CN117535220A - 一种棉花原生质体的制备方法及其应用和转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物分子育种技术领域，具体涉及一种棉花原生质体的制备方法及其应用和转化方法。本发明通过选择棉花黄化苗子叶或棉花黄化苗愈伤组织作为外植体，消耗了大部分次生成分，并通过实验处理减少干扰条件，在棉花中构建了省时、高效的原生质体制备方法。采用该方法可以进一步建立快速高效的原生质体瞬时转化体系，从外植体到获得成功表达GFP的原生质体只需13小时，可以快速获得高通量高活性的原生质体，获得的高通量高活性原生质体可应用于棉花亚细胞定位、体细胞杂交、遗传转化、植株再生等领域。

Description

一种棉花原生质体的制备方法及其应用和转化方法
技术领域
本发明属于植物分子育种技术领域，具体涉及一种棉花原生质体的制备方法及其应用和转化方法。
背景技术
棉花是一种重要的经济作物，棉花产业也是我国国民经济的重要支柱产业。植物中的原生质体是通过物理或者化学方法除去细胞壁后的植物细胞，由于细胞膜具有亲和性，原生质体可用于细胞融合杂交、瞬时转化、亚细胞定位、蛋白互作、代谢网络研究、再生成愈伤组织或胚状体等领域研究。近些年来，随着棉花各品种基因组序列的陆续发表，大量的棉花功能基因亟待验证。因此，利用基于原生质体的基因瞬时表达体系将加速基因功能鉴定的进程，且有助于快速筛选目标性状的DNA片段。
目前植物原生质体分离的方法主要有机械法和酶解法，但是机械法分离操作困难、得率低，所以主流方法还是可快速分离出大批量、高活性原生质体的酶解法。瞬时转化技术通过将连接目的基因的质粒转染至特定物种原生质体中，使得细胞内游离的载体可在短时间内转录翻译表达出目标蛋白，其短期内快速表达的优点使得其已在转基因检测、细胞定位、生物制剂合成、蛋白互作分析、植物品种选育等许多领域都有大量应用。然而在棉花领域，由于棉花的细胞质次生代谢物众多，富含棉酚、多糖、丹宁等物质，对原生质体提取带来难度，并且各品种间个体、个体内不同器官的渗透压、代谢物都不相同，导致提取的原生质体活力不稳定以及瞬时转化效率低下，并且，由于制备的原生质体的缺陷，会进一步导致利用原生质体真叶转化体系进行转化时耗时长，基本需要耗费两天左右，再加上前期棉花真叶种植需要一月左右，过长的实验时间无法适应高通量高效率的实验需求，如何实现棉花原生质体快速提取和高效转化是目前亟待解决的难题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种棉花原生质体的制备方法及其应用和转化方法，快速提取高通量、高活力(90％以上)的棉花原生质体，提高棉花原生质体的高效转化。
本发明提供了一种棉花原生质体的制备方法，包括：将棉花材料和酶解液混合，真空渗透后酶解；对所得酶解料液进行分离，得到所述棉花原生质体；
所述棉花材料包括棉花黄化苗子叶或棉花黄化苗愈伤组织；
所述酶解液包括：MES 0.02mol/L，纤维素酶15g/L，离析酶4g/L，甘露醇0.4～0.5mol/L，KCl 0.02mol/L，CaCl20.01mol/L和BSA 10g/L。
优选的，所述棉花黄化苗子叶为严格避光、生长至两片子叶刚刚分离的状态。
优选的，当棉花材料为棉花黄化苗子叶时，所述酶解液包括：MES 0.02mol/L，纤维素酶15g/L，离析酶4g/L，甘露醇0.5mol/L，KCl 0.02mol/L，CaCl20.01mol/L和BSA 10g/L；当棉花材料为棉花黄化苗愈伤组织时，所述酶解液包括：MES 0.02mol/L，纤维素酶15g/L，离析酶4g/L，甘露醇0.4mol/L，KCl 0.02mol/L，CaCl20.01mol/L和BSA 10g/L。
优选的，所述酶解液与棉花材料的用量比为10mL：0.3～1g；所述酶解的转速为55rpm，时间为4～5h，温度为20～28℃。
优选的，所述真空渗透的条件为避光，压强0.06～0.08MPa，时间为30min；所述分离的方式包括用孔径大小为40μm的细胞筛进行过筛分离。
本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法在原生质体瞬时转化中的应用。
本发明还提供了一种棉花原生质体的转化方法，包括以下步骤：
