CN116964193A - 细胞簇的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明作为用于在由iPS细胞等多能干细胞的集落通过分化诱导因子形成的细胞簇中，富集胚胎发生区域特异性的微图形结构中包含的所期望的细胞、特别是卵黄囊中胚层细胞或羊膜外胚层细胞的手段，提供以下方法。包括在Wnt信号调节下二维培养多能干细胞的工序的、由多能干细胞制造富集有所期望的细胞的细胞簇的方法。例如，包括在活化Wnt信号的条件下二维培养多能干细胞的工序的、由多能干细胞制造富集有卵黄囊中胚层细胞的细胞簇的方法，以及，包括在Wnt信号被抑制的条件下二维培养多能干细胞的工序的、由多能干细胞制造富集有羊膜外胚层细胞的细胞簇的方法。

Description

细胞簇的制造方法
技术领域
本发明涉及由多能干细胞的集落通过分化诱导因子形成的、具有胚胎发生区域特异性的微图形(micropattern)的细胞簇(cell cluster)，以及富集有所期望的细胞的细胞簇的制造方法。此外，涉及通过使该细胞簇中的细胞进一步分化而生成的细胞群的制造方法，通过进一步培养该细胞簇中的细胞或细胞群中的细胞而形成的类器官或立体脏器(three-dimensional organ)。
背景技术
已知ES细胞、iPS细胞等多能干细胞属于胚胎学上定义的上胚层(epiblast、胚盘上层)，由多能干细胞的集落通过分化诱导因子形成具有胚胎发生区域特异性的微图形的细胞簇。例如，非专利文献1中记载了对人ES细胞进行二维培养后，利用BMP4信号形成包含三个胚层(内胚层、中胚层及外胚层)的微图形。另外，非专利文献2中记载了在由人ES细胞形成微图形后，通过抑制Wnt信号来控制向内胚层及中胚层的分化。非专利文献3中记载了在由小鼠ES细胞形成微图形的情况下，虽然比例低，但是出现了卵黄囊中胚层细胞。
另一方面，血管内皮细胞等由中胚层细胞进一步分化。例如，专利文献1中记载了通过气液界面培养形成分层性的细胞网络(例如，血管、神经的网络)的基质组合物的制造方法，并记载了为了形成该细胞网络而使用血管内皮细胞作为血管细胞。专利文献1的实施例中记载了通过使用包含BMP4、VEGF、CHIR99021等的培养基的培养，由人iPS细胞诱导形成侧板中胚层系细胞，通过更换培养基后的进一步培养，得到造血性血管内皮细胞(CD34阳性、CD73阴性)，以及使用包含如此得到的造血性血管内皮细胞的多种细胞，制造形成分层性的细胞网络的基质组合物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2020/203713
非专利文献
非专利文献1：Warmflash等，NATURE METHOD VOL.11No.8August 2014
非专利文献2：Martyn等，Development(2019)146,dev17291
非专利文献3：Morgani等，eLife 2018；7:e32839
发明内容
发明所要解决的课题
目前还不知道在由多能干细胞的集落通过分化诱导因子形成的细胞簇中，对胚胎发生区域特异性的微图形结构中包含的特定的细胞的比率进行调节的方法，例如，富集特定的细胞后高效地得到由该细胞分化的目标细胞的方法。
本发明的课题在于，提供用于富集由多能干细胞形成的细胞簇中包含的所期望的细胞、特别是卵黄囊中胚层细胞(yolk sac mesoderm cell、本说明书中有时也标记为“YSMC”。)或羊膜外胚层细胞(amniotic ectoderm cell、本说明书中有时也标记为“AEC”。)的手段。
用于解决课题的手段
本申请的发明人发现：通过在Wnt信号调节下二维培养多能干细胞，能够富集细胞簇中的所期望的细胞；例如，在开始培养多能干细胞时，通过在培养基中添加Wnt信号活化剂等活化Wnt信号的条件下二维培养多能干细胞，能够制造富集有YSMC的细胞簇；反之，在开始培养多能干细胞时，通过在培养基中添加Wnt信号抑制剂等Wnt信号被抑制的条件下二维培养多能干细胞，能够制造富集有AEC的细胞簇，等等。在细胞簇的一个情况下，YSMC、AEC等所期望的细胞与其它细胞在保持二维的位置关系和边界的同时形成层状结构，能够增加包含所期望的细胞的层的厚度，这也是重要的特征。
即，本发明至少包括下述内容。
[1]
方法，其是由多能干细胞制造富集有所期望的细胞的细胞簇的方法，前述方法包括在Wnt信号调节下二维培养多能干细胞的工序。
[2]
如[1]中记载的方法，其中，前述所期望的细胞是卵黄囊中胚层细胞，在前述Wnt信号调节下二维培养多能干细胞的工序是在活化Wnt信号的条件下二维培养多能干细胞的Wnt信号活化培养工序。
[3]
如[2]中记载的方法，其中，前述Wnt信号活化培养工序是使用添加了Wnt信号活化剂的培养基二维培养多能干细胞的工序。
[4]
如[3]中记载的方法，其中，前述Wnt信号活化剂是GSK3抑制剂。
[4a]
如[4]中记载的方法，其中，前述GSK3抑制剂是CHIR99021。
[5]
如[2]中记载的方法，其中，前述Wnt信号活化培养工序在开始培养前述多能干细胞时进行。
[6]
如[1]中记载的方法，其中，前述多能干细胞是人工多能干细胞。
[7]
细胞群的制造方法，其还包括在[2]中记载的Wnt信号活化培养工序之后，使所得到的前述卵黄囊中胚层细胞分化为CD34+血管内皮祖细胞的培养工序。
[8]
如[7]中记载的方法，其还包括使前述CD34+血管内皮祖细胞分化为CD34+CD32+卵黄静脉生血内皮细胞的培养工序。
[9]
细胞簇，其是通过[1]中记载的方法而得到的。
[10]
细胞群，其是通过[7]中记载的方法而得到的。
[11]
类器官或立体脏器的制造方法，其包括对[9]中记载的细胞簇或[10]中记载的细胞群的至少一部分进行三维培养的工序。
[12]
类器官或立体脏器，其是通过[11]中记载的制造方法而得到的。
[13]
如[1]中记载的方法，其中，前述所期望的细胞是羊膜外胚层细胞，前述在Wnt信号调节下二维培养多能干细胞的工序是在Wnt信号被抑制的条件下二维培养多能干细胞的Wnt信号抑制培养工序。
[14]
如[13]中记载的方法，其中，前述Wnt信号抑制培养工序使用添加了Wnt信号抑制剂的培养基进行。
[15]
如[14]中记载的方法，其中，前述Wnt信号抑制剂为IWP-2。
发明效果
根据本发明，通过在Wnt信号调节下二维培养多能干细胞，能够由多能干细胞制造富集有所期望的细胞的细胞簇，特别是能够通过Wnt信号活化培养工序制造富集有YSM的细胞簇，以及能够通过Wnt信号抑制培养工序制造富集有AEC的细胞簇。而且，富集有YSM的细胞簇例如能够用于类器官或立体脏器的制造、能够高效地制造CD34+血管内皮祖细胞。
