JP2024506946A - マイクロプレートウェルユニットを使用するオルガノイド継代培養のための方法 - Google Patents

Abstract

開示されるものは、スフェロイド、チューモロイド、オルガノイド、および／または他の多細胞体の自動化された細胞継代培養に関連する、種々の実施形態である。オルガノイドは、マイクロウェルプレートのウェルユニット内に配置されるヒドロゲル内で培養され得る。ウェルユニットは、少なくとも１つのチャネルを介して、二次ウェル区分に流動的に接続される、一次ウェル区分を含み、ヒドロゲルは、ウェルユニットの一次ウェル区分内に配置される。ヒドロゲルは、ヒドロゲル断片の中に放散され、それによって、オルガノイドをヒドロゲルから分離する。ヒドロゲル断片は、ウェルユニットから除去される一方、オルガノイドは、ウェルユニット内に留まったままである。留まったままであるオルガノイドは、オルガノイド断片および対応する破片に破砕される。新鮮な培養環境が、オルガノイド断片を使用して生成される。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、その開示全体が、参照することによってその全体として組み込まれる、２０２１年２月１９日に出願された、米国仮出願第６３／１５１，０８２号の優先権および利益を主張する、ＰＣＴ国際特許出願として、２０２２年２月１８日に出願されている。

３次元（３Ｄ）環境内で細胞を培養することは、人体内で観察されるものとより厳密に合致する、細胞の挙動および形態構造をもたらす。本種類の培養のために使用される、３Ｄヒドロゲル／ヒドロスキャフォールドは、一意の属性を有し、すなわち、細胞は、３Ｄ空間内の具体的な場所内に堆積され、長期期間にわたって、定位置に留まったままであることができる。これは、構造（例えば、胚様体、融合胚様体、スフェロイド、チューモロイド、オルガノイド、および／または他の多細胞体）の生成、および経時的な細胞の相互作用および成長が観察される、共培養環境を可能にする。

本開示の側面は、スフェロイド、チューモロイド、オルガノイド、および／または他の多細胞体の自動化された継代培養に関連する。種々の実施形態によると、オルガノイドおよび他の多細胞体が、マイクロプレートのウェル内で、経時的に増殖および成長するため、継代培養が、死細胞および毒性副産物と関連付けられる破片を除去し、総細胞数を低減させ、より小さなオルガノイドの同種集団を取得し、継続的な細胞増殖および繁殖を促進するために要求される。本開示の継代培養方法は、時間を低減させ、コストを低減させ、付加的な実験室機器（例えば、円錐形管、遠心分離機等）および遠心分離に対する必要性を排除することによって、オルガノイドまたは多細胞体の継代培養と関連付けられる、従来的な方法を改良する。

一実施形態では、とりわけ、オルガノイドを継代培養するための方法は、マイクロウェルプレートのウェルユニット内に配置されるヒドロゲル内で、１つまたはそれを上回るオルガノイドを培養するステップを含む。ウェルユニットは、少なくとも１つのチャネルを介して、二次ウェル区分に流動的に接続される、一次ウェル区分を含み、第１のヒドロゲルは、ウェルユニットの一次ウェル区分内に配置される。ヒドロゲルは、ヒドロゲル断片の中に放散され、それによって、１つまたはそれを上回るオルガノイドをヒドロゲルから分離する。ヒドロゲル断片は、ウェルユニットから除去される一方、１つまたはそれを上回るオルガノイドは、ウェルユニット内に留まったままである。１つまたはそれを上回るオルガノイドは、オルガノイド断片および対応する破片に破砕される。オルガノイド断片を含む、新鮮な培養環境が、生成される。

１つまたはそれを上回る側面では、少なくとも１つのチャネルは、ウェルユニットの底部表面と一次ウェル区分および二次ウェル区分の共有側壁の底部部分との間の少なくとも１つの間隙によって形成される。いくつかの実施例では、少なくとも１つの間隙の高さは、約１０ミクロン～最大約１００ミクロンの間でサイズ指定され得る。種々の側面では、第１のヒドロゲルをヒドロゲル断片の中に放散させるステップはさらに、ヒドロゲルを冷却するステップを含む。ヒドロゲルを冷却するステップはさらに、液体培地をウェルユニットの中に分注するステップを含み得る。いくつかの側面では、液体培地は、摂氏約１０度またはそれを下回る温度にある。いくつかの側面では、温度は、摂氏約４度またはそれを下回る。

種々の側面では、本方法はさらに、液体取扱器を介して、ウェルユニットの一次ウェル区分から１つまたはそれを上回るオルガノイドを収集するステップと、液体取扱器内の１つまたはそれを上回るオルガノイドに少なくとも１つの剪断力を印加するステップとを含む。１つまたはそれを上回るオルガノイドは、少なくとも１つの剪断力の結果として、オルガノイド断片および対応する破片に破砕され得る。種々の側面では、本方法はさらに、液体取扱器を介して、オルガノイド断片および対応する破片をウェルユニットの一次ウェル区分の中に堆積させるステップを含むことができる。１つまたはそれを上回る側面では、少なくとも１つの剪断力を印加するステップは、液体取扱器を操作し、１つまたはそれを上回るオルガノイドを液体取扱器内で垂直に運動させるステップを含む。

種々の側面では、ヒドロゲル断片を除去するステップは、液体取扱器をウェルユニットの二次ウェル区分の中に挿入するステップと、少なくとも１つのチャネルを介して、ヒドロゲル断片をウェルユニットの一次ウェル区分から二次ウェル区分の中に移送するステップと、液体取扱器を介して、ヒドロゲル断片を二次ウェル区分から収集するステップとを含むことができる。１つまたはそれを上回る側面では、本方法は、少なくとも１つのチャネルから、破片断片またはオルガノイド断片のうちの少なくとも１つを除去するために、少なくとも１つのチャネルを洗流するステップを含む。１つまたはそれを上回る側面では、本方法は、少なくとも１つのチャネルを介して、対応する破片をウェルユニットの二次ウェル区分に運動させるステップを含む。

種々の側面では、オルガノイド断片を含む、新鮮な培養環境を生成するステップはさらに、液体取扱器を介して、オルガノイド断片を収集するステップと、別のウェルユニットまたはそのウェルユニットのうちの一方の一次ウェル区分の底部表面上に新鮮なヒドロゲルを堆積させるステップとを含む。いくつかの側面では、オルガノイド断片は、一次ウェル区分の底部表面上に新鮮なヒドロゲルを堆積させるステップに先立って、新鮮なヒドロゲル内に埋め込まれる。他の側面では、オルガノイド断片は、新鮮なヒドロゲルが、一次ウェル区分の底部表面上に堆積された後、新鮮なヒドロゲル内に埋め込まれる。１つまたはそれを上回る側面では、ウェルユニットを含むマイクロウェルプレートは、インキュベータ内に設置される。

別の実施形態では、とりわけ、方法は、第１のマイクロプレートの第１のウェルユニットの底部表面上に配置されるヒドロゲルから、１つまたはそれを上回る細胞体を分離するステップを含む。第１のウェルユニットは、少なくとも１つのチャネルを介して、相互に流動的に接続される、培養ウェルと、供給ウェルとを含み、第１のヒドロゲルは、第１のウェルユニットの培養ウェル内に配置される。ヒドロゲルは、ウェルユニットの供給ウェルを介して、第１のウェルユニットから除去され得る一方、１つまたはそれを上回る細胞体は、第１のウェルユニットの培養ウェル内に留まったままである。１つまたはそれを上回る細胞体は、細胞体断片および対応する破片に破砕され得る。対応する破片は、第１のウェルユニットの供給ウェルから除去され得る一方、細胞体断片は、第１のウェルユニットの培養ウェル内に留まったままである。新鮮な培養環境が、第１のウェルユニットまたは第２のウェルユニットの一方内に生成され、新鮮な培養環境は、細胞体断片を含む。

