KR101949856B1

KR101949856B1 - 웰 플레이트, 이의 제조방법, 및 이를 이용하여 세포를 배양하는 방법

Info

Publication number: KR101949856B1
Application number: KR1020170082013A
Authority: KR
Inventors: 김필남; 고일규
Original assignee: 한국과학기술원; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2017-06-28
Filing date: 2017-06-28
Publication date: 2019-02-20
Also published as: KR20190001979A

Abstract

본 발명은 복수 개의 웰을 포함하는 웰 플레이트에 있어서, 상기 웰은 하부에 복수 개의 마이크로웰을 포함하는 마이크로웰 구조물이 형성되어 있는, 웰 플레이트를 제공한다.
본 발명의 복수 개의 마이크로웰을 포함하는 웰 플레이트를 사용하여 세포를 배양할 경우 균일한 크기의 세포를 배양할 수 있으며, 특히 구형 세포 집합체를 형성하는데 용이하게 사용될 수 있다. 또한, 고효율 스크리닝(high throughput screening) 시스템에 적용이 가능하며, 형성된 세포 집합체의 수집 및 재배치 없이 웰 플레이트 내에서 직접 사용이 가능하다.

Description

웰 플레이트, 이의 제조방법, 및 이를 이용하여 세포를 배양하는 방법{WELL PLATE, METHOD OF PREPARING THE SAME, AND METHOD FOR CULTURING A CELL USING THE SAME}

본 발명은 웰 플레이트, 상기 웰 플레이트의 제조방법, 및 상기 웰 플레이트를 이용하여 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.

단순화된 2 차원 세포 배양 시스템은 실제 생체 내 세포의 형질을 구현하기에 적합하지 않은 환경으로서, 이러한 세포 배양 시스템을 이용한 연구는 실제 생체 내에 존재하는 세포의 특성을 제대로 반영하지 못하기 때문에, 실제와 다른 결과를 초래할 수 있다. 또한, 동물을 이용한 세포의 특성 연구는 세포 주변의 다양한 환경(기질세포, 세포외기질 등)으로 인해 특정 세포의 특성을 연구하는데 어려움이 따르며, 비용과 시간적인 측면에서 제약이 있다. 일반적으로 장기를 구성하는 세포 혹은 종양의 경우 일정한 형태의 세포 집합체로 이루어져 있다. 따라서 생체 외에서도 생체 내에서 자라는 세포의 환경을 모사하여, 그에 따른 표현형 및 움직임을 구현할 수 있는 세포 배양 시스템 개발의 필요성이 높아지고 있으며, 최근 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 연구의 결과로 행잉드롭(hanging drop), 현탁 배양(suspension culture), 진탕 배양(shaking culture) 등 다양한 기술들이 개발되었지만 이는 실험자의 수작업에 의해 진행되기 때문에 대량 생산, 일정한 크기 등의 측면에서 단점을 가지고 있다. 따라서, 이러한 단점을 극복하기위해 최근에는 원통형, 피라미드형, 직육면체형 등의 마이크로 구조물를 이용한 세포 집합체 배양 기술들이 개발되고 있다.

이와 관련하여 대한민국 공개특허 제10-2015-0047598호는 충분한 웰 용량을 확보한 마이크로웰 플레이트에 대하여 개시하고 있다.

본 발명의 목적은 웰 플레이트, 상기 웰 플레이트의 제조방법, 및 상기 웰 플레이트를 이용하여 세포를 배양하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

복수 개의 웰을 포함하는 웰 플레이트에 있어서,

상기 웰은 하부에 복수 개의 마이크로웰을 포함하는 마이크로웰 구조물이 형성되어 있는, 웰 플레이트를 제공한다.