利用上述技术方案所述的制备方法制备棉花原生质体，利用W5溶液洗涤后利用MMG溶液重悬，得到棉花原生质体悬浮液；
将所述原生质体悬浮液、含有目的基因的质粒和转化缓冲液混匀，避光转化，然后加入W5，离心，去除上清后，用WI溶液重悬，得到转化后的原生质体悬浮液；
对转化后的原生质体悬浮液于28℃避光培养4.5h～5h，得到高通量高活力原生质体；
所述W5溶液包括：MES 0.002mol/L，NaCl 0.154mol/L，CaCl20.125mol/L和KCl0.005mol/L；
所述MMG溶液包括：MES溶液0.04mol/L，甘露醇0.4～0.5mol/L和MgCl20.015mol/L；
所述WI溶液包括MES溶液0.04mol/L，甘露醇0.4～0.5mol/L和KCl0.02mol/L；
所述转化缓冲液包括：PEG40000.4g/mL，甘露醇0.4～0.5mol/L和CaCl20.1mol/L。
优选的，所述避光转化的条件为：28℃恒温避光转化30min。
优选的，所述棉花原生质体悬浮液、含有目的基因的质粒溶液和转化缓冲液的体积比为10:1:11；所述棉花原生质体悬浮液中原生质体的浓度为2×106个/mL，所述含有目的基因的质粒的浓度为800ng/μL～2500ng/μL。
本发明还提供了上述技术方案所述的转化方法在下述一项或多项中的应用：
(a)棉花亚细胞定位；
(b)体细胞杂交；
(c)遗传转化；
(d)植株再生。
有益效果
本发明属于植物分子育种技术领域，具体涉及一种棉花原生质体的制备方法。由于黄化苗生长时缺乏光照，其子叶薄软，细胞壁相比正常苗更脆弱，本发明通过选择更易酶解，且原生质体的转化效率比绿色子叶更高的棉花黄化苗子叶或棉花黄化苗愈伤组织作为外植体，并通过实验处理减少干扰条件，优化酶解液的配比，在棉花中构建了省时、高效的原生质体提取方法。
本发明对不同的棉花材料进行原生质体提取转化时，针对不同材料间内源物含量的差异选取不同渗透压的酶解液和WI、MMG等溶液；本发明所提供的棉花原生质体转化体系适用于所有无叶绿体的棉花原生质体，能显著缩短原生质体培养的时间以及提高原生质体转化效率，从外植体到获得成功表达GFP的原生质体只需13小时，可以快速获得高通量高活性的原生质体，采用该方法获得的高通量高活性原生质体可应用于棉花亚细胞定位、体细胞杂交、遗传转化、植株再生等领域。
获得棉花真叶至少需要一个月时间，获得棉花正常绿色子叶也需要至少一周，而选择没有叶绿体的黄化苗只需要3～4天；本发明选择黄化苗不仅减少了外植体培养的时间，通过温度控制可以缩短转化后的GFP表达时间，相比于现有技术的过夜表达，最快只需4.5h即可观测到原生质体中质粒的GFP荧光。除种植黄化苗外的实验时间不超过13h，总体系时间不超过5天，对于提高实验效率、快速推进后续实验有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明所使用的棉花黄化苗示意图；
图2为本发明所使用的棉花黄化苗愈伤组织示意图；
图3为测试例1中检测的GFP荧光活性；
图4为测试例2实施例3中28℃转化30min原生质体的结果(GFP荧光观察)；
图5为测试例2实施例3中28℃转化30min原生质体的结果(明场观察)；
图6为测试例2对比例1中38℃转化30min原生质体的结果(GFP荧光观察)；
图7为测试例2对比例1中38℃转化30min原生质体的结果(明场观察)；
图8为测试例3对比例2的GFP荧光结果；
图9为测试例3实施例3的GFP荧光结果；
图10为测试例4处理1的原生质体过夜培养后的FDA染色结果；
图11为测试例4处理2的原生质体过夜培养后的FDA染色结果；
图12为测试例5以棉花正常绿色子叶制备的原生质体的转化效果；
图13为实施例1制备的转化后的原生质体的FDA荧光观察结果；
图14为实施例1制备的转化后的原生质体的FDA明场观察结果；
图15为实施例1制备的单个转化后的原生质体在GFP荧光下的形态；
图16为实施例1制备的单个转化后的原生质体在明场中的形态；
图17为实施例1制备的转化后的原生质体的GFP荧光观察结果；
图18为实施例1制备的转化后的原生质体的GFP明场观察结果；
图19为实施例2制备的转化后的愈伤组织原生质体的FDA荧光观察结果；
图20为实施例2制备的转化后的愈伤组织原生质体的FDA明场观察结果；
图21为实施例2制备的转化后的愈伤组织原生质体的GFP荧光观察结果；