種々の側面では、少なくとも１つのチャネルは、培養ウェルと供給ウェルとの間に、約２５ミクロンを上回るサイズの物体の通過を阻止するように、サイズ指定および成形される。種々の側面では、ヒドロゲルから１つまたはそれを上回る細胞体を分離するステップはさらに、ヒドロゲルを液化させる温度まで、ヒドロゲルを冷却するステップを含む。１つまたはそれを上回る側面では、本方法は、ピペットを介して、培養ウェルから１つまたはそれを上回る細胞体を除去するステップと、ピペットを介して、１つまたはそれを上回る剪断力を１つまたはそれを上回る細胞体に印加するステップとを含む。１つまたはそれを上回る細胞体は、１つまたはそれを上回る印加された剪断力に基づいて、細胞体断片および対応する破片に破砕され得る。種々の側面では、第１のウェルユニットまたは第２のウェルユニットの一方内に新鮮な培養環境を生成するステップはさらに、新鮮なヒドロゲルを第１のウェルユニットまたは第２のウェルユニットの一方内に堆積させるステップであって、細胞体断片は、新鮮なヒドロゲル内に埋め込まれる、ステップと、新鮮なヒドロゲル内に埋め込まれる細胞体断片を培養するステップとを含む。

本開示の他のシステム、方法、特徴、および利点が、以下の図面および詳細な説明の吟味に応じて、当業者に明白である、または明白な状態になるであろう。全てのそのような付加的なシステム、方法、特徴、および利点が、本説明内に含まれ、本開示の範囲内にあり、付随の請求項によって保護されることが意図される。加えて、説明される実施形態の全ての随意のおよび好ましい特徴および修正が、本明細書に教示される開示の全ての側面において使用可能である。さらに、従属請求項の個々の特徴、および説明される実施形態の全ての随意のおよび好ましい特徴および修正が、相互に組み合わせ可能かつ交換可能である。

本開示の多くの側面は、以下の図面を参照して、より深く理解されることができる。図面内の構成要素は、必ずしも縮尺通りではなく、代わりに、本開示の原理を明確に例証することに重点が置かれている。さらに、図面において、同様の参照番号は、いくつかの図全体を通して、対応する部品を指定する。

図１は、本開示の種々の実施形態による、細胞培養と関連付けられるマイクロプレートのウェルユニットの断面の実施例を図示する。

図２Ａ－２Ｂは、本開示の種々の実施形態による、図１のウェルユニットの断面図の実施例を図示しながら、液体培地を図１のウェルユニットから除去するためのワークフローを描写する。 図２Ａ－２Ｂは、本開示の種々の実施形態による、図１のウェルユニットの断面図の実施例を図示しながら、液体培地を図１のウェルユニットから除去するためのワークフローを描写する。

図３Ａ－３Ｈは、本開示の種々の実施形態による、図１のウェルユニットの断面図の実施例を図示し、各図は、細胞継代培養と関連付けられるワークフローステップの実施例を表す。 図３Ａ－３Ｈは、本開示の種々の実施形態による、図１のウェルユニットの断面図の実施例を図示し、各図は、細胞継代培養と関連付けられるワークフローステップの実施例を表す。 図３Ａ－３Ｈは、本開示の種々の実施形態による、図１のウェルユニットの断面図の実施例を図示し、各図は、細胞継代培養と関連付けられるワークフローステップの実施例を表す。 図３Ａ－３Ｈは、本開示の種々の実施形態による、図１のウェルユニットの断面図の実施例を図示し、各図は、細胞継代培養と関連付けられるワークフローステップの実施例を表す。 図３Ａ－３Ｈは、本開示の種々の実施形態による、図１のウェルユニットの断面図の実施例を図示し、各図は、細胞継代培養と関連付けられるワークフローステップの実施例を表す。 図３Ａ－３Ｈは、本開示の種々の実施形態による、図１のウェルユニットの断面図の実施例を図示し、各図は、細胞継代培養と関連付けられるワークフローステップの実施例を表す。 図３Ａ－３Ｈは、本開示の種々の実施形態による、図１のウェルユニットの断面図の実施例を図示し、各図は、細胞継代培養と関連付けられるワークフローステップの実施例を表す。 図３Ａ－３Ｈは、本開示の種々の実施形態による、図１のウェルユニットの断面図の実施例を図示し、各図は、細胞継代培養と関連付けられるワークフローステップの実施例を表す。

図４は、本開示の種々の実施形態による、細胞継代培養に関連する例示的方法のフローチャートを図示する。

詳細な説明
本開示は、スフェロイド、チューモロイド、オルガノイド、および／または他の多細胞体の自動化された継代培養のための方法に関する。マイクロウェルのマイクロプレートは、生体外で、胚様体、融合胚様体、スフェロイド、オルガノイド、および／または他の多細胞体の増殖、培養、監視、および分析のために使用される。種々の実施形態によると、スフェロイド、チューモロイド、オルガノイド、および他の多細胞体が、マイクロプレートのウェル内で、経時的に増殖および成長するため、継代培養が、死細胞および毒性副産物と関連付けられる破片を除去し、総細胞数を低減させ、より小さなオルガノイドの同種集団を取得し、継続的な細胞増殖および繁殖を促進するために要求される。本開示の継代培養方法は、時間を低減させ、コストを低減させ、付加的な実験室機器（例えば、円錐形管、遠心分離機等）および遠心分離に対する必要性を排除することによって、スフェロイド、チューモロイド、オルガノイド、または他の多細胞体の継代培養と関連付けられる、従来的な方法を改良する。加えて、種々の実施形態によると、本開示の継代培養方法は、オルガノイドまたは多細胞体のサイズ範囲を制御および調節することが可能であり、それによって、より多くの制御されたかつ同種集団を提供することによって、従来的な方法を改良する。

種々の実施形態によると、本開示の継代培養方法は、少なくとも１つのチャネルを介して、相互に流動的に接続される、２つの共役ウェルを備える、ウェルユニットを有する、マイクロプレートを使用し、２０２０年１０月２２日に出願され、「Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｕｔｏｍａｔｉｎｇ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ」と題された、米国仮出願第６３／０９４，９４６号、および２０２０年１２月２８日に出願され、「ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ＷＥＬＬＳ ＦＯＲ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＩＶＡＴＩＯＮ」と題された、米国仮出願第６３／１３１，１２３号（その両方が、参照することによってそれらの全体として本明細書に組み込まれる）において説明される、マイクロプレートを含む。図１は、本開示の継代培養方法と関連して使用され得る、マイクロプレートのウェルユニット１００の実施例を図示する。特に、図１は、本開示の種々の実施形態による、胚様体、融合胚様体、スフェロイド、オルガノイド、または他の多細胞体を増殖、培養、監視、および化学分析するために使用され得る、マイクロプレートのウェルユニット１００の例示的図を図示する。

図１に示されるように、細胞体１０３（例えば、スフェロイド、チューモロイド、オルガノイド等）は、ウェルユニット１００内に配置され、液体培地１０９によって囲繞される、ヒドロゲル１０６（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））の半球体内に埋め込まれる。種々の実施形態によると、液体培地１０９は、所望の多細胞体の増殖を生成および／または刺激するために、適切な増殖因子および補完物を含有することができる。好適であり得る例示的増殖因子は、アンジオポエチン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、毛様体神経栄養因子、コロニー刺激因子、エフリン、上皮増殖因子、エリスロポエチン、線維芽細胞増殖因子、グリア由来神経栄養因子、肝細胞増殖因子、インスリン、インスリン様増殖因子、インターロイキン、白血病抑制因子、ケラチノサイト増殖因子、ニューレグリン、ニューロトロフィン、血小板由来増殖因子、形質転換増殖因子、腫瘍壊死因子（α）、血管内皮増殖因子、および／または同様物を含む。

