CN114134103A - 一种高效获得高活力iPSCs单克隆的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效提取iPSCs单克隆的方法，所述方法采用消化法对重编程的iPSCs集落进行消化挑取，所获得的iPSCs单克隆细胞活力显著优于传统针头划板法获得的单克隆细胞活力，并且在操作时细胞更容易脱离细胞板，可获取更多的细胞量；没有尖锐器物划板，不会对细胞造成损伤；无大量细胞漂浮，降低细胞克隆之间污染状况的发生。
Description
技术领域
本发明涉及生物实验技术领域，更为具体的，本发明涉及一种高效获得高活力iPSCs单克隆的方法。
背景技术
iPSC诱导性多能干细胞全称为induced pluripotent stem cells，是通过人工诱导非多能性细胞表达某种特定基因得到的。iPSCs和天然多功能干细胞在很多方面具有相似性，比如某种干细胞基因和蛋白的表达，染色质甲基化模式，倍增之间，胚体形成，畸胎瘤形成，不同嵌合体的形成，以及分化潜能。自2006年有关诱导性多能干细胞(iPSC)产生的初步报告以来，iPSC已成为再生医学、药物筛选和食品工业领域中具有良好前景的细胞来源。由于其强大的增殖和分化能力，与胚胎干细胞(ESC)类似，它们能够作为体内各种细胞类型的可再生来源。此外，由于培育它们不需要使用胚胎，因而不存在伦理问题，且它们的自体移植也不会引起与免疫相关的并发症。伴随着高度的期望，有关iPSC的科学研究在其产生后的10年中迅速发展。
临床或工业相关的iPSC应用需要大量细胞，而目前的细胞克隆技术在挑取iPSCs单克隆的过程中，通常会采用传统的针头机械划板进行挑取，在该过程中不仅会对细胞造成损伤，此外，因为需要将细胞集落划为多个小块，所以会导致大量细胞脱落漂浮在培养基中，造成细胞损失，使细胞集落原本有限的细胞变得更少，致使iPSCs细胞重铺后成活率降低；漂浮在培养基中的细胞容易混入其它细胞克隆团块中，无法得到纯净的单细胞克隆系；铺种细胞后不易贴壁，细胞成活率低，并且细胞活性不佳。因此迫切需要开发一种能够高效获得高活力iPSCs单克隆的方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种高效获得高活力iPSCs单克隆的方法，更为具体的，所述方法包括如下步骤：
步骤如下：
步骤1.采用倒置显微镜观察含有iPSCs的培养皿；
步骤2.在培养皿底部标记要挑取的集落，在每次重编程实验结束时按照如下步骤挑取至少10个不同的集落，置于预铺MEF或基底胶的24孔板中单独扩增，所述挑取的方法为：
①去除培养皿中iPSCs细胞上清，加DPBS清洗细胞两次；
②加入用不含钙镁的DPBS制备的0.5mM的EDTA进行消化，并在消化2—5分钟内密切关注iPSCs状态，当细胞与细胞之间开始进入分离状态但又未明显分离，且细胞没有出现从板底脱落现象时，将消化液去除，缓慢加入培养基终止消化；
③立即将培养皿转移至配备有立体显微镜的无菌细胞培养通风橱内；
④将消化松散的各iPSCs集落缓慢吸入吸头内，然后分别转移至EP管中，为防止混入非本克隆团块细胞，可只吸取集落中间部分细胞；
步骤3.挑取完成后，将EP管放入离心机内以200×g离心5min；
步骤4.去除iPSCs细胞上清液，加入含10μM Y27632的新鲜培养基重悬细胞，然后将iPSCs铺种至预铺MEF或者包被基底胶的24孔板中；
步骤5.将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
步骤6.使集落贴壁24小时后弃去用过的培养基，更换新鲜的培养基，之后每天更换培养基；
步骤7.当克隆覆盖～85％培养表面积时，可以进行传代；
步骤8.采用标准的培养步骤进行传代、扩增，并冻存部分培养板中的细胞留种备用。
本发明相对于现有技术能够获得如下有益的技术效果：
1.本方法中，发明人惊喜地发现，经本发明获得的iPSCs细胞活力显著优于传统划板方法获得的iPSCs；
2.通过本发明的方法扩增获得的iPSCs细胞为单细胞来源克隆，扩增的细胞更为纯净，而传统针头挑取法(机械法)挑取扩增的更多的为非单细胞来源的克隆；
3.将iPSCs细胞消化变松散后细胞状态更佳，挑取时细胞更容易脱离细胞板，显著增加了获得iPSCs的细胞量；
4.由于没有尖锐器物划板，使操作更简便且不会对贴附在培养器皿上的iPSCs细胞造成损伤，并且因此无大量细胞漂浮，降低细胞克隆之间污染状况的发生；
