o anel interno e um anel externo da inserção de anel duplo.

[0031] Em algumas formas de realização do método, a inserção de anel duplo inclui pelo menos uma ranhura circunferencial dentro de uma parede interna do anel interno para reter o hidrogel.

[0032] De acordo com um aspecto de algumas formas de realização dos ensinamentos deste documento, também é fornecido um dispositivo de cultura de células compreendendo: a) uma placa que tem pelo menos um poço com um orifício de passagem formado em uma parede inferior do mesmo; b) uma matriz de hidrogel disposta no orifício de passagem; e c) um gel disposto no topo da matriz de hidrogel.

[0033] Em algumas formas de realização do dispositivo de cultura de células, o gel inclui pelo menos um componente da matriz extracelular (ECM). Em algumas dessas formas de realização, o gel inclui pelo menos um componente de matriz extracelular (ECM) que é disposto dentro de um anel, incluindo uma ranhura circunferencial contínua/ segmentada ao longo de uma superfície interna do mesmo para reter o gel.

[0034] Em algumas formas de realização, o gel incluindo pelo menos um componente de matriz extracelular (ECM) é disposto dentro de uma inserção de anel duplo posicionada em pelo menos um poço, a inserção de anel duplo incluindo uma abertura central definida por um anel interno da inserção de anel duplo e uma pluralidade de compartimentos definidos entre o anel interno e um anel externo da inserção de anel duplo. Em algumas dessas formas de realização, a inserção de anel duplo inclui pelo menos uma ranhura circunferencial dentro de uma parede interna do anel interno para reter o gel, incluindo pelo menos um componente de matriz extracelular (ECM).

[0035] Salvo definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é comumente entendido por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Em caso de conflito, o relatório descritivo da patente, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0036] A invenção é aqui descrita, apenas a título de exemplo, com referência aos desenhos anexos. Com referência específica agora aos desenhos em detalhes, é enfatizado que os detalhes mostrados são apenas a título de exemplo e para fins de discussão ilustrativa das formas de realização da presente invenção, e são apresentados na causa de fornecer o que se acredita ser a descrição mais útil e facilmente compreendida dos princípios e aspectos conceituais da invenção. A este respeito, não é feita nenhuma tentativa de mostrar detalhes estruturais da invenção com mais detalhes do que o necessário para uma compreensão fundamental da invenção, a descrição feita com os desenhos tornando aparente para os técnicos no assunto como as várias formas da invenção podem ser incorporadas na prática.

[0037] Nos desenhos: - As Figuras 1A-B ilustram esquematicamente uma forma de realização do presente dispositivo; - A Figura 2 ilustra esquematicamente uma micro câmara de hidrogel de uma forma de realização do presente dispositivo; - A Figura 3 ilustra esquematicamente um orifício de passagem do macro poço com uma reentrância/ rebaixamento;

- As Figuras 4A-E ilustram esquematicamente a fabricação da matriz de micro câmaras de hidrogel em um macro poço preenchido com uma matriz de hidrogel;

- A Figura 5 ilustra placas de 6 e 24 poços (imagens à esquerda e à direita, respectivamente) tendo orifícios de passagem na parte inferior de cada reentrância do macro poço e do tipo orelha na parede lateral;

- A Figura 6 ilustra rebaixamentos/ reentrâncias em forma de orelha em uma parede lateral dos orifícios de passagem;

- As Figuras 7A-B ilustram um dispositivo de estampagem de micro câmara de acordo com formas de realização da presente invenção.

À Figura 7A ilustra dispositivos de estampagem com 6 e 24 matrizes (imagens superior e inferior, respectivamente). A Figura 7B ilustra um dispositivo de estampagem com um entalhe em cada saliência de estampagem;

- A Figura 8 ilustra a incubação do dispositivo de cultura antes da estampagem da matriz;

- A Figura 9 ilustra a estampagem de matriz de micro câmara de hidrogel (HMA) usando dispositivos de estampagem de 6 e 24 matrizes (imagens superior e inferior respectivamente);

- A Figura 10 ilustra uma vista superior da matriz formada dentro do orifício de passagem preenchido com hidrogel (imagem inferior) correspondente a uma vista lateral esquemática da matriz formada (superior);

- A Figura 11 ilustra uma placa de 6 e 24 poços com HMAs formadas;

- Figura 12 ilustra HMAs de formação cercadas com um anel com fenda;

- A Figura 13 ilustra uma forma de realização dos presentes dispositivos de cultura adequados para co-cultura de duas ou mais populações/ tipos de células;

- A Figura 14 ilustra a cultura de três tipos de células em um único macro poço com duas HMAs cercadas por um anel com fenda; - A Figura 15 são gráficos que ilustram a taxa de crescimento, a taxa de crescimento relativo (em comparação ao controle) e a % da área corada com PI nos esferoides de câncer de mama MCF7 cultivados após tratamento medicamentoso dependente da dose com Tamoxifeno; - As Figuras 16 e 17 ilustram várias vistas de uma forma de realização de uma inserção utilizável com o dispositivo da presente invenção; - A Figura 18 ilustra a posição da inserção das Figuras 16 a 17 em relação à matriz de micro câmara estampada; e - A Figura 19 ilustra outra forma de realização da inserção da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0038] A presente invenção refere-se a formas de realização de um dispositivo de cultura de células que pode ser usado para cultivar células ou objetos multicelulares em 3D. Especificamente, as formas de realização da presente invenção podem ser usadas para cultivar células sob condições adequadas para a formação de objetos multicelulares em 3D (por exemplo, esferoides) e para estudar as capacidades de invasão de células/ objetos multicelulares em 3D, interações entre duas ou mais populações celulares e o efeito de drogas em células e objetos multicelulares em 3D.

[0039] Os princípios e operação da presente invenção podem ser melhor compreendidos com referência aos desenhos e descrições anexas.

[0040] Antes de explicar pelo menos uma forma de realização da invenção em detalhes, deve-se entender que a invenção não está limitada em sua aplicação aos detalhes estabelecidos na descrição a seguir ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras formas de realização ou de ser praticada ou realizada de várias maneiras. Além disso, deve ser entendido que a fraseologia e terminologia aqui empregadas são para fins de descrição e não devem ser consideradas limitativas.

[0041] São conhecidas do estado da técnica, placas de múltiplos poços com fundos opticamente transparentes. Tais placas são fabricadas com fundos de polímero ou vidro opticamente transparentes. Embora essas placas possam ser interrogadas opticamente usando técnicas microscópicas ou espectrográficas, as placas com fundo de polímero são limitadas pelas propriedades ópticas do polímero usado para o fundo do poço, enquanto as placas com fundo de vidro são limitadas pelo custo e pela integridade da interface polímero-vidro.

[0042] Os pedidos de patente anteriormente depositados aos presentes inventores revelaram uma placa de múltiplos poços tendo uma matriz de hidrogel gravada em relevo com câmaras de picolitros. Esses pedidos de patente e estudos subsequentes mostraram que as câmaras de picolitros formadas por hidrogel são altamente eficazes para gerar e estudar objetos multicelulares em 3D, como esferoides.

[0043] Ao reduzir a presente invenção à prática, os presentes inventores se propuseram a conceber placas com câmaras de nanolitros a microlitros com gravação em relevo em hidrogel (por exemplo, poços) que são opticamente transparentes e podem ser interrogadas usando técnicas microscópicas ou espectrográficas.

[0044] Como ainda é descrito aqui abaixo e na seção de Exemplos a seguir, os presentes inventores construíram placas de múltiplos poços com uma matriz de hidrogel incorporada dentro de um orifício de passagem formado na parede inferior de cada poço. Os orifícios de passagem foram projetados para fornecer a transparência óptica necessária para cada poço e cada câmara de sub-microlitro formada no mesmo, bem como para manter a solução de hidrogel retida dentro do orifício durante a solidificação da matriz.

[0045] Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um dispositivo para a cultura de células.

[0046] Como aqui utilizado, o termo cultura refere-se a submeter células ou objetos multicelulares em 3D (por exemplo, esferoides - agregados homogêneos ou heterogêneos nos quais as células retêm função específica do tecido) a condições adequadas para o estudo de células/ objetos multicelulares em 3D. Tais condições podem manter a viabilidade das células ou objetos multicelulares em 3D e/ ou suportar replicação, diferenciação, motilidade e similares.

