JP2023538206A - ハイドロゲルを用いない人工多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ハイドロゲルを用いない人工多能性幹細胞の製造方法を提供する。【選択図】図５
Description
本発明は、ハイドロゲルを用いない人工多能性幹細胞の製造方法に関する。より詳細には、３次元細胞培養プレートを用いてハイドロゲルを用いなくても体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法に関する。
分化した体細胞を未分化な状態の細胞（例えば、幹細胞）に戻す過程をリプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）という。人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）は、逆分化幹細胞、逆分化多能性幹細胞とも呼ばれ、リプログラミング因子（Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃなど）を用いて体細胞を幹細胞に変換するものである（非特許文献１及び２）。
人工多能性幹細胞は、細胞治療薬、生体組織工学、新薬開発、毒性学、及び精密医療に至るまでのその応用分野が幅広い。これらのアプリケーションのためには、高効率、高品質の人工多能性幹細胞及び胚幹細胞を培養する必要があり、均一な大きさで同じ効率の幹細胞が必要であるが、実際には、このような大量生産技術に対する研究は不十分であるのが実情である。また、未だ人工多能性幹細胞をリプログラミングする効率もまた非常に低いほうである。近年、臨床応用するための方法、即ち、外来遺伝子が内部に組み込まれないＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎされない方法について多くの研究が進められており、その中でもエピソーマルベクター（ｅｐｉｓｏｍａｌ ｖｅｃｔｏｒ）のような方法で人工多能性幹細胞の生産を試みているが、これら一連の製造方法は３次元培養方法の効率及び体細胞のリプログラミング効率も同様に低いという問題点がある。
また、人工多能性幹細胞リプログラミングのためには、２次元細胞培養プレートの底をハイドロゲルでコーティングして利用しているが、コロニーがうまく形成されず、細胞のリプログラミング後にコロニーが形成されたとしても、コロニーを分離することが容易でないので、事実上、研究目的だけでなく、商業化の支障となっている。また、既存の方法の場合、大量のクローンを作製することがほとんど不可能であり、既存の方法では人工多能性幹細胞にリプログラミングされた状態のクローンを安定的に確保することが困難である。また、人工多能性幹細胞を容易にスクリーニングできるプラットフォームも必要であるのが実情である。
一方、大韓民国登録特許第１０－１７５６９０１号（特許文献１）には、３次元の組織細胞を培養することが可能な細胞培養チップについて開示されている。前記特許文献１における細胞培養チップは、第１培養部、第２培養部及び第３培養部が各層別に形成されており、各層別に細胞増殖の進行度合いを確認することができる。しかしながら、特許文献１における細胞培養チップでは、スフェロイド及び／又はオルガノイドを高収率で得ることができないという問題点がある。
また、細胞培養時に培養液を交換するピペッティング作業を行う場合があるが、３次元細胞培養が可能なＣｏｒｎｉｎｇスフェロイドマイクロプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）の場合、細胞培養中のスフェロイド又はオルガノイドに影響を与えて、ピペッティング作業時に吸い上がったり、位置が変わったりするといったことがあるので、細胞培養環境には好ましくない問題がある。
マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）は、ＥＨＳ（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ）マウスの肉腫細胞から抽出されたタンパク質複合体であって、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）などの細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）と線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＥＦＧ）、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－ベータ（（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ、ＴＧＦ－β）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）などの成長因子を含む。マトリゲルをなす複合体は、多くの組織に見られる複雑な細胞外環境を提供することによって細胞培養のための基質として用いられている。
