JP2023538209A - 脳オルガノイドの作製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、脳オルガノイドの作製方法を提供する。【選択図】図１２

Description

本発明は、脳オルガノイドの作製方法に関する。より詳細には、ハイドロゲルを用いずに脳オルガノイドを作製する方法である。

分化した体細胞を未分化な状態の細胞（例えば、幹細胞）に戻す過程をリプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）という。人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）は、逆分化幹細胞、逆分化多能性幹細胞とも呼ばれ、リプログラミング因子（Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃなど）を用いて体細胞を幹細胞に変換するものである（非特許文献１及び２）。

アルツハイマー病、パーキンソン病、脳梗塞、脳出血、脊髄損傷などの脳神経疾患の治療において、神経細胞の再生を通じた新しい治療候補物質が多様に登場しているが、このような治療候補物質をスクリーニングするための解決策はまだ不十分である。

最近開発されているオルガノイド技術は、３次元培養方法を利用している。大韓民国登録特許第１０－１７５６９０１号（特許文献１）には、３次元組織細胞を培養可能な細胞培養チップについて開示されている。前記特許文献１の細胞培養チップでは、第１培養部、第２培養部及び第３培養部がそれぞれ層別に形成され、各層別に細胞の成長の進行度合いを確認することができる。しかしながら、特許文献１における細胞培養チップでは、スフェロイド及び／又はオルガノイドを高収率で得ることができないという問題点がある。

また、細胞培養時に培養液を交換するピペッティング作業を行うことがあるが、３次元細胞培養が可能なＣｏｒｎｉｎｇスフェロイドマイクロプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）の場合、細胞培養中のスフェロイド又はオルガノイドに影響を与えて、ピペッティング作業時にスフェロイド又はオルガノイドが吸い上がったり、位置が変わったりするなどといったことがあり、細胞培養環境に好ましくない問題があった。

マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社の製品名）は、ＥＨＳ（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ）マウスの肉腫細胞から抽出されたタンパク質複合体であり、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）などの細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）と線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＥＦＧ）、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－ベータ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ、ＴＧＦ－β）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）などの成長因子を含む。マトリゲルを構成する複合体は、多くの組織に見られる複雑な細胞外環境を提供することによって細胞培養の基質として利用されている。

マトリゲルは、マウス肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）に由来するものであるため、免疫原や病原菌を移入するリスクが大きい。また、マトリゲルは、細胞増殖と組織形成に用いられているが、それだけ複雑な物質であるため、細胞の再現性に大きな問題があるという批判もある。マトリゲルが単純にスフェロイドの成長を物理的に支持する受動的な３Ｄ足場として機能するのか、或いは生物学的に必須の要素を提供することによって、スフェロイド形成に積極的に影響を与えるのかについても不明である。また、マトリゲルは、その価格も非常に高価である。そのため、マトリゲルは細胞培養技術分野の発展に貢献してきた物質ではあるが、このマトリゲルが技術分野の発展を阻害しているのも事実である。

Ｌａｎｃａｓｔｅｒなどは、ヒト人工多能性幹細胞から脳オルガノイドを作製しことがある（非特許文献３）。しかし、この脳オルガノイド培養は、マトリゲルを用いており、脳オルガノイドを大型培養器に入れて行っているので、大量の培地を使用する必要があり、大きさが不規則という欠点がある。また、このようにして作製された脳オルガノイドの場合、一つのオルガノイドから様々な器官が（大脳、中脳、網膜など）混在して均一性がなく、大きさも不規則の問題がある。

そこで、本発明者らは、ハイドロゲルを用いずに人工多能性幹細胞から脳オルガノイドを作製する技術について研究を重ねて本発明を完成するに至った。

大韓民国登録特許第１０－１７５６９０１号

Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｃｅｌｌ． ２００６；１２６：６６３－６７６．

Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ， Ｔａｎａｂｅ Ｋ，Ｏｈｎｕｋｉ Ｍ， Ｎａｒｉｔａ Ｍ，Ｉｃｈｉｓａｋａ Ｔ，Ｔｏｍｏｄａ Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ．２００７；１３１：８６１－８７２．

Ｍａｄｅｌｉｎｅ Ａ． Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， Ｊｕｅｒｇｅｎ Ａ． Ｋｎｏｂｌｉｃｈ， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２０１４ Ｏｃｔｏｂｅｒ； ９（１０）： ２３２９－２３４０．

本発明の目的は、脳オルガノイドの作製方法を提供することである。

しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、上述した課題に限定されるものではなく、言及されていない他の課題は、以下の記載から当該技術分野における通常の技術者に明確に理解されることができる。

前記課題を解決するために、本発明は、以下を含む脳オルガノイドの作製方法を提供する。

ｉ）体細胞を培養する工程と、
ｉｉ）人工多能性幹細胞の製造のためのハイドロゲルを含まない３次元細胞培養プレートを準備する工程と、
ｉｉｉ）前記培養された体細胞を、前記ハイドロゲルを含まない３次元細胞培養プレートで人工多能性幹細胞にリプログラミングさせて人工多能性幹細胞を製造する工程と、
ｉｖ）前記人工多能性幹細胞を前記ｉｉｉ）の３次元細胞培養プレートから分離する工程と、
ｖ）脳オルガノイドを形成するためにハイドロゲルがコーティングされていない３次元細胞培養プレートを準備する工程と、
ｖｉ）前記分離された人工多能性幹細胞をハイドロゲルを含まない３次元細胞培養プレートで培養して脳オルガノイドを形成する工程と、
を含む、脳オルガノイドの作製方法であって、
前記３次元細胞培養プレートは、
複数個のメインウェル（ｍａｉｎ ｗｅｌｌ）と、メインウェルのそれぞれの下部に形成され、細胞培養液が注入され、底面に凹部を含む複数個のサブウェル（ｓｕｂ ｗｅｌｌ）とを含むウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）と、ウェルプレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタと、を含み、
前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、ウェルプレートの下端に互いに着脱可能に固定手段が備えられたベースと、ウェルプレートの上部に配置され、ベースと結合されるカバーとを含み、前記メインウェルは、所定の部位がテーパ状になるように段差が形成され、前記段差は、メインウェルの壁に対して１０～６０°範囲の傾斜角（θ）を有する。