[0047] Exemplos de células que podem ser cultivadas pelo presente dispositivo incluem, mas não estão limitadas a, células eucarióticas e procarióticas. Exemplos de células eucarióticas incluem células humanas, células animais e células vegetais. As células podem ser diferenciadas ou não diferenciadas, normais ou cancerosas, linhagens celulares ou células primárias de amostras humanas e animais. Exemplos incluem células tronco, células tronco cancerígenas, células tumorais circulantes, células tronco pluripotentes induzidas, células tronco embrionárias, células adultas normais, células cancerígenas, células transformadas e similares.

[0048] As células humanas ou animais podem incluir células normais, tais como células hematopoiéticas, células sanguíneas, células sanguíneas do cordão umbilical, células do sistema imune, células do sistema nervoso, células epiteliais, células endoteliais, hepatócitos e afins ou células patogênicas (por exemplo, células tumorais/ de câncer) das categorias de Carcinoma, Leucemia, Linfoma, Mieloma, Sarcoma, Sistema Nervoso Central, Mesotelioma e similares.

[0049] As Formas de realização do dispositivo de cultura de células da presente invenção podem incluir uma placa com pelo menos um poço (também aqui referido como macro poço) com um orifício de passagem formado em uma parede inferior do mesmo ('piso' do poço). O orifício de passagem pode ser perfurado/ usinado na parede inferior após a fundição da placa de múltiplos poços ou, alternativamente, a placa de múltiplos poços pode ser fundida com o orifício de passagem (as placas pré-formadas têm um orifício de passagem).

[0050] A placa pode ser uma placa de múltiplos poços com 4-96 ou mais macro poços fabricados a partir de um polímero transparente ou opaco, como poliestireno, polipropileno ou semelhante. As configurações de placa de macro poços que podem ser usadas como projeto inicial para formas de realização da presente invenção incluem, por exemplo, COSTARº Corning Incorporated 3516 (placas de 6 poços), 3513 (placa de 12 poços), 3524 (placa de 24 poços), 3548 (placa de 48 poços), 3595 (placa de 96 poços) ou Jet BIOFILº TCPO011004 (placa de 4 poços), TCPO011006 (placa de 6 poços), TCP011012 (placa de 12 poços), TCP011024 (placa de 24 poços), TCPO011048 (Placa de 48 poços), TCP011096 (placa de 96 poços) ou placa comercial com fundo de vidro, como Cellvis PO6-14-0-N, PO6-14-1-N, PO6-14-1.5-N, PO6-20-1-N, PO6-20-1.5- N (placas com fundo de vidro de 6 micropoços), PO6-1.5HN (placas com fundo de vidro de 6 poços), P12-1.5HN, P12-1.5P (placas com fundo de vidro de 12 poços), P24-0-N, P24-1.5HN, P24-1.5P (placas com fundo de vidro de 24 poços), P96-0-N, P96-1-N, P96-1.5H-N, P96-1.5P (placas com fundo de vidro de 96 poços) para a versão de inserção e outras. Os macro poços podem ser redondos (cilíndricos), quadrados ou qualquer formato adequado para uso em placas de múltiplos poços com lados retos ou cônicos (por exemplo, cônicos para baixo). As dimensões típicas de macro poços podem ter 6 a 35 mm de diâmetro e 10 a 18 mm de profundidade. A parede inferior de cada poço pode ter 1 a 2,5 mm de espessura (polímero) ou 0,085 a 0,175 mm (vidro).

[0051] O orifício de passagem fornecido na parte inferior de cada macro poço pode ser circular, quadrado ou qualquer outra forma. O orifício de passagem pode ter lados retos, isto é, cilíndrico no caso de um orifício circular,

ou pode afilar de baixo para cima, ou seja, cônico no caso de um orifício circular. O orifício de passagem pode incluir reentrâncias ou saliências ao longo de uma parede lateral do mesmo ou rebaixamentos na parte inferior da parede. As dimensões típicas do orifício de passagem podem ser de 3 a 31 mm de diâmetro e 0,6 a 2,6 mm de altura. Os reentrâncias/ rebaixamentos ou saliências podem ter, por exemplo, 0,4 a 100 mm? em volume e as paredes laterais do orifício de passagem podem ser texturizadas (rugosas).

[0052] Formas de realização do dispositivo de cultura de células podem incluir uma cobertura opticamente transparente no fundo de cada poço. Essa cobertura pode ser fabricada em vidro (por exemplo, espessura do vidro de cobertura nº 1 fabricada por Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Waldemar Knittel Glasbearbeitungs GmbH, Thermo Scientific, Menzel GmbH etc.) ou um polímero opticamente transparente, como poliestireno, polipropileno ou semelhante. A placa de suporte pode ser colada ou fixada de outra forma ao fundo da placa de múltiplos poços. Placas comerciais com fundo de vidro como descrito acima (Cellvis) também podem ser usadas.

[0053] O orifício de passagem na parte inferior de cada macro poço é preenchido com uma matriz de hidrogel composta de ágar ou alginato (carboidrato natural de algas), agarose (carboidrato natural de alga marinha) ou polímeros sintéticos (por exemplo, poli (etileno glicol) (PEG) e Pluronicº) ou proteínas derivadas naturalmente (por exemplo, colágeno, gelatina, fibrina, fibronectina, laminina, tenascina, versican, elastina etc. (peptídeo natural de mamíferos) ou glicosaminoglicano (heparina/ heparina sulfato, condroitina sulfato/ dermatan sulfato, queratan sulfato e ácido hialurônico (carboidrato natural de mamíferos) ou uma mistura de dois ou mais hidrogéis. Uma matriz de hidrogel de agarose pode ser composta de uma 1 a 10% de agarose [por exemplo, agarose de baixo ponto de fusão (LMA) da Cambrex Bio Science Rockland, Inc., Rockland, ME EUA].

[0054] Os hidrogéis são redes poliméricas retentoras de forma entumecidas com uma alta porcentagem de água (T. K. Merceron e S. V. Murphy, “Hydrogels for 3D Bioprinting Applications”, em Essentials of 3D Biofabrication and Translation, Elsevier, 2015, pp. 249-270.). Um hidrogel pode ser composto de proteínas ou glicosaminoglicanos derivados naturalmente (por exemplo, colágeno, gelatina, fibrina e ácido hialurônico etc.), alginato e ágar (carboidrato natural de algas), agarose ou polímeros sintéticos como polietileno glicol (PEG) e plurônicoº.

[0055] Essas moléculas podem ser misturadas com células e outros fatores bioativos ou incorporadas em células pré-cultivadas, em solução aquosa e, em seguida, ser manipuladas para formar uma rede de malha reticulada e insolúvel, resultando em um hidrogel carregado de células. À manipulação da forma monomérica/ não reticulada para a forma polimérica/ reticulada é realizada através da indução de ligação física ou química através de alterações ambientais (como pH, temperatura e concentração iônica), iniciação enzimática ou foto polimerização.

[0056] Os hidrogéis são um meio atraente para a cultura de células devido à sua hidrofilicidade e capacidade de encapsular células e moléculas bioativas, imitando assim muitas das características da ECM natural (J. Malda, J. Visser, F. P. Melchels, T. Jiingst, W. E. Hennink, W. J. A. Dhert, J. Groll, and D. W. Hutmacher,25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication”, Adv. Mater., Vol. 25, n. 36, pp. 5011-5028, setembro de 2013.). Além disso, eles têm boa porosidade para difusão de oxigênio, nutrientes e metabólitos; pode ser processado sob condições moderadas favoráveis às células; e produzem pouca ou nenhuma irritação, inflamação ou produtos de degradação (Fedorovich NE, Alblas J, Wijn JR, Hennink WE, Verbout AJ, Dhert WJ. Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of- the-art and novel application in organ printing. Tissue Eng. 2007; 13: 1905-25.).

[0057] O hidrogel pode ser derramado in situ ou pode ser pré- formado (como uma única ou múltiplas inserções de poço). No último caso, um modelo para um ou mais macro poços pode ser usado para fabricar um ou mais insertos que podem ser montados nos respectivos orifícios de passagem de uma placa de múltiplos poços ou em uma placa sem fundo. Alternativamente, uma inserção com um orifício de passagem e quatro ou mais compartimentos em forma de cunha circunferencial pode ser colocada dentro do macro poço de uma placa de múltiplos poços e o hidrogel pode ser derramado in situ através dele. À inserção é mostrada nas Figuras 16 a 18 e é descrita mais adiante.

[0058] As reentrâncias/ saliências/ rebaixamentos ou a superfície texturizada da parede lateral do orifício de passagem dentro do fundo do macro poço ou uma ranhura circunferencial dentro da inserção podem reter e segurar o hidrogel, de modo a impedir o deslocamento/ movimento do mesmo para fora do orifício de passagem após a gelificação.