マトリゲルは、マウス肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）に由来するものであるため、免疫原や病原菌を移入するリスクが大きい。また、マトリゲルは、細胞増殖と組織形成に用いられているが、それだけ複雑な物質であるため、細胞の再現性に大きな問題があるという批判もある。マトリゲルが単純に成長するスフェロイドに物理的な支持を呈する受動的な３Ｄ足場として機能するのか、或いは生物学的に必須の要素を提供することによって、スフェロイド形成に積極的に影響を及ぼすのかどうかも不明である。また、マトリゲルは、その価格も非常に高価である。そのため、マトリゲルは細胞培養技術分野の発展に貢献してきた物質ではあるが、このマトリゲルが技術分野の発展の阻害原因となっているのも事実である。
そこで、本発明者らは、ハイドロゲルを用いずに人工多能性幹細胞のリプログラミング効率を高める技術について研究を重ねて本発明を完成するに至った。
Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｃｅｌｌ． ２００６；１２６：６６３－６７６．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ， Ｔａｎａｂｅ Ｋ，Ｏｈｎｕｋｉ Ｍ， Ｎａｒｉｔａ Ｍ，Ｉｃｈｉｓａｋａ Ｔ，Ｔｏｍｏｄａ Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ．２００７；１３１：８６１－８７２．
本発明の目的は、人工多能性幹細胞の製造方法を提供することである。
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、上述した課題に限定されるものではなく、言及されていない他の課題は、以下の記載から当該技術分野における通常の技術者に明確に理解されることができる。
前記課題を解決するために、本発明は、以下を含む人工多能性幹細胞の製造方法を提供する。
体細胞を培養する工程と、
前記培養された体細胞を、ハイドロゲルを含まない３次元細胞培養プレートで人工多能性幹細胞にリプログラミングさせる工程と、
を含む人工多能性幹細胞の製造方法であって、
前記３次元細胞培養プレートは、
複数個のメインウェル（ｍａｉｎ ｗｅｌｌ）と、メインウェルのそれぞれの下部に形成され、細胞培養液が注入され、底面に凹部を含む複数個のサブウェル（ｓｕｂ ｗｅｌｌ）とを含むウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）と、ウェルプレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタと、を含み、
前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、ウェルプレートの下端に互いに着脱可能に固定手段が備えられたベースと、ウェルプレートの上部に配置され、ベースと結合されるカバーと、を含み、前記メインウェルは、所定の部位がテーパ状になるように段差が形成され、前記段差は、メインウェルの壁に対して１０～６０°範囲の傾斜角（θ）を有する。
前記培養された体細胞を、ハイドロゲルを含まない３次元細胞培養プレートで人工多能性幹細胞にリプログラミングさせる工程と、
を含む人工多能性幹細胞の製造方法であって、
前記３次元細胞培養プレートは、
複数個のメインウェル（ｍａｉｎ ｗｅｌｌ）と、メインウェルのそれぞれの下部に形成され、細胞培養液が注入され、底面に凹部を含む複数個のサブウェル（ｓｕｂ ｗｅｌｌ）とを含むウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）と、ウェルプレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタと、を含み、
前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、ウェルプレートの下端に互いに着脱可能に固定手段が備えられたベースと、ウェルプレートの上部に配置され、ベースと結合されるカバーと、を含み、前記メインウェルは、所定の部位がテーパ状になるように段差が形成され、前記段差は、メインウェルの壁に対して１０～６０°範囲の傾斜角（θ）を有する。
前記体細胞は、線維芽細胞であってもよいが、必ずしもこれに限定されるものではなく、この技術分野で公知の体細胞であれば、いずれも使用可能である。
前記体細胞は、一般的な２次元ウェルプレート、３次元細胞培養プレート、又は本発明による３次元プレートで培養することができる。
前記ハイドロゲルは、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）に基づくハイドロゲルであってもよい。
前記細胞外マトリックスに基づくハイドロゲルは、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、製品名）であってもよい。
前記リプログラミング工程後に、前記リプログラミングされた人工多能性幹細胞のスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成する工程をさらに含むことができる。
前記３次元細胞培養プレートのサブウェルは、凹部に向かってテーパ状になるように傾斜面が形成され、前記サブウェル１２０の上端径は、３．０～４．５ｍｍの範囲であり、前記凹部１２１の上端径は０．４５～１．５ｍｍの範囲であり、前記サブウェルと凹部の傾斜面（θ２）は、４０～５０°の範囲であり、前記サブウェルの直径と凹部の直径に対する長さの比は、１：０．１～０．５の範囲であってもよい。