附图说明
[图1]图1涉及实施例的[1]“通过Wnt信号活化培养工序制作人卵黄囊中胚层细胞(本发明的第1实施方式)”及[3]“通过免疫细胞染色分析细胞群的分化标志物”。“+CHIR”表示在培养基中添加CHIR99021(Wnt信号活化剂)的情况，“(-)”表示作为对照，不添加CHIR99021的情况。[图1A]是光学显微镜下的观察像。右上段是在Wnt信号活化条件(在培养基中添加Wnt信号活化剂)下开始培养人iPS细胞后第2天的图像，右下段是作为对照，在未活化Wnt信号的条件(不在培养基中添加Wnt信号活化剂)下开始培养人iPS细胞后第2天的图像。[图1B]是Brachyury及GATA6的荧光图像。在彩色图像中，细胞簇的中央部被染成绿色，表示Brachyury的表达，外缘部被染成紫色，表示GATA6的表达。[图1C]是示出在+CHIR、(-)的各荧光图像中的Brachyury、GATA6及FOXF1的各荧光强度(换算为灰度的情况下)与距中心的距离的关系的图。
[图2]图2涉及实施例的[2]“通过Wnt信号抑制培养工序制作人羊膜外胚层细胞(本发明的第2实施方式)”及[3]“通过免疫细胞染色分析细胞群的分化标志物”。“+IWP-2”表示在培养基中添加IWP-2(Wnt信号抑制剂)的情况，“(-)”表示作为对照，不在培养基中不添加IWP-2的情况，“+CHIR”表示作为参考，在培养基中添加本发明的第1实施方式中使用的CHIR99021来代替IWP-2的情况。上段：DAPI及GATA6的荧光图像。在彩色图像中，细胞簇的中央部利用DAPI被染成蓝色，外缘部被染成红色，表示GATA6的表达。中段：SOX2及CDX2的荧光图像。在彩色图像中，细胞簇的中央部被染成青色，表示SOX2的表达，外缘部被染成粉色，表示CDX2的表达。下段：TFAP2A及SOX2的荧光图像。在彩色图像中，细胞簇的中央部被染成青色，表示SOX2的表达，外缘部被染成橙色，表示TFAP2A的表达(主要为+IWP-2)。
[图3]图3涉及实施例的[4]“人卵黄静脉生血内皮细胞的制作”、[5]通过免疫细胞染色分析细胞群的分化标志物及[6]“使用流式细胞仪的分化标志物分析”。“+CHIR”是在培养基中添加CHIR99021(Wnt信号活化剂)，对所得到的细胞簇进行分化诱导的情况，“(-)”是作为对照，不添加CHIR99021，对所得到的细胞簇进行分化诱导的情况。[图3A]是Brachyury及CD34的荧光图像。在彩色图像中，右侧(+CHIR)的细胞群中，表示Brachyury的表达的绿色的中央部的区域扩散得较小、表示CD34的表达的红色的外缘部的区域扩散得较大，与之相对，左侧(-)的细胞群中，表示Brachyury的表达的绿色的中央部的区域较大，外缘部被染成橙色，表示GATA6、和比中央部低的Brachyury的表达。[图3B]是基于CD34及CD32的表达的流式细胞仪的分析结果。
具体实施方式
-细胞簇的制造方法-
本发明的细胞簇的制造方法是由多能干细胞制造富集有所期望的细胞的细胞簇的方法，包括在Wnt信号调节下二维培养多能干细胞的工序。本发明的细胞簇的制造方法包括代表性的下述2个实施方式、即第1实施方式及第2实施方式。
本说明书中，“富集有(enriched)”所期望的细胞是指，细胞簇中的所期望的细胞的量、或所期望的细胞的量相对于全部细胞的量的比率与富集前的细胞簇或不实施本发明(在不调节Wnt信号的条件下)而得到的细胞簇这样的对照中的量或比率相比增加。作为反向表述，“进行富集(enrich)”及“富集(enrichment)”所期望的细胞是指，使细胞簇中的所期望的细胞的量、或所期望的细胞的量相对于全部细胞的量的比率与对照中的量或比率相比增加。本发明的特定的实施方式中，以通过本发明制造的细胞簇中的所期望的细胞的量或比率与对照的细胞簇中的量或比率相比至少增加20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％的方式进行富集。
本说明书中，“二维培养”多能干细胞是指在无饲养层的情况下贴壁培养多能干细胞。用于二维培养(无饲养层贴壁培养)iPS细胞、ES细胞等多能干细胞的培养方法是已知的。例如，无饲养层培养人ES/iPS细胞的方法记载于Rodin S等，Nat Biotechnol.(2010)28(6):611-5、Chen等，Nat Methods(2011)8(5):424-429、Miyazaki,T.等，Nat Commun(2012)3,1236、Okita等，Stem Cells,(2013)31(3):458-66、及Nakagawa M等，ScientificReports,(2014)4:3594。
本说明书中“细胞簇”是指由多能干细胞的集落形成的、具有胚胎发生区域特异性的微图形的细胞的聚集体(aggregate)。“集落”是指在固体培养基中，由1个细胞形成的可视的团块，“多能干细胞的集落”是指1个多能干细胞在维持未分化性的同时进行自我复制，复制的细胞与细胞粘附并增加而成的可视的细胞聚集体。另外，“微图形”是指不同的细胞种类根据固定的规则、而非无序地进行排列的状态(规则可以是自然产生的，也可以是人工设计的)，“胚胎发生区域特异性的微图形”是指细胞聚集体通过一边维持放射形对称一边分化为多种细胞而形成的、与生物体胚胎形成中的细胞分化模式部分近似的几何学的配置。用于由多能干细胞的集落形成这样的细胞簇的手段、例如在培养基中添加的分化诱导因子是已知的(例如，参照前述非专利文献1～3)。本发明中，在以下记载的第1实施方式及第2实施方式中也可以使用与以往相同的分化诱导因子。作为这样的分化诱导因子，例如可举出BMP4、TGFb、bFGF、VEGF，特别是优选使用BMP4及VEGF。
分化诱导因子的使用量没有特别限定，本领域技术人员可以根据Wnt信号活化培养工序、Wnt信号抑制培养工序中的分化诱导因子的种类，分化诱导因子彼此或分化诱导因子与培养基的组合等进行适当调节，使得形成具有规定的微图形的细胞簇，以及，在本发明中，特别是在进一步添加Wnt信号活化剂或Wnt信号抑制剂时，能够制造富集有所期望的细胞的细胞簇。BMP4的培养基中的浓度可以设为例如在10～100μM的范围内，优选在50～80μM的范围内。TGFb的培养基中的浓度可以设为例如在2～20μM的范围内，优选在2～10μM的范围内。bFGF的培养基中的浓度可以设为例如在10～100μM的范围内，优选在50～80μM的范围内。VEGF的培养基中的浓度可以设为例如在5～100μM的范围内，优选在50～80μM的范围内。