種々の実施形態によると、図１のウェルユニット１００は、一次ウェル区分１１２と、二次ウェル区分１１５とを備える。種々の実施例では、一次ウェル区分１１２および二次ウェル区分１１５は、マイクロプレートの傾動に応答して、一次ウェル区分１１２と二次ウェル区分１１５との間の液体（例えば、液体培地１０９）の重力流を促進するために、少なくとも１つのチャネル１１８を介して、相互に流体接続している。一次ウェル区分１１２と二次ウェル区分１１５との間で、液体培地１０９を交換することは、毒性副産物を除去し、増殖中の細胞培養物に新鮮な栄養物を供給する。図１の実施例では、ヒドロゲル１０６および細胞体１０３は、ウェルユニット１００の一次ウェル区分１１２内に配置される。

種々の実施例によると、少なくとも１つのチャネル１１８はさらに、あるサイズ（例えば、約２５ミクロン（μ）を上回る）の寸法（直径、高さ、幅等）を有する物体が、一方のウェル区分から他方のウェル区分に通過しないように阻止するようにサイズ指定および成形される。いくつかの実施例では、少なくとも１つのチャネル１１８の高さは、約１０ミクロン～約１００ミクロンの間でサイズ指定され得る。他の実施例では、少なくとも１つのチャネルの高さは、約１０ミクロン～約２５ミクロン間でサイズ指定され得る。例えば、少なくとも１つのチャネル１１８の高さが、約２５ミクロンである場合、一次ウェル区分１１２内に存在する、約２５μまたはそれを上回るサイズの物体（例えば、スフェロイド、チューモロイド、オルガノイド、オルガノイド断片等）は、二次ウェル区分１１５に移動しないように阻止されるであろう。しかしながら、一次ウェル区分１１２内に存在し、あるサイズ（例えば、約２５μ）を下回るまたはそれに等しい寸法（例えば、直径、高さ、幅等）を有する、対応する破片（例えば、毒性副産物、死細胞、細胞体１０３を培養するステップの結果である他の対応する破片、総細胞数を低減させるステップの結果として除去され、より小さなオルガノイドの同種集団を取得することになる細胞体断片等）は、少なくとも１つのチャネル１１８を通して、かつ二次ウェル区分１１５の中に通過することが可能である。結果として、対応する破片は、一次ウェル区分１１２内の細胞体１０３を阻害することなく、二次ウェル区分１１５を介して、液体取扱器（例えば、ピペット）を使用して吸引される、または別様に収集されることができる。

種々の実施形態によると、一次ウェル区分１１２は、一次ウェル区分１１２の中に堆積される、ヒドロゲル１０６内に埋め込まれ得る、堆積された細胞体１０３（例えば、細胞集合体）を支持するようにサイズ指定および成形される。例えば、一次ウェル区分１１２は、理解され得るように、胚様体、融合胚様体、スフェロイド、オルガノイド、および／または他の多細胞体を増殖するために使用される、培養ウェルと見なされ得る。種々の実施形態によると、マイクロプレート内のいくつかのウェルユニット１００に依存して、一次ウェル区分１１２の幅は、（例えば、９６個ウェルプレートに関して）最大約８ミリメートル（ｍｍ）、（例えば、４８個ウェルプレートに関して）最大１１ｍｍ、（例えば、２４個ウェルプレートに関して）最大約１７ｍｍ、および／または理解され得るような他のサイズであることができる。加えて、一次ウェル区分１１２および二次ウェル区分１１５の深さは、マイクロプレートが、各ウェルユニット１００の個別の一次ウェル区分１１２または二次ウェル区分１１５から外へ流体を溢れさせることなく、ウェルユニット１００内の流体交換を可能にするために傾動され得るように規定される。

二次ウェル区分１１５は、一次ウェル区分１１２内に位置付けられる、増殖中の細胞集合体に栄養を投与するために使用され得る、栄養投与培地および／または他の栄養物を供給するために使用され得る。加えて、二次ウェル区分１１５は、理解され得るように、細胞集合体から上清を採集するために使用され得る。例えば、二次ウェル区分１１５は、一次ウェル区分１１２内の増殖中の細胞培養物によって使用され得る、栄養投与培地および／または他の栄養物を備える、供給ウェルと見なされることができる。二次ウェル区分１１５は、本開示の種々の実施形態による、一次ウェル区分１１２と交換され得る、流体を保持するようにサイズ指定および成形される。種々の実施形態によると、マイクロプレート内のいくつかのウェルユニット１００に依存して、二次ウェル区分１１５の幅は、（例えば、９６個ウェルプレートに関して）最大約８ミリメートル（ｍｍ）、（例えば、４８個ウェルプレートに関して）最大１１ｍｍ、（例えば、２４個ウェルプレートに関して）最大約１７ｍｍ、および／または理解され得る他のサイズであり得る。

種々の実施形態によると、一次ウェル区分１１２および二次ウェル区分１１５のサイズおよび形状は、相互に異なり得る。いくつかの実施例では、一次ウェル区分１１２は、（寸法、例えば、直径または容積において）二次ウェル区分１１５よりも大きい。他の実施例では、二次ウェル区分１１５は、一次ウェル区分１１２よりも大きい。いくつかの実施例では、一次ウェル区分１１２は、二次ウェル区分１１５の形状とは異なる形状を備える。

種々の実施形態によると、ウェルユニット１００はさらに、マイクロプレートのウェルプレート本体の下側に配置される、底部層シート１２１を備える。底部層シート１２１は、ウェルユニット１００の底部表面を形成する、ウェルプレート本体の下側に取り付けられる。種々の実施例では、底部層シート１２１は、理解され得るように、マイクロプレートのウェルユニット１００内で培養されている、スフェロイド、オルガノイド、または他の細胞培養物の撮像を可能にするために、光学透過性である、視認窓を備える。視認窓は、明視野、位相コントラスト、蛍光性、共焦点、二光子、または当技術分野において公知であるような他の顕微鏡撮像モダリティであろうとなかろうと、顕微鏡観察にとって好適である、窓であることができる。

種々の実施例では、底部層シート１２１は、マイクロプレートのウェルユニット１００内の増殖中のスフェロイド、オルガノイド、または他の細胞体のための酸素供給を増加させるように構成される、ガス透過可能シートを備える。ガス透過可能シートは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＰＥＦＰ、ポリイミド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリカーボネート、および／または理解され得るような他の材料を備える材料から形成されることができる。種々の実施例によると、ガス透過可能シートは、約５～７０ミクロンの厚さを有することができる。種々の実施例によると、ガス透過可能シートは、複数の細孔を備えることができる。他の実施例では、ガス透過可能シートは、分子が、拡散によって通過することを可能にすることができる。代替として、ガス透過可能シートは、いくつかの他の厚さと、細孔直径と、細孔密度とを備えることができる。

ここで図２Ａおよび２Ｂに目を向けると、示されるものは、本開示の種々の実施形態による、液体培地１０９をウェルユニット１００から除去するステップと関連付けられる、ワークフローの実施例である。特に、図１と同様に、図２Ａは、ウェルユニット１０２の一次ウェル区分１１２の底部表面（例えば、底部層シート１２１）上に配置されるヒドロゲル１０６内に埋め込まれている、細胞体１０３を含む、培養環境を図示する。液体培地１０９がまた、ウェルユニット１００の一次ウェル区分１１２および二次ウェル区分１１５の両方において図示されている。理解され得るように、液体培地１０９は、所望の細胞体１０３を生成するために、適切な増殖因子および補完物を備えることができる。