[0059] A matriz de hidrogel pode ser vertida de modo que preencha o orifício de passagem e, opcionalmente, se estenda para fora do orifício de passagem e para dentro do macro poço. No caso da inserção, o hidrogel pode preencher o orifício de passagem e se estender para preencher um canal circunferencial dentro da inserção para criar uma barreira entre as áreas circunferenciais em forma de cunha (para co-cultivar 2 a 8 tipos diferentes de células em cada uma das áreas).

[0060] A matriz de hidrogel inclui uma pluralidade de câmaras de picolitro a microlitro formadas nas mesmas por meio, por exemplo, de gravação em relevo usando uma ferramenta dedicada.

[0061] A seção Exemplos a seguir descreve um dispositivo de estampagem/ gravação em relevo que pode ser usado para fabricar os micropoços na superfície superior da matriz de hidrogel, bem como o método de uso dos mesmos para essa fabricação.

[0062] As câmaras gravadas em relevo (também aqui referidas como micro câmaras ou micropoços) fornecem as condições e o volume necessários para a cultura de células únicas e a formação de agregados celulares (por exemplo, objetos multicelulares em 3D). Cada matriz pode incluir uma única micro câmara ou uma matriz de micro câmaras com 40 a 7400 micro câmaras (também aqui referida como uma matriz de hidrogel de micro câmaras ou HMA). Dependendo do tamanho do macro poço, do número de micro câmaras em uma matriz e do uso, o volume de cada micro câmara pode variar entre menos de um nano-litro e centenas de microlitros (por exemplo, 0,5 a 50 nanolitros a 1 a 500 microlitros). Por exemplo, uma placa de 96 poços, matriz HMC de 40, pirâmide plana invertida superior truncada em forma quadrada de 50 um x 50 um, tamanho de fundo de micro poço gravado em relevo em uma área de 3 mm de diâmetro, cada micro câmara possui um volume de 16,59 nL.

[0063] Os micropoços podem ter qualquer forma adequada para cultura. Uma forma que pode ser usada é uma pirâmide truncada invertida com uma base (superior) de 320 a 430 um ou maior e um topo truncado (na parte inferior do micropoço) de 35 a 150 um ou maior. A altura do micropoço depende do padrão de gravação em relevo, altura do orifício de passagem e se a matriz de hidrogel se estende ou não acima do orifício de passagem para dentro do macro poço; uma altura típica pode ser de 190 um.

[0064] Como é descrito em mais detalhes na seção Exemplos a seguir, o presente dispositivo de cultura pode ser usado para cultivar células individuais, formar objetos multicelulares em 3D, estudar o efeito de compostos (por exemplo, drogas) em células ou objetos multicelulares em 3D, bem como clonar e diferenciar células tronco.

[0065] O presente dispositivo também pode ser usado para estudos de invasão ou para estudar os efeitos de um tipo de célula em outra.

[0066] A fim de facilitar esses estudos, o presente dispositivo pode incluir um anel posicionável no macro poço no topo da matriz de hidrogel. O anel pode incluir uma ranhura/ fenda interna circunferencial. O anel pode ser fabricado a partir de um polímero, como poliestireno e polipropileno, com um diâmetro de 3 a 31 mm, uma altura de 3 a 10 mm e uma espessura de 1 a 2mm. A ranhura/ fenda interna pode ter 0,5 a 2 mm de profundidade (dentro da parede lateral do anel). Os slots podem passar completamente através da parede lateral do anel ou não. A ranhura/ fenda pode ser formada na matriz de hidrogel em torno da área da matriz HMC durante o procedimento de gravação em relevo. No caso da inserção, uma ranhura circunferencial e contínua/ segmentada na parte interna da inserção pode ser fabricada para reter a ECM e mantê-la contra o hidrogel.

[0067] Para estudos de invasão, uma matriz de ECM em sua forma solúvel é vertida dentro do anel ou dentro da inserção ou diretamente em cima da matriz de ECM. A ranhura/ fenda no anel ou na inserção ou na matriz de hidrogel em torno da matriz de ECM ajuda a manter a matriz de ECM em posição contra a matriz de ECM, mediante gelificação da ECM, permitindo, assim, o contato entre as células e os componentes da ECM na matriz de ECM.

[0068] Placa de múltiplos poços de qualquer tamanho com qualquer número de micro câmaras gravadas em relevo pode ser usada para estudos de invasão. Por exemplo, uma placa de 6 poços com 1 a 3 HMAs gravados em relevo em cada macro poço pode ser usada para um ensaio de invasão. As células podem ser carregadas na placa a uma concentração inferior a 5 células/ micro câmara (MC) adicionando suavemente uma suspensão de células no topo da HMA, permitindo que as células se estabilizem por gravidade por 15 minutos. Em seguida, alíquotas de 50 a 500 ul de meio fresco (total de 2 a 4 mL para placas de 6 poços e 1 ml total para placas de 24 poços, mas não limitado a) podem ser suavemente adicionadas à borda do fundo de plástico de macro poços ao longo do lado da matriz de hidrogel e a placa pode então ser incubada a 37 ºC por 24 a 72 horas para formar objetos multicelulares em 3D.

[0069] Após a formação de objetos multicelulares em 3D, o meio pode ser removido dos macro poços e dos componentes da ECM (pelo menos um componente ou uma mistura de poucos componentes da ECM, por exemplo, colágeno, gelatina, fibronectina, laminina, tenascina, versicana, elastina, ácido hialurônico, heparano sulfato, sulfato de condroitina, sulfato de queratan e outros) podem ser vertidos suavemente sobre os objetos multicelulares em 3D. Indicadores/ nanopartículas/ esferas para a medição da atividade enzimática/ proteínas/ ácidos nucleicos/ exossomos e outros fatores que podem ser secretados pelos esferoides podem ser misturados com o gel de ECM ou adicionados às micro câmaras antes da gelificação. Após a gelificação (para um colágeno tipo |, a placa é incubada a 37 ºC por 1 hora), o gel de ECM envolve/ cobre os objetos multicelulares em 3D e após a gelificação é retido pela fenda formada no anel ou na inserção ou na matriz de hidrogel.

[0070] As placas podem ser incubadas por vários dias e as imagens podem ser obtidas para acompanhar o movimento de todos os objetos multicelulares em 3D (mudança de forma) ou o movimento de células únicas (saindo do esferoide para dentro da ECM circundante).

[0071] As imagens podem ser adquiridas por qualquer tipo de microscópio invertido (Olympus, Nikon, Leica etc.) ou por qualquer tipo de unidade de imagem com placas de microtitulação (por exemplo, citômetro de imagem de micropoços Celigo de alto rendimento, estágio JuL|, leitor multimodo de imagem em célula Cytation, etc.) através do vidro inferior que cobre o orifício de passagem preenchido com o HMA.

[0072] As imagens podem ser analisadas manualmente por um especialista ou automaticamente, usando o software de análise de imagem.

[0073] O presente dispositivo também pode ser usado para co- cultivar dois ou mais tipos de células para estudos de interação célula-célula.

[0074] Um macro poço, com dois HMAs gravados em relevo, pode ser usado para estudar interações entre duas populações de células que compartilham um único meio de crescimento (cobrindo os dois HMAs). Além disso, e como descrito na seção de Exemplos a seguir, tal um macro poço encaixado com o anel pode ser usado para estudar três populações diferentes com a terceira semeada fora do anel e dentro do meio de cultura.

[0075] No caso da inserção, um a quatro (ou mais) tipos de células diferentes podem ser semeados nos compartimentos criados pela inserção. Esses compartimentos estão localizados em torno da HMA e permitem o estudo de 5 populações celulares diferentes.

[0076] As formas de realização do presente dispositivo também podem permitir a semeadura de células em diferentes áreas de uma matriz, fornecendo barreiras removíveis para a semeadura. Tais barreiras podem ter a forma de cortadores de biscoito, com a forma e o tamanho dependendo da região da HMA semeado. Por exemplo, uma área quadrada de 12 x 12 mm gravada em relevo da matriz de HMC é dividida em 3 subáreas separadas, com um triângulo de 4 x 12 mm cada. A separação é realizada usando partições de plástico. Outras formas também podem ser projetadas, por exemplo, um círculo dividido em 4 a 8 setores ou segmentos. Depois de carregar as células nas diferentes regiões, a ECM é adicionada a cada região, as barreiras plásticas são removidas e a interação direta entre dois (ou mais) tipos de células (por exemplo, invasão de células cancerígenas em células estromais) é ativada, permitindo células co- cultivadas em áreas adjacentes para interagir e/ ou migrar livremente.