5.细胞铺种过程iPSCs细胞状态好，细胞更容易贴壁，成活率高，培养一天即可完成细胞贴壁。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1A:重编程iPSCs-细胞克隆大小-4x；B:重编程iPSCs-细胞克隆大小-10x；C:高效挑取iPSCs克隆后培养细胞状态-Day2-4x；D：高效挑取iPSCs克隆后培养细胞状态-Day3-10x；E:重编程iPSCs-针头机械划板挑克隆-4x；F:重编程iPSCs-针头机械划板挑克隆-10x；G:传统针头机械挑取iPSCs克隆后培养细胞状态-Day2-4x；H：传统针头机械挑取iPSCs克隆后培养细胞状态-Day6-20x；
图2：A:iPSCs-高效挑取克隆细胞计数(50W/孔)-4x；B:iPSCs-针头机械挑取克隆细胞计数(12W/孔)-4x；C:iPSCs-高效挑取克隆细胞台盼蓝染色活率计数-10x(活率达98％)；D:iPSCs-针头机械挑克隆细胞台盼蓝染色活率计数-10x(活率为60％)；
图3：CCK-8鉴定各密度梯度iPSCs细胞活性(其中iPS-WT-01、iPS-WT-02、ES-WT-01、ES-WT-02为4组实验组(高效挑取方法)，iPS-WT-mock、ES-WT-mock为2组对照组(传统机械挑取方法))；
图4：实施例3中iPSCs细胞基因编辑PCR结果胶图；
图5：iPSCs基因编辑测序结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，本发明的高效挑取法适用于各种细胞克隆的挑取，此处所描述的优选实施例虽只描述了重编程iPSC的高效挑取，然而该实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1高效挑取高活力iPSCs的方法
一PBMCs制备重编程iPSC：
1、第–4天：按照5×105细胞/mL的密度将外周血单核细胞(PBMCs)接种于含有PMBC完全培养基的24-孔板的中间孔中。
2、第–3至–1天：用0.5mL新鲜的PBMC培养基更换一半用过的培养基。
3、第0天：使用适当的MOI，利用仙台病毒试剂转染细胞。培养细胞过夜。
4、第1天：更换新鲜的PBMC完全培养基，以去除仙台病毒重编程载体。准备MEF培养皿在第三天使用。
5、第3天：将转染的细胞接种于含有不含细胞因子的StemPro-34完全培养基的MEF培养皿中。
6、第4至6天：每隔一天更换用过的不含细胞因子的StemPro-34完全培养基。
7、第7天：用iPSC完全培养基更换一半用过的不含细胞因子的StemPro-34完全培养基，开始向iPSC培养基转移。
8、第8天：将培养基完全更换为iPSC完全培养基，完成培养基的替换。继续在MEF培养皿上培养。
9、第9至28天：每隔更换为新鲜的iPSC完全培养基，监测培养器皿中是否出现iPSC集落。手动挑取克隆并转移未分化的iPSCs至新鲜的MEF培养皿中扩增。
二iPSC集落的高效挑取：
1.采用倒置显微镜以4X-10X观察含有iPSCs的培养皿(见图1A-图1B)；
2.在培养皿底部标记要挑取的集落，在每次重编程实验结束时按照下述方法挑取至少10个不同的集落，置于预铺MEF或基底胶的24孔板中单独扩增；
①去除培养皿中细胞上清，加DPBS清洗细胞两次；
②加入用不含钙镁的DPBS制备的0.5mM的EDTA进行消化，并在消化2—5分钟内密切关注细胞状态，当细胞与细胞之间开始进入分离状态但又未明显分离，且细胞没有出现从板底脱落现象时，将消化液去除，缓慢加入培养基终止消化。
③立即将培养皿转移至配备有立体显微镜的无菌细胞培养通风橱内(即生物安全柜)。
④使用10-μL或200-μL吸头将消化松散的各细胞集落缓慢吸入吸头内，然后分别转移至1.5ml EP管中，为防止混入非本克隆团块细胞，可只吸取集落中间部分细胞。
3.挑取完成后，将EP管放入离心机内以200×g离心5min。
4.去除细胞上清液，加入含10μM Y27632的新鲜培养基重悬细胞，然后将细胞铺种至预铺MEF或者包被基底胶的24孔板中。
5.将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
6.使集落贴壁24小时后弃去用过的培养基，更换新鲜的人iPSC培养基。之后每天更换培养基。
7.当克隆覆盖～85％培养表面积时，可以进行传代。
8.采用标准的培养步骤进行传代、扩增，并冻存部分培养板中的细胞留种备用。