또한, 본 발명은

복수 개의 웰을 포함하는 웰 플레이트에 있어서,

상기 웰의 하부에 복수 개의 마이크로웰을 포함하는 마이크로웰 구조물을 부착하는 단계를 포함하는 웰 플레이트의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

복수 개의 웰을 포함하는 웰 플레이트를 사출 성형함에 있어서,

상기 웰의 하부에 복수 개의 마이크로웰을 포함하는 마이크로웰 구조물을 형성하는 것을 특징으로 하는 웰 플레이트의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

상기 웰 플레이트를 이용하여 세포를 3 차원 형태로 배양하는 방법을 제공한다.

본 발명의 복수 개의 마이크로웰을 포함하는 웰 플레이트를 사용하여 세포를 배양할 경우 균일한 크기의 세포를 배양할 수 있으며, 특히 구형 세포 집합체를 형성하는데 용이하게 사용될 수 있다. 또한, 고효율 스크리닝(high throughput screening) 시스템에 적용이 가능하며, 형성된 세포 집합체의 수집 및 재배치 없이 웰 플레이트 내에서 직접 사용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 제조예에 따른 마이크로웰 스탬프의 이미지이고,
도 2는 본 발명의 제조예 1에 웰 플레이트 제조과정을 나타낸 모식도이고,
도 3은 본 발명의 제조예 1에 따라 제조된 마이크로웰의 SEM 이미지이고,
도 4는 본 발명의 제조예 2에 따른 웰 플레이트 제조과정을 나타낸 모식도이고,
도 5는 본 발명의 실시예 및 종래 웰 플레이트에 따른 마이크로웰을 이용한 다양한 농도의 세포배양 이미지 및 크기를 측정한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

복수 개의 웰을 포함하는 웰 플레이트에 있어서,

이하, 상기 웰 플레이트에 대하여 상세히 설명한다.

웰 플레이트는, 통상 소 스케일의 세포 배양이나 생화학 실험 등에 사용된다.

웰 플레이트는, 수지제의 평판의 한쪽의 면(상측의 면)에 개방되는 웰이 형성되어 있다. 웰은 일반적으로 n행 m열로 배치되어 있고, 그 수는 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 등의 것이 사용되어 왔다.

또한, 웰은 세포 응집 덩어리를 형성하기 위한 공간을 구획하는 부분이다.

본원의 웰 플레이트에 대하여 설명하자면 우선, 상기 마이크로웰은 개구로부터 폐쇄된 기저로 이어져 형성되며, 상기 마이크로웰의 기저에서 기설정된 지점까지 횡단면이 원형으로 점점 넓어지는 형태를 가진다.

상기 마이크로웰이 상기 각각의 웰의 하부에 형성됨으로써 상기 웰 플레이트는 이중의 웰을 포함하는 구조를 가지게 된다.

상기 마이크로웰은 기저에서 기설정된 지점까지 횡단면이 원형으로 점점 넓어지는 형태를 가지며 상기 기설정된 지점이란 임의의 지점으로서 상기 마이크로웰의 깊이 중의 임의의 지점을 가리키는 것일 수 있다.