[0077] As formas de realização do presente dispositivo podem ser usadas para recuperar um e mais objetos multicelulares em 3D de acordo com seu fenótipo, isto é, resposta a medicamentos, parâmetros metabólicos,

imunocoloração, capacidade invasiva, etc., identificando fenótipos de cada um dos objetos multicelulares em 3D usando técnicas de imagem e matriz de HMC. Objetos multicelulares em 3D recuperados podem ser ainda caracterizados usando abordagens moleculares e bioquímicas.

[0078] A matriz de HMC da presente invenção permite monitorar objetos multicelulares em 3D individuais sem risco de deslocamento de objetos multicelulares em 3D durante o tratamento com medicamentos, coloração e outras manipulações e recuperar especificamente objetos multicelulares em 3D individuais.

[0079] As formas de realização da presente invenção também permitem a recuperação e enriquecimento de células específicas. Por exemplo, ao realizar um ensaio de invasão, as células invadem de um objeto multicelular 3D para a ECM circundada. As células que exibem esse fenótipo invasivo podem ser analisadas posteriormente usando abordagens bioquímicas e moleculares.

[0080] Objetos multicelulares em 3D podem ser recuperados da matriz de ECM usada para um ensaio de invasão deixando para trás as células invasoras na ECM. As células podem ser separadas da ECM para exame ou enriquecimento (carregadas pela segunda vez na matriz de HMC, criação de esferoides e realizar a invasão da ECM e recuperadas, tudo isso por várias rodadas).

[0081] Assim, a presente invenção fornece um dispositivo de cultura que pode ser usado para semear células individuais, estudar o desenvolvimento e a invasão de células e agregados, estudar o efeito de drogas em células e agregados individuais, isolar células e objetos multicelulares em 3D de um fenótipo específico e identificar e isolar células com um fenótipo invasivo, bem como estudar interações célula-célula.

[0082] Uma forma de realização do presente dispositivo, aqui referido como dispositivo (10) é mostrado na Figura 1A a Figura 3. A fabricação do dispositivo (10) é mostrada na Figura 4.

[0083] A Figura 1A é um lado esquemático de um único macro poço (12) com um orifício de passagem (14) preenchido com uma matriz de hidrogel (16) formada com uma matriz de matriz de hidrogel (15) com uma pluralidade de micro câmaras (17). A Figura 1B é um esquema de vista superior de três micro câmaras (17) formadas na matriz de hidrogel (16).

[0084] Como é mostrado nestas figuras, essas formas de realização do dispositivo (10) incluem um orifício de passagem com forma cônica (14) através do fundo de plástico (18) da placa (20). O orifício de passagem é preenchido com hidrogel (16) que é gravado em relevo com uma pluralidade de micro câmaras (17), cada um com a forma de uma pirâmide truncada invertida. As dimensões típicas de cada micro câmara (17) são mostradas na Figura 2. Um suporte (22) feito de material opticamente transparente, tal como vidro, é fixado no fundo do orifício de passagem (14).

[0085] A Figura 3 ilustra um orifício de passagem (14) com um rebaixamento/ recorte (24) para reter a matriz de hidrogel (16) dentro do orifício de passagem(14).

[0086] O rebaixamento/ recorte (24) pode ser fornecido ao longo da circunferência do orifício de passagem (14) em, por exemplo, uma extremidade inferior do mesmo (como é mostrado na Figura 3) ou em regiões discretas da parede lateral (26).

[0087] As Figuras 4A a E ilustram a formação de HMA (15) usando um dispositivo de estampagem/ gravação em relevo (30).

[0088] A Figura 4A ilustra o macro poço (12) com o orifício de passagem (14) formado e o suporte (22) posicionado sob ele.

[0089] Uma gota de agarose líquida é posicionada no topo do suporte (22) dentro do orifício de passagem (14) (Figura 4B). Um dispositivo de estampagem/ gravação (30) é empurrado para dentro da agarose para formar micro câmaras (17) e espalhar a agarose líquida dentro do orifício de passagem (16), de modo que fique preso sob os entalhes (24) (Figura 4C). Quando a agarose endurece após a gelificação (Figura 4D), o dispositivo de estampagem/ gravação em relevo (30) é puxado para fora para deixar para trás o HMA (15) (Figura 4E).

[0090] Um dispositivo de estampagem/ gravação em relevo (30) (também aqui referido como “estampagem PDMS"”) é mostrado na Figura 7A. O dispositivo (30) inclui uma pluralidade de hastes/ saliências (31), cada uma carregando um molde de formação de matriz de micro câmara (33) na face distal do mesmo. A Figura 7B ilustra o dispositivo (30) no qual as saliências de estampagem (31) incluem um entalhe (35). O entalhe (35) forma um canal ao lado da matriz de micro câmara estampada. O canal permite o fornecimento e a remoção de líquidos (por exemplo, meios de crescimento) sem perturbar/ deslocar as células/ esferoides crescidos na matriz. O entalhe (35) é configurado para gerar um canal que começa cerca de 2 mm acima do nível da matriz, a fim de evitar a entrada de células no canal quando as células são carregadas na matriz.

[0091] Para evitar remodelar (texturizar/ canalizar) a parede inferior do macropoço, uma inserção com a forma geral do macropoço (por exemplo, esférico para macropoços esféricos, quadrado para macropoços quadrado) e os componentes estruturais que impedem que o hidrogel se desloque/ mude de lugar pode ser utilizado. A inserção pode incluir fendas/ canais para impedir a separação da ECM do hidrogel e vários compartimentos para cultura simultânea de vários tipos de células. A inserção pode ser posicionada dentro do macropoço e o hidrogel pode ser vertido através dele.

[0092] As Figuras 16 a 18 ilustram uma forma de realização de uma inserção dentro do poço que é aqui referida como inserção (100).

[0093] A inserção (100) pode ser formada como um anel duplo com um anel interno (102) anexado a um anel externo (104) por meio de discos (106). O anel interno (102) define uma abertura central (103), enquanto o anel externo (104) define os compartimentos (114) (divididos pelos discos (106)). O anel interno (102) pode ter 3 a 31 mm de diâmetro e 3 a 10 mm de altura, enquanto o anel externo (104) pode ter 6 a 35 mm de diâmetro e 1 a 10 mm de altura. A inserção (100) inclui ainda “asas' (108) que se estendem dos discos (106) para reter o gel que pode ser vertido nos compartimentos (114).

[0094] Uma ranhura circunferencial contínua ou segmentada (110) no anel interno (102) pode ser usada para impedir o descolamento da MEC, enquanto uma segunda ranhura circunferencial (112) (contínua ou segmentada) pode ser usada para impedir o deslocamento de hidrogel. A ranhura circunferencial (110) pode ter profundidade de 0,3 a 1 mm e altura de 1 a 2 mm e seu comprimento depende da circunferência/ diâmetro do anel. A segunda ranhura circunferencial (112) pode ter 0,3 a 2 mm de profundidade e 1 a 3 mm de altura e seu comprimento depende da circunferência/ diâmetro do anel. À soma do comprimento dos ranhuras circunferenciais segmentares pode ser de aproximadamente um terço a um quarto do comprimento circunferencial.

[0095] Os canais (113) na parte inferior de cada raio (106) são preenchíveis com hidroge! (quando vertidos através da inserção (100)) para criar uma barreira entre os compartimentos (114) (quatro mostrados, 2 a 8 ou mais são possíveis).

[0096] A Figura 18 ilustra a posição da inserção (100) com a abertura central (103) posicionada sobre o macropoço (MW) com micropoços e compartimentos gravados em relevo (114) em torno do macropoço.

[0097] A Figura 19 ilustra uma forma de realização da inserção (100) que inclui reentrâncias semicirculares (120) (meias brocas) na borda externa do anel externo (104) e uma ranhura/ fenda segmentada (110) na borda interna do anel interno (104). Os reentrâncias (120) permitem que o ar escape pelos canais (113) quando o hidrogel é vertido, facilitando assim o preenchimento completo dos canais (113) com o hidrogel.

[0098] Como usado aqui, o termo “cerca de" refere-se a + 10%.

[0099] Objetos adicionais, vantagens e novos recursos da presente invenção se tornarão evidentes para um técnico no assunto ao examinar os exemplos a seguir, que não pretendem ser limitativos.