前記３次元細胞培養プレートの前記メインウェルの個々の体積は、１００～３００μｌの範囲であり、前記凹部の個々の体積は、２０～５０μｌの範囲であり、前記メインウェルと凹部の個々の体積比は、平均１：０．１～０．５であってもよい。
前記メインウェルは、段差とサブウェルとの間に空間部を含み、前記空間部の高さ（ａｈ）は平均２．０～３．０ｍｍの範囲であり、前記サブウェルの高さ（ｂｈ）は平均１．０～２．０ｍｍの範囲であり、前記空間部とサブウェルの高さの比（ａｈ：ｂｈ）は、１：０．３～１の範囲であってもよい。
前記体細胞は、前記細胞培養プレートのサブウェルに１００～１０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種することができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、様々な変更を加えることができ、様々な実施例を有することができるので、特定の実施例を図面に例示し、詳細な説明に詳細に説明する。
しかし、これは本発明を特定の実施例に限定することを意図するものではなく、本発明の思想及び技術的範囲に含まれるすべての変更、均等物ないし代替物を含むことを理解すべきである。本発明の説明において、関連する公知技術の具体的な説明が本発明の要旨を不明瞭にするおそれがあると判断される場合には、その詳細な説明は省略する。
本出願で使用される用語は、単に特定の実施例を説明するために使用されたものであって、本発明を限定することを意図するものではない。単数表現は、文脈上明らかに他に意味がない限り、複数表現を含む。
本発明において、「含む」又は「有する」などの用語は、明細書上に記載された特徴、数字、工程、動作、構成要素、部品、又はそれらを組み合わせたものが存在することを指定するためのものであって、１つ又はそれ以上の他の特徴や数字、工程、動作、構成要素、部品、又はそれらを組み合わせたものの存在又は付加の可能性を予め排除しないものと理解されるべきである。
一般に、細胞、スフェロイド、オルガノイドなどを培養する際、細胞外マトリックスの役割を担うためにハイドロゲルが使用された。人工多能性幹細胞の場合、２次元プレートで行う方法が一般的であり、細胞をリプログラミングするためには、細胞外マトリックスに基づくハイドロゲル（例えば、マトリゲル）を細胞培養プレートにコーティングして使用する。
しかし、本発明は、ハイドロゲルを含まない３次元細胞培養プレートを用いて人工多能性幹細胞を製造する方法を提供する。本発明の３次元細胞培養プレートについての具体的な説明は、以下の通りである。
本発明は、一実施例において、以下を含む３次元細胞培養プレートを用いる。
３次元細胞培養プレートは、複数個のメインウェル（ｍａｉｎ ｗｅｌｌ）と、メインウェルのそれぞれの下部に形成され、細胞培養液が注入され、底面に凹部を含む複数個のサブウェル（ｓｕｂ ｗｅｌｌ）を含むウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）と、
ウェルプレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタと、を含み、
前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、ウェルプレートの下端に互いに着脱可能に固定手段が備えられたベースと、ウェルプレートの上部に配置し、ベースと結合されるカバーと、を含み、
前記メインウェルは、所定の部位にテーパ状になるように段差が形成され、前記段差はメインウェルの壁に対して１０～６０°の範囲の傾斜角（θ）を有する。
ウェルプレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタと、を含み、
前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、ウェルプレートの下端に互いに着脱可能に固定手段が備えられたベースと、ウェルプレートの上部に配置し、ベースと結合されるカバーと、を含み、
前記メインウェルは、所定の部位にテーパ状になるように段差が形成され、前記段差はメインウェルの壁に対して１０～６０°の範囲の傾斜角（θ）を有する。
従来の９６ウェルプレートの場合、高収率の薬剤の効能を評価するために、実験及び解析を数回以上行う必要があったため、時間及びコストがかかるという問題があった。さらに、細胞培養時に培養液を交換するピペッティング作業を行うことがしばしばあるが、従来のＣｏｒｎｉｎｇスフェロイドマイクロプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）の場合、細胞培養中のスフェロイド又はオルガノイドに影響を与えて、ピペッティング作業時にスフェロイド又はオルガノイドが吸い上がったり、位置が変わったりするといったことがあるので、細胞培養環境に好ましくない問題があった。
そこで、本発明は上述のような課題を解決するためになされたものであって、ウェルプレート内に形成された複数個のメインウェル内に複数個のサブウェルを含ませ、高収率のスフェロイド／オルガノイドを作製することが可能であり、プレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタを含ませ、大容量の高速画像撮影時の公差を小さくし、ウェルプレート内の画像を均一に撮影できる細胞培養プレートを提供する。さらに、メインウェルの段差によって、培養される細胞は、培地交換時のピペッティング作業による影響を最小限に抑えられる細胞培養プレートを提供する。