对于在Wnt信号调节下二维培养多能干细胞时使用的“培养基”而言，在以下记载的第1实施方式中可以进一步添加Wnt信号活化剂，以及，在第2实施方式中可以进一步添加Wnt信号抑制剂，除此以外，可以是与多能干细胞的二维培养中使用的一般的培养基、特别是为了通过多能干细胞的二维培养形成具有胚胎发生区域特异性的微图形的细胞簇所使用的已知的培养基基本相同的培养基。本领域技术人员能够根据所培养的多能干细胞选择合适种类及量的基础培养基、以及根据需要使用的添加物，通过将它们混合来制备合适的培养基。
作为用于培养iPS细胞、ES细胞等多能干细胞的培养基，例如可举出含有10～15％FBS的DMEM、DMEM/F12或DME培养液(这些培养液中能够进一步适当含有LIF、青霉素/链霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸类、β-巯基乙醇等。)，市售的培养液，例如小鼠ES细胞培养用培养液(TX-WES培养液、Thrombox公司)、灵长类ES细胞培养用培养液(灵长类ES/iPS细胞用培养液、REPROCELL公司)、无血清培养基(mTESR、Stemcell Technology公司)、iPS/ES细胞增殖用培养基/再生医疗用培养基(StemFit(注册商标)AK02N、AjinomotoHealthy Supply Co.,Inc.)、iPS细胞培养用无饲养层培养基(Essential 8、Gibco)，也可以使用无血清培养基(例如，Sun N等，(2009),Proc Natl Acad Sci USA.106:15720-15725)。
培养容器没有特别限定，能够使用培养皿、烧瓶、微孔板、商品名“OptiCell”(Nunc公司)等细胞培养片等。培养容器优选进行了用于提高与细胞的粘附性(亲水性)的表面处理，用胶原蛋白、明胶、多聚-L-赖氨酸、多聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、人工基膜(matrigel)(例如，BD Matrigel(日本Becton Dickinson公司))、玻连蛋白等细胞粘附用基质进行了包被。
·第1实施方式/Wnt信号活化培养工序
第1实施方式是制造富集有“卵黄囊中胚层细胞”(YSMC)作为“所期望的细胞”的细胞簇的方法，并且是进行“在活化Wnt信号的条件下二维培养多能干细胞的工序”(Wnt信号活化培养工序)作为“在Wnt信号调节下二维培养多能干细胞的工序”的实施方式。
YSMC是在位于胚外的发育早期的造血器官、即卵黄囊中向形成血岛的血细胞和构成血管结构的细胞分化的细胞，就细胞标志物而言，能够确定为GATA6阳性且Brachyury阴性(GATA6+Brachyury-)的细胞，此外，FOXF1、GATA3、GATA4、纤连蛋白(FN1)、胶原蛋白(例如，COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL4A1、COL6A1、COL6A3)、层粘连蛋白-111(例如，LAMA1、LAMB1、LAMC1)、KDR及HAND1等也可能为阳性。对于在细胞簇中是否富集有YSMC、或以何种程度进行了富集而言，例如能够对通过以这样的细胞标志物为靶标的免疫染色而得到的荧光图像进行分析，并通过与对照进行比较来定量或定性地评价或判定。
Wnt信号活化培养工序适合在用于由多能干细胞分化诱导成具有规定的微图形的细胞簇的培养开始时(培养早期)，更具体而言，适合在由多能干细胞向包含胚胎外胚层(embryonic ectoderm)及原条(primitive streak)的胚胎上胚层(embryonic epiblast)、和胚外外胚层(extraembryonic ectoderm)分化分歧前进行。例如，在添加有规定的分化诱导因子的培养基中，从对iPS细胞(的集落)进行培养的分化诱导开始算起，优选在第0天至第2天在活化Wnt信号的条件下培养iPS细胞、即进行Wnt信号活化培养工序。更具体而言，优选第0天在培养基中(与规定的分化诱导因子一起)添加Wnt信号活化剂，在该培养基中培养iPS细胞等多能干细胞。需要说明的是，在这样的实施方式中，在第1天的培养基及/或第2天的培养基中添加Wnt信号活化剂不是必需的。
“活化Wnt信号的条件”只要能够发挥得到富集有YSM的细胞簇这一本发明的作用效果，则没有特别限定，能够利用已知的手段。典型地可举出在培养基中添加具有活化Wnt信号的作用的种类及量的物质、即“Wnt信号活化剂”作为活化Wnt信号的条件。
Wnt信号活化剂的种类没有特别限定，例如优选GSK3抑制剂。作为GSK3抑制剂，例如可举出CHIR99021、SB-216763、BIO(6-溴靛玉红-3'-肟(6-bromoindirubin-3'-oxime))、LY2090314等化合物。作为Wnt信号活化剂，除了GSK3抑制剂以外，例如还可举出SFRP抑制剂(例如，WAY-316606)、Notum抑制剂(例如，ABC99)、PP2A活化剂(例如，IQ1)、ARFGAP1活化剂(例如，QS11)、β连环蛋白活化剂(例如，DCA)、杂芳基嘧啶、2-氨基-4-[3,4-(亚甲基二氧基)苄基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶等化合物。在本发明的方法中，也可以并用2种以上，例如2、3或4种Wnt信号活化剂。
Wnt信号活化剂的使用量没有特别限定，能够根据Wnt信号活化剂的种类，以发挥所期望的程度的作用效果的方式、即以细胞簇中的YSMC富集至所期望的程度的方式进行适当调节。例如，在使用GSK3抑制剂(CHIR99021等)作为Wnt信号活化剂的情况下，培养基中GSK3抑制剂的浓度例如可以设为在0.5～3μM的范围内，优选在1～2μM的范围内。
需要说明的是，已知为了培养iPS细胞等所惯用的(对于从上胚层开始的几乎所有的分化细胞诱导是必需的)生长因子BMP4与Wnt信号相关，但是在使用iPS细胞等培养中使用的常规量、即不能确认到YSMC的富集这一本发明的第1实施方式的作用效果的量(例如，如后述实施例中的对照所使用的)的情况下的BMP4不视为第1实施方式中的Wnt信号活化剂。换言之，假设即使在BMP4以常规量存在于培养基中的情况下，本发明中的Wnt信号活化剂也是指(通过与对照进行比较等)被认为与其无关地单独具有YSMC的富集这一本发明的第1实施方式的作用效果的、BMP4以外的种类及量的物质。