EXEMPLOS

[00100] Agora é feita referência aos exemplos a seguir, os quais, juntamente com as descrições acima, ilustram a invenção de uma maneira não limitativa.

EXEMPLO 1

FABRICAÇÃO DE UMA PLACA DE CULTURA DE CÉLULAS COM ORIFÍCIO DE PASSAGEM

[00101] Foram modificadas placas de cultura de células com 6, 12, 24, 48 ou 96 poços (também aqui referidos como macro poços), com dimensões de cerca de 127,8 mm x 85,5 mm, a fim de fazer o presente dispositivo.

[00102] Uma abertura cônica (orifício de passagem) foi cortada no meio da parede inferior plástica de cada macro poço a um ângulo de 45º (Figura 5). O orifício de passagem em forma de cone foi configurado para evitar movimentos verticais do hidrogel (flutuante). Elementos adicionais do orifício de passagem, como rebaixamentos (descritos adicionalmente a seguir) também foram usados para evitar o movimento horizontal do hidrogel e para melhorar ainda mais a retenção de hidrogel no orifício de passagem.

[00103] O diâmetro do fundo foi selecionado de modo que pelo menos um anel de 2 mm (ou mais largo) permanecesse na circunferência de cada macro poço, a fim de permitir a colagem de uma cobertura de vidro no fundo da placa. Dependendo das placas utilizadas, o diâmetro do orifício de passagem tem o tamanho em cone de 6 a 31 mm na parte inferior e de 4 a 28 mm na parte superior. A profundidade do orifício de passagem depende da espessura da parede inferior do macro poço e pode ser, por exemplo, 1 a 2,5 mm.

[00104] Vários (3 a 4) rebaixamentos foram usinados nas laterais dos orifícios de passagem a uma profundidade que é metade da espessura da parede inferior (1,27 mm/ 2 = 0,635 mm na placa de 24 poços e 1,8 mm/ 2 = 0,9 mm na placa de 6 poços). A Figura 6 é uma vista superior dos rebaixamentos em forma de orelha, mostrando o orifício de passagem e o aro/ anel de 2 mm (para colar um vidro de cobertura).

[00105] Um suporte opticamente transparente (placa de vidro) foi aderido ao fundo da placa de macro poço com polidimetilsiloxano (PDMS) e colado ainda nas bordas de vidro por Adesivo Óptico da Norland (NOA) colado no fundo da placa de macro poço com polidimetilsiloxano (PDMS)) ou Adesivo Óptico da Norland (NOA). A placa pronta foi desintoxicada por lavagem abundante em água para remover o excesso de monômeros de cola.

EXEMPLO 2

FABRICAÇÃO DAS MICRO CÂMARAS

[00106] Uma matriz de hidrogel vertida nos orifícios de passagem foi gravada em relevo com uma pluralidade de micro Câmaras (também aqui referidas como micro ou sub micropoços) usando uma estampagem.

DISPOSITIVO DE ESTAMPAGEM/ GRAVAÇÃO

[00107] As cabeças de estampagem de PDMS foram coladas a cilindros fabricados de Plexiglias em diferentes diâmetros. As outras extremidades dos cilindros foram coladas a um suporte de acrílico. Para uma placa de 6 poços, o cilindro tinha 10 mm de diâmetro e para uma placa de 24 poços, o cilindro tinha 6 mm de diâmetro (Figura 7A, imagens superior e inferior, respectivamente). As cabeças de estampagem de PDMS foram dimensionadas de acordo.

[00108] O suporte de Plexiglas foi dimensionado para caber na abertura superior da placa do macro poço (como uma tampa/ cobertura). Quando o suporte é encaixado na placa do macro poço, os cilindros se estendem para o meio de cada macro poço. O comprimento de cada cilindro, incluindo a cabeça de estampagem de PDMS, dependia da placa comercial escolhida e de suas dimensões. O comprimento do cilindro com estampagem de PDMS é projetado para deixar um espaço entre o fundo das micro câmaras e a placa de vidro; esse espaço é preenchido com a matriz de hidrogel, como mostra a Figura 2; 70 a 200 um de camada de hidrogel.

[00109] Também foi utilizado um dispositivo de estampagem/ gravação em relevo alternativo fabricado a partir de um metal como aço inoxidável (no lugar do Plexiglas). O uso de um cilindro de metal e, opcionalmente, uma cabeça de estampagem de metal (no lugar do PDMS) permite o uso de um controlador de temperatura para aquecer/ resfriar o dispositivo de estampagem.

FABRICAÇÃO DE MICRO CÂMARAS

[00110] Uma pequena gota (+ 70 ul para placas de 24 poços e + 400 ul para placas de 6 poços) da solução de agarose de baixo ponto de fusão (6%) pré-aquecida a 65 a 70 ºC foi simetricamente pingada no orifício de passagem na superfície do fundo de vidro pré-aquecido a 80 ºC em banho seco (Figura 8).

[00111] Um dispositivo de estampagem de PDMS pré- aquecido foi então gentilmente colocado sobre as gotas de agarose, como mostrado na Figura 9.

[00112] O conjunto foi incubado à temperatura ambiente (RT) por 5 a 10 minutos para pré-gelificação e pré-resfriamento, seguido por 20 minutos de incubação a 4 ºC até a gelificação completa da agarose.

[00113] O dispositivo de estampagem foi então retirado, deixando o gel de agarose padronizado com micro câmaras (MCs).

[00114] Uma vista superior das MCs formadas é mostrada na Figura 10 com referência a uma vista lateral esquemática mostrando as várias regiões de cada macro poço e MC.

[00115] A placa de cultura compreendendo as MCs foi esterilizada por UV. Os macro poços foram então preenchidos com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). A placa totalmente preparada foi coberta com Parafilm e armazenada a 4 ºC em atmosfera umidificada.

EXEMPLO 3

FABRICAÇÃO DE PLACAS DE CULTURA PARA ENSAIOS DE INVASÃO

[00116] Os ensaios de invasão utilizam componentes de ECM para identificar células capazes de invasão. Um anel de inserção de plástico com uma circunferência é posicionado no macro poço na junção entre o fundo plástico do macro poço e o hidrogel. Esta inserção pode ser mantida por pressão ou colada nos lados de plástico do macro poço ou no fundo de vidro. À inserção envolve a estrutura da matriz de hidroge! e uma fenda (pré-fabricada ou fabricada após a colocação do anel) prende os componentes de ECM vertidos sobre a matriz de hidrogel, a fim de impedir a flutuação/ movimento/ separação da ECM da estrutura de hidrogel quando o meio de cultura é adicionado ao macro poço.

[00117] A Figura (12) ilustra a fabricação de uma placa de ensaio de invasão. O anel de polímero está posicionado no macro poço (1) e é colado nos lados do poço. Se não for pré-fabricado com uma fenda, em cada anel será então feita uma fenda usando uma pistola de solda (2). Um hidroge! é então vertido em cada macro poço e gravado em relevo para criar uma matriz de HMC (3) e uma vez gelificado (e preenchido com células), um gel de ECM é vertido sobre as células (dentro do anel) e a placa está pronta para o teste de invasão (4).

EXEMPLO 4 FABRICAÇÃO DE PLACAS DE CULTURA PARA ENSAIOS DE CO-CULTURA

[00118] As placas de co-cultura foram fabricadas gravando duas ou mais matrizes de MC em um único orifício de passagem preenchido com hidrogel. A gravação em relevo foi realizada usando um dispositivo de estampagem de PDMS com duas estampagens lado a lado.

[00119] A Figura 13 ilustra um macro poço com duas matrizes de MC retangulares lado a lado com uma inserção de anel posicionada em torno das matrizes para um ensaio de invasão de co-cultura. Essa placa permite a semeadura de três tipos diferentes de células - uma primeira ao redor do anel, uma segunda na primeira matriz e uma terceira na segunda matriz. Isso permite medir a interação (através do meio de cultura compartilhado) entre três tipos de células. Esta placa com duas matrizes também pode ser usada sem o anel em ensaios de co-cultura de duas células.

EXEMPLO 5

PLACAS COM CÉLULAS

[00120] As células são carregadas nas placas em diferentes concentrações, dependendo do ensaio/ experimento e das dimensões da placa e da MC.

[00121] Para experimentos de célula única e experimentos de auto-renovação/ formação de clones, é importante que apenas uma célula seja semeada dentro de cada MC e, como tal, MC menores são normalmente usadas (35 x 35 um).

