CN113278582A - 一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，包括以下步骤：步骤一：选择合适人群；步骤二：设置对照组实验；步骤三：使用不同培养基对细胞进行培养扩增，使用光学显微镜观察细胞生长情况，并定期换液，等待细胞生长到80％融合状态及时传代；步骤四：分别对两组扩增后的细胞第二代进行免疫染色；步骤五：提取总RNA，使用PCR扩增检测Oct‑4、Nanog‑3和Sox‑2等胚胎干细胞基因的表达，本发明通过使用胚胎干细胞的扩增方法来扩增胚胎样干细胞，能够通过借鉴之前对胚胎干细胞进行的研究，通过之前成熟的干细胞研究技术对胚胎样干细胞进行研究，能够建立一种获得多潜能干细胞的新途径，为临床应用提供一种分化潜能更强的种子细胞。
Description
技术领域
本发明属于胚胎样干细胞分离技术领域，具体涉及一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法。
背景技术
胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESC，简称ES、EK或ESC细胞)是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型，胚胎干细胞研究在美国一直是一个颇具争议的领域，支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，因为胚胎干细胞可以分化成多种功能的组织细胞，被认为是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。而反对者则认为，进行胚胎干细胞研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式，这有反生命伦理。
1、现有的技术虽然能够分离得到多潜能干细胞，但是没有对多潜能干细胞的来源进行更进一步的探究，并且没有对其和间充质干细胞之间的关系进行探究，因此急需探索分离扩增具有ECS类似的多潜能干细胞的技术方法，为临床应用提供分化潜能更强的种子细胞；
2、现有的技术方法中，要么添加的细胞因子较多，要么基因转染操作复杂，导致分离成本较高且存在一定的安全隐患。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，包括以下步骤：
步骤一：选择合适人群；
步骤二：设置对照组实验；
步骤三：使用不同培养基对细胞进行培养扩增，使用光学显微镜观察细胞生长情况，并定期换液，等待细胞生长到80％融合状态，及时传代；
步骤四：分别对两组扩增后的细胞第二代进行免疫染色；
步骤五：提取总RNA，使用PCR扩增检测Oct-4、Nanog-3和Sox-2等胚胎干细胞基因的表达；
步骤六：观察实验结果，并对实验数据进行研究。
优选的，所述步骤一中，从健康年轻供体采集骨髓或从健康产妇采集脐带。
优选的，所述步骤二中，将分离出的细胞或微小组织放置在添加鱼卵蛋白的胚胎干细胞培养扩增体系的细胞培养瓶内，细胞培养瓶内放置有细胞培养液。
优选的，所述步骤二中，采用添加了鱼卵蛋白的无血清培养基(含20％SR，2mol/L-glutamine，1％NEAA，0.1mol/Lmercap-toethanol和5ng/mLbFGF的knockout-DMEM培养液)对细胞进行扩增，按照相同的细胞密度，采用经典的间充质干细胞分离方法，即有血清培养基(含10％NCS的DMEM/F12培养液)对细胞进行扩增。
优选的，所述步骤四中，光学显微镜下观察细胞生长情况并拍照，每4天换液，弃除不贴壁的细胞，到细胞生长至80％融合状态时，用trypsin/EDTA消化传代细胞。
优选的，所述步骤五中，所述步骤五中，取第二代细胞作免疫染色和RT-PCR分析以检测Oct-4，Nanog-3，Sox-2和CD34的表达情况。
优选的，所述步骤六中，使用TRIZOL提取总RNA，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测观察PCR产物，并对结果进行照相。
优选的，所述步骤六中，观察图像结果，对比胚胎样干细胞和间充质干细胞形态特征，并记录数据。
与现有技术相比，本发明提供了一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，具备以下有益效果：
1、本发明通过使用胚胎干细胞的扩增方法来扩增胚胎样干细胞，能够通过借鉴之前对胚胎干细胞进行的研究，通过之前成熟的干细胞研究技术对胚胎样干细胞进行研究，能够建立一种获得多潜能干细胞的新途径，为临床应用提供一种分化潜能更强的种子细胞；