·第2实施方式/Wnt信号抑制培养工序
第2实施方式是制造富集有“羊膜外胚层细胞”(amniotic ectoderm cell：AEC)作为“所期望的细胞”的细胞簇的方法，并且是进行“在Wnt信号被抑制的条件下二维培养多能干细胞的工序”(Wnt信号抑制培养工序)作为“在Wnt信号调节下二维培养多能干细胞的工序”的实施方式。
AEC是向覆盖胎儿胚胎的羊膜上皮细胞分化的外胚层系细胞。作为AEC的细胞标志物，已知CDX2、TFAP2A、GATA3、TFAP2B、E-钙黏着蛋白等，能够通过它们中的1种或2种以上是否为阳性来确定(阳性为AEC，阴性为AEC以外)。另外，也可以与上述细胞标志物(阳性标志物)组合，利用作为未分化细胞、胚胎外胚层的细胞标志物的NANOG、SOX2等中的1种或2种以上是否为阴性来确定AEC(阴性为AEC，阳性为未分化细胞或外胚层)。对于在细胞簇中是否富集有AEC而言，例如能够对通过以这样的细胞标志物为靶标的免疫染色而得到的荧光图像进行分析，并通过与对照进行比较来定量或定性地评价或判定。
“Wnt信号被抑制的条件”只要能够发挥得到富集有AEC的细胞簇这一本发明的作用效果，则没有特别限定，能够利用已知的手段。典型地可举出在培养基中添加具有抑制Wnt信号的作用的种类及量的物质、即“Wnt信号抑制剂”作为抑制Wnt信号的条件。
Wnt信号抑制剂的种类没有特别限定，例如优选Porcupine(PORCN)抑制剂。作为Porcupine抑制剂，例如可举出IWP-2、LGK974、Wnt-C59、ETC-159、IWP-O1、IWP L6、GNF-6231、Porcn-IN-1等化合物。Wnt信号抑制剂中，除了Porcupine抑制剂以外，例如还可举出(非膜结合性)游离Wnt抑制剂(例如，Ant1.4Br/Ant 1.4Cl)、Frizzled抑制剂(例如，氯硝柳胺(Niclosamide))、液泡ATP酶(Vacuolar ATPase)抑制剂(例如，apicularen和巴佛洛霉素(bafilomycin))、端锚聚合酶1/轴蛋白(tankyrase 1/Axin)活化剂(例如，XAV939)、轴蛋白活化剂(例如，IWR)、端锚聚合酶,轴蛋白活化剂(例如，G007-LK及G244-LM)、CK1抑制剂(例如，pyrvinium)、Dsh抑制剂(例如，NSC668036)、TCF/β连环蛋白抑制剂(例如，2,4-二氨基-喹唑啉、PKF115-584)、TCF抑制剂(例如，槲皮素)、CREB结合蛋白抑制剂(例如，ICG-001)、β连环蛋白TBL相互作用抑制剂(例如，BC2059)、Shizokaol D等化合物。在本发明的方法中，也可以并用2种以上，例如2、3或4种Wnt信号抑制剂。
Wnt信号抑制剂的使用量没有特别限定，可以根据Wnt信号抑制剂的种类进行适当调节，使得发挥所期望的程度的作用效果，即细胞簇中的AEC富集至所期望的程度。例如，在使用Porcupine抑制剂(IWP-2等)作为Wnt信号抑制剂的情况下，培养基中的Porcupine抑制剂的浓度可以设为例如在0.5～2μM的范围内，优选在0.5～1μM的范围内。
需要说明的是，在本发明的第2实施方式中，也能够以iPS细胞等培养中使用的常规量在培养基中添加BMP4，但是即使在这样的情况下，本发明中的Wnt信号抑制剂也是指(通过与对照进行比较等)被认为具有AEC的富集这一本发明的第2实施方式的作用效果的种类及量的物质。
·所期望的细胞以外的细胞
通过本发明的细胞簇的制造方法得到的细胞簇可以包含YSMC、AEC等所期望的细胞以外的细胞(在本说明书中称为“非所期望细胞”。)。作为非所期望细胞，可举出已知的微图形中包含的除YSMC及AEC以外的细胞，例如SOX2阳性胚胎外胚层、T(Brachyury)阳性细胞(原条)、以及源自它们的胚胎中胚层及胚胎内胚层等。对于通过本发明的制造方法得到的细胞簇而言，在一个情况下，YSMC、AEC等所期望的细胞与非所期望细胞在保持二维的位置关系和边界的同时形成层状结构，能够增加包含所期望的细胞的层的厚度，这也是本发明的特征之一。
-细胞群的制造方法-
本发明的细胞群的制造方法还包括在根据细胞簇的制造方法的第1实施方式的Wnt信号活化培养工序之后，由所得到的卵黄囊中胚层细胞(YSMC)分化为CD34+血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell：EPC)的培养工序(EPC分化工序)，根据需要，也可以还包括其它工序。
本说明书中，特别是在与制造方法有关的内容中提到的“细胞群”是指通过在形成前述“细胞簇”后进一步培养，由此包含由所期望的细胞(YSMC、AEC等)分化成的细胞的细胞的聚集体。
EPC是能够确定为CD34阳性细胞、具有分化成血管内皮细胞(endothelial cell：EC)的能力的细胞。由EPC分化的EC中，例如除了后述的卵黄静脉生血内皮细胞(vitellinevenous hemogenic endothelial cell：VVHEC、CD34阳性且CD32阳性)以外，还包括微血管内皮细胞(microvessel endothelial cells:MVEC)、脐静脉内皮细胞(umbilical-veinendothelial cells:UVEC)等。另外，由EPC分化的EC中，包括具有造血功能的血管内皮细胞、即造血性血管内皮细胞(hemogenic endothelial cell；HEC、CD34阳性且CD73阴性)，和不具有造血功能的血管内皮细胞、即非造血性血管内皮细胞(non-hemogenic endothelialcell；non-HEC、CD31阳性、CD73阳性及CD144阳性)这两者。