[00122] Para experimentos de produção de objetos multicelulares em 3D, mais de uma célula é semeada em cada MC. O número de células carregadas em cada MC depende do tamanho dos objetos multicelulares em 3D necessários no experimento. Geralmente, 5 a 100 células ou mais são semeadas em cada MC (90 x 90 a 150 x 150 um ou maior). À concentração de células necessárias para o carregamento é calculada com base em: 1) número de células/ MC; 2) o volume do meio carregado - o volume depende da área e do formato da matriz da MC gravada em relevo. Por exemplo: Para a matriz redonda com diâmetro de 10 mm na placa de 6 poços, é necessário um volume de 60 ul para 500 MC. Para 1 célula/ MC, são necessárias 500 células/ 60 ul. Portanto, é utilizada uma concentração de 8333 células/ ml para carregamento.

[00123] Placas com células/ esferoides formados podem ser mantidas por dias e transportadas para um usuário final.

EXEMPLO 6

PROTOCOLO DE ENSAIO DE INVASÃO

[00124] Esferoides 3D maduros são preparados em placas de invasão de 6 poços. A placa é resfriada em gelo por 10 minutos e os esferoides em 3D são cobertos com uma solução de colágeno tipo 1 (3 mg/ ml!) (Cultrex, Rat Collagen 1) misturada com substrato conjugado com gelatina DQ FITC e incubada a 37 ºC por 1 h para alcançar a gelificação total.

[00125] O substrato conjugado com gelatina DQ FITC é um substrato específico de gelatina não fluorescente fortemente marcado com fluoresceína, clivado enzimaticamente de maneira eficaz por MMP-2 e MMP-9,

para produzir peptídeos altamente fluorescentes. A intensidade da fluorescência do produto (FI) reflete o nível de atividade enzimática da MMP.

[00126] A invasão de esferoides é analisada por monitoramento em tempo real de grupos de células e células invasoras individuais que escapam do arranjo de esferas usando um microscópio invertido (descrito mais adiante). As imagens serão adquiridas em intervalos de 6h por 48h, totalizando 8 aquisições. No final do experimento, esferoides e células invasoras serão corados in situ para marcadores, fixados na HMCA (matriz de micro câmaras de hidrogel) e marcados para marcadores intracelulares, a fim de caracterizar o fenótipo de células invasoras vs. células no corpo de esferoides.

[00127] Os parâmetros que podem ser extraídos em cada ponto do tempo podem incluir: (a) número de células invasoras que escaparam da margem/ limite da esfera indicado no tempo 0; (b) área total de invasão (número de pixels); (c) distância máxima de invasão; (d) número de células invasoras separadas da área de invasão conectada e (e) FI de gelatina DQ (atividade MMP).

[00128] Com base nos parâmetros acima, os esferoides podem ser classificados como aglomerados de células altamente invasivos ou baixo/ não invasivo. Leituras morfométricas e fluorescentes correspondentes de todos os objetos (esferoides e células) serão utilizadas para definir os fenótipos invasivos.

[00129] Um microscópio invertido de campo amplo totalmente motorizado, com sistema de foco automático e capacidade de mapa de foco (Nikon, Olympus e Leica etc.) pode ser usado para adquirir imagens automaticamente em intervalos de tempo pré-definidos de uma série de regiões na HMCA (matriz de micro câmaras de hidrogel). Cada conjunto de aquisições começará com a imagem do campo claro, seguida de várias imagens fluorescentes, uma para cada sonda fluorescente, tirada em diferentes momentos predefinidos.

[00130] Vários algoritmos foram desenvolvidos para detecção de esferoides e avaliação de parâmetros morfométricos usando imagens de campo claro e análise de FI. Células/ esferoides podem ser definidos automaticamente como regiões de interesse (ROIs) pela detecção de borda de Sobel modificada e operação morfológica, e sua área de seção pode ser delineada na imagem do campo claro. Para cada imagem de campo amplo fluorescente, as ROIs podem ser determinadas mapeando esses contornos na imagem do campo fluorescente interrogado. Após a subtração do plano de fundo e limiar, dois parâmetros podem ser extraídos automaticamente: o valor médio de FI obtido para cada ROI (FI médio de todos os pixels que estão dentro das bordas do limite) e a fração da área do sinal fluorescente.

[00131] Com base no esquema de análise acima, pode ser desenvolvido um conjunto de algoritmos para processamento multiparamétrico rápido e análise do teste de invasão e resposta ao medicamento. Esse conjunto de algoritmos pode incluir (a) um algoritmo de segmentação automática de células/ esferas em suas MCs e células invasoras individuais, (b) extração de características do objeto: tamanho, forma, textura e localização espacial (c) extração de parâmetros de FI para cada objeto, para cada marcador fluorescente, (d) uma estrutura completa para análise multiparamétrica de dados de imagem fluorescente e suas imagens de campo claro correspondentes para cada objeto medido, produzindo um conjunto de dados completo que contém todos os parâmetros medidos relacionados a cada objeto em cada momento, bem como alterações nesses parâmetros durante o curso do experimento, (e) análise de agrupamentos para classificação de células/ esferoides altamente invasivos vs. não invasivos, (f) definição de diferentes fenótipos celulares, usando classificação supervisionada, com base na classificação acima (ver e) e conjunto de dados (ver d) e (g) análise de aprendizado de máquina para prever o potencial de invasão de esferoides enriquecidos com fenótipos celulares invasivos, bem como sua resposta ao tratamento. EXEMPLO 7 CO-CULTURA DE ESFEROIDES PRCSC, FIBROBLASTOS ASSOCIADOS AO CÂNCER DE PRÓSTATA (PCAFS) E CÉLULAS INFLAMATÓRIAS

[00132] Demonstrou-se que os principais componentes do estroma do câncer apoiam o comportamento do tumor, regulam as células cancerígenas, mantêm e afetam significativamente a resistência à terapia (Shiao SL, Chu GC-Y, Chung LWK. Regulation of prostate cancer progression by the tumor microenvironment. Cancer Lett [Internet] Elsevier Ireland Ltd; 2016; 380: 340-8.), (Eder T, Weber A, Neuwirt H, Grunbacher G, Ploner C, Klocker H, Sampson N, Eder IE. Cancer-Associated Fibroblasts Modify the Response of Prostate Cancer Cells to Androgen and Anti- Androgens in Three-Dimensional Spheroid Culture. Int J] Mol Sci. 2016; 17: 1-15.) e (Maolake A, Izumi K, Shigehara K, Natsagdorj A. Tumor-associated macrophages promote prostate migration through activation of the CCL22 - CCRA4 axis cancer. 2017; 8: 9739-51.).

[00133] Os esferoides das células tronco do câncer de próstata (PFCSC) podem ser co-cultivados em placas de co-cultura (CCPs) ao lado de PCAFs e células inflamatórias (células semelhantes a macrófagos).

[00134] As células macrofágicas M2 foram identificadas histologicamente no tecido do câncer de próstata (PrC) em vários estágios da doença (Thapa D, Ghosh R. Chronic inflammatory mediators enhance prostate cancer development and progression. Biochem Pharmaco! [Internet] 2015 [citado em 1 nov 2015]; 94: 53-62.) e (Lanciotti M, Masieri L, Raspollini MR, Minervini A, Mari A, Comito G, Giannoni E, Carini M, Chiarugi P, Serni S. The role of MI and M2 macrophages in prostate cancer in relation to extracapsular tumor extension and biochemical recurrence after radical prostatectomy. Biomed Res Int. 2014;

2014: 486798.). Eles promovem a sobrevivência, adesão, invasão e metástase da PrC e apoiam mutuamente a progressão do tumor, modulando níveis de citocinas, fatores de crescimento e espécies reativas de oxigênio no microambiente da PrC (Thapa D, Ghosh R. Chronic inflammatory mediators enhance prostate cancer development and progression. Biochem Pharmacol [Internet] 2015 [citado 2015 nov 1]; 94: 53-62.), (Pinato DJ. Cancer-related inflammation: an emerging prognostic domain in metastatic castration-resistant prostate carcinoma. Cancer [Internet] 2014 [citado 2015 nov 1]; 120: 32724.) e (Shiao SL, Chu GC-Y, Chung LWK. Regulation of prostate cancer progression by the tumor microenvironment. Cancer Lett [Internet] Elsevier Ireland Ltd; 2016; 380: 340-8.) Foi demonstrado anteriormente que as células U937-M promovem proliferação e invasão de PrC (Lindholm PF, Lu Y, Adley BP, Vladislav T, Jovanovic B, Sivapurapu N, Yang XJ, Kajdacsy-Balla A. Role of monocyte- lineage cells in prostate cancer cell invasion and tissue factor expression. Prostate [Internet] 2010 [cited 2015 Nov 1]; 70: 1672-82.) e servem como um nicho para apoiar o crescimento do CSC (Maolake A, Izumi K, Shigehara K, Natsagdorj A. Tumor-associated macrophages promote prostate migration through activation of the CCL22 - CCRA4 axis cancer. 2017; 8: 9739-51.) e (Lau EY-T, Ho NP-Y, Lee TK-W. Cancer Stem Cells and Their Microenvironment: Biology and Therapeutic Implications. Stem Cells Int [Internet] 2017; 2017: 1-11.).