实施例2(对比例)：通过传统划板方法(对照组)进行重编程iPSC集落的挑取
一重编程步骤如实施例1的步骤一；
二传统方法(对照组)挑取iPSC集落的方法：
1.采用倒置显微镜4X-10X观察含有重编程细胞的培养皿。
2.在培养皿底部标记要挑取的集落，在每次重编程实验结束时用针头直接挑取至少10个不同的集落，置于预铺MEF的24孔板中单独扩增，针头挑取方法如下：
①将培养皿转移至配备有立体显微镜的无菌细胞培养通风橱内(即生物安全柜)。
②使用25号11/2英寸针头将待挑取的集落切成5–6片网格状图形。
③使用200μL吸头将切下的小块转移至新鲜制备的含有人iPSC和预铺MEF的24孔板中。
3.将含有挑取集落的预铺MEF的培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
4.使集落贴壁48小时后再弃去用过的培养基，更换新鲜的人iPSC培养基。之后每天更换培养基。
5.当克隆覆盖～85％培养表面积时，可以进行传代。
6.采用标准的培养步骤进行传代、扩增，并冻存部分培养板中的细胞留种备用。
实施例3两种挑取方法(实施例1的高效挑取法和实施例2的传统针头挑取法)所获
得的细胞比较
一形态、数量和存活率的比较：
图1A-B中展示了iPSCs挑取前细胞集落的状态，图1C-D中展示了iPSCs通过高效挑取法挑取后培养的iPSCs克隆状态，由图可见，高效挑取法对于所挑取的iPSCs几乎无损伤，细胞贴壁率高，细胞饱满，图1E-F中展示的为传统针头挑取法挑取过程中的划痕以及对细胞的损伤，图G-H中展示了传统的针头挑取法挑取的细胞克隆状态，可明显看出，传统的针头挑取法挑取的i PSCs细胞导致细胞贴壁率低，细胞状态差,细胞有老化现象，即细胞扁平不饱满、边缘不清晰、细胞突触变多、折光性差且增殖缓慢；黑点很多、细胞碎片多(如图箭头所指区域，细胞凋亡后留下的痕迹)。在图2中则进一步证实了上述观点：通过对高效挑取法获得的克隆细胞计数可达50w细胞/孔(图2A,-4x)，而传统针头挑取法获得的克隆细胞计数仅为12w细胞/孔(图2B,-4x)。通过对克隆细胞进行台盼蓝染色可知，由高效挑取法获得的克隆细胞活率达98％(图2C，-10x)，而由针头机械挑取法获得的克隆细胞活率仅为60％(图2D，-10x)。
二重编程细胞的细胞活性比较：
1.CCK8细胞增殖实验：
通过CCK8细胞增殖实验对两种方法挑取获得的重编程细胞进行活性分析，其中iPS-WT-01、iPS-WT-02、ES-WT-01、ES-WT-02取自4组高效挑取方法获得的iPS细胞，iPS-WT-mock、ES-WT-mock取自2组机械挑取方法(对照组)获得的iPS细胞。
从图3的数据可以看出，高效挑取方法获得的iPS细胞活性明显高于对照组iPS细胞的活性。
实施例4利用高效挑取法获得的重编程iPSC细胞的功能验证
将利用高效挑取法获得的重编程iPSC细胞的用于基因型遗传病患者细胞替代、编辑治疗。
具体步骤如下：
1.用Matrigel预包被24孔板。
2.准备需要转染(编辑或替代治疗)的细胞，铺种：
①当无饲养层6孔板中培养的重编程iPSC融合度小于85％时，去除mTeSR1培养基，每孔用2ml DPBS(不含钙和镁)轻轻洗涤细胞两次。
②每孔加入1mL Versene溶液，在37℃培养箱中孵育3-5分钟。
③显微镜下观察消化的细胞，当可以看到单个细胞收缩，但菌落仍然附着在孔上时抽吸去除Versene溶液。
④加入1ml的mTeSR1培养基终止消化，用1ml移液管将细胞从孔表面冲洗掉，在培养皿中吹打3次，分离成3-5个细胞的小簇。在显微镜下确认没有剩余的大簇后，将其收集到15ml离心管中。
⑤进行总活细胞计数，包括单个细胞以及小集群中的单个细胞，将细胞稀释至10Wcells/mL，然后将细胞按照5W-7.5W/孔铺种至24孔板。
⑥将培养板放回培养箱中，在37℃、5％CO2条件下培养过夜。
3.转染当天更换新鲜的mTeSR1培养基。
使用LipofectamineTMStem转染试剂按表1进行DNA质粒(含puro抗性)转染：
表1
4.筛选：用适量浓度的puro对转染细胞进行15-30天的筛杀。
5.iPSC集落的高效挑取：
步骤如下：
(1)将转染筛杀后的细胞消化成单个细胞，并按照1W/孔、2W/孔和3W/孔的密度梯度进行铺种。
(2)待细胞长至30-50个细胞/团时，选取细胞团块之间间隙较大且数量适宜的孔进行单细胞克隆挑取。
(3)采用倒置显微镜10X观察含有转染细胞的培养皿。