以下に添付の図面を参照して本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。説明に先立って、本明細書及び特許請求の範囲で使用される用語又は単語は、通常又は辞書の意味に限定されて解釈されるべきではなく、発明者は、自身の発明を最も最良の方法で説明するために用語の概念を適切に定義できるという原則に基づいて、本発明の技術的思想に符合する意味や概念として解釈されなければならない。
従って、本明細書に記載された実施例と図面に示される構成は、本発明の最も好ましい一実施例に過ぎず、本発明の技術的思想をすべて代弁するものではないので、本出願時点においてこれらを代替できる様々な均等物と変形例があり得ることを理解すべきである。
図１（ａ）は、本発明の一実施例による細胞培養プレートの正面図であり、図１（ｂ）は、本発明の一実施例による細胞培養プレートの断面図であり、図２は、本発明の一実施例による細胞培養プレートに形成されたメインウェルを詳細に示す図であり、図３は、本発明の一実施例による細胞培養プレートのウェルプレート、ベース及びカバーを示す図である（（ａ）カバー、（ｂ）ベース、（ｃ）マイクロプレート及びベースの固定手段）。
以下、図１～図３を参照して本発明の一実施例による細胞培養プレートを詳細に説明する。
図１～図３に示すように、本発明の一実施例による細胞培養プレート１０は、複数個のメインウェル１１０と、メインウェル１１０のそれぞれの下部に形成され、細胞培養液が注入され、底面に凹部１２１を含む複数個のサブウェル１２０を含むウェルプレート１００と、ウェルプレート１００を支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタ２００とを含んで構成される。
まず、図１及び図２を参照して、本発明の一実施例によるウェルプレート１００を詳細に説明する。
前記ウェルプレート１００は、モールドを介してプラスチック射出成形されたプレート状に製造される。このようなプラスチック射出用モールドは、メインウェル１１０をウェル構造物として繰り返しパターンを持たせることで、生産単価を下げ、微細加工による大きさの拡大化を容易にすることによって 製造することができる。これによって細胞の大量生産が容易になり、使用者のニーズに合わせて様々な大きさに変形して使用することが可能である。
前記メインウェル１１０は、ウェルプレート１００に複数個形成されており、それぞれのメインウェル１１０は、段差１０１を含む。前記段差１０１は、メインウェル１１０の所定の部位に形成されるものであって、より詳細には、前記段差１０１は、メインウェル１１０の全長の１／３～１／２の位置に形成されてもよく、前記段差１０１は、メインウェル１１０の下端から１／３～１／２の位置に形成されてもよい。
従来、マイクロプレートにて細胞を培養する際には培養液を交換するピペッティング作業を行う場合があるが、このような場合、細胞培養中のスフェロイド又はオルガノイドに影響を与えて、ピペッティング作業時にスフェロイド又はオルガノイドが吸い上がったり、位置が変わったりするといったことがあるので、細胞培養環境に好ましくない問題があったが、前記段差１０１をこのような問題を防止するために設けた。
前記段差１０１は、ピペットが適用される空間であってもよく、具体的には、メインウェル１１０の壁に対して１０～６０°の範囲の傾斜角（θ）を有してもよい。又は、２０～５０°の範囲の傾斜角を有してもよく、好ましくは３０～４５°の範囲の傾斜角を有してもよい。もし、前記段差１０１の傾斜角が１０°未満である場合には、メインウェル１１０内に傾斜角が小さすぎてピペットを適用できる空間が十分でないため、メインウェル１１０内の培養液を吸入する際、ピペットがサブウェル１２０の内側に滑ってしまい、スフェロイド又はオルガノイドが吸い上がったり、位置が変わったりすることがある。併せて、前記傾斜角（θ）が６０°を超える場合にはピペットを適用できる空間は確保できるが、段差１０１の傾斜角が大きいすぎて培養液を十分に吸入し難いことがあり、サブウェル１２０に細胞を播種する際、細胞が全部のサブウェル１２０に入りきらず、段差１０１に播種される問題が発生するおそれがある。従って、上述した範囲の傾斜角を有することが好ましい。
なお、本発明の一実施例によるメインウェル１１０は、段差１０１と後述するサブウェル１２０との間に空間部１３０を含むことができる。具体的には、前記空間部１３０は、培養液が注入される空間であって、サブウェル１２０内部の細胞が同じ培養液を共有できる空間である。
より具体的には、空間部１３０の高さ（ａｈ）は、平均２．０～３．０ｍｍの範囲であってもよく、２．２～２．８ｍｍの範囲であってもよく、又は平均２．３～２．７ｍｍの範囲であってもよい。さらに、サブウェル１２０の高さ（ｂｈ）は、平均１．０～２．０ｍｍの範囲であってもよく、又は平均１．２～１．８ｍｍの範囲であってもよい。
例えば、前記空間部１３０の高さ（ａｈ）は平均２．５ｍｍであり、サブウェルの高さ（ｂｈ）は平均１．５ｍｍであってもよい。