[00135] As células U937 flutuantes podem ser tratadas com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (10 ng a 1 ug/ mL) para obter células aderentes semelhantes a macrófagos (U937-M). Em seguida, o tipo M2 pode ser selecionado cultivando-se em meio condicionado das células PrC (Maolake A, Izumi K, Shigehara K, Natsagdorj A. Tumor-associated macrophages promote prostate migration through activation of the CCL22 - CCRA4 axis cancer. 2017; 8: 9739-51.), e crescido na borda externa do macro poço, no fundo de plástico ao redor da matriz de HMC (consulte a Figura 14). Os subtipos M podem ser identificados por coloração para CCR7 e CD163 (M1 e M2, respectivamente).

[00136] Os fibroblastos associados ao câncer de próstata (PrCAFs) modulam a remodelação da MEC (Tuxhorn JA, Ayala GE, Smith MJ, Smith VC, Dang TD, Rowley DR. Reactive stroma in human prostate cancer: induction of myofibroblast phenotype and extracellular matrix remodeling. Clin Cancer Res. 2002; 8: 2912-23), proliferação de tumores (Shaw A, Gipp J, Bushman W. The Sonic Hedgehog pathway stimulates prostate tumor growth by paracrine signaling and recapitulates embryonic gene expression in tumor mpyofibroblasts. Oncogene. Macmillan Publishers Limited; 2009; 28: 4480-90) e ((Schauer IG, Rowley DR. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 2011; 82: 200-10), angiogênese (Webber JP, Spary LK, Sanders AJ, Chowdhury R, Jiang WG, Steadman R, Wymant J, Jones AT, Kynaston H, Mason MD, Tabi Z, Clayton A. Differentiation of tumour- promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene 2015; 34: 290-302) e sensibilidade às drogas nas células PrC (Cheteh EH, Augsten M, Rundqvist H, Bianchi J, Same V, Egevad L, Bykov VJ, Ostman A, Wiman KG. Human cancer-associated fibroblasts enhance glutathione levels and antagonize drug-induced prostate cancer cell death. Cell Death Dis [Internet] Nature Publishing Group; 2017; 8: e2848). As células imortalizadas hNTERT PF179T CAF (ATCCº CRL-3290TM) apresentam um modelo de estroma adequado para um estudo de PrC (Madar S, Brosh R, Buganim Y, Ezra O, Goldstein 1, Solomon H, Kogan |, Goldfmger N, Klocker H, Rotter V. Modulated expression of WFDC1 during carcinogenesis and cellular senescence. Carcinogenesis. 2009; 30: 20- 7). Essas PCAFs podem ser cultivadas como esferoides nas micro câmaras de hidrogel, uma vez que as células estromais na configuração 3D fazem com que os fenótipos das células PrC se tornem mais invasivos (Windus LC, Glover TT, Avery VM. Bone- stromal cells up-regulate tumourigenic markers in a tumour-

stromal 3D model of prostate cancer. Mol Cancer [Internet] Molecular Cancer; 2013; 12: 112).

[00137] Podem ser estabelecidas condições de cultura para sustentar todas as populações celulares dentro de diferentes compartimentos do CCP em um ambiente mútuo, incluindo componentes de meio, tempo de incubação e cultura, densidade celular inicial, densidade celular inicial, razão de células estromais para células tumorais, sequência de semeadura celular (semeadura simultânea/ sequencial), troca de meio e duração do crescimento celular.

EXEMPLO 9

TRIAGEM DE MEDICAMENTOS

[00138] O potencial citotóxico e o efeito de inibição do crescimento celular dos fármacos testados podem ser avaliados usando as placas de micro câmara de hidrogel aqui descritas.

[00139] Uma suspensão de células pode ser carregada no topo da HMA como descrito acima e o meio celular fresco pode então ser adicionado. Células individuais ou esferoides formados podem ser testados. Um medicamento testado ou candidato a medicamento pode ser adicionado ao meio celular dos poços da placa em diferentes concentrações, em diferentes momentos e em diferentes períodos de incubação (dosagem e tempo diferentes de exposição ao medicamento).

[00140] As células/ esferoides podem ser visualizadas em imagem e medidas antes da exposição aos medicamentos testados e em diferentes momentos após a adição do medicamento (horas-dias) e comparadas às células/ esferoides não tratadas cultivados nas mesmas condições. Um teste de exclusão de viabilidade celular pode então ser realizado (usando um corante fluorescente como iodeto de propídio (PI) ou um corante colorimétrico como azul de tripano).

[00141] Vários parâmetros podem ser avaliados, incluindo: (i) A taxa de crescimento (a proporção entre as áreas seccionais de esferoides ou entre os volumes calculados de esferoides em dois momentos de esferoides individuais) - esse parâmetro é testado em todos os momentos do experimento; (ii) valor de IC50 — a concentração do medicamento que inibe o crescimento de esferoide em 50%; e (iii) A área corada do esferoide (apresentando células mortas) - este parâmetro é testado apenas no ponto final do experimento.

[00142] Utilizando o protocolo acima, foram testados os efeitos do 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) no crescimento de esferoides do câncer de mama MCF7. Os esferoides MCF7 foram gerados e cultivados por 48h em uma placa de imagem de 24 poços com base em HMA. Diferentes concentrações de 4-OHT (0 a 100 uM) foram adicionadas aos poços da placa em diferentes períodos de tempo (1 a 5 dias). No quinto dia, os esferoides foram corados com PI (25 ug/ ml). O experimento foi realizado em triplicatas; a taxa de crescimento, taxa de crescimento relativo (em comparação ao controle) e % da área corada de PI foram medidas e são mostradas nos gráficos da Figura 15.

EXEMPLO 10 RECUPERAÇÃO, ENRIQUECIMENTO E ANÁLISE MOLECULAR DE PRTMICS

[00143] As células tronco de câncer de próstata (PrCSCs) e células iniciadoras metastáticas de tumor de próstata (PrºTMICs) são importantes para a compreensão do câncer de próstata (PrC), metástase e desenvolvimento de terapias eficazes para eliminar esse fenótipo.

[00144] Formas de realização da presente matriz de HMC podem ser usadas para recuperar uma população de PrTMIC e para enriquecer e expandir o fenótipo TMIC.

[00145] Como os esferoides PrCSC e as células invadidas são incorporadas na camada de hidrogel, a recuperação de populações de TMIC puras pode ser efetuada usando um protocolo de duas etapas para separar e recuperar os conjuntos de esferoides de PrC e células invasoras potencialmente metastáticas. Estruturas relativamente grandes de esferoides de interesse podem ser captadas manualmente usando um micromanipulador com uma ponta capilar, deixando o pool de células invadidas dentro do hidrogel. Esta técnica foi usada com sucesso para recuperar clones encapsulados no gel de colágeno (Guan Z, Jia S, Zhu Z, Zhang M, Yang CJ. Facile and Rapid Generation of Large- Scale Microcollagen Gel Array for Long-Term Single-Cell 3D Culture and Cell Proliferation Heterogeneity Analysis. Anal Chem. 2014; 86: 2789-97. doi:

10.1021//ac500088m). Esferoides de PrC isolados podem então ser usados para analisar melhor a capacidade de renovação da PrCSC e a análise genética.