前記体細胞は、線維芽細胞であってもよいが、必ずしもこれに限定されるものではなく、この技術分野で公知の体細胞であれば、いずれも使用可能である。

前記体細胞は、一般的な２次元ウェルプレート、３次元細胞培養プレート、又は本発明による３次元プレートで培養することができる。

前記脳オルガノイド形成工程は、
前記人工多能性幹細胞を胚様体（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｂｏｄｙ）にした後、
前記凝集した人工多能性幹細胞に神経上皮細胞誘導（ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）培地を添加して神経上皮細胞を誘導し、
神経外胚葉（ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ）分化培地を添加し、神経上皮細胞から神経外胚葉組織に分化させ、
前記神経外胚葉組織に神経上皮芽誘導培地を添加し、神経上皮芽を増殖させ、
前記増殖した神経上皮芽に脳組織誘導培地を添加し、脳組織を形成させることを含むことができる。

前記胚体とは、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞を他の細胞に分化させるためにスフェロイド形態にする過程を意味する。

前記ハイドロゲルは、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）に基づくハイドロゲルであってもよい。

前記細胞外マトリックスに基づくハイドロゲルは、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、製品名）であってもよい。

前記脳オルガノイドの大きさは０．８～１．３ｍｍであってもよい。好ましくは１ｍｍ以下であってもよい。

前記３次元細胞培養プレートのサブウェルは、凹部に向かってテーパ状になるように傾斜面が形成され、前記サブウェル１２０の上端径は、３．０～４．５ｍｍの範囲であり、前記凹部１２１の上端径は０．４５～１．５ｍｍの範囲であり、前記サブウェルと凹部の傾斜面（θ２）は、４０～５０°の範囲であり、前記サブウェルの直径と凹部の直径に対する長さの比は、１：０．１～０．５の範囲であってもよい。

前記３次元細胞培養プレートの前記メインウェルの個々の体積は、１００～３００μｌの範囲であり、前記凹部の個々の体積は、２０～５０μｌの範囲であり、前記メインウェルと凹部の個々の体積比は、平均１：０．１～０．５であってもよい。

前記メインウェルは、段差とサブウェルとの間に空間部を含み、前記空間部の高さ（ａｈ）は平均２．０～３．０ｍｍの範囲であり、前記サブウェルの高さ（ｂｈ）は平均１．０～２．０ｍｍの範囲であり、前記空間部とサブウェルの高さの比（ａｈ：ｂｈ）は、１：０．３～１の範囲であってもよい。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明は、様々な変更を加えることができ、様々な実施例を有することができるので、特定の実施例を図面に例示し、詳細な説明に詳細に説明する。

しかし、これは本発明を特定の実施例に限定することを意図するものではなく、本発明の思想及び技術的範囲に含まれるすべての変更、均等物ないし代替物を含むことを理解すべきである。本発明の説明において、関連する公知技術の具体的な説明が本発明の要旨を不明瞭にするおそれがあると判断される場合には、その詳細な説明は省略する。

本出願で使用される用語は、単に特定の実施例を説明するために使用されたものであって、本発明を限定することを意図するものではない。単数表現は、文脈上明らかに他に意味がない限り、複数表現を含む。

本発明において、「含む」又は「有する」などの用語は、明細書上に記載された特徴、数字、工程、動作、構成要素、部品、又はそれらを組み合わせたものが存在することを指定するためのものであって、１つ又はそれ以上の他の特徴や数字、工程、動作、構成要素、部品、又はそれらを組み合わせたものの存在又は付加の可能性を予め排除しないものと理解されるべきである。

一般に、細胞、スフェロイド、オルガノイドなどを培養する際、細胞外マトリックスの役割を担うためにハイドロゲルが使用された。一般的に２次元プレートや３次元プレートを用いて人工多能性幹細胞をリプログラミングしたとき、細胞外マトリックスに基づくドロゲル（例えば、マトリゲル）を細胞培養プレートにコーティングして使用する。

しかし、本発明は、ハイドロゲルを含まない３次元細胞培養プレートを用いて人工多能性幹細胞を作製し、これを用いて脳オルガノイド方法を提供する。まず、本発明の３次元細胞培養プレートについての具体的な説明は、以下の通りである。

本発明は、一実施例では、以下を含む３次元細胞培養プレートを用いる。
３次元細胞培養プレートは、複数個のメインウェル（ｍａｉｎ ｗｅｌｌ）と、メインウェルのそれぞれの下部に形成され、細胞培養液が注入され、底面に凹部を含む複数個のサブウェル（ｓｕｂ ｗｅｌｌ）とを含むウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）と、
ウェルプレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタと、を含み、
前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、ウェルプレートの下端と互いに着脱可能に固定手段が備えられたベースと、ウェルプレートの上部に配置され、ベースと結合されるカバーとを含み、
前記メインウェルは、所定の部位にテーパ状になるように段差が形成され、前記段差はメインウェルの壁に対して１０～６０°の範囲の傾斜角（θ）を有する。