このとき、前記空間部とサブウェル１２０との高さの比（ａｈ：ｂｈ）は、１：０．３～１の範囲であってもよく、より詳細には、空間部とサブウェル１２０の高さの比（ａｈ：ｂｈ）は、１：０．４～０．９又は１：０．５～０．８であってもよい。もし、サブウェル１２０の高さが空間部の高さに対して１：０．３未満である場合には、サブウェル１２０の培地を交換する際、小さな力でも内部で培養中の細胞が抜け出すことがあり、サブウェル１２０の高さが空間部の高さに対して１：１を超える場合、細胞に必要な培養液が十分に変換されずにアポトーシスが誘発される可能性がある。従って、空間部１３０とサブウェル１２０は、上述した高さの範囲と高さの比を有することが好ましい。
次に、サブウェル１２０は、メインウェル１１０のそれぞれの下部に形成されるものであって、底面に凹部１２１を含む。特定の態様として、前記サブウェル１２０は、メインウェル１１０の下部に複数個を含むことができる。メインウェル１１０の下部に含まれるサブウェル１２０は、それぞれの大きさと形状が同じであり、これにより均一な条件のスフェロイド及びオルガノイドを生成することができる。
前記サブウェル１２０は、凹部１２１に向かってテーパ状になるように傾斜面を形成することができる。具体的には、前記サブウェル１２０の上端部は、垂直方向を基準に下降するほど水平幅が小さくなることがある。例えば、前記サブウェル１２０の上端部は、逆ピラミッド状からなることができる。図示の実施例では、サブウェル１２０の上端部がピラミッド状又は漏斗状のように、垂直方向に下降するほど水平幅が小さくなる形状からなることができる。
特に、前記サブウェル１２０は、大きさと形状が同じであるように複数個含むことによって、前記細胞培養プレートは均一な条件で大量のスフェロイド又はオルガノイドを生成することができる。
特定の態様として、１つのメインウェル１１０には同じ大きさのサブウェル１２０を４～２５個含むことができ、全マイクロプレート１００には９６～１，７２８個のサブウェル１２０を含むことができる。これにより同一で、精密に大きさを制御することが可能である。
加えて、サブウェル１２０は、凹部１２１を含み、前記凹部の下端において前記凹部１２１は３Ｄスフェロイド又はオルガノイドを培養できるように空間が形成される。具体的には、前記凹部１２１は、「Ｕ字状」、「Ｖ字状」、又は「Ц字状」であってもよく、例えば、前記凹部１２１は「Ｕ字状」であってもよい。
前記サブウェル１２０の上端径は、３．０～４．５ｍｍの範囲であってもよく、又は３．５～４．３ｍｍであってもよく、又は平均４ｍｍであってもよい。さらに、凹部１２１の上端径は０．４５～１．５ｍｍであってもよく、又は０．５～１．０ｍｍ又は平均０．５ｍｍであってもよい。
加えて、前記サブウェル１２０の直径と凹部１２１の直径に対する長さの比は、１：０．１～０．５の範囲であってもよく、好ましくは前記サブウェル１２０の直径と凹部１２１の直径に対する長さの比は１：０．１２であってもよい。
前記凹部１２１の上端径がサブウェル１２０の上端径１に対して０．１未満である場合に凹部１２１の細胞培養空間を十分に確保することができず、培養液交換時に、小さな力でも細胞が抜け出る問題が発生することがあり、凹部１２１の上端径がサブウェル１２０の上端径１に対して０．５を超えると、細胞に必要な十分な培養液を交換できず、安定的に培養することが難しい問題が発生するおそれがある。
一方、メインウェルの壁を基準にサブウェル１２０と凹部１２１の傾斜面は４０～５０°の傾斜角（θ２）を有してもよく、４２～４８°の範囲の傾斜角（θ２）、 ４３～４７°の範囲の傾斜角（θ２）又は平均４５°の傾斜角（θ２）を有してもよい。
上述したサブウェル１２０は、１００～１０００ｃｅｌｌs／ｗｅｌｌ以下の細胞培養が可能であり、安定的にスフェロイドの大きさを制御できる利点がある。
さらに、本発明の一実施例によるメインウェル１１０の個々の体積は１００～３００μｌの範囲であり、凹部１２１の個々の体積は２０～５０μｌの範囲であり、前記メインウェル１１０と凹部１２１の個々の体積比は平均１：０．０７～０．５であることを特徴とする。好ましくは、前記一実施例によるメインウェル１１０の個々の体積は２５０～３００μｌの範囲であり、前記凹部の個々の体積は２５～３５μｌの範囲であってもよく、前記メインウェル１１０と凹部１２１の個々の体積比は平均１：０．１１であってもよい。
具体的には、メインウェル１１０の個々の体積が１００μｌ未満の場合、細胞培養時に十分な培養液を収容できない問題が発生することがあり、３００μｌを超える場合には、培養効率が低下する可能性がある。
併せて、凹部１２１は実質的な細胞が培養される空間であって、その体積が２０μｌ未満の場合には細胞培養空間が十分でないため、細胞が抜け出る問題が発生することがあり、５０μｌを超えると細胞等を安定して培養することが困難な問題が発生するおそれがある。従って、前記メインウェル１１０と凹部１２１は、上述した範囲の体積を有することが好ましい。
前述の本発明の細胞培養プレートの構成により、ハイドロゲルを含まなくても、即ち、ハイドロゲルを細胞培養プレートにコーティングしなくても細胞がスフェロイド状に維持され、人工多能性幹細胞へのリプログラミングが高効率で起こり、リプログラミング後に持続的にその形態と機能が維持される。
本発明の一実施例による細胞培養プレート１０は、ウェルプレート１００を支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタ２００を含む。ここで、ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタ２００とは、ＨＣＳ（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）システムに装着するコネクタ２００を意味するものであり、具体的には、前記コネクタ２００は本発明ではベース２１０とカバー２２０を意味することができる。