作为本发明的细胞群的制造方法中的培养基，能够使用前述的本发明的细胞簇的制造方法中的多能干细胞用的培养基、或由多能干细胞等分化的目标细胞用的培养基、或它们的混合物。作为EPC用的基础培养基，例如可举出DMEM/F-12(Gibco)、Stempro-34SFM(Gibco)、Essential 6培养基(Gibco)、Essential 8培养基(Gibco)、EGM(Lonza)、BulletKit(Lonza)、EGM-2(Lonza)、BulletKit(Lonza)、EGM-2MV(Lonza)、VascuLife EnGSComp Kit(LCT)、人内皮-SFM基础生长培养基(Human Endothelial-SFM Basal GrowthMedium)(Invitrogen)、人微血管内皮细胞增殖培养基(TOYOBO)等。作为EPC用添加物，例如可举出选自由B27添加剂(GIBCO)、BMP4(骨成型蛋白4)、GSKβ抑制剂(例如，CHIR99021)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)、FGF2(成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor)(也称为bFGF(碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor))))、佛司可林(Forlskolin)、SCF(干细胞因子(Stem Cell Factor))、TGFβ受体抑制剂(例如，SB431542)、Flt-3L(FMS样酪氨酸激酶3配体(Fms-related tyrosine kinase 3ligand))、IL-3(白介素3)、IL-6(白介素6)、TPO(血小板生成素)、hEGF(重组人上皮细胞生长因子)、氢化可的松、抗坏血酸、IGF1、FBS(胎牛血清)、抗生素(例如，庆大霉素、两性霉素B)、肝素、L-谷氨酰胺、酚红及BBE组成的组中的1种以上。
EPC分化工序适合在Wnt信号活化培养工序之后的规定期间(例如，约2天)进行，换言之，在前述的由多能干细胞向具有规定的微图形的细胞簇的分化诱导开始算起的第2天至第4天进行。
作为用于由YSMC分化为EPC的培养方法、培养基组成(基础培养基、分化诱导因子、其它添加物等的种类及使用量)、培养条件、其它与培养相关的事项，例如能够参照Ohta,R.等，J.Vis.Exp.(148),e59823,doi:10.3791/59823(2019)。例如，可以在EPC分化工序用的培养基中适量添加VEGF、FGF2(bFGF)、SCF、TGFb抑制剂(例如，SB431542)等分化诱导因子。
本发明的细胞群的制造方法根据需要可以还包括其它工序。作为这样的任意工序，例如可举出由通过EPC分化工序得到的EPC进一步分化为其它细胞的培养工序。
本发明的一个实施方式中，本发明的细胞群的制造方法可以还包括由EPC分化为CD34+CD32+卵黄静脉生血内皮细胞(vitelline venous hemogenic endothelial cell：VVHEC)的培养工序(VVHEC分化工序)。已知VVHEC是源自卵黄囊中胚层的HEC，是负责胎儿期早期的卵黄囊内的造血的细胞，在本发明中，是能够由YSMC经EPC进行分化的细胞。作为VVHEC的细胞标志物，除了CD34及CD32以外，还已知FN1、ACTA2及LYVE1，以及作为静脉标志物的NR2F2、APLNR及PROX1等，通过它们中的1种或2种以上(优选全部)是否为阳性能够确定(阳性为VVHEC、阴性为VVHEC以外)。
VVHEC分化工序适合在EPC培养工序之后的规定期间(例如，约2天)进行，换言之，在前述的由多能干细胞向具有规定的微图形的细胞簇的分化诱导开始算起的第4天至第6天进行。
作为用于由EPC分化为VVHEC的培养方法、培养基组成(基础培养基、分化诱导因子、其它添加物等的种类及使用量)、培养条件、其它与培养相关的事项，例如能够参照Matsybara等，Biochemical and Biophysical Research Communications,515(1),2019。例如，可以在VVHEC分化工序用的培养基中适量添加VEGF、SCF、Flt-3L、IL-3、IL-6、TPO等分化诱导因子。
本发明的细胞群的制造方法可以还包括由通过VVHEC分化工序得到的VVHEC分化为其它细胞，例如单核细胞/巨噬细胞(CD14阳性)、红细胞·中幼粒细胞祖细胞(CD33阳性)等的培养工序。用于由VVHEC分化为这些细胞的培养方法、培养基组成(基础培养基、分化诱导因子、其它添加物等的种类及使用量)、培养条件、其它与培养相关的事项可以与已知的方法相同。在由VVHEC分化为单核细胞/巨噬细胞(CD14阳性)、红细胞·中幼粒细胞祖细胞(CD33阳性)等的情况下，例如能够参照Gene I.Uenishi等，Nature Communications(2018)9:1828。
-类器官或立体脏器的制造方法-
本发明的类器官或立体脏器的制造方法包括对通过本发明的细胞簇的制造方法得到的细胞簇、或通过本发明的细胞群的制造方法得到的细胞群的至少一部分进行三维培养的工序。
本说明书中“三维培养”是指在包埋于包含成为细胞外基质等的支架的成分的培养基中的状态下培养细胞。作为基于三维培养的类器官或立体脏器的制造方法，已知有各种方法及实施方式(例如，参照前述专利文献1)。本发明中，作为成为用于制造类器官或立体脏器的原料的细胞，能够通过除了使用本发明的细胞簇或细胞群以外、与以往一般的或已知的制造方法相同的方法及实施方式制造类器官或立体脏器。
另外，近年来，被称为类器官中的一种、以三维方式构建早期胚胎(early embryo)的胚状体(embryoid)及类原肠胚(gastruloid)的制造方法也是已知的。通过使用包含YSMC、AEC这样的位于胚胎和外胚层的边界区域的细胞的本发明的细胞簇或细胞群，有能够制造得以更精致地重现结构的胚状体或类原肠胚的可能性。
-试剂盒-
本发明的另一侧面为提供用于通过在Wnt信号调节下二维培养多能干细胞从而由多能干细胞制造富集有所期望的细胞的细胞簇的试剂盒。本发明的试剂盒例如为包含1种以上的Wnt信号活化剂的富集有卵黄囊中胚层细胞(YSMC)的细胞簇的制造用试剂盒、或包含1种以上的Wnt信号抑制剂的富集有羊膜外胚层细胞(AEC)的细胞簇的制造用试剂盒。对于与这样的试剂盒有关的事项，例如Wnt信号活化剂、Wnt信号抑制剂、使用上述各试剂盒的培养方法、能够在试剂盒中包含的其它构成部件等，在本说明书中，与关于细胞簇的制造方法、细胞群的制造方法等的内容中记载的事项相同，可以参照这些记载事项。
-定义-
·多能干细胞
本说明书中“多能干细胞(pluripotent stem cell)”是指能够分化成生物体的具有各种不同形态、功能的组织、细胞，具有能够分化成三个胚层(内胚层、中胚层、外胚层)中的任何系统的细胞的能力的干细胞。本发明中能够使用的多能干细胞没有特别限定，例如可举出人工多能干细胞(有时也称为iPS细胞)、胚胎干细胞(有时也称为ES细胞)、通过核移植得到的源自克隆胚胎的胚胎干细胞、精原干细胞、胚胎生殖细胞等。