従来の９６ウェルプレートの場合、高収率の薬剤の効能を評価するために、実験及び解析を数回以上行う必要があったため、時間及びコストがかかるという問題があった。さらに、細胞培養時に培養液を交換するピペッティング作業を行うことがしばしばあるが、従来のＣｏｒｎｉｎｇスフェロイドマイクロプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）の場合、細胞培養中のスフェロイド又はオルガノイドに影響を与えて、ピペッティング作業時にスフェロイド又はオルガノイドが吸い上がったり、位置が変わったりするといったことがあるので、細胞培養環境に好ましくない問題があった。

そこで、本発明は上述のような課題を解決するためになされたものであって、ウェルプレート内に形成された複数個のメインウェル内に複数個のサブウェルを含ませ、高収率のスフェロイド／オルガノイドを作製することが可能であり、プレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタを含ませ、大容量の高速画像撮影時の公差を狭めて、ウェルプレート内の画像を均一に撮影できる細胞培養プレートを提供する。さらに、メインウェルの段差によって、培養される細胞は、培地交換時のピペッティング作業による影響を最小限に抑えられる細胞培養プレートを提供する。

以下に添付の図面を参照して本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。説明に先立って、本明細書及び特許請求の範囲で使用される用語又は単語は、通常又は辞書の意味に限定されて解釈されるべきではなく、発明者は、自身の発明を最も最良の方法で説明するために用語の概念を適切に定義できるという原則に基づいて、本発明の技術的思想に符合する意味や概念として解釈されなければならない。

従って、本明細書に記載された実施例と図面に示される構成は、本発明の最も好ましい一実施例に過ぎず、本発明の技術的思想をすべて代弁するものではないので、本出願時点においてこれらを代替できる様々な均等物と変形例があり得ることを理解すべきである。

図１（ａ）は、本発明の一実施例による細胞培養プレートの正面図であり、図１（ｂ）は、本発明の一実施例による細胞培養プレートの断面図であり、図２は、本発明の一実施例による細胞培養プレートに形成されたメインウェルを詳細に示す図であり、図３は、本発明の一実施例による細胞培養プレートのウェルプレート、ベース及びカバーを示す図である（（a）カバー、（b）ベース、（ｃ）マイクロプレート及びベースの固定手段）。

以下、図１～図３を参照して本発明の一実施例による細胞培養プレートを詳細に説明する。

図１～図３に示すように、本発明の一実施例による細胞培養プレート１０は、複数個のメインウェル１１０と、メインウェル１１０のそれぞれの下部に形成され、細胞培養液が注入され、底面に凹部１２１を含む複数個のサブウェル１２０を含むウェルプレート１００と、ウェルプレート１００を支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタ２００とを含んで構成される。

まず、図１及び図２を参照して、本発明の一実施例によるウェルプレート１００を詳細に説明する。

前記ウェルプレート１００は、モールドを介してプラスチック射出成形されたプレート状に製造される。このようなプラスチック射出用モールドは、メインウェル１１０をウェル構造物として繰り返しパターンを持たせることで、産生単価を下げ、微細加工による大きさの拡大化を容易にすることによって 製造することができる。これによって、細胞の大量産生が容易であり、使用者のニーズに合わせて様々な大きさに変形して使用することが可能である。

前記メインウェル１１０は、ウェルプレート１００に複数個形成されており、それぞれのメインウェル１１０は、段差１０１を含む。前記段差１０１は、メインウェル１１０の所定の部位に形成されるものであって、より詳細には、前記段差１０１は、メインウェル１１０の全長の１／３～１／２の位置に形成されてもよく、前記段差１０１は、メインウェル１１０の下端から１／３～１／２の位置に形成されてもよい。

従来、マイクロプレートにて細胞を培養する際には培養液を交換するピペッティング作業を行う場合があるが、このような場合、細胞培養中のスフェロイド又はオルガノイドに影響を与えて、ピペッティング作業時にスフェロイド又はオルガノイドが吸い上がったり、位置が変わったりするといったことがあるので、細胞培養環境に好ましくない問題があったが、前記段差１０１をこのような問題を防止するために設けた。

前記段差１０１は、ピペットが適用される空間であってもよく、具体的には、メインウェル１１０の壁に対して１０～６０°の範囲の傾斜角（θ）を有してもよい。又は、２０～５０°の範囲の傾斜角を有してもよく、好ましくは３０～４５°の範囲の傾斜角を有してもよい。もし、前記段差１０１の傾斜角が１０°未満である場合には、メインウェル１１０内に傾斜角が小さすぎてピペットを適用できる空間が十分でないため、メインウェル１１０内の培養液を吸入する際、ピペットがサブウェル１２０の内側に滑ってしまい、スフェロイド又はオルガノイドが吸い上がったり、位置が変わったりすることがある。併せて、前記傾斜角（θ）が６０°を超える場合にはピペットを適用できる空間は確保できるが、段差１０１の傾斜角が大きいすぎて培養液を十分に吸入することが困難な場合があり、サブウェル１２０に細胞を播種する際、細胞が全部のサブウェル１２０に入り込まず、段差１０１に播種される問題が発生するおそれがある。従って、上述した範囲の傾斜角を有することが好ましい。

なお、本発明の一実施例によるメインウェル１１０は、段差１０１と後述するサブウェル１２０との間に空間部１３０を含むことができる。具体的には、前記空間部１３０は、培養液が注入される空間であって、サブウェル１２０内部の細胞が同じ培養液を共有できる空間である。

より具体的には、空間部１３０の高さ（ａｈ）は、平均２．０～３．０ｍｍの範囲であってもよく、２．２～２．８ｍｍの範囲であってもよく、又は平均２．３～２．７ｍｍの範囲であってもよい。さらに、サブウェル１２０の高さ（ｂｈ）は、平均１．０～２．０ｍｍの範囲であってもよく、又は平均１．２～１．８ｍｍの範囲であってもよい。