상기 마이크로웰의 깊이는 예를 들어, 약 500 μm 내지 약 1,000 μm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 마이크로웰의 깊이는 약 500 μm 내지 약 1,000 μm, 약 600 μm 내지 약 1,000 μm, 약 700 μm 내지 약 1,000 μm, 약 800 μm 내지 약 1,000 μm, 약 900 μm 내지 약 1,000 μm, 약 500 μm 내지 약 900 μm, 약 500 μm 내지 약 800 μm, 약 500 μm 내지 약 700 μm, 또는 약 500 μm 내지 약 600 μm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 기설정된 지점의 깊이는 상기 마이크로웰의 개구로부터 약 250 μm 내지 약 750 μm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 기설정된 지점의 깊이는 상기 마이크로웰의 개구로부터 약 250 μm 내지 약 750 μm, 약 300 μm 내지 약 750 μm, 약 350 μm 내지 약 750 μm, 약 400 μm 내지 약 750 μm, 약 450 μm 내지 약 750 μm, 약 500 μm 내지 약 750 μm, 약 550 μm 내지 약 750 μm, 약 600 μm 내지 약 750 μm, 약 650 μm 내지 약 750 μm, 약 700 μm 내지 약 750 μm, 약 250 μm 내지 약 700 μm, 약 250 μm 내지 약 650 μm, 약 250 μm 내지 약 600 μm, 약 250 μm 내지 약 550 μm, 약 250 μm 내지 약 500 μm, 약 250 μm 내지 약 450 μm, 약 250 μm 내지 약 400 μm, 약 250 μm 내지 약 350 μm, 또는 약 250 μm 내지 약 300 μm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 마이크로웰의 개구로부터 상기 기설정된 지점까지는 횡단면이 동일할 수도 있으나, 점점 좁아지는 것이 바람직하다. 즉, 횡단면이 점점 좁아짐으로써 상기 마이크로웰에 배양시키고자 하는 세포를 첨가 시에 세포가 마이크로웰의 경사면을 따라 기저로 가라앉을 수 있다.

상기 기저에서 기설정된 지점까지 횡단면의 직경은 약 200 μm 내지 약 1,500 μm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 기저에서 기설정된 지점까지 횡단면의 직경은 약 200 μm 내지 약 1,500 μm, 약 300 μm 내지 약 1,500 μm, 약 400 μm 내지 약 1,500 μm, 약 500 μm 내지 약 1,500 μm, 약 600 μm 내지 약 1,500 μm, 약 700 μm 내지 약 1,500 μm, 약 800 μm 내지 약 1,500 μm, 약 900 μm 내지 약 1,500 μm, 약 1,000 μm 내지 약 1,500 μm, 약 1,100 μm 내지 약 1,500 μm, 약 1,200 μm 내지 약 1,500 μm, 약 1,300 μm 내지 약 1,500 μm, 약 1,400 μm 내지 약 1,500 μm, 약 200 μm 내지 약 1,400 μm, 약 200 μm 내지 약 1,300 μm, 약 200 μm 내지 약 1,200 μm, 약 200 μm 내지 약 1,100 μm, 약 200 μm 내지 약 1,000 μm, 약 200 μm 내지 약 900 μm, 약 200 μm 내지 약 800 μm, 약 200 μm 내지 약 700 μm, 약 200 μm 내지 약 600 μm, 약 200 μm 내지 약 500 μm, 약 200 μm 내지 약 400 μm, 또는 약 200 μm 내지 약 300 μm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 복수 개의 마이크로웰의 개구는 다각형의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 복수 개의 마이크로웰의 개구가 다각형의 형태일 경우, 상기 형태는 삼각형, 사각형, 오각형, 육각형, 칠각형, 또는 팔각형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 마이크로웰의 개구가 다각형의 형태일 경우 각각의 개구는 서로 선접합하고 있는 것일 수 있다. 상기 개구가 선접합 함으로써 각각의 개구 사이에 빈 공간이 생기지 않게 되며, 따라서 상기 마이크로웰에 배양시키고자 하는 세포를 첨가 시에 모든 세포가 마이크로웰 내로 첨가되게 된다. 즉, 각각의 개구 사이에 빈 공간이 있을 경우 마이크로웰 내로 첨가되지 않고 상기 빈 공간에 세포가 놓일 수 있어 후에 이를 처리하지 않아도 된다는 장점이 있다.

또한, 상기 마이크로웰의 개구가 다각형의 형태를 가짐으로써 웰 내의 동일 면적 내에서 최대한 많은 수의 마이크로웰을 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 마이크로웰의 개구는 육각형의 형태일 수 있다.