图22为实施例2制备的转化后的愈伤组织原生质体的GFP明场观察结果；
图23为PM999报告载体图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种棉花原生质体的制备方法，包括：将棉花材料和酶解液混合，真空渗透后酶解，对所得酶解料液进行分离，得到所述棉花原生质体；所述棉花材料包括棉花黄化苗子叶或棉花黄化苗愈伤组织；所述酶解液包括：MES 0.02mol/L，纤维素酶15g/L，离析酶4g/L，甘露醇0.4～0.5mol/L，KCl0.02mol/L，CaCl20.01mol/L和BSA 10g/L。
在本发明中，所述棉花黄化苗子叶优选为严格避光、生长至两片子叶刚刚分离的状态；本发明对棉花材料的来源没有特殊限定，采用常规市售品种均可。本发明通过选择处于刚分离状态的黄化苗子叶或较容易获得的愈伤组织作为外植体，有效减少了外植体培养的时间，对于提高实验效率、快速推进后续实验有重要意义。
本发明将棉花材料和酶解液混合，真空渗透后酶解，分离，得到所述棉花原生质体。本发明将棉花材料和酶解液混合前，优选的还包括将棉花黄化苗子叶切成0.5mm的细丝或者取棉花黄化苗愈伤组织中的嫩黄色非胚性愈伤颗粒。
在本发明中，所述酶解液包括：MES 0.02mol/L，纤维素酶15g/L，离析酶4g/L，甘露醇0.4～0.5mol/L，KCl 0.02mol/L，CaCl20.01mol/L和BSA 10g/L。本发明优选根据棉花材料配制酶解液：当棉花材料为棉花黄化苗子叶时，所述酶解液优选的包括：MES 0.02mol/L，纤维素酶15g/L，离析酶4g/L，甘露醇0.5mol/L，KCl 0.02mol/L，CaCl20.01mol/L和BSA10g/L；当棉花材料为棉花黄化苗愈伤组织时，所述酶解液优选的包括：MES 0.02mol/L，纤维素酶15g/L，离析酶4g/L，甘露醇0.4mol/L，KCl 0.02mol/L，CaCl20.01mol/L和BSA 10g/L。本发明所提供的酶解液能够有效分解植物细胞的细胞壁，使原生质体裸露出来；其中的MES作为pH缓冲剂能够调节酸碱环境，保持原生质体的稳定性，避免其破裂，进而增加原生质体的释放量；纤维素酶和离析酶用于消化细胞壁中的纤维素、半纤维素、甘露聚糖、木聚糖、半乳甘露聚糖、果胶等物质；甘露醇溶液用于维持细胞外渗透压，KCl和CaCl2提供无机离子以保持细胞内渗透压的动态平衡，三者共同保证原生质体的膜稳定性；BSA(牛血清蛋白)可以防止酶解过程对细胞膜和细胞器造成伤害。
在本发明中，所述酶解液与棉花材料的用量比优选为10mL：0.3～1g，进一步优选为10mL：0.3g；所述酶解的转速优选为55rpm，时间优选为4～5h，温度优选为20～28℃。
在本发明中，所述真空渗透的条件优选为避光；所述真空渗透的压强优选为0.06～0.08MPa，进一步优选为0.06MPa；所述真空渗透的时间优选为30min。本发明通过真空渗透可以把酶解液压入细胞壁间隙，使其充分酶解，进而大幅缩短酶解时间，使酶解时间降至4～5h，仅为现有技术的一半。
在本发明中，所述分离的方式优选包括用孔径大小为40μm的细胞筛进行过筛分离。本发明优选进行所述分离前，向酶解所得产物中添加W5溶液，终止酶解，所述W5溶液和所得酶解料液的体积比为1：1。
本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法在原生质体瞬时转化中的应用。
本发明还提供了一种棉花原生质体的转化方法，包括以下步骤：
利用上述技术方案所述的制备方法制备棉花原生质体，利用W5溶液洗涤后利用MMG溶液重悬，得到棉花原生质体悬浮液；
将所述原生质体悬浮液、含有目的基因的质粒和转化缓冲液混匀，避光转化，然后加入等量W5，离心，去除上清后，用WI溶液重悬，得到转化后的原生质体悬浮液；
对转化后的原生质体悬浮液于28℃避光培养4.5h～5h，得到高通量高活力原生质体；
所述W5溶液包括：MES 0.002mol/L，NaCl 0.154mol/L，CaCl20.125mol/L和KCl0.005mol/L；
所述MMG溶液包括：MES溶液0.04mol/L，甘露醇0.4～0.5mol/L和MgCl20.015mol/L；
所述WI溶液包括MES溶液0.04mol/L，甘露醇0.4～0.5mol/L和KCl0.02mol/L；