例えば、前記空間部１３０の高さ（ａｈ）は平均２．５ｍｍであり、サブウェルの高さ（ｂｈ）は平均１．５ｍｍであってもよい。

このとき、前記空間部とサブウェル１２０との高さの比（ａｈ：ｂｈ）は、１：０．３～１の範囲であってもよく、より詳細には、空間部とサブウェル１２０の高さの比（ａｈ：ｂｈ）は、１：０．４～０．９又は１：０．５～０．８であってもよい。もし、サブウェル１２０の高さが空間部の高さに対して１：０．３未満である場合には、サブウェル１２０の培地を交換する際、小さな力でも内部で培養中の細胞が抜け出すことがあり、サブウェル１２０の高さが空間部の高さに対して１：１を超える場合、細胞に必要な培養液が十分に変換されずに細胞死が誘発される可能性がある。従って、空間部１３０とサブウェル１２０は、上述した高さの範囲と高さの比を有することが好ましい。

次に、サブウェル１２０は、メインウェル１１０のそれぞれの下部に形成されるものであって、底面に凹部１２１を含む。特定の態様として、前記サブウェル１２０は、メインウェル１１０の下部に複数個を含むことができる。

メインウェル１１０の下部に含まれるサブウェル１２０は、それぞれの大きさと形状が同じであり、これにより均一な条件のスフェロイド及びオルガノイドを生成することができる。

前記サブウェル１２０は、凹部１２１に向かってテーパ状になるように傾斜面を形成することができる。具体的には、前記サブウェル１２０の上端部は、垂直方向を基準に下降するほど水平幅が小さくなることがある。例えば、前記サブウェル１２０の上端部は、逆ピラミッド状からなることができる。図示の実施例では、サブウェル１２０の上端部がピラミッド状又は漏斗状のように、垂直方向に下降するほど水平幅が小さくなる形状からなることができる。

特に、前記サブウェル１２０は、大きさと形状が同じであるように複数個含むことによって、前記細胞培養プレートは均一な条件で大量のスフェロイド又はオルガノイドを生成することができる。

特定の態様として、１つのメインウェル１１０には同じ大きさのサブウェル１２０を４～２５個含むことができ、全マイクロプレート１００には９６～１，７２８個のサブウェル１２０を含むことができる。これにより同一で、精密に大きさを制御することが可能である。

加えて、サブウェル１２０は、凹部１２１を含み、前記凹部の下端において前記凹部１２１は３Ｄスフェロイド又はオルガノイドを培養できるように空間が形成される。具体的には、前記凹部１２１は、「Ｕ字状」、「Ｖ字状」、又は「Ц字状」であってもよく、例えば、前記凹部１２１は「Ｕ字状」であってもよい。

前記サブウェル１２０の上端径は、３．０～４．５ｍｍの範囲であってもよく、又は３．５～４．３ｍｍであってもよく、又は平均４ｍｍであってもよい。さらに、凹部１２１の上端径は０．４５～１．５ｍｍであってもよく、又は０．５～１．０ｍｍ又は平均０．５ｍｍであってもよい。

加えて、前記サブウェル１２０の直径と凹部１２１の直径に対する長さの比は、１：０．１～０．５の範囲であってもよく、好ましくは前記サブウェル１２０の直径と凹部１２１の直径に対する長さの比は１：０．１２であってもよい。

前記凹部１２１の上端径がサブウェル１２０の上端径１に対して０．１未満である場合に凹部１２１の細胞培養空間を十分に確保することができず、培養液交換時に、小さな力でも細胞が抜け出る問題が発生することがあり、凹部１２１の上端径がサブウェル１２０の上端径１に対して０．５を超えると、細胞に必要な十分な培養液を交換できず、安定的に培養することが難しい問題が発生するおそれがある。

一方、メインウェルの壁を基準にサブウェル１２０と凹部１２１の傾斜面は４０～５０°の傾斜角（θ２）を有してもよく、４２～４８°の範囲の傾斜角（θ２）、 ４３～４７°の範囲の傾斜角（θ２）又は平均４５°の傾斜角（θ２）を有してもよい。

上述したサブウェル１２０は、１００～１０００ｃｅｌｌs／ｗｅｌｌ以下の細胞培養が可能であり、安定的にスフェロイドの大きさを制御できる利点がある。

さらに、本発明の一実施例によるメインウェル１１０の個々の体積は１００～３００μｌの範囲であり、凹部１２１の個々の体積は２０～５０μｌの範囲であり、前記メインウェル１１０と凹部１２１の個々の体積比は平均１：０．０７～０．５であることを特徴とする。好ましくは、前記一実施例によるメインウェル１１０の個々の体積は２５０～３００μｌの範囲であり、前記凹部の個々の体積は２５～３５μｌの範囲であってもよく、前記メインウェル１１０と凹部１２１の個々の体積比は平均１：０．１１であってもよい。

具体的には、メインウェル１１０の個々の体積が１００μｌ未満の場合、細胞培養時に十分な培養液を収容できない問題が発生することがあり、３００μｌを超える場合には、培養効率が低下する可能性がある。

併せて、凹部１２１は実質的な細胞が培養される空間であって、その体積が２０μｌ未満の場合には細胞培養空間が十分でないため、細胞が抜け出る問題が発生することがあり、５０μｌを超えると細胞等を安定して培養することが困難な問題が発生するおそれがある。従って、前記メインウェル１１０と凹部１２１は、上述した範囲の体積を有することが好ましい。