한편, 상기 마이크로웰의 개구가 다각형일 경우 상기 개구의 모서리의 길이는 약 230 μm 내지 약 750 μm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 개구의 모서리의 길이는 약 230 μm 내지 약 750 μm, 약 250 μm 내지 약 750 μm, 약 300 μm 내지 약 750 μm, 약 350 μm 내지 약 750 μm, 약 400 μm 내지 약 750 μm, 약 450 μm 내지 약 750 μm, 약 500 μm 내지 약 750 μm, 약 550 μm 내지 약 750 μm, 약 600 μm 내지 약 750 μm, 약 650 μm 내지 약 750 μm, 약 700 μm 내지 약 750 μm, 약 230 μm 내지 약 700 μm, 약 230 μm 내지 약 650 μm, 약 230 μm 내지 약 600 μm, 약 230 μm 내지 약 550 μm, 약 230 μm 내지 약 500 μm, 약 230 μm 내지 약 450 μm, 약 230 μm 내지 약 400 μm, 약 230 μm 내지 약 350 μm, 약 230 μm 내지 약 300 μm, 또는 약 230 μm 내지 약 250 μm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 웰은 상기 마이크로웰을 약 10 개 내지 약 30 개 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 웰은 상기 마이크로웰을 약 10 개 내지 약 30 개, 약 15 개 내지 약 30 개, 약 20 개 내지 약 30 개, 약 25 개 내지 약 30 개, 약 10 개 내지 약 25 개, 약 10 개 내지 약 20 개, 약 10 개 내지 약 15 개, 또는 약 19 개 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 웰의 깊이는 약 5 mm 내지 약 15 mm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 웰의 깊이는 약 5 mm 내지 약 15 mm, 약 6 mm 내지 약 15 mm, 약 7 mm 내지 약 15 mm, 약 8 mm 내지 약 15 mm, 약 9 mm 내지 약 15 mm, 약 10 mm 내지 약 15 mm, 약 11 mm 내지 약 15 mm, 약 12 mm 내지 약 15 mm, 약 13 mm 내지 약 15 mm, 약 14 mm 내지 약 15 mm, 약 5 mm 내지 약 14 mm, 약 5 mm 내지 약 13 mm, 약 5 mm 내지 약 12 mm, 약 5 mm 내지 약 11 mm, 약 5 mm 내지 약 10 mm, 약 5 mm 내지 약 9 mm, 약 5 mm 내지 약 8 mm, 약 5 mm 내지 약 7 mm, 또는 약 5 mm 내지 약 6 mm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 웰 플레이트는 상기 웰을 6 개 내지 1,536 개 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게 상기 웰 플레이트는 상기 웰을 96 개 또는 384 개 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어 상기 웰을 96 개 포함할 경우 상기 웰은 12행 8열로 배열되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은

복수 개의 웰을 포함하는 웰 플레이트에 있어서,

즉, 복수 개의 웰을 포함하는 웰 플레이트를 준비한 후에, 상기 웰의 하부에 미리 제작한 복수 개의 마이크로웰을 포함하는 마이크로웰 구조물을 부착하여 마이크로웰 구조물을 포함하는 웰 플레이트를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은

이때, 상기 사출 성형은

복수 개의 웰 스탬프를 포함하는 웰 플레이트 스탬프의 웰 스탬프 상부에 제 1 경화성 폴리머를 도포하여 경화시키는 단계(단계 1);

상기 경화된 웰 플레이트 스탬프에 제 2 경화성 폴리머를 도포하는 단계(단계 2); 및

상기 제 1 경화성 폴리머가 도포된 상기 웰 플레이트 스탬프를 웰 플레이트 상에서 경화시킨 후 제거하는 단계(단계 3)를 포함하는 것일 수 있다.

상기 웰 스탬프의 상부는 복수 개의 마이크로웰 구조물 제조용 몰드를 포함하는 것일 수 있다.