ウェルユニット１００の少なくとも１つのチャネル１１８は、一次ウェル区分１１２と隣接する二次ウェル区分１１５との間の流体接続を提供する。少なくとも１つのチャネル１１８はさらに、対応するマイクロプレートの傾動を介して、液体培地１０９の継続的な重力流を促進し、細胞体１０３（例えば、オルガノイドまたは他の多細胞体）の事前の栄養投与を可能にする能力を提供する。種々の実施例では、液体培地１０９（例えば、栄養投与培地および／または他の栄養物）は、二次ウェル区分１１５の中に導入され、最終的に、少なくとも１つのチャネル１１８を介して、一次ウェル区分１１２の中に導入されることができる。種々の実施形態では、液体培地１０９は、着目ウェル（例えば、一次ウェル区分１１２）内の環境を阻害することなく、液体取扱器２００（例えば、ピペット）を使用して、ウェル区分（例えば、二次ウェル区分１１５）のうちの一方に添加される、および／またはそこから除去されることができる。

図２Ｂは、液体取扱器２００を使用して、液体培地１０９を除去した後のウェルユニット１００の実施例を図示する。理解され得るように、液体培地１０９は、一次ウェル区分１１２の環境（例えば、ヒドロゲル１０６内に埋め込まれる、細胞体１０３）を阻害することなく、除去されることができる。

次に、本開示の継代培養ワークフローの概要が、図３Ａ－３Ｈを参照して提供される。特に、図３Ａ－３Ｈは、マイクロプレートのウェルユニット１００の断面図を図示する。各図は、種々の実施形態による、継代培養ワークフローと関連付けられる、個別のステップに対応する。種々の実施形態によると、細胞体１０３が、マイクロプレートのウェルユニット１００内で経時的に増殖するため、継代培養が、死細胞および毒性副産物と関連付けられる破片を除去し、総細胞数を低減させ、より小さなオルガノイドの同種集団を取得し、継続的な細胞増殖を促進し、細胞体１０３の全体的な健康を維持するために要求される。

図３Ａに図示されるように、ヒドロゲル１０６の半球体は、複数のヒドロゲル断片３０３または別様に液体形態に分解されることができる。例えば、固体ヒドロゲル１０６は、液体に変換され、それによって、細胞体１０３をヒドロゲル１０６から分離することができる。いくつかの実施例では、固体ヒドロゲル１０６は、ヒドロゲル１０６の融解性質に基づいて、ヒドロゲル１０６の温度を調節することによって、複数のヒドロゲル断片３０３または別様に液体形態に分解される。いくつかの実施例では、ヒドロゲル１０６は、摂氏約１０度（℃）を下回る温度において、液体形態に分解されることができる。本実施例では、図３Ａに示されるように、約１０度（℃）を下回る（または約４℃を下回る）温度を有する液体培地１０９が、液体取扱器２００を使用して、一次ウェル区分１１２または二次ウェル区分１１５を介して、ウェルユニット１００の中に導入されることができる。いくつかの実施例では、マイクロプレートは、対応するウェルユニット１００内に堆積されるヒドロゲル１０６が、液化を開始するように、マイクロプレートの温度を調節するように設計される、温度制御デバイス（例えば、冷却プレート）上に位置付けられることができる。

次に図３Ｂに目を向けると、ヒドロゲル断片３０３または別様に液体形態のヒドロゲル１０６は、液体取扱器２００を介して、液体培地１０９とともに、ウェルユニット１００から除去されることができる。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、複数のヒドロゲル断片３０３または別様に液体形態の分解されたヒドロゲル１０６は、一次ウェル区分１１２と二次ウェル区分１１５との間に形成されるチャネル１１８を通して通過することができる。加えて、少なくとも１つのチャネル１１８の寸法は、少なくとも１つのチャネル１１８の寸法を上回る寸法を伴って、サイズ指定および成形される、細胞体１０３の通過を阻止する。したがって、細胞体１０３は、液化されたヒドロゲル１０６およびヒドロゲル断片３０３が、少なくとも１つのチャネル１１８を通して、かつ二次ウェル区分１１５の中に通過する間、一次ウェル区分１１２内に留まったままであろう。ヒドロゲル１０６から分離された細胞体１０３を保護するために、液化されたヒドロゲル１０６、ヒドロゲル断片３０３、および／または液体培地１０９は、ウェルユニット１００の二次ウェル区分１１５から除去されることができる。

いくつかの実施例では、図３Ａおよび３Ｂと関連付けられるワークフローステップは、ヒドロゲル１０６が、完全に分解されることを可能にし、ウェルユニット１００からのヒドロゲル１０６の完全な除去を可能にするために繰り返されることができる。換言すると、液体培地１０９の導入および除去を伴う、細胞体懸濁液の洗浄は、ヒドロゲル１０６をウェルユニット１００から除去するために、複数回、繰り返されることができる。

いったんヒドロゲル１０６が、除去されると、元々、ヒドロゲル１０６内に埋め込まれていた細胞体１０３のみが、ウェルユニット１００内に留まったままである。これは、図３Ｃに図示される。いくつかの実施例では、低レベルの液体培地１０９が、依然として、ウェルユニットの一次ウェル区分１１２内に存在し得る。本液体培地１０９は、必要に応じて、除去されることができる。例えば、マイクロプレートは、余剰培地１０９が、除去のために、所与のウェルユニット１００の二次ウェル区分１１５に流動することを可能にするために傾動されることができる。液体培地１０９は、理解され得るように、液体取扱器２００を使用して除去されることができる。

ここで図３Ｄに目を向けると、示されるものは、粗いピペット分注を使用して、細胞体１０３を破砕するステップと関連付けられる、ワークフローステップの実施例である。種々の実施例では、液体培地１０９は、細胞体１０３を含有するウェルユニット１００の中に導入されることができる。液体取扱器２００は、分解された、または別様に液化されたヒドロゲル１０６の除去の後、一次ウェル区分１１２内に留まったままである、細胞体１０３を吸引または別様に収集するために使用されることができる。いったん細胞体１０３が、液体取扱器２００の中に吸引されると、剪断力が、細胞体１０３に印加され、それによって、細胞体１０３を複数の細胞体断片３０６（例えば、スフェロイド断片、チューモロイド断片、オルガノイド断片等）および対応する破片３０９に分解させることができる。細胞体断片３０６は、細胞体１０３（例えば、スフェロイド、チューモロイド、オルガノイド等）の多細胞断片を備える。

印加される剪断力は、液体取扱器２００の手動または自動化された操作の結果であり、液体取扱器２００の縦軸に沿って、細胞体１０３の上下運動を引き起こし得る。剪断力は、細胞体１０３を複数の細胞体断片３０６および対応する破片に分解させることができる。剪断力は、細胞体１０３の所望のサイズが、取得されるまで、細胞体１０３に印加されることができる。いくつかの実施例では、酵素および／または化学物質（例えば、トリプシン、軽度解離培地等）が、液体によって吸引されるステップに先立って、ウェルユニット１００またはそうでなければ細胞体１０３に添加されてもよい。いくつかの実施例では、いったん細胞体１０３が、多細胞体断片３０６（例えば、オルガノイド断片）に分解されると、細胞体断片３０６は、マイクロプレートのウェルユニット内に設置され、細胞解離試薬内で、所定の時間量（例えば、最大約２０分）にわたってインキュベートされることができる。

種々の実施例では、細胞体断片３０６の好ましいサイズは、約２５～５００μである。しかしながら、他のサイズの断片も、取得され得ることに留意されたい。対応する破片３０９は、細胞体１０３と関連付けられる死細胞、および細胞体１０３の培養の間に成長する毒性副産物を備えることができる。

図３Ｅに移ると、複数の細胞体断片３０６および対応する破片３０９は、ウェルユニット１００の一次ウェル区分１１２、すなわち、液体培地１０９内に再導入されることができる。特に、図３Ｅは、元々、ヒドロゲル１０６内に埋め込まれていた細胞体１０３に印加される剪断力の結果である、複数の細胞体断片３０６および対応する破片３０９を図示する。少なくとも１つのチャネル１１８の寸法を下回ってサイズ指定される、対応する破片３０９は、少なくとも１つのチャネル１１８を通して通過し、二次ウェル区分１１５の中に流動することが可能であるであろう。種々の実施例では、マイクロプレートの傾動が、液体培地１０９の重力流を引き起こし、それによって、対応する破片３０９が、二次ウェル区分１１５に進入することを可能にするために要求され得る。