前述の本発明の細胞培養プレートの構成により、ハイドロゲルを含まなくても、即ち、ハイドロゲルを細胞培養プレートにコーティングしなくても人工多能性幹細胞へのリプログラミングが高効率で起こり、リプログラミング後にオルガノイドも良好に形成される。

本発明の一実施例による細胞培養プレート１０は、ウェルプレート１００を支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタ２００を含む。ここで、ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタ２００とは、ＨＣＳ（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）システムに装着するコネクタ２００を意味するものであり、具体的には、前記コネクタ２００は本発明ではベース２１０とカバー２２０を意味することができる。

より具体的には、前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、ウェルプレート１００の下端と互いに着脱可能な固定手段１４０、２４０が備えられたベース２１０とウェルプレート１００の上部に配置し、ベース２１０と結合されるカバー２２０を含む。そして、前記ベース２１０の上端及びウェルプレート１００の下端は、互いに着脱可能に固定可能な固定手段１４０、２４０を含むことを特徴とする。

このとき、前記ベースは、ウェルプレート１００を支持するための凸部２４０を含み、前記ウェルプレート１００は、ベース２１０の凸部２４０に対向する落とし込み部１４０を含むことができる。前記固定手段によってウェルプレート１００を固定し、スクリーニング時に画像を均一に撮影することができる。

前記ベースは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルエーテルケトン又はポリエーテルイミド材料からなることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。

前記ウェルプレートは、ポリジメチルシリコーン、高脂肪変性シリコーン、メチルクロロフェニルシリコーン、アルキル変性シリコーン、メチルフェニルシリコーン、シリコーンポリエステル、又はアミノ変性シリコーン材料からなることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。

一方、本発明の細胞培養プレート１００において人工多能性幹細胞を形成する際にマトリゲルを使用する必要がない。

図４は、マトリゲルを用いた２次元細胞培養プレート、及び本発明によるマトリゲルを必要としない３次元細胞培養プレートを用いた人工多能性幹細胞の製造方法を比較して示したものである。体細胞（繊維芽細胞）を培養した後、エピソーマルベクターを電気穿孔法により線維芽細胞にトランスフェクトしてリプログラミングを誘導し、人工多能性幹細胞を作製する。２次元マトリゲル培養の場合、人工多能性幹細胞コロニーを切り離す過程が煩わしく、収率が低い。しかし、本発明の３次元培養プレートを用いる場合、マトリゲルがないので人工多能性幹細胞にリプログラミングされた多数の単一細胞等が集まり、３次元球状の細胞集合体であるスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成する。このスフェロイドは、３次元細胞培養プレートに容易に分離することができ、継代培養が可能である（図７ｄ）。即ち、リプログラミング効率が非常に高い。

また、前述したように、本発明で用いる３次元細胞培養プレートは、１つのメインウェル１１０に同じ大きさのサブウェル１２０を４～２５個含むことができ、全マイクロプレート１００には９６～１，７２８個のサブウェル１２０を含むことができる。これにより、同一で、精密に大きさを制御可能な人工多能性幹細胞及びそのスフェロイドを大量製造することができる。

図１０は、人工多能性幹細胞リプログラミング工程で得られた人工多能性幹細胞スフェロイドの大量増殖及び細胞分化誘導工程を模式的に示す図である。本発明の３次元細胞培養プレートを用いると、人工多能性幹細胞の増殖速度が非常に速いことが分かる。また、スフェロイドを単一細胞に分離して再び播種した後、継代培養を続けると、均一な大きさのモノクローナルのスフェロイドが数百個ないし数千個生成されるので、人工多能性幹細胞スフェロイドバンクを生成することもできる。このバンクを用いて細胞分化を誘導することができるが、本発明は神経分化を誘導することにより脳オルガノイドを作製したものである。

本発明の製造方法によれば、ハイドロゲルを必要とせずにリプログラミング効率が増進された人工多能性幹細胞を製造した後、それを用いて脳オルガノイドを作製することができる。さらに、本発明による脳オルガノイドは、大きさが１３ｍｍ以下と非常に小さい超小型脳オルガノイドである。

図１（ａ）は、本発明の一実施例による細胞培養プレートの正面図であって、図１（ｂ）は、本発明の一実施例による細胞培養プレートの断面図である。

本発明の一実施例による細胞培養プレートに形成されたメインウェルを詳細に示す図である。

本発明の一実施例による細胞培養プレートのウェルプレート、ベース及びカバーを示す図である（（ａ）カバー、（ｂ）ベース、（ｃ）マイクロプレート及びベースの固定手段）。

図４（ａ）は、本発明の一実施例と比較例による人工多能性幹細胞の製造過程を模式的に示したものであり、図４（ｂ）は本発明の一実施例と比較例による人工多能性幹細胞の発生を示す画像である（図４以下の全ての図において、説明の便宜上、本発明の３次元細胞培養プレートを正確に表示せず、便宜上、Ｕ字状に表示した。）

本発明の一実施例（３Ｄ ｉＰＳＣ）と比較例（２Ｄ ｉＰＳＣ）画像である。

本発明の一実施例（３Ｄｓｐｈ－ｉＰＳＣ）と比較例（２Ｄ Ｍａｔｒｉｇｅ）のＡＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色画像である。

図７（ａ）は、経時的なＡＰ画像（Ｄ４、Ｄ９、Ｄ１５、Ｄ２１）であり、図７（ｂ）は、コロニー数を比較したものであり、図７（ｃ）は、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ発現結果であり、図７（ｄ）は、ｉＰＳＣｓのスフェロイドの形成過程を示したものである。

図８（ａ）は、従来の３次元培養と本発明の一実施例による培養結果のスフェロイド（コロニー）の大きさの分布を示す結果であり、図８（ｂ）は、リプログラム因子（多能性マーカー）発現結果である。