所述转化缓冲液包括：PEG40000.4g/mL，甘露醇0.4～0.5mol/L和CaCl20.1mol/L。
本发明利用上述技术方案所述的制备方法制备棉花原生质体，利用W5溶液对棉花原生质体进行洗涤。在本发明中，所述W5溶液包括：MES 0.002mol/L，NaCl 0.154mol/L，CaCl20.125mol/L和KCl 0.005mol/L；本发明在利用W5溶液对棉花原生质体进行洗涤前，优选的还包括将W5溶液提前在冰上预冷30min。本发明所述W5溶液能够用于终止酶解、对原生质体进行重悬和洗涤，同时能有效保持原生质体的活力。
对棉花原生质体进行洗涤后，本发明利用MMG溶液重悬洗涤后的棉花原生质体，得到棉花原生质体悬浮液。在本发明中，所述MMG溶液包括：MES溶液0.04mol/L，甘露醇0.4～0.5mol/L和MgCl20.015mol/L。本发明优选根据棉花材料配制MMG溶液：当棉花材料为棉花黄化苗子叶时，所述MMG溶液优选的包括：MES溶液0.04mol/L，甘露醇0.5mol/L和MgCl20.015mol/L；当棉花材料为棉花黄化苗愈伤组织时，所述MMG溶液优选的包括：MES溶液0.04mol/L，甘露醇0.4mol/L和MgCl20.015mol/L。本发明所述棉花原生质体悬浮液中原生质体的浓度优选为2×106个/mL。本发明在转化之前使用MMG溶液重悬棉花原生质体，其中的Mg2+在15mM的工作浓度下可以促进原生质体的转化效率。
得到棉花原生质体悬浮液后，本发明将所述棉花原生质体悬浮液、含有目的基因的质粒和转化缓冲液混匀，避光转化。在本发明中，所述棉花原生质体悬浮液、含有目的基因的质粒溶液和转化缓冲液的体积比优选为10:1:11；所述目的基因优选为GFP基因；所述含有目的基因的质粒的浓度优选为800ng/μL～2500ng/μL，进一步优选为1000ng/μL～2000ng/μL，更优选为1200ng/μL；所述避光转化的条件优选为：28℃恒温避光转化30min。
避光转化后，本发明向混合溶液中加入等量W5，离心，去除上清，用WI溶液重悬，得到转化后的原生质体悬浮液。在本发明中，所述WI溶液优选的包括MES溶液0.04mol/L，甘露醇0.4～0.5mol/L和KCl 0.02mol/L。本发明优选根据棉花材料配制WI溶液：当棉花材料为棉花黄化苗子叶时，所述WI溶液优选的包括MES溶液0.04mol/L，甘露醇0.5mol/L和KCl0.02mol/L；当棉花材料为棉花黄化苗愈伤组织时，所述WI溶液优选的包括MES溶液0.04mol/L，甘露醇0.4mol/L和KCl 0.02mol/L。本发明的WI溶液用于在转化后长时间培养过程中保证细胞的完整性。
得到转化后的棉花原生质体悬浮液后，本发明对所述转化后的原生质体悬浮液于28℃避光培养4.5h～5h，得到高通量高活力原生质体。在本发明中，对所述原生质体悬浮液进行培养前的的步骤优选为在冰上操作。
本发明还提供了上述技术方案所述的转化方法在下述一项或多项中的应用：
(a)棉花亚细胞定位；
(b)体细胞杂交；
(c)遗传转化；
(d)植株再生。
本发明在棉花中构建了省时、高效的原生质体制备方法，建立了快速高效的原生质体瞬时转化体系，从外植体到获得成功表达GFP的原生质体只需13小时，可以快速获得高通量高活性的原生质体。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种棉花原生质体的制备方法及其应用和转化方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明实施例中，所述育苗有机基质购买自江苏培蕾基质科技发展有限公司；纤维素酶和离析酶购自日本yakult公司。
在本发明实施例中，涉及原生质体时所用枪头都经过如下处理：剪掉尖端并用打火机烧一遍使之变圆润。本发明实施例中使用的质粒为PM999载体，使用天根无内毒素质粒中量提取试剂盒(DP108)提取DNA。PM999载体的图谱如图23所示，载体序列长度为4804bp，如SEQ ID No.1所示，具体为：GGGGATCGATCCCCGGGCGGCCGCAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGTCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAGGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTAC
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实施例1
1.配制溶液
酶解液：取1mL浓度为0.2mol/L的MES溶液于70℃水浴中预热3-5min，然后加入0.15g纤维素酶、0.04g离析酶、6.25mL浓度为0.8mol/L的甘露醇溶液和100μL浓度为2mol/L的KCl溶液。将混合液密封置于55℃水浴10-15min后取出，冷却至室温后添加100μL浓度为1mol/L的CaCl2溶液和0.01g BSA(牛血清蛋白)粉末，定容至10mL。酶解液充分混匀后为淡褐色澄清液体。随后使用干净的0.45μm过滤器过滤灭菌至干净的5cm一次性培养皿。
WI溶液：取200μL浓度为0.2mol/L的MES溶液，加入6.25mL浓度为0.8mol/L的甘露醇溶液、100μL浓度为2mol/L的KCl溶液，用ddH2O定容至10mL。
W5溶液：取1mL浓度为0.2mol/L的MES溶液，加入10mL浓度为1.54mol/L的NaCl溶液、12.5mL浓度为1mol/L的CaCl2溶液、250μL浓度为2mol/L的KCl溶液，用ddH2O定容至100mL。
MMG溶液：取200μL浓度为0.2mol/L的MES溶液，加入6.25mL浓度为0.8mol/L的甘露醇溶液、75μL浓度为2mol/L的MgCl2溶液，用ddH2O定容至10mL。
转化缓冲液：准确称取0.4g PEG4000片剂于2mL圆底离心管，加入625μL浓度为0.8mol/L的甘露醇溶液、100μL浓度为1mol/L的CaCl2溶液，用ddH2O定容至1mL。PEG4000转化缓冲液配制完成后55℃水浴1-2h，取出后放至室温使用。
2.植株培养、原生质体提取
将蛭石与育苗有机基质(购自江苏培蕾基质科技发展有限公司)以体积比2：1混合配制营养土，装入4cm圆形营养钵中，每钵种植1颗棉花Jin668的种子，于28℃，相对湿度40～70％的条件下进行避光培养。
培养至种子两片子叶刚刚展开(如图1所示)，将叶片连同茎和叶脉交接部分一起切下来，称取0.3g子叶，置于装有10mL 0.5M甘露醇溶液的培养皿中，使叶片完全浸没于甘露醇溶液中，用锋利的剃须刀片将叶片切割成0.5mm宽的细丝(每切2-3片叶后换一片新刀片)。
迅速将切好的叶片完全浸入10mL酶解液中，置入真空干燥箱中，压强设置为0.06MPa，避光条件下真空渗透30min；然后置于摇床上以55rpm，室温条件下继续避光酶解4-5h。
冰上预冷W5溶液，使用干净的塑料吸管吸取9mLW5溶液，缓慢加入酶解液/原生质体混合液中以终止反应。取1mLW5溶液润洗40μm的过滤器，轻柔过滤含有原生质体细胞的酶解液至提前预冷好的50mL圆底无菌离心管中。
离心机预冷至4℃，升速降速均设为1，于100rcf条件下低温离心2min以沉淀原生质体，尽可能去除上清液。
用预冷的W5溶液缓慢重悬原生质体，血球计数板计数，将原生质体的密度调整为2×106个/mL。
冰上45°倾斜静置原生质体30min，使原生质体沉淀于圆底离心管下部，避免细胞重叠。尽可能去除W5溶液，用室温保存的MMG溶液重悬原生质体，将其密度调整至为2×106个/mL。
3.PEG介导的原生质体转化：
在2mL圆底离心管中加入10μL DNA(质粒浓度要在1200/μL以上，本实施例所使用的的质粒PM999 DNA使用天根无内毒素质粒中量提取试剂盒提取，DP108)，加入100μL原生质体(其中约含原生质体2×105个)，轻轻吸打混匀，混匀后室温放置不超过1min，防止原生质体沉降，然后沿管壁加入110μL转化缓冲液，轻敲或颠倒离心管6-10次，使其完全混匀。在28℃恒温培养箱下避光转化30min。
加入450μL室温保存的W5溶液于转化混合液中，轻微颠倒混匀以终止转化。室温下100g离心2min，去除上清后，用1mL室温保存的WI溶液重新悬浮原生质体，得到转化后的原生质体悬浮液。
用0.1％BSA溶液润洗细胞培养六孔板两次后，将原生质体悬浮液加入六孔板，在28℃恒温培养箱内，严格避光培养原生质体4.5h。室温下100g离心2min收集转化后的原生质体，留下约200μL上清液重悬。