“人工多能干细胞”(iPS细胞)是指向哺乳动物体细胞或未分化干细胞中导入特定的因子(核重新编程因子(nuclear reprogramming factor))，通过重新编程而得到的细胞。现在，有各种“人工多能干细胞”，也能够使用下述细胞：山中等人通过向小鼠成纤维细胞中导入Oct3/4·Sox2·Klf4·c-Myc这4种因子而建立的iPSC(Takahashi K,YamanakaS.,Cell,(2006)126:663-676)；此外，将相同的4种因子导入人成纤维细胞而建立的源自人细胞的iPSC(Takahashi K,Yamanaka S.等，Cell,(2007)131:861-872.)；在导入上述4种因子后，以Nanog的表达为指标进行筛选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)；用不包含c-Myc的方法制作的iPS细胞(Nakagawa M,Yamanaka S.等，Nature Biotechnology,(2008)26,101-106)；用VIRUS-Free法导入6种因子而建立的iPS细胞(Okita K等，Nat.Methods 2011May；8(5):409-12,OkitaK等，Stem Cells.31(3):458-66.)。另外，也能够使用下述细胞：Thomson等人制作的通过导入OCT3/4·SOX2·NANOG·LIN28这4种因子而建立的人工多能干细胞(Yu J.,Thomson JA.等，Science(2007)318:1917-1920.)；Daley等人制作的人工多能干细胞(Park IH,DaleyGQ.等，Nature(2007)451:141-146)；樱田等人制作的人工多能干细胞(日本特开2008-307007号)等。此外，也能够使用公开的全部非专利文献(例如，Shi Y.,Ding S.,等，CellStem Cell,(2008)Vol3,Issue5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.等，Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,等，Nature Biotechnology,(2008)26,NO7,795-797)或专利文献(例如，日本特开2008-307007号、日本特开2008-283972号、US2008/2336610、US2009/047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/006997、WO2009/007852)中记载的本领域已知的任何人工多能干细胞。
作为人工多能干细胞(iPS细胞)，能够利用NIH、理研(理化学研究所)、京都大学等建立的各种iPS细胞株。例如，对于人iPS细胞株而言，可举出理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学的201B7株、253G1株、253G4株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、625A4株、648A1株、1201C1株、1205D1株、1210B2株、1231A3株、1383D2株、1383D6株等。或者，也可以使用由京都大学、Cellular DynamicsInternational等提供的临床级的细胞株，以及使用这些细胞株制作的研究用及临床用的细胞株等。
作为“胚胎干细胞”(ES细胞)，对于小鼠ESC而言，能够利用inGenious targetinglaboratory公司、理研(理化学研究所)等建立的各种小鼠ES细胞株，对于人ES细胞而言，能够利用NIH、理研、京都大学、Cellartis公司建立的各种人ES细胞株。例如，作为人ES细胞株，能够利用NIH的CHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WisCellResearch的H1株、H9株、理研的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。或者，也可以使用临床级的细胞株，以及使用这些细胞株制作的研究用及临床用的细胞株等。
·细胞标志物
本说明书中“细胞标志物”是指在规定的细胞型中特异性表达(阳性标志物)或不表达(阴性标志物)的基因，具体而言，通过基因组中的该基因的转录而作为mRNA、或通过该mRNA的翻译而作为蛋白质生成(阳性标志物)或未生成(阴性标志物)的物质。细胞标志物优选能够通过荧光物质标记(染色)，并且是能够容易地对表达该细胞标志物的细胞进行检测、浓缩、分离等的、在细胞表面表达的蛋白质(细胞表面标志物)。
标志物基因为“阳性”是指该基因的mRNA或蛋白质的表达量能够通过对于本领域技术人员而言为常规或已知的方法检测、或比规定的阈值(背景值(background level)等)高。标志物基因为“阴性”是指该基因的mRNA或蛋白质的表达量不能通过对于本领域技术人员而言为常规或已知的方法检测、或比规定的阈值(背景值等)低。
对于细胞标志物是阳性还是阴性而言，本领域技术人员能够通过常规或已知的方法从而根据定性或定量的结果来判定。作为蛋白质的细胞标志物能够利用使用该蛋白质的特异性抗体的免疫学试验、例如ELISA、免疫染色、流式细胞术等进行检测或测定表达量。作为mRNA的细胞标志物能够利用使用该mRNA的特异性核酸的试验、例如RT-PCR(包含定量PCR)、微阵列、生物芯片等进行检测或测定表达量。
·类器官
本说明书中“类器官”是指组合了多种细胞且人为创造的与各种脏器、组织等类似的三维结构体。类器官中也包括脏器类器官、癌类器官等，广义而言，也包括以三维方式构建早期胚胎的结构的胚状体(例如，Science 07Jun 2019:Vol.364,Issue 6444,pp.948-951；DOI:10.1126/science.aax0164)、类原肠胚(例如，Nature volume 582,pages 410-415(2020))。“脏器类器官”不仅包括具有与各种脏器或组织类似的功能和结构的、处于比较成熟的阶段的类器官，还包括处于这样的复杂化的早期阶段的被称为“器官芽(organbud)”、“原基”等的结构体。对于脏器类器官而言，已知例如肝脏、胰脏、肾脏、心脏、肺脏、脾脏、食道、胃、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、生殖腺、脑、脊髓等各种脏器类器官(例如，参照https://www.nejm.org/doi/pdf/10.1056/NEJMra1806175、https://www.nature.com/articles/s41568-018-0007-6、http://www.amsbio.com/brochures/organoid-culture-handbook.pdf)。