本発明の一実施例によるｉＰＳＣｓの多能性マーカー発現の結果である。

人工多能性幹細胞リプログラミング工程で得られた人工多能性幹細胞スフェロイドの大量増殖及び細胞分化誘導工程を模式的に示す図である。

本発明の一実施例による脳オルガノイドの形成過程を模式的に示す図である。

図１２（ａ）は、本発明の一実施例により製造された経時的な脳オルガノイド画像であり、図１２（ｂ）は、本発明の一実施例による１つの細胞培養プレートで大量培養し、且つ、均一な大きさで培養される脳オルガノイド画像を示し、図１２（ｃ）は、経時的な脳オルガノイドの大きさの変化を示すグラフである。

本発明の一実施例によるマトリゲル非存在下で形成された脳オルガノイド画像である。

図１４（ａ）は、非特許文献３の方法により作製された脳オルガノイドの染色画像であり、図１４（ｂ）は、本発明の一実施例に従って形成された脳オルガノイド染色画像である。

図１５（ａ）は、脳オルガノイド免疫染色解析の結果であり、図１５（ｂ）は、脳オルガノイド遺伝子発現解析の結果である。

本発明は、様々な形態に変更することができ、様々な実施例を有することができるところ、以下に特定の実施例を図面に例示し、詳細な説明にて詳細に説明する。しかしながら、これは本発明を特定の実施形態に限定することを意図するものではなく、本発明の精神及び技術的範囲に含まれるすべての変形、等価物ないし代替物を含むことを理解されなければならない。本発明の説明において、関連する公知技術の具体的な説明が本発明の要旨を不明瞭にするものと判断される場合、その詳細な説明は省略する。

実施例１．実験方法

１－１：線維芽細胞の培養及び人工多能性幹細胞の作製

ヒト線維芽細胞株であるＦ１３４（ｔｈｅ ｇｅｒｍａｎ ｆｅｄｅｒａｌ ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ／ＲＫＩ：ＡＺ １７１０－７９－１－４－４１ Ｅ０１）を１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）及び１ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）含むＤＭＥＭ中で３５ｍｍ又は１００ｍｍのペトリ皿に培養した。培養した線維芽細胞にエピソームｉＰＳＣリプログラミングベクター（ＥＰ５ＴＭ ｋｉｔ：カタログ番号Ａ１６９６０．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によりトランスフェクションさせ（ＮｅｏｎＴＭ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）、リプログラミングした。電気穿孔法は、１６５０Ｖ、１０ｍｓ、３パルス条件で行った。

図４ａに示すように、トランスフェクトされた線維芽細胞を本発明の３次元細胞培養プレート（マトリゲルなし、実施例）と２次元の１２ウェルプレート（マトリゲルコーティング、比較例１）及び市販製品であるＡｄｄｇｅｎｅ（比較例２、マトリゲルコーティング、図４ａには図示せず）に接種し、Ｎ２Ｂ２７培地（ｂＦＧＦを含む）で培養した。１５日間培養した後、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ培地と交換した。１５日後に実施例（３次元細胞培養プレート）の３Ｄ ｉＰＳＣを２次元プレートである１２ウェルプレートにプレーティングし、実施例と比較例のコロニー数を確認した。

１－２：線維芽細胞のリプログラミング効率の解析

Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔマニュアルに従って（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）、リプログラムされた細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した後、Ｂｌｕｅ－ｃｏｌｏｒ ＡＰ溶液で染色し、ＰＢＳで２回洗浄した後、コロニー染色有無を光学顕微鏡下で観察した。染色されたコロニーの数を数えて定量化した。

実施例と比較例で培養した細胞を撮影し、細胞球の大きさを比較した。スフェロイドを自動プレート機器によりイメージングを行い、この時、自動に機器が焦点を合わせて進めるようにした。画像の大きさの解析は、ｉｍａｇｅＪプログラムのマクロプログラムを用いて行った（図５、６及び７関連）。

１－３：人工多能性幹細胞の３次元培養方法の最適化

実施例と比較例で培養した３次元人工多能性幹細胞を撮影しており、これにより細胞球の大きさをそれぞれ比較して測定した（図８（a））。画像の結果をテストするために、外部検査会社（細胞バイオＣＥＦＯ、韓国）に依頼し、このテストはブラインドテストで進められた。

１－４：免疫染色

リプログラムされた細胞を４％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定した。固定細胞を１％ＢＳＡ及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳで室温で１時間反応させた後、各一次抗体Ｏｃｔ４（１：１００、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｓｏｘ２（１：１００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）、Ｎａｎｏｇ（１：２００、Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ、Ｋｏｔｏ－Ｋｕ、Ｊａｐａｎ）、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（１：２００、ａｂｃａｍ）処理し、ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ又はａｎｔｉ－マウスＩｇＧ（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を二次抗体で反応させた。蛍光画像を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｓｈｉｎｊｕｋｕ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で解析した。ＤＡＰＩを核染色溶液として使用した。

１－５：ｑＰＣＲ

線維芽細胞とリプログラミングされた細胞からＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した後、Ａｃｃｕｐｏｗｅｒ ＲＴ ｍｉｘ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｃｏｒｐ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡにした。リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を用いて行った。本発明で使用されるプライマー配列は、表１の通りである

１－６：脳オルガノイドの作製と解析

リプログラミングされたｉＰＳＣ細胞を用いて３次元脳オルガノイドを作製した。直径３ｍｍの本発明による細胞培養プレートに、１ウェル当たり９，０００個のｉＰＳＣ細胞を初期播種し、培養液の組成を調節して脳オルガノイドを培養した。各培養工程における培養液の組成は、ＭＡ Ｌａｎｃａｓｔｅｒの論文（非特許文献１）に従っており、ただし、マトリゲルを用いずに培養した（図１１参照）。