ここで図３Ｆに目を向けると、示されるものは、本開示の種々の実施形態による、対応する破片３０９の除去の実施例である。特に、少なくとも１つのチャネル１１８の寸法を下回る寸法を有する、対応する破片３０９は、少なくとも１つのチャネル１１８を通過し、そこで、それらが液体取扱器２００を介して除去され得る、二次ウェル区分１１５の中に進入することが可能である。種々の実施例では、マイクロプレートの傾動は、２つのウェル間を運動させるために、液体培地１０９の重力流を引き起こし、液体培地１０９および対応する破片３０９が、チャネル１１８を通して、かつ異なるウェルの中に運動することを可能にし得る。いくつかの実施例では、液体培地１０９の添加および／または液体培地１０９および破片３０９の除去は、ウェルユニット１００から全ての破片３０９を除去するために、必要に応じて繰り返され得る。

いったん破片が、ウェルユニット１００から除去されると、細胞体断片３０６のみが、いくつかの実施例では、いくつかの残留液体培地１０９とともに、ウェルユニット１００内に留まったままである。いくつかの実施例では、付加的な液体培地１０９は、図３Ｇに図示されるように、ウェルユニット１００内に提供され得、細胞体断片３０６は、液体取扱器２００の中に吸引され得る。細胞体断片３０６の除去は、ウェルユニット１００内の新鮮な環境の準備を可能にする。

特に、いったん細胞体断片３０６が、ウェルユニット１００から除去されると、ヒドロゲル１０６は、ウェルユニット１００の一次ウェル区分１１２内に堆積され得る。いくつかの実施例では、細胞体断片３０６は、マイクロプレートのウェルユニット１００の一次ウェル区分１１２内にヒドロゲル１０６を堆積させるステップに先立って、ヒドロゲル１０６内に埋め込まれ得る。種々の実施形態では、新しいマイクロプレートが、使用されるであろう。他の実施例では、細胞体断片３０６は、ウェルユニット１００に戻され、ヒドロゲル１０６が、ウェルユニット１００内に堆積された後、ヒドロゲル１０６上に堆積される。図３Ｈは、堆積されたヒドロゲル１０６の上に、細胞体断片３０６を堆積させるステップの実施例を図示する。いくつかの実施例では、マイクロプレートは、トレイ上に設置され、所望の温度（例えば、約３７度）まで加熱され、所望の時間量（例えば、最大約２０分）にわたってインキュベートされることができる。

いったんヒドロゲル１０６および細胞体断片３０６が、ウェルユニット１００の中に導入されると、液体培地１０９が、ウェルユニット１００に添加され、それによって、新鮮な環境を提供し、細胞体断片３０６が、所望されるように増殖および成長することを可能にすることができる。マイクロプレートは、インキュベータ内に設置され、細胞体断片の増殖および成長を刺激することができる。本継代培養方法は、必要に応じて、繰り返されることができる。

ここで図４に目を向けると、示されるものは、本開示の種々の実施形態による、マイクロプレートのウェルユニット１００に対する、細胞継代培養に関連する例示的方法のフローチャートである。

ステップ４０３から始まり、細胞体１０３は、マイクロプレートのウェルユニット１００の一次ウェル区分１１２内で培養され、スフェロイド、チューモロイド、オルガノイド、および／または他の多細胞体の増殖および成長を提供することができる。種々の実施形態によると、細胞体１０３は、ヒドロゲル１０６内に埋め込まれることができる。さらに、１つまたはそれを上回る増殖因子および補完物が、液体培地１０９の形態でマイクロプレートのウェルユニット１００の中に導入されることができる。好適であり得る例示的増殖因子は、アンジオポエチン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、毛様体神経栄養因子、コロニー刺激因子、エフリン、上皮増殖因子、エリスロポエチン、線維芽細胞増殖因子、グリア由来神経栄養因子、肝細胞増殖因子、インスリン、インスリン様増殖因子、インターロイキン、白血病抑制因子、ケラチノサイト増殖因子、ニューレグリン、ニューロトロフィン、血小板由来増殖因子、形質転換増殖因子、腫瘍壊死因子（α）、血管内皮増殖因子、および／または同様物を含む。細胞体１０３が、マイクロプレートのウェルユニット１００内で経時的に増殖および成長するため、継代培養が、死細胞および毒性副産物と関連付けられる破片３０９を除去し、継続的な細胞増殖を促進し、総細胞数を低減させ、より小さな細胞体の同種集団（例えば、スフェロイド、チューモロイド、オルガノイド等）を取得し、細胞体１０３の全体的な健康を維持するために要求され得る。

ステップ４０６において、ヒドロゲル１０６の半球体は、複数のヒドロゲル断片３０３および／または液体形態に変換する、または別様に放散させるために、分解される。例えば、ヒドロゲル１０６の半球体は、液体に変換され、それによって、細胞体１０３をヒドロゲル半球体から分離することができる。いくつかの実施例では、ヒドロゲル１０６の融解性質に基づいて、ヒドロゲル１０６の温度（例えば、約１０℃またはそれを下回る、約４℃またはそれを下回る）を調節するステップは、ヒドロゲル１０６を複数のヒドロゲル断片３０３または別様に液体形態に放散させ得る。

種々の実施形態によると、細胞体１０３の培養に続いて、ウェルユニット１００内に存在する培養液体培地１０９は、ウェルユニット１００から除去され得、解離液体培地１０９（例えば、軽度解離培地）が、ウェルユニット１００の中に導入され得る。いくつかの実施例では、マイクロプレートは、所望の時間量（例えば、最大約２０分）にわたって、インキュベータ内に設置されることができる。本実施例では、所望の温度を下回るまたはそれに等しい温度を有する、解離液体培地１０９は、図３Ａに示されるように、液体取扱器２００を使用して、一次ウェル区分１１２または二次ウェル区分１１５を介して、ウェルユニット１００の中に導入されることができる。いくつかの実施例では、マイクロプレートは、対応するウェルユニット１００内に堆積されるヒドロゲル１０６が、液化を開始するように、マイクロプレートの温度を調節するように設計される、温度管理デバイス（例えば、冷却プレート）上に位置付けられることができる。ヒドロゲル１０６が、液体形態および／またはヒドロゲル断片３０３に還元されるにつれて、細胞体１０３は、ヒドロゲル１０６から分離される。

ステップ４０６において、ヒドロゲル断片３０３または別様に液体形態のヒドロゲル１０６は、ウェルユニット１００の二次ウェル区分１１５から除去されることができる。特に、ヒドロゲルが、断片３０３または別様に液体形態に還元されるにつれて、ヒドロゲル１０６は、二次ウェル区分１１５から一次ウェル区分１１２を流動的に接続する、少なくとも１つのチャネル１１８を通して通過することができる。いくつかの実施例では、マイクロプレートは、一次ウェル区分１１２から二次ウェル区分１１５の中への流体流を促進するために傾動されることができる。

例えば、マイクロプレートは、揺動または傾動装置上に設置されることができる。そのような装置は、マイクロウェルプレートをある軸を中心として「傾動」し、それによって、反対側に対して片側の高さを上昇させ、ウェルユニット１００の一次ウェル区分１１２（例えば、培養ウェル）から二次ウェル区分１１５（例えば、培養ウェル）への流体流を促進する、またはその逆の場合も同じであり得る、モータに動作可能に接続される、ここで説明されるようなマイクロウェルプレートを受容するように構成される、平坦な表面を有することができる。細胞体が、少なくとも１つのチャネル１１８の寸法を超過する寸法を伴ってサイズ指定されると、細胞体１０３は、理解され得るように、ウェルユニット１００の一次ウェル区分１１２内に留まったままである。