类器官的立体结构能够通过肉眼或显微镜观察来确认。除了这样的立体结构的确认以外，能够基于对应于脏器含有的细胞的标志物、特别是脏器的实质细胞的标志物是否为阳性，进一步优选基于在培养上清液中是否分泌了这些标志物的蛋白质来判断。
·立体脏器
本说明书中“立体脏器”也称为成熟脏器类器官，是指包含比脏器类器官进一步成熟的细胞群或结构的结构体。
对于是否由脏器类器官得到了立体脏器而言，例如能够从下述一个或多个观点来判定：结构体中的细胞的密度(是否超过规定的基准等)；结构体的立体形状(是否比固定水准更立体等)；功能、性状(是否获得了代谢功能等规定的功能或性状等)；细胞标志物(细胞标志物的基因或蛋白质的表达是否为阳性、阳性细胞的密度是否超过规定的基准、培养上清液中的标志物蛋白质分泌量是否超过规定的基准等)等。上述细胞的密度、立体形状、功能、性状、细胞标志物等能够根据脏器类器官及立体脏器来适当设定，例如，对于是否达到与生物体内的脏器相同程度或近似水准而言，可以按照上述的判定基准。
本发明中的多能干细胞的集落、细胞簇、细胞群、类器官、立体脏器等中包含的细胞可以源自于人，也可以源自人以外的动物，例如小鼠、大鼠、犬、猪、猴等哺乳动物。例如，在脏器类器官或立体脏器的用途为向人移植、人的医药的开发(在以往的动物实验、人细胞试验等中难以发现的引起药物中毒的药物的检测等)等情况下，细胞优选源自于人。
本说明书中，对于细胞、化合物、其它物质，只要没有另外说明，则以单数形式记载的事项和以复数形式记载的事项可以相互转换和解释。
“包含(comprise、include、contain等)”表示包含但不限定于该语句后面的要素。因此，虽然启示包含该语句后面的要素，但不启示排除其它任意的要素。另一方面，“由……组成(consisting of等)”是指包含且限定于该语句后面的所有要素。因此，“由……组成”表示所列举的要素是要求的或必需的，实质上不存在其它要素。“本质上由……组成(consisting essentially of等)”是指包含该语句后面的任意的要素，且限定于不影响本发明中对于该要素所确定的活性或作用的其它要素。因此，“本质上由……组成”表示所列举的要素是要求的或必需的，但其它要素是任意选择的，根据它们是否影响所列举的要素的活性或作用而有时存在，有时不存在。
实施例
以下的实施例中，“第……天”表示自人iPS细胞集落的分化诱导开始起的天数。“第0天”为在Wnt信号调节下开始培养时。
[实施例1]Wnt信号调节下的卵黄囊中胚层细胞及羊膜外胚层细胞的制作
[1]通过Wnt信号活化培养工序制作人卵黄囊中胚层细胞(本发明的第1实施方式)
将人iPS细胞(625A4；京都大学iPS研究所)在AK02N(Ajinomoto)(10cm培养皿；8ml、24孔板；0.5ml)中于5％CO2、37℃培养6～7天，形成直径500～700μm的iPS细胞集落。将所得到的集落在添加了BMP4(80ng/ml)、VEGF(80ng/ml)及CHIR99021(2μM)的Essential 8培养基(Gibco)(10cm培养皿；8ml、24孔板；0.5ml)中，于5％CO2、37℃培养2天(第0～2天)。
[2]通过Wnt信号抑制培养工序制作人羊膜外胚层细胞(本发明的第2实施方式)
将人iPS细胞(625A4；京都大学iPS研究所)在AK02N(Ajinomoto)(10cm培养皿；8ml、24孔板；0.5ml)中于5％CO2、37℃培养6～7天，形成直径500～700μm的iPS细胞集落。将所得到的集落在添加了BMP4(80ng/ml)、VEGF(80ng/ml)及IWP-2(2μM)的Essential 8培养基(Gibco)(10cm培养皿；8ml、24孔板；0.5ml)中，于5％CO2、37℃培养2天(第0～2天)。
作为对照，与[1]及[2]同样地形成iPS细胞集落后，将所得到的集落在添加了BMP4(80ng/ml)及VEGF(80ng/ml)的Essential 8培养基(Gibco)(10cm培养皿；8ml、24孔板；0.5ml)中于5％CO2、37℃培养2天(第0～2天)。
[3]通过免疫细胞染色的细胞簇的分化标志物分析
通过[1]或[2]的第0～2天的工序实施分化诱导后，除去培养基，用PBS(-)(GIBCO)清洗1次后，以500μl/24孔的容量对细胞添加4％多聚甲醛，于室温放置15分钟。然后，用PBS(-)清洗3次，于4℃保存过夜。然后，以500μl/24孔的容量对细胞添加无血清型蛋白封闭(PROTEIN BLOCK SERUM-FREE blocking)溶液[DAKO,X909]，于室温放置60分钟，进行封闭。然后，以500μl/24孔的容量添加在1％PBS(-)封闭液中加入了靶标抗原的任一种一抗(1/100Anti-GATA6(Abcam,ab22600),1/50Anti-Brachyury T(R&D,AF2085),1/400Anti-Sox2(CST,3579P2),1/100Anti-CDX2(R&D,MAB3665),1/50Anti-AP-2a(Santa Cruz,sc-12726))的一抗溶液，于室温静置60分钟或于4℃静置过夜。接下来，用PBS(-)清洗3次后，以500μl/24孔的容量添加在1％PBS(-)封闭液中加入了与一抗对应的二抗(1/1000Alexa Flour555,1/1000Alexa Flour 647及1/1000DAPI-HCB Hycult Biotech,HM2167)的二抗溶液，于室温孵育60分钟。然后，用PBS(-)清洗3次后，以PBS(-)500μl/24孔的容量添加、保持，使用LSM880共聚焦激光显微镜(Zeiss)实施荧光图像的取得。所取得的图像的处理及定量分析使用图像分析软件“Fiji”来实施。
对于[1]的第2天的细胞簇，涉及细胞标志物Brachyury、GATA6及FOXF1的分析结果示于图1。确认到根据本发明的第1实施方式，在培养基中添加了Wnt信号活化剂、即CHIR99021的情况(+CHIR)与不添加的情况(-)相比，形成富集有Brachyury阴性、GATA6阳性且FOXF1阳性的YSM，换言之，外缘部的YSMC区域增加的细胞簇(图1B、C)。需要说明的是，通过光学显微镜的观察像确认到通过本发明的第1实施方式得到的细胞簇与通过以往的方法得到的细胞簇在形态学上不同(图1A)。另外，如这些图所示，可知就通过本发明的方法得到的细胞簇而言，规定的细胞形成了在二维上明确的层状结构。