免疫染色法と遺伝子発現解析により作製された脳オルガノイドの特性を解析した。免疫染色のために１ｍｍ以上のオルガノイドを４％ＰＦＡを用いて固定した後、１５％、３０％スクロースに十分に浸漬する。次に、Ｏ．Ｃ．Ｔコンパウンドに脳オルガノイドを移した後、急速冷凍してブロックを作製した。クライオトークを用いて約１０～１５μｍの厚さにオルガノイドを切断した後、既存の２次元免疫染色法を用いて染色した（ＦＯＸＧ１（１：５００、Ａｂｃａｍ）、ＭＡＰ２（１：５００、Ａｂｃａｍ））。

培養した脳オルガノイドからＲＮＡ抽出キット（ＲＮＥａｓｙ ｐｌｕｓ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した（Ｈｉｇｈ－ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ ｋｉｔ、Ｓｔｅｐｏｎｅ ｐｌｕｓ）。表２に示すように設計されたプライマーを用いて、当該遺伝子発現レベルをＲＴ－ＰＣＲを用いて解析した。

実施例２．幹細胞リプログラミング効率の確認

図４ｂをみると、２次元培養の場合、Ｄ１５になって初めて少量のコロニーが形成され始めることが分かる。Ｄ１５までｉＰＳＣリプログラミング誘導後、３ＤｉＰＳＣを２次元プレートにプレーティングし、比較例１と実施例１のコロニー数を比較してみたところ、形成されるコロニー数の差が大きかった。ｉＰＳＣで十分に分化した細胞がコロニーを形成するため、実施例のｉＰＳＣリプログラミング収率が高いことがわかる。図５及び図７ｂをみると、２次元培養（比較例１）と３次元培養時（実施例）において、コロニーの個数の差が非常に大きいことが分かる。図６をみると、ＡＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色の結果、３Ｄ ｉＰＳＣスフェロイド（実施例、３Ｄｓｐｈ－ｉＰＣＳ）においてリプログラミング効率が非常に高いことがわかる。また、図６及び図７ａをみると、２Ｄマトリゲル（比較例１）と３ＤｉＰＳＣスフェロイド（実施例、３Ｄ ｓｐｈ－ｉＰＣＳ）とを比較したとき、画像が均一で鮮明に示されるが、これは本発明の３次元細胞培養プレートが大量の画像解析が可能であることを示すものである。

図７ｃをみると、３次元細胞培養プレートにおけるリプログラミング効率が非常に良好であることが分かる。また、図７ｄをみると、本発明はマトリゲルを用いないので、ｉＰＣＳｓにリプログラミングされた多数の単一細胞が集まって３次元球状の細胞集合体であるスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成し、このスフェロイドを３次元細胞培養プレートから容易に分離し、再播種することができることが分かる。即ち、リプログラム効率が非常に高い。

図８は、比較例２の従来の３次元培養と本発明の実施例の３次元培養（図８ｂのＳｐｈｅｒｏｉｄＦｉｌｍ）とを比較したものである。従来の３次元培養は大きさが均一ではなく、ｏｃｔ４発現量が比較的低い。しかしながら、本発明は、大きさが非常に均一であり（９９．４５％）、リプログラミング因子発現率が非常に高かった。即ち、従来の３次元培養と比較した場合でも、本発明は幹細胞培養において効果的であり、体細胞を人工多能性幹細胞にリプログラミングできる効率を高くすることができる。また、大きさが均一であるということは、標準化された人工多能性幹細胞及び幹細胞をスフェロイド形態で３次元的に大量に製造できることを意味する。

実施例３．幹細胞の特性の解析

図９をみると、本発明に従って製造されたｉＰＳＣｓは、多能性マーカーの発現が非常に高いことが分かる。

実施例４．脳オルガノイドの作製及び特性の評価

４－１：脳オルガノイドの作製

図１０に示すように、本発明により製造されたｉＰＳＣｓを継代培養する場合、大量増殖が可能であることが分かる。また、このように製造されたｉＰＳＣｓを脳オルガノイドの作製に用いることができることを示す。

図１１に示すように、各工程における脳オルガノイドの作製方法について説明する。幹細胞を胚芽体（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｂｏｄｙ）にする工程、神経外胚葉細胞（ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）を誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）する工程、ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌに分化させる工程、神経外胚葉芽（ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｂｕｄ）を増進させる工程、最終的に脳オルガノイドを分化する工程に分かれている。このようにして作製された工程の後、分化培地により培養される工程を経る。

４－２：脳オルガノイドの特徴の解析

図１２に示すように、本発明により製造された脳オルガノイドは均一な大きさで生成されることが分かる。図１２（ｂ）は、本発明の細胞培養プレートが高速大容量イメージングが可能であることを裏付ける写真である。本発明によるオルガノイドの作製方法は、マトリゲルを使用しないので経済的で、ミニ脳オルガノイドであるため、大してスペースをとらないという長所がある。

図１３は脳オルガノイド培養写真であるが、多様な器官が混在していないことを確認することができる。初期細胞播種後、２日以内に約５００μｍの直径を有する均一な大きさの胚様体が形成され、神経分化が進むにつれてオルガノイドの外側に透明な神経上皮が形成されることが確認された（培養１２日目）。約４０日間培養した脳オルガノイドの断面をＨ＆Ｅ染色によって確認したところ、外側に神経ロゼット構造が見られた。