ヒドロゲル１０６（例えば、ヒドロゲル断片３０３）および液体培地１０９は、図３Ｂに図示されるように、液体取扱器２００を使用して、二次ウェル区分１１５から除去されることができる。ヒドロゲル１０６および液体培地１０９がまた、一次ウェル区分１１２から除去され得るが、一次ウェル区分１１２内に置かれる、細胞体１０３を保存し、それが阻害されることを回避するために、二次ウェル区分１１５から液体培地１０９およびヒドロゲル１０６を除去することが好ましい。

ステップ４１２において、ヒドロゲル１０６の全てが、ウェルユニット１００から除去されたかどうかが、決定されることができる。ヒドロゲル１０６の全て（または容認可能な量）が、除去されていた場合、本プロセスは、ステップ４１５に進む。そうでなければ、本プロセスは、ステップ４０６に戻る。特に、液体培地１０９は、ウェルユニット１００の中に再導入され、ヒドロゲル１０６が、除去のために適切に分解されることを可能にし得る。本ワークフローのこれらのステップは、ウェルユニット１００からのヒドロゲル１０６の除去を可能にするために、必要に応じて、繰り返されることができる。加えて、ウェルユニット１００の一次ウェル区分１１２内に留まったままである細胞体は、理解され得るように、液体培地１０９をウェルユニット１００に導入し、それを除去することによって、洗浄されることができる。本洗浄プロセスは、最大約３回、行われ得る。

ステップ４１５において、ウェルユニット１００の一次ウェル区分１１２内に留まったままである細胞体１０３は、図３Ｄに図示されるように、吸引される、または別様に液体取扱器２００内に収集される。

ステップ４１８において、液体培地１０９（例えば、解離または培養培地等）が、液体取扱器２００に添加され得、細胞体１０３は、複数の細胞体断片３０６および破片３０９に分解される。種々の実施例では、液体培地１０９は、細胞体１０３の分解を促進するために使用されることができる。例えば、剪断力は、液体取扱器２００の本体内で、細胞体１０３の前後運動を引き起こす、粗いピペット分注の結果として、細胞体１０３に印加されることができる。本実施例では、液体取扱器２００は、数回（例えば、２０回）操作され、細胞体１０３が、液体取扱器２００の本体内で運動することを可能にし、それによって、細胞体１０３を複数の細胞体断片３０６および破片３０９（例えば、死細胞、毒性副産物等）に分解させることができる。種々の実施例では、細胞体断片３０６の好ましいサイズは、約２５～５００μである。しかしながら、理解され得るように、他のサイズの断片も、取得され得ることに留意されたい。

ステップ４２１において、細胞体断片３０６および破片３０９は、図３Ｅに図示されるように、ウェルユニット１００の一次ウェル区分１１２に戻される。ステップ４２４において、破片３０９は、ウェルユニット１００から除去される。種々の実施例では、液体培地１０９が、図３Ｆに図示されるように、破片３０９が、細胞体断片３０６から洗い流され、少なくとも１つのチャネル１１８を通して、二次ウェル区分１１５の中に進行することを可能にするために、導入されることができる。特に、マイクロプレートは、少なくとも１つのチャネル１１８を通して、かつ２つのウェル区分の間に、流体の重力流を引き起こすために傾動されることができる。少なくとも１つのチャネル１１８の寸法を下回る寸法を伴ってサイズ指定される破片３０９は、理解され得るように、チャネル１１８を通して通過し、二次ウェル区分１１５の中に流動することが可能である。同様に、細胞体断片３０６は、少なくとも１つのチャネル１１８の寸法を上回る寸法を伴ってサイズ指定され、それによって、少なくとも１つのチャネル１１８を通過して通過しないように阻止され、一次ウェル区分１１２内に留まったままである。種々の実施例では、液体培地１０９の添加は、破片３０９の二次ウェル区分１１５の中への移動、および／または液体取扱器２００を使用した破片３０９の除去が、破片３０９の除去を確実にするために、必要に応じて、繰り返され得る。

ステップ４２７において、一次ウェル区分１１２内に留まったままである、細胞体断片３０６は、図３Ｇに図示されるように、液体取扱器２００を使用して、吸引される、または別様に収集されることができる。種々の実施例では、液体培地１０９が、ウェルユニット１００に添加され、細胞体断片３０６の安全な取扱および収集を可能にする。

ステップ４３０では、ヒドロゲル１０６が、ウェルユニット１００の一次ウェル区分１１２の中に堆積され、細胞を培養するための新鮮な環境を生成することができる。理解され得るように、本明細書に説明されるようなヒドロゲル１０６は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標） Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むことができる。他の側面では、本明細書に説明されるようなヒドロゲルまたはスキャフォールドは、１つまたはそれを上回る細胞外マトリクス成分、例えば、コラーゲンまたはフィブロネクチン、バイオインク、ゼラチン、アルギン酸塩、Ｂｉｏｍｉｍｅｓｙｓ（登録商標）、セルロースベースのヒドロゲル、基底膜抽出物（ＢＭＥ）、または他のヒドロゲル、スキャフォールド、または理解され得るようなスキャフォールドを伴わない溶液を含むことができる。

ステップ４３３において、細胞体断片３０６は、ヒドロゲル１０６内に堆積される。種々の実施例では、細胞体断片３０６は、とりわけ、バイオインク液滴印刷、マイクロコンタクト印刷、フォトリソグラフィ、ディップペンナノリソグラフィ、および／またはピペット分注を含む、任意の好適な技法によって、ヒドロゲル１０６内に堆積されることができる。いくつかの実施例では、篩または他の濾過デバイスが、ヒドロゲル１０６内に堆積される、および／またはそれと予め混合される細胞体断片３０６のサイズを制御するために使用されることができる。例えば、任意の細胞体断片３０６が、所望されるものを上回ってサイズ指定される場合、篩は、新しいかつ新鮮な環境内で、より大きな細胞体断片３０６の使用を抑制するために使用されることができる。本方法は、ヒドロゲル１０６が、ウェルユニット１００内に堆積された後にヒドロゲル１０６内に堆積されている、細胞体断片３０６について議論するが、いくつかの実施形態では、細胞体断片３０６は、ヒドロゲル１０６をウェルユニット１００内に堆積させるステップに先立って、ヒドロゲル１０６内に堆積される、または別様に埋め込まれ得ることに留意されたい。種々の実施例では、（細胞体断片３０６の有無にかかわらず）ヒドロゲル１０６は、所望の温度（例えば、摂氏約３７度）まで加熱される、予め保温されたマイクロプレート上に堆積されることができ、マイクロプレート（細胞体断片を含む）は、所望の時間量（例えば、最大約２０分）にわたって、インキュベータ内に設置されることができる。

ステップ４３６において、液体培地１０９は、ウェルユニット１００の中に導入されることができる。液体培地１０９は、一次ウェル区分１１２または二次ウェル区分１１５を介して、ウェルユニット１００の中に導入されることができる。例えば、液体培地１０９は、マイクロプレートのウェルユニット１００の少なくとも１つのチャネル１１８を通して駆動される、流体流によって、二次ウェル区分１１５から一次ウェル区分１１２に送達されることができる。そのような流体流はさらに、ユーザによって所望される期間にわたって、ユーザによって所望される間隔において、マイクロプレートプレートを手動で傾動することによって、または自動化された傾動または揺動器装置上へのマイクロプレートの設置による等、他の方法によって促進されることができる。

ステップ４３９において、マイクロプレートは、組織培養インキュベータ内に設置され、細胞体断片３０６（例えば、スフェロイド、チューモロイド、オルガノイド、および／または他の多細胞体）の増殖および成長を可能にすることができる。その後、継代培養プロセスは、完了に進み得る。
（細胞）

本開示による細胞は、幹細胞（例えば、万能性幹細胞）、支持細胞、成体体性幹細胞（ＡＳＣ）、患者由来の材料（例えば、チューモロイド）、および／または同等物を含むことができる。