より具体的には、前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、ウェルプレート１００の下端に互いに着脱可能なように固定手段１４０、２４０が備えられたベース２１０とウェルプレート１００の上部に配置し、ベース２１０と結合するカバー２２０を含む。そして、前記ベース２１０の上端及びウェルプレート１００の下端は、互いに着脱可能に固定可能な固定手段１４０、２４０を含むことを特徴とする。
このとき、前記ベースは、ウェルプレート１００を支持するための凸部２４０を含み、前記ウェルプレート１００は、ベース２１０の凸部２４０に対向する落とし込み部１４０を含むことができる。前記固定手段によってウェルプレート１００を固定し、スクリーニング時に画像を均一に撮影することができる。
前記ベースは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルエーテルケトン又はポリエーテルイミド材料からなることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
前記ウェルプレートは、ポリジメチルシリコーン、高脂肪変性シリコーン、メチルクロロフェニルシリコーン、アルキル変性シリコーン、メチルフェニルシリコーン、シリコーンポリエステル、又はアミノ変性シリコーン材料からなることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
一方、本発明の細胞培養プレート１００において人工多能性幹細胞を形成する際にマトリゲルを使用する必要がない。
図４は、マトリゲルを用いた２次元細胞培養プレート及び本発明によりマトリゲルを必要としない３次元細胞培養プレートを用いた人工多能性幹細胞の製造方法を比較して示したものである。体細胞（繊維芽細胞）を培養した後、エピソーマルベクターを電気穿孔法により線維芽細胞にトランスフェクトしてリプログラミングを誘導し、人工多能性幹細胞を作製する。２次元マトリゲル培養の場合、人工多能性幹細胞コロニーを切り離す過程が煩わしく、収率が低い。しかし、本発明の３次元培養プレートを用いる場合、マトリゲルがないので、人工多能性幹細胞にリプログラミングされた多数の単一細胞等が集まり、３次元球状の細胞集合体であるスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成する。このスフェロイドは、３次元細胞培養プレートに容易に分離することができ、継代培養が可能である（図７ｄ）。即ち、リプログラミング効率が非常に高い。
また、前述したように、本発明で用いる３次元細胞培養プレートは、１つのメインウェル１１０に同じ大きさのサブウェル１２０を４～２５個含むことができ、全マイクロプレート１００には９６～１，７２８個のサブウェル１２０を含むことができる。これにより、同一で、精密に大きさを制御可能な人工多能性幹細胞及びそのスフェロイドを大量製造することができる。
本発明の製造方法によれば、ハイドロゲルを必要とせずにリプログラミング効率が増進された人工多能性幹細胞を大量製造することができる。
本発明は、様々な形態に変更することができ、様々な実施例を有することができるところ、以下に特定の実施例を図面に例示し、詳細な説明にて詳細に説明する。しかしながら、これは本発明を特定の実施形態に限定することを意図するものではなく、本発明の精神及び技術的範囲に含まれるすべての変形、等価物ないし代替物を含むことを理解されなければならない。本発明の説明において、関連する公知技術の具体的な説明が本発明の要旨を不明瞭にするものと判断される場合、その詳細な説明は省略する。
実施例１．実験方法
１－１：線維芽細胞の培養及び人工多能性幹細胞の作製
ヒト線維芽細胞株であるＦ１３４（ｔｈｅ ｇｅｒｍａｎ ｆｅｄｅｒａｌ ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ／ＲＫＩ：ＡＺ １７１０－７９－１－４－４１ Ｅ０１）を１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）及び１ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を含むＤＭＥＭ中で３５ｍｍ又は１００ｍｍのペトリ皿に培養した。培養した線維芽細胞にエピソームｉＰＳＣリプログラミングベクター（ＥＰ５ＴＭ ｋｉｔ：カタログ番号Ａ１６９６０．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によりトランスフェクトさせ（ＮｅｏｎＴＭ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）、リプログラミングした。電気穿孔法は、１，６５０Ｖ、１０ｍｓ、３パルス条件で行った。