2、本发明通过设置对照组实验，对照组实验分别采用无血清培养基和使用传统方法对细胞进行扩增，能够确定bFGF对胚胎样干细胞分离的影响，从而能够了解bFGF对细胞生长调节作用；
3、本发明几乎没有对细胞造成损伤，通过采用RT-PCR分析，能够检测Oct-4，Nanog-3，Sox-2和CD34的表达情况，并通过使用1％琼脂糖凝胶电泳检测观察照相，能够方便研究人员直观地观察到胚胎样干细胞的基因表达情况。
4、本发明通过运用添加鱼卵蛋白的胚胎干细胞培养扩增体系从骨髓、脐带等组织中培养扩增胚胎样干细胞，一方面鱼卵提取物有诱导成体细胞逆分化为干细胞的作用，另一方面胚胎干细胞培养体系又具有维持干细胞多能性的作用，共同作用机制就是强化了干细胞多能性分化及其维持，最终能够获得表达多能性标志的多潜能干细胞。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方案：一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，包括以下步骤：
步骤一：选择合适人群；
步骤二：设置对照组实验；
步骤三：使用不同培养基对细胞进行培养扩增，使用光学显微镜观察细胞生长情况，并定期换液，等待细胞生长到80％融合状态，及时传代；
步骤四：分别对两组扩增后的细胞第二代进行免疫染色；
步骤五：提取总RNA，使用PCR扩增检测Oct-4、Nanog-3和Sox-2等胚胎干细胞基因的表达；
步骤六：观察实验结果，并对实验数据进行研究。
本发明中，优选的，步骤一中，从健康年轻供体采集骨髓或从健康产妇采集脐带。
本发明中，优选的，步骤二中，将分离出的细胞或微小组织放置在添加鱼卵蛋白的胚胎干细胞培养扩增体系的细胞培养瓶内，细胞培养瓶内放置有细胞培养液。
本发明中，优选的，步骤二中，采用添加了鱼卵蛋白的无血清培养基(含20％SR，2mol/L-glutamine，1％NEAA，0.1mol/Lmercap-toethanol和5ng/mLbFGF的knockout-DMEM培养液)对细胞进行扩增，按照相同的细胞密度，采用经典的间充质干细胞分离方法，即有血清培养基(含10％NCS的DMEM/F12培养液)对细胞进行扩增。
本发明中，优选的，步骤四中，光学显微镜下观察细胞生长情况并拍照，每4天换液，弃除不贴壁的细胞，到细胞生长至80％融合状态时，用trypsin/EDTA消化传代细胞。
本发明中，优选的，步骤五中，取第二代细胞作免疫染色和RT-PCR分析以检测Oct-4，Nanog-3，Sox-2和CD34的表达情况。
本发明中，优选的，步骤六中，使用TRIZOL提取总RNA，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测观察PCR产物，并对结果进行照相。
本发明中，优选的，步骤六中，观察图像结果，对比胚胎样干细胞和间充质干细胞形态特征，并记录数据。
实施例一
一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，包括以下步骤：
步骤一：选择合适人群；
步骤二：设置对照组实验；
步骤三：使用不同培养基对细胞进行培养扩增，使用光学显微镜观察细胞生长情况，并定期换液，等待细胞生长到80％融合状态，及时传代；
步骤四：分别对两组扩增后的细胞第二代进行免疫染色；
步骤五：提取总RNA，使用PCR扩增检测Oct-4、Nanog-3和Sox-2等胚胎干细胞基因的表达；
步骤六：观察实验结果，并对实验数据进行研究。
优选的，所述步骤一中，从健康年轻供体采集骨髓或从健康产妇采集脐带。
优选的，所述步骤二中，将分离出的细胞或微小组织放置在添加鱼卵蛋白的胚胎干细胞培养扩增体系的细胞培养瓶内，细胞培养瓶内放置有细胞培养液。
优选的，所述步骤二中，采用添加了鱼卵蛋白的无血清培养基(含20％SR，2mol/L-glutamine，1％NEAA，0.1mol/Lmercap-toethanol和5ng/mLbFGF的knockout-DMEM培养液)对细胞进行扩增，按照相同的细胞密度，采用经典的间充质干细胞分离方法，即有血清培养基(含10％NCS的DMEM/F12培养液)对细胞进行扩增。
优选的，所述步骤四中，光学显微镜下观察细胞生长情况并拍照，每4天换液，弃除不贴壁的细胞，到细胞生长至80％融合状态时，用trypsin/EDTA消化传代细胞。
优选的，所述步骤五中，所述步骤五中，取第二代细胞作免疫染色和RT-PCR分析以检测Oct-4，Nanog-3，Sox-2和CD34的表达情况。
优选的，所述步骤六中，使用TRIZOL提取总RNA，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测观察PCR产物，并对结果进行照相。