상기 제 1 경화성 폴리머는 놀렌드 광학 접착제 74(Norland Optical Adhesive 74, NOA 74), 놀렌드 광학 접착제 71(Norland Optical Adhesive 71, NOA 71), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리머를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 웰 스탬프 상부에 제 1 경화성 폴리머를 도포한 후, 경화시키는 과정은 상기 웰 스탬프를 파라필름 또는 폴리다이메틸실록산(polydimethylsiloxane) 상에서 경화시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 파라필름 또는 폴리다이메틸실록산 상에서 경화시킴으로써 상기 웰 스탬프의 상부를 평평하게 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 제 2 경화성 폴리머는 NOA 74, NOA 71, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리머를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 제 2 경화성 폴리머를 도포하기 전에 상기 파라필름 또는 폴리다이메틸실록산을 떼어낸 후, 상기 도포를 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 웰 플레이트의 재료는 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌 수지, 에틸렌-프로필렌 공중합체 등의 폴리올레핀계 수지 또는 환상 폴리올레핀계 수지, 폴리스티렌, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌계 수지 등의 폴리스티렌계 수지, 폴리카보네이트 수지, 폴리에틸렌테레프탈레이트 수지, 폴리메틸메타크릴레이트 수지 등의 메타크릴계 수지, 염화비닐 수지, 폴리부틸렌테레프탈레이트 수지, 폴리아릴레이트 수지, 폴리술폰 수지, 폴리에테르술폰 수지, 폴리에테르에테르케톤 수지, 폴리에테르이미드 수지, 폴리테트라플루오로에틸렌 등의 불소계 수지, 폴리메틸펜텐 수지, 폴리아크릴로니트릴 등의 아크릴계 수지, 프로피오네이트 수지 등의 섬유소계수지, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 재료를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

특히, 배양 용기에 요구되는 성형성, 방사선 멸균 내성의 특성을 가지는 폴리스티렌 수지가 바람직 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 세포 응집 덩어리의 형상 관찰이나 흡광도 측정을 행하는 경우에는 투명성의 수지를 선택하고, 웰 마다의 발광 측정이나 형광 측정을 행하는 경우에는 차광성의 수지를 선택하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 사출성형은

웰에 생체적합성 폴리머를 첨가하는 단계(단계 1); 및

상기 생체적합성 폴리머가 첨가된 웰에 마이크로웰 구조물 제조용 몰드를 찍은 후 제거하는 단계(단계 2)

를 포함하는 것일 수 있다.

이때, 상기 생체적합성 폴리머는 다당체 폴리머일 수 있으며, 상기 다당체 폴리머는 아가로오스(agarose), NOA 74, NOA 71, 폴리다이메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리머를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

더욱 상세히 설명하면 상기 웰에 농도 1% 내지 20%의 생체적합성 폴리머 용액을 떨어뜨려준 후 상기 생체적합성 폴리머 용액이 굳기 전에 마이크로웰 구조물 제조용 몰드를 찍은 후 상기 용액이 굳으면 상기 몰드를 제거하여 웰 플레이트를 제조하는 것일 수 있다.

따라서, 상기 웰 플레이트를 제조함에 있어서, 미리 준비한 마이크로웰 구조물을 웰의 하부에 부착할 수 있고, 또는 사출성형의 방법을 채용할 수 있으며, 이때 상기 사출성형은 폴리머를 이용하는 방법 또는 생체적합성 폴리머를 이용하는 방법을 채용하는 것일 수 있다.

상기와 같은 제조방법을 통해 제조된 웰 플레이트는 복수 개의 웰을 포함하며, 상기 웰은 하부에 복수 개의 마이크로웰을 포함하는 마이크로웰 구조물이 형성되어 있는 것일 수 있다.

상기 마이크로웰은 개구로부터 폐쇄된 기저로 이어져 형성되며, 상기 마이크로웰의 기저에서 기설정된 지점까지 횡단면이 원형으로 점점 넓어지는 형태를 가진다.