図４ａに示すように、トランスフェクトされた線維芽細胞を本発明の３次元細胞培養プレート（マトリゲルなし、実施例）と２次元の１２ウェルプレート（マトリゲルコーティング、比較例１）及び市販製品であるＡｄｄｇｅｎｅ（比較例２、マトリゲルコーティング、図４ａには図示せず）に接種し、Ｎ２Ｂ２７培地（ｂＦＧＦを含む）で培養した。１５日間培養した後、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ培地と交換した。１５日後に実施例（３次元細胞培養プレート）の３Ｄ ｉＰＳＣを２次元プレートである１２－ウェルプレートにプレーティングし、実施例と比較例のコロニー数を確認した。
１－２：線維芽細胞のリプログラミング効率の解析
Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔマニュアルに従って（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）、リプログラムされた細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した後、Ｂｌｕｅ－ｃｏｌｏｒ ＡＰ溶液で染色し、ＰＢＳで２回洗浄した後、コロニー染色有無を光学顕微鏡下で観察した。染色されたコロニーの数を数えて定量化した。
実施例と比較例で培養した細胞を撮影し、細胞球の大きさを比較した。スフェロイドを自動プレート機器によりイメージングを行い、この時、自動に機器が焦点を合わせて進めるようにした。画像の大きさの解析は、ｉｍａｇｅＪプログラムのマクロプログラムを用いて行った（図５、６及び７関連）。
１－３：人工多能性幹細胞の３次元培養方法の最適化
実施例と比較例で培養した３次元人工多能性幹細胞を撮影し、これにより細胞球の大きさをそれぞれ比較して測定した（図８（a））。画像に対する結果をテストするために、外部の検査会社（細胞バイオＣＥＦＯ、韓国）に依頼し、このテストはブラインドテストで進められた。
１－４：免疫染色
リプログラムされた細胞を４％パラホルムアルデヒドで常温で２０分間固定した。固定細胞を１％ＢＳＡ及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳで常温で１時間反応させた後、各一次抗体Ｏｃｔ４（１：１００、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｓｏｘ２（１：１００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）、Ｎａｎｏｇ（１：２００、Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ、Ｋｏｔｏ－Ｋｕ、Ｊａｐａｎ）、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（１：２００、ａｂｃａｍ）処理し、ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄヤギ抗－ウサギＩｇＧ又は抗－マウスＩｇＧ（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を二次抗体で反応させた。蛍光画像は蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｓｈｉｎｊｕｋｕ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で解析した。ＤＡＰＩを核染色溶液として使用した。
１－５：ｑＰＣＲ
線維芽細胞とリプログラミングされた細胞からＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した後、Ａｃｃｕｐｏｗｅｒ ＲＴ ｍｉｘ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｃｏｒｐ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡを作成した。リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を用いて行った。本発明で使用されるプライマー配列は、表１の通りである。
実施例２．リプログラミング効率の確認
図４ｂをみると、２次元培養の場合、Ｄ１５になって初めて少量のコロニーが形成され始めることが分かる。Ｄ１５までｉＰＳＣリプログラミングを誘導した後、３ＤｉＰＳＣを２次元プレートにプレーティングし、比較例１と実施例１のコロニー数を比較してみたところ、形成されるコロニー数において差が大きかった。ｉＰＳＣから分化に成功した細胞がコロニーを形成するため、実施例のｉＰＳＣリプログラミング収率が高いことがわかる。図５及び図７ｂをみると、２次元培養（比較例１）と３次元培養時（実施例）、コロニーの個数の差が非常に大きいことが分かる。図６をみると、ＡＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色の結果、３Ｄ ｉＰＳＣスフェロイド（実施例、３Ｄ ｓｐｈ－ｉＰＣｓ）においてリプログラミング効率が非常に高いことがわかる。また、図６及び図７ａをみると、２Ｄマトリゲル（比較例１）と３Ｄ ｉＰＳＣスフェロイド（実施例、３Ｄ ｓｐｈ－ｉＰＣｓ）とを比較したとき、画像が均一で鮮明に示されるが、これは本発明の３次元細胞培養プレートが大量の画像解析が可能であることを示すものである。
図７ｃをみると、３次元細胞培養プレートにおいて、リプログラミング効率が非常に良好であることが分かる。また、図７ｄをみると、本発明はマトリゲルを用いないので、ｉＰＣｓによりリプログラミングされた多数の単一細胞が集まって３次元球状の細胞集合体であるスフェロイドを形成し、このスフェロイドを３次元細胞培養プレートから容易に分離し、再プレーティングすることができることが分かる。即ち、リプログラム効率が非常に高い。