[00146] A degradação enzimática de agarose e ECM pode ser usada para recuperar populações de células invasivas (Bates M. Three- Dimensional Mammalian Cell Culture Using Hydrogel Filled Scaffold. TISSUE Eng [Internet] 2013 [citado em 2 de novembro de 2015. Disponível em Www.msoe.edu/servlet/JiveServlet/downloadBody/4262-102-1- 5486/Paper MBates.pdf) adicionando 6 -Agarase (agarose 4-glicanohidrolase) ao hidrogel e incubando a 37 ºC até o gel se liquefazer e colagenase para a degradação do colágeno (ou outras enzimas para degradação da MEC). À solução dissolvida pode então ser coletada e centrifugada. O tratamento com 6 -Agarase/ colagenase não tem efeitos na viabilidade celular dos mamíferos ou na compatibilidade funcional (Carlsson J, Malmavist M. Effects of bacterial agarase on agarose gel in cell culture. In Vitro [Internet] 1977 [citado em 2 de novembro de 2015]; 13: 417-22. Doi: 10.1007/BF02615101). A população celular invadida isolada pode então ser submetida ao procedimento de ciclagem na HMCA, com base no modelo de ensaio de invasão. O pool de células pode ser suspenso em meio fresco e re-semeado em uma HMC adicional para uma segunda sequência de formação de esferoides seguida de um ensaio de invasão. Essa estratégia cíclica pode criar uma população de PrTMIC enriquecida. Após duas a quatro rodadas de semeadura e invasão, as células coletadas podem ser submetidas a fenotipagem molecular adicional e caracterização funcional. EXEMPLO 11 EFEITO DA RIGIDEZ AMBIENTAL NAS ESTRUTURAS EM 3D MULTICELULARES, FORMAÇÃO E CRESCIMENTO DO CÂNCER DE MAMA IN VITRO.

[00147] Os tecidos biológicos normalmente possuem níveis variados de rigidez, que contribuem para o desempenho de suas funções fisiológicas. Alterações na rigidez do tecido podem refletir a transformação de um estado normal para um patológico. As células cancerígenas dentro do tumor são influenciadas pelas condições mecânicas de seu microambiente, que podem direcionar o destino celular. Formas de realização da presente matriz de HMC podem ser usadas para imitar a rigidez circundante desejada in vitro para formação e crescimento de objetos/ estruturas de câncer de mama em 3D. Objetos em 3D não aderentes e não amarrados foram gerados a partir de células únicas dentro de uma matriz de hidrogel, cultivada sob várias condições mecânicas que foram criadas pelo procedimento de incorporação de agarose e medidas em resolução de um único objeto, explorando as propriedades mecânicas e ópticas vantajosas da agarose. Este estudo demonstra diferenças no desenvolvimento in vitro de micro-tecidos de câncer de mama em 3D sob várias condições de rigidez. Estruturas individuais de câncer de mama em 3D revelaram diferenças significativas na taxa de crescimento de objetos, morfologia e características vitais associadas à extensão da rigidez ambiental, ao momento em que a incorporação foi realizada e ao número inicial de células semeadas. Os objetos em 3D iniciados a partir de menos de seis células são significativamente diferentes daqueles iniciados por mais células e demonstram uma taxa de crescimento independente da rigidez circundante. Além disso, a cultura de controle de objetos 3D cultivada livremente sob condições de baixa rigidez carece do subconjunto específico do fenótipo pré-invasivo que se desenvolveu nos arredores mais rígidos.

[00148] Entende-se que certas características da invenção, que são, para maior clareza, descritas no contexto de formas de realização separadas, também podem ser fornecidas em combinação em uma única forma de realização. Inversamente, várias características da invenção, que são, por uma questão de brevidade, descritas no contexto de uma única forma de realização, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer sub- combinação adequada.

[00149] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com formas de realização específicas da mesma, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes para os técnicos no assunto. Consequentemente, pretende-se englobar todas essas alternativas, modificações e variações que se enquadram no espírito e no amplo escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados em sua totalidade por referência no relatório descritivo, na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado como sendo incorporado aqui por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência neste pedido não deve ser interpretada como uma admissão de que essa referência está disponível como estado da técnica à presente invenção.

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES

1. — DISPOSITIVO DE CULTURA DE CÉLULAS, caracterizado por compreender: (a) uma placa com pelo menos um poço com um orifício de passagem formado em uma parede inferior do mesmo; e (b) uma matriz de hidrogel disposta no referido orifício de passagem.

2. "DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda: (c) pelo menos uma câmara formada na referida matriz de hidrogel.

3. — DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referido orifício de passagem ser moldado de modo a reter a referida matriz de hidrogel dentro dele.

4, DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela referida matriz de hidrogel se estender para dentro do referido pelo menos um poço.

5. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda um suporte opticamente transparente posicionado sob a referida placa, em que a referida matriz de hidrogel! disposta dentro do referido orifício de passagem entra em contato com uma superfície superior do referido suporte.

6. “DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referido orifício de passagem ser modelado como um cone truncado.

7. “DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo referido orifício de passagem ter um diâmetro variando de 2 a 32 mm.

8. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por uma superfície interna do referido orifício de passagem incluir pelo menos uma região rebaixada.

9. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo referido rebaixamento ter uma profundidade de 0,5 a 2 mm.

10. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por uma superfície interna do referido orifício de passagem incluir saliências direcionadas radialmente para dentro.

11. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelas referidas saliências terem 0,5 a 3,5 mm de comprimento.

12. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender uma pluralidade de câmaras de picolitro a microlitro formadas na referida matriz de hidrogel.

13. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela referida câmara de picolitro a microlitro ser formada como uma pirâmide truncada invertida.

14. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por cada uma das referidas câmaras de picolitro a microlitro ter um volume que varia de 1 a 50 nanolitros.

15. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda um anel posicionável no referido pelo menos um poço, o referido anel incluindo uma ranhura interna circunferencial.

16. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo referido anel ter 2 a 32 mm de diâmetro.

17. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda uma inserção de anel duplo posicionável no referido pelo menos um poço, a referida inserção de anel duplo incluindo uma abertura central definida por um anel interno da referida inserção de anel duplo e uma pluralidade de compartimentos definidos entre o referido anel interno e um anel externo da referida inserção de anel duplo.

18. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo referida inserção de anel duplo incluir pelo menos uma ranhura circunferencial dentro de uma parede interna do referido anel interno.

19. MÉTODO PARA CULTIVAR UM OU MAIS TIPOS DE CÉLULAS, caracterizado por compreender: (a) fornecer o dispositivo de cultura de células, conforme definido na reivindicação 12; (b) semear um ou mais tipos de células dentro da referida câmara de picolitro a microlitro; e (c) submeter o dispositivo de cultura de células a condições adequadas para a cultura dos referidos um ou mais tipos de células.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pela referida câmara ser formada dentro de uma pluralidade de compartimentos, cada um deles destinado a semear um tipo de célula.

21. MÉTODO PARA FABRICAR UM DISPOSITIVO DE CULTURA, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma placa tendo pelo menos um poço com um orifício de passagem formado em uma parede inferior do mesmo; (b) enchero referido orifício de passagem com um hidrogel; e (c) gravar em relevo pelo menos uma câmara de cultura de células no referido hidrogel.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender ainda o posicionamento de uma inserção de anel duplo dentro do referido poço antes de (b).

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pela referida inserção de anel duplo incluir uma abertura central definida por um anel interno da referida inserção de anel duplo e uma pluralidade de compartimentos definidos entre o referido anel interno e um anel externo da referida inserção de anel duplo.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pela referida inserção de anel duplo incluir pelo menos uma ranhura circunferencial dentro de uma parede interna do referido anel interno para reter o referido hidrogel.

25. DISPOSITIVO DE CULTURA DE CÉLULAS, caracterizado por compreender: (a) uma placa tendo pelo menos um poço com um orifício de passagem formado em uma parede inferior do mesmo; (b) uma matriz de hidrogel disposta dentro do referido orifício de passagem; e (c) um gel disposto no topo da referida matriz de hidrogel.

26. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo referido gel incluir pelo menos um componente de matriz extracelular (ECM).

27. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo referido gel, incluindo pelo menos um componente de matriz extracelular (ECM), ser disposto dentro de um anel, incluindo uma ranhura circunferencial contínua/ segmentada ao longo de uma superfície interna do mesmo para reter o referido gel.

28. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo referido gel, incluindo pelo menos um componente de matriz extracelular (ECM), ser disposto dentro de uma inserção de anel duplo posicionado dentro do referido pelo menos um poço, a referida inserção de anel duplo incluindo uma abertura central definida por um anel interno da referida inserção de anel duplo e uma pluralidade de compartimentos definidos entre o referido anel interno e um anel externo da referida inserção de anel duplo.

29. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pela referida inserção de anel duplo incluir pelo menos uma ranhura circunferencial dentro de uma parede interna do referido anel interno para reter o referido gel, incluindo pelo menos um componente de matriz extracelular (ECM).