상기 웰 플레이트는 상기 웰을 6 개 내지 1536 개 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게 상기 웰 플레이트는 상기 웰을 96 개 또는 384 개 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어 상기 웰을 96 개 포함할 경우 상기 웰은 12행 8열로 배열되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은

상기 세포를 배양하는 방법은 상기 마이크로웰 플레이트의 마이크로웰에 세포를 첨가하는 단계(단계 1); 및

상기 세포가 첨가된 마이크로웰 플레이트를 인큐베이터 내에 넣고 상기 세포를 배양하는 단계(단계 2)

를 포함하는 것일 수 있다.

이때, 상기 인큐베이터 내의 온도는 약 30℃ 내지 약 40℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 인큐베이터 내의 온도는 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 33℃ 내지 약 40℃, 약 35℃ 내지 약 40℃, 약 37℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 37℃, 약 30℃ 내지 약 35℃, 또는 약 30℃ 내지 약 33℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 배양은 약 12 시간 내지 약 100 시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 배양은 약 12 시간 내지 약 100 시간, 약 20 시간 내지 약 100 시간, 약 30 시간 내지 약 100 시간, 약 40 시간 내지 약 100 시간, 약 50 시간 내지 약 100 시간, 약 60 시간 내지 약 100 시간, 약 70 시간 내지 약 100 시간, 약 80 시간 내지 약 100 시간, 약 90 시간 내지 약 100 시간, 약 12 시간 내지 약 90 시간, 약 12 시간 내지 약 80 시간, 약 12 시간 내지 약 70 시간, 약 12 시간 내지 약 60 시간, 약 12 시간 내지 약 50 시간, 약 12 시간 내지 약 40 시간, 약 12 시간 내지 약 30 시간, 또는 약 12 시간 내지 약 20 시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 마이크로웰을 포함하는 웰 플레이트를 사용하여 세포를 배양함으로써 동일한 크기의 세포를 배양할 수 있으며, 상기 마이크로웰의 개구가 다각형일 경우 각각의 개구가 서로 선접합함으로써 비어 있는 공간이 없어 모든 세포가 마이크로웰 내에 첨가될 수 있다. 따라서, 마이크로웰 내에 첨가되지 않은 세포를 처리하는 단계가 생략될 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[제조예 1] 웰 플레이트의 제조(폴리머를 이용)

<단계 1> 마이크로웰 스탬프 제작

마이크로웰을 포함하는 웰 플레이트를 제조하기 위해 3D 프린팅을 이용하여 마이크로웰 스탬프를 제작하였으며, 상기 스탬프를 도 2에 나타내었다. 프로토타입(prototype)으로 상기 스탬프에서 마이크로웰에 해당하는 부분의 직경 및 깊이를 500 μm의 크기로 제작하였으며 황동을 이용하여 제작하였다.

<단계 2> 마이크로웰 몰딩

상기 단계 1에서 제작한 마이크로웰 스탬프를 이용하여 웰 플레이트 내에 마이크로웰을 형성하였으며 상기 과정은 도 1에 나타내었다. 우선, 상기 단계 1에서 제작된 마이크로웰 스템프에 UV 경화성 폴리머(NOA 74)를 한방울 떨어뜨려 준 뒤, 파라필름 또는 폴리다이메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 상에 올린 뒤 UV로 예비 가교(pre-crosslinking) 시켰다. 그 후, 예비 가교된 폴리머 상에 UV 경화성 폴리머(결합 물질, NOA 74)을 떨어뜨려준 후, 마이크로웰을 전사 시키고자 하는 웰 플레이트(96 웰 플레이트)에 올린 후, UV로 완전 가교(fully crosslinking) 시키고, 상기 마이크로웰 스템프를 제거하였다. 상기 과정을 통해 제조된 웰 플레이트의 마이크로웰 SEM 이미지를 도 3에 나타내었다.

[제조예 2] 웰 플레이트의 제조(아가로오스를 이용)

<단계 1> 마이크로웰 스탬프 제작

상기 제조예 1과 같은 방법으로 마이크로웰 스탬프를 제작하였다.