本開示による細胞は、哺乳類細胞、特に、ヒト、ラット、またはマウス細胞であることができる。細胞は、当業者に公知である研究において典型的に使用される、種々の不死化細胞株または一次細胞株（例えば、ＨＵＶＥＣ）を含むことができる。本開示による細胞は、万能性または多能性幹細胞（例えば、限定することを意図しないが、胚性幹細胞、人工万能性幹細胞、成体体性幹細胞（ＡＳＣ）、患者由来の物質（例えば、チューモロイド）、または間葉系幹細胞）であり得る。実施形態では、本開示による幹細胞は、ＡＴＣＣ（登録商標）または当技術分野において公知の他の営利会社等の直販店を通して、当業者にとって商業的に入手可能である、マウスまたはヒトの幹細胞であることができる。本開示による幹細胞はまた、当技術分野による、任意の数の再プログラミング方法および／またはキットを利用する、一次細胞の源から、ユーザによって再プログラミングされた、ヒト、マウス、またはラット（または別の有機体）の幹細胞であることができる。

支持細胞は、例えば、幹細胞培養を支持するために公知である、細胞を支持するものであり得る。限定することを意図しないが、そのような細胞は、マウス胚性線維芽細胞、人工万能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株、胚性幹細胞株（例えば、Ｅ５、Ｅ７等）、成体体性幹細胞（ＡＳＣ）、患者由来の物質（例えば、チューモロイド）、患者由来のオルガノイド（例えば、腸、肝臓、ｌｐｓｃ由来のオルガノイド等）、スフェロイド、胚様体、チューモロイド異種移植片、種々の有機体（例えば、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ等）、または当技術分野において公知の他のものを含むことができる。

培養の異なる段階における種々の細胞／細胞体の培養は、当技術分野において公知であるような標準的な培地および技法（例えば、ダルベッコ変法イーグル培地、幹細胞培地、ｍＴｅＳＲ^ＴＭ、ｌｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ^ＴＭ腸内オルガノイド培養培地、またはその変異体、ウシ胎仔血清、およびマウスのｉＰＳＣの白血病抑制因子を含む、培地）を使用して遂行されることができる。内胚葉系、外胚葉系、および中胚葉系列の体性細胞または組織標的細胞への幹細胞の分化もまた、当技術分野において公知であり、説明され、本開示の方法に従って採用されることができる。
（ヒドロゲル／スキャフォールド）

ヒドロゲルおよび／またはスキャフォールドは、本明細書に説明されるようなマイクロウェルプレート、システム、キット、および方法において採用され、本明細書に説明されるような細胞体の３Ｄ培養、増殖、および化学分析を促進することができる。

実施形態では、本明細書に説明されるようなヒドロゲルまたはスキャフォールドは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標） Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むことができる。他の側面では、本明細書に説明されるようなヒドロゲルまたはスキャフォールドは、１つまたはそれを上回る細胞外マトリクス成分、例えば、コラーゲンまたはフィブロネクチン、バイオインク、ゼラチン、アルギン酸塩、Ｂｉｏｍｉｍｅｓｙｓ（登録商標）、セルロースベースのヒドロゲル、基底膜抽出物（ＢＭＥ）、または他のヒドロゲル、スキャフォールド、または理解され得るようなスキャフォールドを伴わない溶液を含むことができる。

別様に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって、一般的に理解されるものと同一の意味を有する。一般的に使用される辞書内で定義されるもの等の用語は、本明細書および関連する技術分野の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有するものとして解釈されるべきであり、本明細書に明示的に定義されない限り、理想化された、または過度に形式上の意味において解釈されるべきではないことが、さらに理解されるであろう。

本開示の多くの側面は、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる、以下の付属を参照して、より深く理解されることができる。図面内の構成要素は、必ずしも縮尺通りではなく、代わりに、本開示の原理を明確に例証することに重点が置かれている。

本明細書内で使用されるように、用語「約」、「おおよそ」、「～においてまたは約～」、および「実質的に」は、当該量または値が、その正確な値である、または請求項において列挙される、または本明細書に教示されるような同等の結果または効果を提供する、ある値であり得ることを意味する。すなわち、量、サイズ、配合、パラメータ、および他の分量および特性は、正確ではなく、正確である必要はないが、所望されるように、近似している、および／またはより大きくまたはより小さくあり得、許容誤差、変換係数、四捨五入、測定誤差、および同等物、および同等の結果または効果が取得されるような当業者に公知な他の因子を反映することが理解される。いくつかの状況では、同等の結果または効果を提供する値が、合理的に決定され得ない。そのような場合では、本明細書内で使用されるように、「約」および「～においてまたは約～」は、規定された値の±２０％、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、または±５％を示される公称値を意味し、例えば、約１インチは、別様に示される、または推測されない限り、０．８インチ～１．２インチ、０．８インチ～１．１５インチ、０．９インチ～１．１インチ、０．９１インチ～１．０９インチ、０．９２インチ～１．０８インチ、０．９３インチ～１．０７インチ、０．９４インチ～１．０６インチ、または０．９５インチ～１．０５インチの範囲を指すことが、概して、理解される。「約」、「おおよそ」、または「～においてまたは約～」が、定量値の前に使用される場合、具体的に別様に記述されない限り、パラメータもまた、具体的な定量値自体も含むことが理解される。

任意の比、濃度、量、および他の数値データが、範囲形式で本明細書に表され得る。そのような範囲形式は、利便性および簡潔性のために使用され、したがって、範囲の限界として明示的に列挙される数値を含むだけではなく、各数値および下位領域が、明示的に列挙される場合と同様に、その範囲内に包含される、全ての個々の数値または下位領域を含む、柔軟性のある様式において解釈されるべきである。例証すると、「約０．１％～約５％」の濃度範囲は、約０．１重量％～約５重量％の明示的に列挙される濃度を含むだけではなく、示された範囲内で、個々の濃度（例えば、１％、２％、３％、および４％）および下位領域（例えば、０．５％、１．１％、２．２％、３．３％、および４．４％）を含むように解釈されるべきである。記述された範囲が、限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本開示内に含まれ、例えば、語句「ｘ～ｙ」は、「ｘ」～「ｙ」の範囲、および「ｘ」を上回る、かつ「ｙ」を下回る範囲を含む。本範囲はまた、上限、例えば、「約ｘ、ｙ、ｚ、またはそれを下回る」ものとして表され得、「約ｘ」、「約ｙ」、および「約ｚ」の具体的な範囲、および「ｘを下回る」、「ｙを下回る」、および「ｚを下回る」範囲を含むように解釈されるべきである。同様に、語句「ｘ、ｙ、ｚ、またはそれを上回る」は、「約ｘ」、「約ｙ」、および「約ｚ」の具体的な範囲、および「ｘを上回る」、「ｙを上回る」、および「ｚを上回る」範囲を含むように解釈されるべきである。いくつかの側面では、用語「約」は、数値の有効数字に従って、従来的な丸めを含むことができる。加えて、語句「約ｘ～ｙ」は、「約ｘ～約ｙ」を含む。

用語「実質的に」は、意図される目的に負の影響を及ぼさない、記述用語からの逸脱を許可することが意味される。本明細書内で使用される、全ての記述用語は、その記述用語が、用語「実質的に」によって明示的に修飾されない場合であっても、用語「実質的に」によって修飾されるように暗示的に理解される。

本明細書に説明されるものに類似する、または同等であるいかなる方法および材料もまた、本開示の実践または試験において使用され得るが、本明細書に開示される種々の開示との併用にとって好適な種々の方法および材料が、ここで説明される。当技術分野において周知の機能または構築は、簡潔性および／または明瞭性のために、詳細に説明されない場合がある。