优选的，所述步骤六中，观察图像结果，对比胚胎样干细胞和间充质干细胞形态特征，并记录数据。
实施例二
一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，包括以下步骤：
步骤一：选择合适人群；
步骤二：设置对照组实验；
步骤三：使用不同培养基对细胞进行培养扩增，使用光学显微镜观察细胞生长情况，并定期换液，等待细胞生长到80％融合状态，及时传代；
步骤四：分别对两组扩增后的细胞第二代进行免疫染色；
步骤五：提取总RNA，使用PCR扩增检测Oct-4、Nanog-3和Sox-2等胚胎干细胞基因的表达；
步骤六：观察实验结果，并对实验数据进行研究。
优选的，所述步骤一中，从健康年轻供体采集骨髓或从健康产妇采集脐带。
优选的，所述步骤二中，将分离出的细胞或微小组织放置在添加鱼卵蛋白的胚胎干细胞培养扩增体系的细胞培养瓶内，细胞培养瓶内放置有细胞培养液。
优选的，所述步骤二中，采用添加了鱼卵蛋白的无血清培养基(含20％SR，2mol/L-glutamine，1％NEAA，0.1mol/Lmercap-toethanol和5ng/mLbFGF的knockout-DMEM培养液)对细胞进行扩增，按照相同的细胞密度，采用经典的间充质干细胞分离方法，即有血清培养基(含10％NCS的DMEM/F12培养液)对细胞进行扩增。
优选的，所述步骤四中，光学显微镜下观察细胞生长情况并拍照，每4天换液，弃除不贴壁的细胞，到细胞生长至80％融合状态时，用trypsin/EDTA消化传代细胞。
优选的，所述步骤五中，所述步骤五中，取第二代细胞作免疫染色和RT-PCR分析以检测Oct-4，Nanog-3，Sox-2和CD34的表达情况。
优选的，所述步骤六中，使用TRIZOL提取总RNA，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测观察PCR产物，并对结果进行照相。
优选的，所述步骤六中，观察图像结果，对比胚胎样干细胞和间充质干细胞形态特征，并记录数据。
实施例三
一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，包括以下步骤：
步骤一：选择合适人群；
步骤二：设置对照组实验；
步骤三：使用不同培养基对细胞进行培养扩增，使用光学显微镜观察细胞生长情况，并定期换液，等待细胞生长到80％融合状态，及时传代；
步骤四：分别对两组扩增后的细胞第二代进行免疫染色；
步骤五：提取总RNA，使用PCR扩增检测Oct-4、Nanog-3和Sox-2等胚胎干细胞基因的表达；
步骤六：观察实验结果，并对实验数据进行研究。
优选的，所述步骤一中，从健康年轻供体采集骨髓或从健康产妇采集脐带。
优选的，所述步骤二中，将分离出的细胞或微小组织放置在添加鱼卵蛋白的胚胎干细胞培养扩增体系的细胞培养瓶内，细胞培养瓶内放置有细胞培养液。
优选的，所述步骤二中，采用添加了鱼卵蛋白的无血清培养基(含20％SR，2mol/L-glutamine，1％NEAA，0.1mol/Lmercap-toethanol和5ng/mLbFGF的knockout-DMEM培养液)对细胞进行扩增，按照相同的细胞密度，采用经典的间充质干细胞分离方法，即有血清培养基(含10％NCS的DMEM/F12培养液)对细胞进行扩增。
优选的，所述步骤四中，光学显微镜下观察细胞生长情况并拍照，每4天换液，弃除不贴壁的细胞，到细胞生长至80％融合状态时，用trypsin/EDTA消化传代细胞。
优选的，所述步骤五中，所述步骤五中，取第二代细胞作免疫染色和RT-PCR分析以检测Oct-4，Nanog-3，Sox-2和CD34的表达情况。
优选的，所述步骤六中，使用TRIZOL提取总RNA，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测观察PCR产物，并对结果进行照相。
优选的，所述步骤六中，观察图像结果，对比胚胎样干细胞和间充质干细胞形态特征，并记录数据。
实施例四
一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，包括以下步骤：
步骤一：选择合适人群；
步骤二：设置对照组实验；
步骤三：使用不同培养基对细胞进行培养扩增，使用光学显微镜观察细胞生长情况，并定期换液，等待细胞生长到80％融合状态，及时传代；
步骤四：分别对两组扩增后的细胞第二代进行免疫染色；
步骤五：提取总RNA，使用PCR扩增检测Oct-4、Nanog-3和Sox-2等胚胎干细胞基因的表达；
步骤六：观察实验结果，并对实验数据进行研究。
优选的，所述步骤一中，从健康年轻供体采集骨髓或从健康产妇采集脐带。