<단계 2> 마이크로웰 몰딩

상기 단계 1에서 제작한 마이크로웰 스탬프를 이용하여 웰 플레이트 내에 마이크로웰을 형성하였으며 상기 과정은 도 4에 나타내었다. 우선, 96 웰 플레이트에 아가로오스(Agarose) 용액(4%)을 떨어뜨려 주었다. 상기 아가로오스 용액이 굳기 전, 마이크로웰 스템프를 아가로오스 용액 위에 찍은 뒤 아가로오스 용액이 굳을 때까지 기다렸다. 그 후에 마이크로웰 플에이트를 조심스럽게 제거하였다.

[실시예 1] 제조예 1의 웰 플레이트를 이용한 세포배양

제작된 마이크로웰에 보빈 세럼 알부민(bovine serum albumin, BSA(10%))을 넣어 준 후, 상온에서 1 시간이상 코팅하였다. 마이크로웰을 BSA로 코팅함으로써, 세포가 폴리머에 부착될 수 없는 환경을 만들어 주었다. 그 후에, 코팅된 마이크로웰을 포스페이트-버퍼 살린(phosphate-buffered saline, PBS)으로 세척해 주었다. 세척된 마이크로웰에 원하는 농도의 세포를 넣어주었다. 그리고, 37, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 세포 파종 후, 1 일차부터 세포구가 형성됨을 확인하였다. 이를 도 5에 나타내었으며, 균일한 크기의 세포구가 형성됨을 확인하였고(도 5a), 농도의 증가에 따라 세포구의 직경이 커짐을 확인(도 5b)할 수 있었다. 반면, 종래의 웰 플레이트를 이용한 경우 세포구의 크기가 상이하게 형성됨을 확인할 수 있었다(도 5a).

[실시예 2] 제조예 2의 웰 플레이트를 이용한 세포배양

제작된 마이크로웰에 원하는 농도의 세포를 넣어주었다. 그리고, 37, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 세포 파종 후, 1 일차부터 세포구가 형성됨을 확인하였다. 상기 실시예 1과 같이 균일한 크기의 세포구가 형성됨을 확인하였고, 농도의 증가에 따라 세포구의 직경이 커짐을 확인할 수 있었다. 반면, 종래의 웰 플레이트를 이용한 경우 세포구의 크기가 상이하게 형성됨을 확인할 수 있었다.

Claims

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복수 개의 웰을 포함하는 웰 플레이트를 사출 성형함에 있어서,
상기 웰의 하부에 복수 개의 마이크로웰을 포함하는 마이크로웰 구조물을 형성하는 것을 특징으로 하며,
상기 사출 성형은
복수 개의 웰 스탬프를 포함하는 웰 플레이트 스탬프의 웰 스탬프 상부에 제 1 경화성 폴리머를 도포하여 경화시키는 단계(단계 1);
상기 경화된 웰 플레이트 스탬프에 제 2 경화성 폴리머를 도포하는 단계(단계 2); 및
상기 제 1 경화성 폴리머가 도포된 상기 웰 플레이트 스탬프를 웰 플레이트 상에서 경화시킨 후 제거하는 단계(단계 3)
를 포함하는 웰 플레이트의 제조방법.
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제12항에 있어서,
상기 웰 스탬프의 상부는 복수 개의 마이크로웰 구조물 제조용 몰드를 포함하는 것인, 웰 플레이트의 제조방법.
복수 개의 웰을 포함하는 웰 플레이트를 사출 성형함에 있어서,
상기 웰의 하부에 복수 개의 마이크로웰을 포함하는 마이크로웰 구조물을 형성하는 것을 특징으로 하며,
상기 사출성형은
웰에 생체적합성 폴리머를 첨가하는 단계(단계 1); 및
상기 생체적합성 폴리머가 첨가된 웰에 마이크로웰 구조물 제조용 몰드를 찍은 후 제거하는 단계(단계 2)
를 포함하는
웰 플레이트의 제조방법.
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