对于[1]及[2]各自的第2天的细胞簇，涉及细胞标志物GATA6、SOX2、CDX2及TFAP2A的分析结果示于图2。确认到根据本发明的第2实施方式，在培养基中添加了Wnt信号抑制剂、即IWP-2的情况(+IWP-2)与不添加的情况(-)相比，形成富集有CDX2阳性(中段)且TFAP2A阳性(下段)的AEC，换言之，在外缘部具备AEC区域的细胞簇。与在培养基中添加了CHIR99021的情况(+CHIR)不同，在添加了IWP-2的情况下(+IWP-2)，外缘部处的GATA6阳性细胞为少数(上段)。还确认到在+CHIR的条件下，CDX2阴性的区域(中段)为GATA6阳性(上段)，在+IWP-2的条件下，CDX2阳性(中段)的区域为GATA6阴性(上段)。
[4]人卵黄静脉生血内皮细胞的制作
通过[1]制作人卵黄囊中胚层细胞后，更换为在Essential 6培养基(Gibco)(10cm培养皿；8ml)中添加了VEGF(80ng/ml)、FGF2(25ng/ml)、SCF(50ng/ml)及SB431542(2μM)的培养基，于5％CO2、37℃进一步培养2天，诱导血细胞-血管内皮共同祖细胞。然后，更换为在Stempro-34SFM(Gibco)(10cm培养皿；8ml)中添加了VEGF(80ng/ml)、SCF(50ng/ml)、Flt-3L(50ng/ml)、IL-3(50ng/ml)、IL-6(50ng/ml)及TPO(5ng/ml)的培养基，于5％CO2、37℃培养2天后，更换为从上述组成的培养基中除去VEGF的培养基，于5％CO2、37℃培养2天，由此诱导CD34阳性且CD32阳性的卵黄静脉生血内皮细胞。
[5]通过免疫细胞染色分析细胞群的分化标志物
通过[4]的第4-6天的工序实施分化诱导后，变更为使用1/50Anti-CD34(Abcam,ab81289)作为一抗，除此以外，通过与[3]相同的步骤进行免疫细胞染色。对于[4]的第6天的细胞群，涉及细胞标志物Brachyury及CD34的分析结果示于图3(A)。确认到自根据本发明的第1实施方式得到的细胞簇(+CHIR)的外缘部的YSM区域出现丰富的CD34阳性的血管内皮祖细胞。
[6]使用流式细胞仪的分化标志物分析
通过[4]的第6-8天的工序分化诱导卵黄静脉生血内皮细胞后，除去培养基，用PBS(-)(GIBCO)清洗2次后，以3mL/培养皿的容量添加TrypLE Express(Gibco)。于37℃放置15分钟。然后，通过用P1000微量移液器进行吹吸来分离细胞并回收至15mL管，添加7mL的Stempro-34SFM(Gibco)培养基后，以1000rpm、室温、5分钟的条件进行离心。除去上清液后，使用包含1mM EDTA、4％FBS的PBS(-)缓冲液，清洗1次后，用50μl的一抗溶液(1/50PE-CD32(BioLegend,Cat:303205),BV421-CD34(BD Biosciences,Cat:562577)in BD HorizonBrilliant TM Stain Buffer)悬浮细胞，在冰上静置30分钟。接下来，用包含1mM EDTA、4％FBS的PBS(-)缓冲液清洗2次后，用包含1/1000DAPI、1mM EDTA、4％ FBS的PBS(-)缓冲液悬浮细胞，移至40μm带细胞滤网盖的试管。使用所得到的抗体染色细胞悬浮液，通过BDLSRFortessa流式细胞仪实施分化标志物的分析。从流式细胞仪得到的数据的分析使用FlowJo实施。
对于[4]的第8天的细胞群的流式细胞仪的结果示于图3(B)。确认到与对照(-)相比，自根据本发明的第1实施方式得到的细胞簇(+CHIR)的外缘部的YSM区域产生了更多的CD34阳性且CD32阳性的卵黄静脉生血内皮细胞，换言之，YSM区域中的CD34阳性的血管内皮祖细胞更具有向为CD32阳性的卵黄静脉生血内皮细胞的分化能力。

Claims (15)

1.方法，其是由多能干细胞制造富集有所期望的细胞的细胞簇的方法，所述方法包括在Wnt信号调节下二维培养多能干细胞的工序。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述所期望的细胞是卵黄囊中胚层细胞，所述在Wnt信号调节下二维培养多能干细胞的工序是在活化Wnt信号的条件下二维培养多能干细胞的Wnt信号活化培养工序。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述Wnt信号活化培养工序是使用添加了Wnt信号活化剂的培养基二维培养多能干细胞的工序。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述Wnt信号活化剂是GSK3抑制剂。
5.如权利要求2所述的方法，其中，所述Wnt信号活化培养工序在开始培养所述多能干细胞时进行。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述多能干细胞是人工多能干细胞。
7.细胞群的制造方法，其还包括在权利要求2记载的Wnt信号活化培养工序之后，使所得到的所述卵黄囊中胚层细胞分化为CD34+血管内皮祖细胞的培养工序。
8.如权利要求7所述的方法，其还包括使所述CD34+血管内皮祖细胞分化为CD34+CD32+卵黄静脉生血内皮细胞的培养工序。
9.细胞簇，其是通过权利要求1所述的方法而得到的。
10.细胞群，其是通过权利要求7所述的方法而得到的。
11.类器官或立体脏器的制造方法，其包括对权利要求9所述的细胞簇或权利要求10所述的细胞群的至少一部分进行三维培养的工序。
12.类器官或立体脏器，其是通过权利要求11所述的制造方法而得到的。
13.如权利要求1所述的方法，其中，所述所期望的细胞是羊膜外胚层细胞，所述在Wnt信号调节下二维培养多能干细胞的工序是在Wnt信号被抑制的条件下二维培养多能干细胞的Wnt信号抑制培养工序。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述Wnt信号抑制培养工序使用添加了Wnt信号抑制剂的培养基进行。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述Wnt信号抑制剂为IWP-2。
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