語句「Ｘ、Ｙ、またはＺのうちの少なくとも１つ」等の選言的用語は、具体的に別様に記述されない限り、そうでなければ、アイテム、用語等が、Ｘ、Ｙ、またはＺのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせ（例えば、Ｘ、Ｙ、および／またはＺ）であり得ることを提示するために、一般に使用されるような文脈を伴って理解される。したがって、そのような選言的用語は、概して、ある実施形態が、Ｘのうちの少なくとも１つ、Ｙのうちの少なくとも１つ、またはＺのうちの少なくとも１つが、それぞれ存在することを要求することを含意するべきではないことを意図されない。

本開示の上記に説明される実施形態は、本開示の原理の明確な理解のために記述される実装の単なる可能性として考えられる実施例にすぎないことが強調されるべきである。多くの変形例および修正が、本開示の精神および原理から実質的に逸脱することなく、上記に説明される実施形態に対して行われてもよい。全てのそのような修正および変形例は、本開示の範囲内で本明細書に含まれ、以下の請求項によって保護されることが意図される。

Claims (20)

1. オルガノイドを継代培養するための方法であって、前記方法は、
   マイクロウェルプレートのウェルユニット内に配置されるヒドロゲル内で、１つまたはそれを上回るオルガノイドを培養することであって、前記ウェルユニットは、少なくとも１つのチャネルを介して、二次ウェル区分に流動的に接続される一次ウェル区分を備え、前記ヒドロゲルは、前記ウェルユニットの前記一次ウェル区分内に配置される、ことと、
   前記ヒドロゲルを複数のヒドロゲル断片の中に放散させ、それによって、前記１つまたはそれを上回るオルガノイドを前記ヒドロゲルから分離することと、
   前記複数のヒドロゲル断片を前記ウェルユニットから除去することであって、前記１つまたはそれを上回るオルガノイドは、前記ウェルユニット内に留まったままである、ことと、
   前記１つまたはそれを上回るオルガノイドを複数のオルガノイド断片および対応する破片に破砕することと、
   前記複数のオルガノイド断片を備える新鮮な培養環境を生成することと
   を含む、方法。
2. 前記少なくとも１つのチャネルは、前記ウェルユニットの底部表面と前記一次ウェル区分および前記二次ウェル区分の共有側壁の底部部分との間の少なくとも１つの間隙によって形成される、請求項１に記載の方法。
3. 前記少なくとも１つの間隙の高さは、約１０ミクロン～最大約１００ミクロンの範囲内である、請求項２に記載の方法。
4. 前記ヒドロゲルを複数のヒドロゲル断片に放散させることはさらに、前記ヒドロゲルを冷却することを含む、請求項１－３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記ヒドロゲルを冷却することはさらに、液体培地を前記ウェルユニットの中に分注することを含み、前記液体培地は、摂氏約１０度またはそれを下回る温度にある、請求項４に記載の方法。
6. 前記温度は、摂氏約４度またはそれを下回る、請求項５に記載の方法。
7. 液体取扱器を介して、前記ウェルユニットの前記一次ウェル区分から前記１つまたはそれを上回るオルガノイドを収集することと、
   前記液体取扱器内の前記１つまたはそれを上回るオルガノイドに少なくとも１つの剪断力を印加することであって、前記１つまたはそれを上回るオルガノイドは、前記少なくとも１つの剪断力の結果として、前記複数のオルガノイド断片および前記対応する破片に破砕される、ことと、
   前記液体取扱器を介して、前記複数のオルガノイド断片および前記対応する破片を前記ウェルユニットの前記一次ウェル区分の中に堆積させることと
   をさらに含む、請求項１－６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記少なくとも１つの剪断力を印加することは、前記液体取扱器を操作し、前記１つまたはそれを上回るオルガノイドを前記液体取扱器内で垂直に運動させることを含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記複数のヒドロゲル断片を除去することはさらに、
   液体取扱器を前記ウェルユニットの前記二次ウェル区分の中に挿入することと、
   前記少なくとも１つのチャネルを介して、前記複数のヒドロゲル断片を前記ウェルユニットの前記一次ウェル区分から前記二次ウェル区分の中に移送することと、
   前記液体取扱器を介して、前記複数のヒドロゲル断片を前記二次ウェル区分から収集することと
   を含む、請求項１－８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記少なくとも１つのチャネルから、破片断片またはオルガノイド断片のうちの少なくとも１つを除去するために、前記少なくとも１つのチャネルを洗流することをさらに含む、請求項１－９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記少なくとも１つのチャネルを介して、前記対応する破片を前記ウェルユニットの前記二次ウェル区分まで運動させることをさらに含む、請求項１－１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記複数のオルガノイド断片を備える前記新鮮な培養環境を生成することはさらに、
    液体取扱器を介して、前記複数のオルガノイド断片を収集することと、
    別のウェルユニットまたは前記ウェルユニットのうちの一方の前記一次ウェル区分の底部表面上に新鮮なヒドロゲルを堆積させることと
    を含む、請求項１－１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記複数のオルガノイド断片は、前記一次ウェル区分の前記底部表面上に前記新鮮なヒドロゲルを堆積させることに先立って、前記新鮮なヒドロゲル内に埋め込まれる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記複数のオルガノイド断片は、前記新鮮なヒドロゲルが、前記一次ウェル区分の前記底部表面上に堆積された後、前記新鮮なヒドロゲル内に埋め込まれる、請求項１２に記載の方法。
15. インキュベータ内に、前記ウェルユニットを備える前記マイクロウェルプレートを設置することをさらに含む、請求項１－１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 方法であって、
    第１のマイクロウェルプレートの第１のウェルユニットの底部表面上に配置されるヒドロゲルから、１つまたはそれを上回る細胞体を分離することであって、前記第１のウェルユニットは、少なくとも１つのチャネルを介して、相互に流動的に接続される培養ウェルと、供給ウェルとを備え、前記ヒドロゲルは、前記第１のウェルユニットの前記培養ウェル内に配置される、ことと、
    前記第１のウェルユニットの前記供給ウェルを介して、前記ヒドロゲルを前記第１のウェルユニットから除去することであって、前記１つまたはそれを上回る細胞体は、前記第１のウェルユニットの前記培養ウェル内に留まったままである、ことと、
    前記１つまたはそれを上回る細胞体を複数の細胞体断片および対応する破片に破砕することと、
    前記第１のウェルユニットの前記供給ウェルから前記対応する破片を除去することであって、前記複数の細胞体断片は、前記第１のウェルユニットの前記培養ウェル内に留まったままである、ことと、
    前記第１のウェルユニットまたは第２のウェルユニットの一方内に、新鮮な培養環境を生成することであって、前記新鮮な培養環境は、前記複数の細胞体断片を備える、ことと
    を含む、方法。
17. 前記少なくとも１つのチャネルは、前記培養ウェルと前記供給ウェルとの間に、約２５ミクロンを上回ってサイズ指定される物体の通過を阻止するように、サイズ指定および成形される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ヒドロゲルから前記１つまたはそれを上回る細胞体を分離することは、前記ヒドロゲルを液化させる温度まで、前記ヒドロゲルを冷却することをさらに含む、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
19. ピペットを介して、前記培養ウェルから前記１つまたはそれを上回る細胞体を除去することと、
    前記ピペットを介して、１つまたはそれを上回る剪断力を前記１つまたはそれを上回る細胞体に印加することであって、前記１つまたはそれを上回る細胞体は、少なくとも部分的に、前記１つまたはそれを上回る印加された剪断力に基づいて、前記複数の細胞体断片および前記対応する破片に破砕される、ことと
    をさらに含む、請求項１６－１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記第１のウェルユニットまたは前記第２のウェルユニットの一方内に前記新鮮な培養環境を生成することはさらに、
    新鮮なヒドロゲルを前記第１のウェルユニットまたは前記第２のウェルユニットの一方内に堆積させることであって、前記複数の細胞体断片は、前記新鮮なヒドロゲル内に埋め込まれる、ことと、
    前記新鮮なヒドロゲル内に埋め込まれる前記複数の細胞体断片を培養することと
    を含む、請求項１６－１９のいずれか１項に記載の方法。

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