实施例2
1.配制溶液
酶解液：取1mL浓度为0.2mol/L的MES溶液于70℃水浴中预热3-5min，然后加入0.15g纤维素酶、0.04g离析酶、5mL浓度为0.8mol/L的甘露醇溶液和100μL浓度为2mol/L的KCl溶液。将混合液密封置于55℃水浴10-15min后取出，冷却至室温后添加100μL浓度为1mol/L的CaCl2溶液和0.01g BSA(牛血清蛋白)粉末，定容至10mL。酶解液充分混匀后为淡褐色澄清液体。随后使用干净的0.45μm过滤器过滤灭菌至干净的5cm一次性培养皿。
WI溶液：取200μL浓度为0.2mol/L的MES溶液，加入5mL浓度为0.8mol/L的甘露醇溶液、100μL浓度为2mol/L的KCl溶液，用ddH2O定容至10mL。
W5溶液：取1mL浓度为0.2mol/L的MES溶液，加入10mL浓度为1.54mol/L的NaCl溶液、12.5mL浓度为1mol/L的CaCl2溶液、250μL浓度为2mol/L的KCl溶液，用ddH2O定容至100mL。
MMG溶液：取200μL浓度为0.2mol/L的MES溶液，加入5mL浓度为0.8mol/L的甘露醇溶液、75μL浓度为2mol/L的MgCl2溶液，用ddH2O定容至10mL。
转化缓冲液：准确称取0.4g PEG4000片剂于2mL圆底离心管，加入500μL浓度为0.8mol/L的甘露醇溶液、100μL浓度为1mol/L的CaCl2溶液，用ddH2O定容至1mL。PEG4000转化缓冲液配制完成后55℃水浴1-2h，取出后放至室温使用。
2.棉花愈伤组织原生质体提取和转化
棉花愈伤组织来自棉花YZ-1品种，采用普通分化培养基继代培养两周后使用(如图2所示)。
用镊子挑选棉花黄化苗愈伤组织中的松散的、湿润的嫩黄色非胚性愈伤颗粒，将其完全浸入10mL酶解液中，置入真空干燥箱中，压强设置为0.06MPa，避光条件下真空渗透30min；然后置于摇床上以55rpm，室温条件下继续避光酶解4-5h。
冰上预冷W5溶液，使用干净的塑料吸管吸取9mLW5溶液，缓慢加入酶解液/原生质体混合液中以终止反应。取1mLW5溶液润洗40μm的过滤器，轻柔过滤含有原生质体细胞的酶解液至提前预冷好的50mL圆底无菌离心管中。
离心机预冷至4℃，升速降速均设为1，于100rcf条件下低温离心2min以沉淀原生质体，尽可能去除上清液。
用预冷的W5溶液缓慢重悬原生质体，血球计数板计数，将原生质体的密度调整为2×106个/mL。
冰上45°倾斜静置原生质体30min，使原生质体沉淀于圆底离心管下部，避免细胞重叠。尽可能去除W5溶液，用室温保存的MMG溶液重悬原生质体，将其密度调整至为2×106个/mL。
3.PEG介导的原生质体转化：
在2mL圆底离心管中加入10μL DNA(质粒浓度要在1200/uL以上，本实验所使用的的质粒PM999 DNA使用天根无内毒素质粒中量提取试剂盒提取，DP108)，加入100μL原生质体(约2×105个)，轻轻吸打混匀，混匀后室温放置不超过1min，防止原生质体沉降，然后沿管壁加入110μL转化缓冲液，轻敲或颠倒离心管6-10次，使其完全混匀。在28℃恒温培养箱下避光转化30min。
加入450μL室温保存的W5溶液于转化混合液中，轻微颠倒混匀以终止转化。室温下100g离心2min，去除上清后，用1mL室温保存的WI溶液重新悬浮原生质体，得到转化后的原生质体悬浮液。
用0.1％BSA溶液润洗细胞培养六孔板两次后，将原生质体悬浮液加入六孔板，在28℃恒温培养箱内，严格避光培养原生质体4.5h。室温下100g离心2min收集原生质体，留下约200μL上清液重悬原生质体。
测试例1
保存温度对原生质体GFP表达量的影响
将实施例1步骤3制备的转化后的原生质体放置4℃冰箱保存，观察原生质体活性，结果如图3所示。
由图3可知，本发明实施例所制备的原生质体在过夜后仍能保留部分活性。
实施例3
按照实施例1所记载的方式配置溶液，并制备棉花原生质体，在2mL圆底离心管中加入10μL DNA(质粒浓度要在800ng/μL以上，本实施例所使用的的质粒PM999 DNA使用天根无内毒素质粒中量提取试剂盒提取，DP108)，加入100μL原生质体(约2×105个)，轻轻吸打混匀，混匀后室温放置不超过1min，防止原生质体沉降，然后沿管壁加入110μL转化缓冲液，轻敲或颠倒离心管6-10次，使其完全混匀。在28℃恒温培养箱下避光转化30min。