図１４（ａ）に示すように、皮質板（ｃｏｒｔｉｃａｌ ｐｌａｔｅ）と神経細胞の位置がそれぞれ異なり、１つのオルガノイド内でも神経細胞がランダムに成長していることが分かる。しかし、図１４（ｂ）に示すように、皮質板と神経細胞の位置が均一であり、１つのオルガノイドと複数個のオルガノイドでそれぞれ均一な脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ）を確認することができる。

図１５は、本発明の一実施例によるマトリゲル非存在下で４０日間脳オルガノイドを解析した結果である。免疫染色解析の結果（ａ）、Ｆｏｘｇ１が前脳（Ｆｏｒｅｂｒａｉｎ）で発現されることを確認した。遺伝子発現解析の結果（ｂ）、ｉＰＳＣの多能性マーカーであるＯｃｔ４の発現は分化するにつれて減少し、深層で発現される神経マーカーであるＴＢＲ１とＣｔｉｐ２の発現は増加することが確認された。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に説明したが、この技術分野における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい実施形態に過ぎず、これにより本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義される。

１００：ウェルプレート
１０１：段差
１１０：メインウェル
１２０：サブウェル
１２１：凹部
１３０：空間部
１４０：落とし込み部
２００：ハイコンテントスクリーニング用コネクタ
２１０：ベース
２２０：カバー
２４０：凸部

Claims (9)

1. 脳オルガノイドの作製方法であって、
   ｉ）体細胞を培養する工程と、
   ｉｉ）人工多能性幹細胞の製造のためのハイドロゲルを含まない３次元細胞培養プレートを準備する工程と、
   ｉｉｉ）培養された前記体細胞を、前記ハイドロゲルを含まない３次元細胞培養プレートで前記人工多能性幹細胞にリプログラミングさせて前記人工多能性幹細胞を製造する工程と、
   ｉｖ）前記人工多能性幹細胞を、前記ｉｉｉ）の３次元細胞培養プレートから分離する工程と、
   ｖ）前記脳オルガノイドを形成するためにハイドロゲルがコーティングされていない３次元細胞培養プレートを準備する工程と、
   ｖｉ）分離された前記人工多能性幹細胞を、ハイドロゲルを含まない３次元細胞培養プレートで培養して脳オルガノイドを形成する工程と、を含み、
   前記３次元細胞培養プレートは、
   複数個のメインウェル（ｍａｉｎ ｗｅｌｌ）と、前記メインウェルのそれぞれの下部に形成され、細胞培養液が注入され、底面に凹部を含む複数個のサブウェル（ｓｕｂ ｗｅｌｌ）と、を含むウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）と、
   ウェルプレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタと、を含み、
   前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、
   前記ウェルプレートの下端に互いに着脱可能に固定手段が備えられたベースと、
   前記ウェルプレートの上部に配置され、前記ベースと結合されるカバーと、を含み、
   前記メインウェルは、所定の部位がテーパ状になるように段差が形成され、
   前記段差は、前記メインウェルの壁に対して１０～６０°範囲の傾斜角（θ）を有する、
   脳オルガノイドの作製方法。
2. 前記脳オルガノイドの形成工程は、
   前記人工多能性幹細胞を胚様体（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｂｏｄｙ）にした後、凝集した前記人工多能性幹細胞に神経上皮細胞誘導（ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）培地を添加し、神経上皮細胞を誘導する工程と、
   神経外胚葉（ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ）分化培地を添加し、神経上皮細胞から神経外胚葉組織に分化させる工程と、
   前記神経外胚葉組織に神経上皮芽誘導培地を添加し、神経上皮芽を増殖させる工程と、
   増殖した前記神経上皮芽に脳組織誘導培地を添加し、脳組織を形成させる工程と、を含む、請求項１に記載の脳オルガノイドの作製方法。
3. 前記ハイドロゲルは、細胞外マトリックスに基づくハイドロゲルである、請求項１に記載の脳オルガノイドの作製方法。
4. 前記細胞外マトリックスに基づくハイドロゲルは、マトリゲルである、請求項３に記載の脳オルガノイドの作製方法。
5. 前記脳オルガノイドの大きさは、０．８～１．３ｍｍである、請求項１に記載の脳オルガノイドの作製方法。
6. 前記脳オルガノイドは、１ｍｍ以下である、請求項１に記載の脳オルガノイドの作製方法。
7. 前記サブウェルは、前記凹部に向かってテーパ状になるように傾斜面が形成され、
   前記サブウェル（１２０）の上端径は、３．０～４．５ｍｍの範囲であり、
   前記凹部（１２１）の上端径は、０．４５～１．５ｍｍの範囲であり、
   前記サブウェルと前記凹部の前記傾斜面（θ２）は、４０～５０°の範囲であり、
   前記サブウェルの直径と前記凹部の直径に対する長さの比は、１：０．１～０．５の範囲であることを特徴とする、請求項１に記載の脳オルガノイドの作製方法。
8. 前記メインウェルの個々の体積は、１００～３００μｌの範囲であり、
   前記凹部の個々の体積は、２０～５０μｌの範囲であり、
   前記メインウェルと前記凹部の個々の体積比は、平均１：０．１～０．５であることを特徴とする、請求項１に記載の脳オルガノイドの作製方法。
9. 前記メインウェルは、前記段差と前記サブウェルとの間に空間部を含み、
   前記空間部の高さ（ａｈ）は平、均２．０～３．０ｍｍの範囲であり、
   前記サブウェルの高さ（ｂｈ）は、平均１．０～２．０ｍｍの範囲であり、
   前記空間部と前記サブウェルの高さの比（ａｈ ：ｂｈ）は、１：０．３～１の範囲であることを特徴とする、請求項１に記載の脳オルガノイドの作製方法。

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