図８は、比較例２の従来の３次元培養と本発明の実施例の３次元培養（図８ｂのＳｐｈｅｒｏｉｄＦｉｌｍ）とを比較したものである。従来の３次元培養は大きさが均一ではなく、ｏｃｔ４発現量が比較的低い。しかしながら、本発明は、大きさが非常に均一であり（９９．４５％）、リプログラミング因子発現率が非常に高い。即ち、従来の３次元培養と比較したときでも、本発明は幹細胞培養において効果的であり、体細胞を人工多能性幹細胞にリプログラミングできる効率を高めることができる。また、大きさが均一であるということは、標準化された人工多能性幹細胞及び幹細胞をスフェロイド形態で３次元的に大量に製造できることを意味する。
実施例３．人工多能性幹細胞の特性の解析
図９をみると、本発明に従って製造されたｉＰＳＣｓは、多能性マーカーの発現が非常に高いことが分かる。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に説明したが、この技術分野における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい実施形態に過ぎず、これにより本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるといえる。
１００：ウェルプレート
１０１：段差
１１０：メインウェル
１２０：サブウェル
１２１：凹部
１３０：空間部
１４０：落とし込み部
２００：ハイコンテントスクリーニング用コネクタ
２１０：ベース
２２０：カバー
２４０：凸部
１０１：段差
１１０：メインウェル
１２０：サブウェル
１２１：凹部
１３０：空間部
１４０：落とし込み部
２００：ハイコンテントスクリーニング用コネクタ
２１０：ベース
２２０：カバー
２４０：凸部
Claims (9)
- 人工多能性幹細胞の製造方法であって、
体細胞を培養する工程と、
前記培養された体細胞を、ハイドロゲルを含まない３次元細胞培養プレートで人工多能性幹細胞にリプログラミングさせる工程と、を含み、
前記３次元細胞培養プレートは、
複数個のメインウェル（ｍａｉｎ ｗｅｌｌ）と、前記メインウェルのそれぞれの下部に形成され、細胞培養液が注入され、底面に凹部を含む複数個のサブウェル（ｓｕｂ ｗｅｌｌ）と、を含むウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）と、
前記ウェルプレートを支持するハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタと、を含み、
前記ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）用コネクタは、
前記ウェルプレートの下端に互いに着脱可能に固定手段が備えられたベースと、
前記ウェルプレートの上部に配置し、前記ベースと結合されるカバーと、を含み、
前記メインウェルは、所定の部位がテーパ状になるように段差が形成され、
前記段差は、メインウェルの壁に対して１０～６０°範囲の傾斜角（θ）を有する、
人工多能性幹細胞の製造方法。 - 前記体細胞は、線維芽細胞である、請求項１に記載の製造方法。
- 前記ハイドロゲルは、細胞外マトリックスに基づくハイドロゲルである、請求項１に記載の製造方法。
- 前記細胞外マトリックスに基づくハイドロゲルは、マトリゲルである、請求項３に記載の製造方法。
- 前記リプログラミング工程後に、リプログラミングされた前記人工多能性幹細胞のスフェロイドを形成する工程をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
- 前記サブウェルは、前記凹部に向かってテーパ状になるように傾斜面が形成され、
前記サブウェル（１２０）の上端径は、３．０～４．５ｍｍの範囲であり、
前記凹部（１２１）の上端径は、０．４５～１．５ｍｍの範囲であり、
前記サブウェルと前記凹部の前記傾斜面（θ２）は、４０～５０°の範囲であり、
前記サブウェルの直径と前記凹部の直径に対する長さの比は、１：０．１～０．５ - 前記メインウェルの個々の体積は、１００～３００μｌの範囲であり、
前記凹部の個々の体積は、２０～５０μｌの範囲であり、
前記メインウェルと前記凹部の個々の体積比は、平均１：０．１～０．５であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。 - 前記メインウェルは、前記段差と前記サブウェルとの間に空間部を含み、
前記空間部の高さ（ａｈ）は、平均２．０～３．０ｍｍの範囲であり、
前記サブウェルの高さ（ｂｈ）は、平均１．０～２．０ｍｍの範囲であり、
前記空間部と前記サブウェルの高さの比（ａｈ：ｂｈ）は、１：０．３～１の範囲であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。 - 前記体細胞は、前記細胞培養プレートの前記サブウェルに１００～１０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種されるものである、請求項１に記載の製造方法。
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