优选的，所述步骤二中，将分离出的细胞或微小组织放置在添加鱼卵蛋白的胚胎干细胞培养扩增体系的细胞培养瓶内，细胞培养瓶内放置有细胞培养液。
优选的，所述步骤二中，采用添加了鱼卵蛋白的无血清培养基(含20％SR，2mol/L-glutamine，1％NEAA，0.1mol/Lmercap-toethanol和5ng/mLbFGF的knockout-DMEM培养液)对细胞进行扩增，按照相同的细胞密度，采用经典的间充质干细胞分离方法，即有血清培养基(含10％NCS的DMEM/F12培养液)对细胞进行扩增。
优选的，所述步骤四中，光学显微镜下观察细胞生长情况并拍照，每4天换液，弃除不贴壁的细胞，到细胞生长至80％融合状态时，用trypsin/EDTA消化传代细胞。
优选的，所述步骤五中，所述步骤五中，取第二代细胞作免疫染色和RT-PCR分析以检测Oct-4，Nanog-3，Sox-2和CD34的表达情况。
优选的，所述步骤六中，使用TRIZOL提取总RNA，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测观察PCR产物，并对结果进行照相。
优选的，所述步骤六中，观察图像结果，对比胚胎样干细胞和间充质干细胞形态特征，并记录数据。
综合上述实施例，得出以下结论：
bFGF是影响ELSCs分离的重要因素，作为一种重要的促有丝分裂原，它是维持人胚胎干细胞自我更新而不分化的强刺激因子，研究中ELSCs形态比MSCs明显细小，其原因可能就是bFGF对细胞生长调节作用的结果。表观遗传学研究还表明：bFGF对干细胞的生长调节的影响是广泛的，它对干细胞的生长调节是通过一个由正向调节和负向调节共同组成的基因网络调控完成的，该实验ELSCs表达多潜能抗原标志，提示ELSCs是一种分化潜能更强的干细胞。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：选择合适人群；
步骤二：设置对照组实验；
步骤三：使用不同培养基对细胞进行培养扩增，使用光学显微镜观察细胞生长情况，并定期换液，等待细胞生长到80％融合状态，及时传代；
步骤四：分别对两组扩增后的细胞第二代进行免疫染色；
步骤五：提取总RNA，使用PCR扩增检测Oct-4、Nanog-3和Sox-2等胚胎干细胞基因的表达；
步骤六：观察实验结果，并对实验数据进行研究。
2.根据权利要求1所述的一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：所述步骤一中，从健康年轻供体采集骨髓或从健康产妇采集脐带。
3.根据权利要求1所述的一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：所述步骤二中，将分离出的细胞或微小组织放置在添加鱼卵蛋白的胚胎干细胞培养扩增体系的细胞培养瓶内，细胞培养瓶内放置有细胞培养液。
4.根据权利要求1所述的一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：所述步骤二中，采用添加了鱼卵蛋白的无血清培养基(含20％SR，2mol/L-glutamine，1％NEAA，0.1mol/Lmercap-toethanol和5ng/mLbFGF的knockout-DMEM培养液)对细胞进行扩增，按照相同的细胞密度，采用经典的间充质干细胞分离方法，即有血清培养基(含10％NCS的DMEM/F12培养液)对细胞进行扩增。
5.根据权利要求1所述的一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：所述步骤四中，光学显微镜下观察细胞生长情况并拍照，每4天换液，弃除不贴壁的细胞，到细胞生长至80％融合状态时，用trypsin/EDTA消化传代细胞。
6.根据权利要求1所述的一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：所述步骤五中，取第二代细胞作免疫染色和RT-PCR分析以检测Oct-4，Nanog-3，Sox-2和CD34的表达情况。
7.根据权利要求1所述的一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：所述步骤六中，使用TRIZOL提取总RNA，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测观察PCR产物，并对结果进行照相。
8.根据权利要求1所述的一种胚胎样干细胞的培养扩增技术方法，其特征在于：所述步骤六中，观察图像结果，对比胚胎样干细胞和间充质干细胞形态特征，并记录数据。
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