(4)在培养皿底部标记要挑取的集落，在每次转染筛杀实验结束时挑取至少24个不同的集落，置于预铺MEF或基底胶的48或96孔板中单独扩增。
(5)去除培养皿中细胞上清，加DPBS清洗细胞两次。
(6)加入用不含钙镁的DPBS制备的0.5mM的EDTA进行消化，并在消化2-5分钟内密切关注细胞状态，当细胞与细胞之间开始进入分离状态但又未明显分离，且细胞没有出现从板底脱落现象时，将消化液去除，缓慢加入培养基终止消化。
(7)立即将培养皿转移至配备有立体显微镜的无菌细胞培养通风橱内(即生物安全柜)。
(8)使用10-μL吸头将消化松散的各细胞集落缓慢吸入吸头内，然后分别转移至0.6ml EP管中，为防止混入非本克隆团块细胞，可只吸取集落中间部分细胞。
6.挑取完成后，将EP管放入离心机内以200×g离心5min。
7.去除细胞上清液，加入含10μM Y27632的新鲜培养基重悬细胞，然后将细胞铺种至预铺MEF或者包被基底胶的48或96孔板中。
8.将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
9.使集落贴壁24小时后弃去用过的培养基，更换新鲜的人iPSC培养基。之后每天更换培养基。
10.当克隆融合度达80％培养板表面积时，可用200-μL吸头刮取部分细胞进行PCR和sanger测序进行鉴定。
结果如图4-图5所示：
通过核酸胶图(图4)可见片段敲除后的条带比无编辑细胞mock的条带要小。通过sanger测序进一步验证(图5)；
1.单克隆细胞挑取后Sanger测序结果：与mock无编辑细胞测序结果对比可见纯合大片段碱基缺失，无套峰，该细胞为单一基因型的细胞pool。
2.单克隆细胞挑取后测序结果：与mock无编辑细胞测序结果对比可见套峰，该细胞为多种基因型的细胞pool。
由此可见，通过高效挑取法不影响iPSCs功能的实现，且扩增的细胞为单细胞来源克隆，细胞更为纯净，在转染质粒进行基因编辑或替代进行切割修复后，可以通过基因测序直接对细胞是否实现基因编辑或修复(单峰)进行鉴定，提高实验效率；而传统针头挑取法(机械法)挑取扩增的更多的为非单细胞来源的克隆，即为复合基因型的混合细胞，在基因测序图中会显示出现杂带(套峰)，难以区分不同基因型对表型的影响。因此本发明所提供的高效挑取法可实现获得单一基因型的细胞，有助于我们更好的对结果进行分析。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (3)
1.一种获得高活力iPSCs单克隆的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤如下：
步骤1.采用倒置显微镜观察含有iPSCs的培养皿；
步骤2.在培养皿底部标记要挑取的集落，在每次重编程实验结束时按照如下步骤挑取至少10个不同的集落，置于预铺MEF或基底胶的24孔板中单独扩增，所述挑取的方法为：
①去除培养皿中iPSCs细胞上清，加DPBS清洗细胞两次；
②加入用不含钙镁的DPBS制备的0.5mM的EDTA进行消化，并在消化2—5分钟内密切关注iPSCs状态，当细胞与细胞之间开始进入分离状态但又未明显分离，且细胞没有出现从板底脱落现象时，将消化液去除，缓慢加入培养基终止消化；
③立即将培养皿转移至配备有立体显微镜的无菌细胞培养通风橱内；
④将消化松散的各iPSCs集落缓慢吸入吸头内，然后分别转移至EP管中，为防止混入非本克隆团块细胞，可只吸取集落中间部分细胞；
步骤3.挑取完成后，将EP管放入离心机内以200×g离心5min；
步骤4.去除iPSCs细胞上清液，加入新鲜培养基重悬细胞，然后将iPSCs铺种至预铺MEF或者包被基底胶的24孔板中。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中所述新鲜培养基中含10μMY27632。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
步骤5.将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
步骤6.使集落贴壁24小时后弃去用过的培养基，更换新鲜的培养基，之后每天更换培养基；
步骤7.当克隆覆盖～85％培养表面积时，可以进行传代；
步骤8.采用标准的培养步骤进行传代、扩增，并冻存部分培养板中的细胞留种备用。
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