对比例1
同实施例3，唯一区别在于，在38℃恒温培养箱下避光转化30min。
测试例2
不同转化温度对棉花子叶原生质体转化效率的影响
取两枚载玻片，分别于四周粘贴窄双面胶，实施例3和对比例1转化得到的原生质体各取10μL分别置于两枚载玻片上，用盖玻片封片，于激光共聚焦扫描电子显微镜下进行扫描成像，结果如图4～图7所示。
由图4～图7可知，转化后28℃和38℃暗培养的转化效率有显著差距，视野内28℃转化率约8％，38℃转化率约2％。因此选择28℃进行转化暗培养。
对比例2
同实施例3，唯一区别在于，转化缓冲液的配方为：准确称取0.4g PEG4000片剂于2mL圆底离心管，加入250μL浓度为0.8mol/L的甘露醇溶液、100μL浓度为1mol/L的CaCl2溶液，用ddH2O定容至1mL。
测试例3
不同渗透压的PEG转化液对棉花子叶原生质体转化效率的影响
取两枚载玻片，分别于四周粘贴窄双面胶，实施例3和对比例2转化得到的原生质体各取10μL分别置于两枚载玻片上，用盖玻片封片，于激光共聚焦扫描电子显微镜下进行扫描成像，结果如图8～图9所示。
由图8～图9可知，两种浓度下转化率几乎没有差异，都在10％左右，说明只更改甘露醇浓度对于提升转化效率作用不大。
测试例4
不同渗透压W5洗涤对棉花原生质体活性的影响
按照实施例1所记载的方式制备棉花原生质体，将提取出的新鲜黄化苗子叶原生质体分为两个处理组，并按照下述方式进行处理：
处理1：将黄化苗子叶原生质体置于不含甘露醇的W5溶液中过夜培养，不含甘露醇的W5溶液配方为：MES 0.002mol/L，NaCl 0.154mol/L，CaCl20.125mol/L和KCl 0.005mol/L；
处理2：将黄化苗子叶原生质体置于含甘露醇的W5溶液中过夜培养，含甘露醇的W5溶液配方为：MES 0.002mol/L，NaCl 0.154mol/L，CaCl20.125mol/L，KCl 0.005mol/L和5mol/L甘露醇。
为防止原生质体在室温下失活，故将处理1和处理2的原生质体放置于4℃冰箱中过夜培养。使用FDA(二乙酸荧光素)染色检查细胞活性，活细胞可以被染成绿色，而死细胞无法被染色，结果如图10～图11所示。
由图10～图11可知，使用不含甘露醇的W5可以在一定程度上维持原生质体活性，而使用5M甘露醇浓度的W5过夜培养的原生质体活性不佳。因此在配制W5溶液时，选择不添加甘露醇。
测试例5
正常苗绿色子叶作为外植体对转化效率的影响
选取两片子叶刚刚分开时期的棉花Jin668普通绿色苗，按照实施例1所记载的方式提取棉花原生质体并进行转化，培养4.5h后观察转化效率。结果如图12所示。
由图12可知，绿色子叶几乎没有转化成功的原生质体。故后续还是选用黄化苗的子叶进行实验。
测试例6
(1)以黄化苗子叶为材料制备的原生质体中有很多碎片干扰活性判断，因此使用FDA(二乙酸荧光素)染色检查实施例1所制备的原生质体的细胞活性，结果如图13～图14所示。
由图13～图14可知，实施例1所制备的原生质体的活性接近100％。
(2)于载玻片四周粘贴窄双面胶，取10μL实施例1转化得到的原生质体置于载玻片上，用盖玻片封片，于激光共聚焦扫描电子显微镜下进行扫描成像，结果如图15～图18所示。
图15～图16为转化质粒后的原生质体GFP和明场对比图，由图15～图16可知，实施例1所制备的原生质体细胞个体分明，圆润无棱角，可见本发明实施例1的酶解效果良好。
结合图13，图17～图18，按照如下公式计算转化效率；
转化效率＝有GFP荧光的细胞数量/有FDA活性的细胞数量
其中，图17中约有30个细胞有GFP荧光，此处用于对照的FDA活性细胞为图13，图13中约有91个有FDA活性的细胞，经计算可得实施例1所制备的原生质体的转化效率约为32％。
测试例7
(1)使用FDA(二乙酸荧光素)染色检查实施例2所制备的原生质体的细胞活性，结果如图19～图20所示。
由图19～图20可知，实施例2所制备的愈伤组织原生质体的活性接近100％。
(2)于载玻片四周粘贴窄双面胶，取10μL实施例2转化得到的原生质体置于载玻片上，用盖玻片封片，于激光共聚焦扫描电子显微镜下进行扫描成像，结果如图21～图22所示。
结合图21～图22，按照如下公式计算转化效率；
转化效率＝有GFP荧光的细胞数量/圆润无破裂的细胞数量
由于愈伤组织原生质中没有干扰性的组织碎片，因此可以直接用圆润无破裂的细胞数量作为活性细胞数量。其中图21中约有25个GFP荧光细胞，图22中约有56个圆润无破裂的细胞，经计算可得实施例2所制备的愈伤组织原生质体的转化效率约为44％。
根据上述内容可以看出，本发明所提供的原生质体制备方法省时、高效，本发明所建立的原生质体瞬时转化体系，从外植体到获得成功表达GFP的原生质体仅需13小时，可以快速获得高通量高活性的原生质体，并且使原生质体的活性保持在90％以上。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种棉花原生质体的制备方法，其特征在于，包括：将棉花材料和酶解液混合，真空渗透后酶解；对所得酶解料液进行分离，得到所述棉花原生质体；
所述棉花材料包括棉花黄化苗子叶或棉花黄化苗愈伤组织；
所述酶解液包括：MES 0.02mol/L，纤维素酶15g/L，离析酶4g/L，甘露醇0.4～0.5mol/L，KCl 0.02mol/L，CaCl20.01mol/L和BSA 10g/L。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述棉花黄化苗子叶为严格避光、生长至两片子叶刚刚分离的状态。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
当棉花材料为棉花黄化苗子叶时，所述酶解液包括：MES 0.02mol/L，纤维素酶15g/L，离析酶4g/L，甘露醇0.5mol/L，KCl 0.02mol/L，CaCl20.01mol/L和BSA 10g/L；
当棉花材料为棉花黄化苗愈伤组织时，所述酶解液包括：MES 0.02mol/L，纤维素酶15g/L，离析酶4g/L，甘露醇0.4mol/L，KCl 0.02mol/L，CaCl20.01mol/L和BSA 10g/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液与棉花材料的用量比为10mL：0.3～1g；所述酶解的转速为55rpm，时间为4～5h，温度为20～28℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述真空渗透的条件为避光，压强0.06～0.08MPa，时间为30min；所述分离的方式包括用孔径大小为40μm的细胞筛进行过筛分离。
6.权利要求1～5任一项所述的制备方法在原生质体瞬时转化中的应用。
7.一种棉花原生质体的转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用权利要求1～5任一项所述的制备方法制备棉花原生质体，利用W5溶液洗涤后利用MMG溶液重悬，得到棉花原生质体悬浮液；
将所述原生质体悬浮液、含有目的基因的质粒和转化缓冲液混匀，避光转化，然后加入W5，离心，去除上清后，用WI溶液重悬，得到转化后的原生质体悬浮液；
对转化后的原生质体悬浮液于28℃避光培养4.5h～5h，得到高通量高活力原生质体；
所述W5溶液包括：MES 0.002mol/L，NaCl 0.154mol/L，CaCl20.125mol/L和KCl0.005mol/L；
所述MMG溶液包括：MES溶液0.04mol/L，甘露醇0.4～0.5mol/L和MgCl20.015mol/L；
所述WI溶液包括MES溶液0.04mol/L，甘露醇0.4～0.5mol/L和KCl0.02mol/L；
所述转化缓冲液包括：PEG 40000.4g/mL，甘露醇0.4～0.5mol/L和CaCl20.1mol/L。
8.根据权利要求7所述的转化方法，其特征在于，所述避光转化的条件为：28℃恒温避光转化30min。
9.根据权利要求7所述的转化方法，其特征在于，所述棉花原生质体悬浮液、含有目的基因的质粒溶液和转化缓冲液的体积比为10:1:11；所述棉花原生质体悬浮液中原生质体的浓度为2×106个/mL，所述含有目的基因的质粒的浓度为800ng/μL～2500ng/μL。
10.权利要求7～9任一项所述的转化方法在下述一项或多项中的应用：
(a)棉花亚细胞定位；
(b)体细胞杂交；
(c)遗传转化；
(d)植株再生。
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