CN115386531A - 植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法，该方法中采用了一种通用型植物细胞壁酶解液及一种通用型植物原生质体保存液、重悬液与转化液，原生质体制备方法包括酶解和纯化两个步骤，原生质体瞬时转化方法包括酶解、纯化、重悬、转化、漂洗和培养六个步骤，且原生质体制备方法和原生质体瞬时转化方法中的酶解和纯化步骤相同。本发明还提供一种植物通用型原生质体制备试剂盒和瞬时转化试剂盒，一种植物通用型原生质体制备方法及试剂盒在单子叶和双子叶植物原生质体制备中的应用，以及一种植物通用型原生质体瞬时转化方法及试剂盒在单子叶和双子叶植物原生质体瞬时转化中的应用。本发明克服了现有技术中存在的诸多问题。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法、试剂盒及应用。
背景技术
原生质体是指去除细胞壁后由细胞质膜包被的具有生命活力的植物细胞。原生质体具有结构简单、发育同步性好和易导入外源遗传物质等特点，是植物基因瞬时转化的良好材料。原生质体瞬时转化是进行植物基因瞬时表达、启动子活性分析、转录因子与顺式作用元件相互作用、蛋白质间的相互作用以及蛋白质亚细胞定位等研究的重要方法。而本申请的发明人经过研究发现，国内外现有植物原生质体制备和瞬时转化方法均至少存在多个如下缺点：
通用性差：如CN109355246B公开的一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用、CN110643566A公开的一种水稻原生质体分离与转化方法、CN107099552A公开的一种PEG4000介导的马铃薯原生质体转化方法及其应用，均仅可应用于一种植物，在多种植物间不通用，在同一植物的不同组织器官间不通用。
稳定性差：在用同一种方法开展不同批次的实验时，不同批次原生质体的瞬时转化效率差异较大，实验结果稳定性差。
原生质体制备速度慢：现有方法中，取材方法繁琐、细胞壁消化时间长、原生质体纯化方法复杂等多种因素会降低原生质体制备速度。
原生质体保存时间短：原生质体的质量不佳或原生质体保存液性质不稳定导致无法长时间完整保存原生质体。
原生质体产量低：植物材料选择、植物材料处理、细胞壁酶解等方面存在不足会降低原生质体产量。
原生质体易破裂：在原生质体制备过程中易发生破裂，或在瞬时转化后发生大量破裂现象，或在转化后继续培养过程中容易破裂。
操作过程复杂：现有方法中，需要进行数次离心过程，需要用BSA溶液对各类原生质体容器进行预处理，不仅操作步骤多、转化过程复杂，而且成本高。
转化效率低下：高质量质粒的提取和保存、原生质体制备及转化环境条件的控制、试剂的稳定性、原生质体的活力等方面存在不足会降低原生质体转化效率。
依赖进口试剂：现有原生质体的制备及瞬时转化方法，如Wang等(2022)[AnEfficient and Universal Protoplast Isolation Protocol Suitable for TransientGene Expression Analysis and Single-Cell RNA Sequencing.Int.J.Mol.Sci.2022；23(7):3419.]报道的方法，依赖进口试剂，而进口试剂存在购买难、成本高、货期长，在实际推广应用过程中存在诸多不便。
试剂种类较多：在原生质体制备和转化过程中，用到较多种类的试剂，不仅增加了试剂配制的难度，也会影响到原生质体的活力。
试剂无法长期保存：现有方法中，所配试剂均无法长期有效保存，且有多种试剂必须现用现配，不适用于多批次重复实验。
因此，如何创新地开发一种可以同时克服上述现有技术不足的植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法及试剂盒和应用具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的诸多技术问题，本发明提供一种植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法，利用本方法可快速从多种植物的不同组织器官中高效分离出原生质体，获得的原生质体活性高、完整性好、实验重复性强、长期保存不易破损。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法，所述方法中采用了一种通用型植物细胞壁酶解液即WQ1酶解液、一种通用型植物原生质体保存液即WQ2保存液、一种通用型植物原生质体重悬液即WQ3重悬液及一种通用型植物原生质体转化液即WQ4转化液；所述WQ1酶解液由1.0％～3.0％(w/v)的纤维素酶R-10、0.25％～1.0％(w/v)的离析酶R-10、300～600mM的D-Mannitol、10～40mM的MES、0.1％～0.2％(w/v)的BSA、0％～0.05％(v/v)的β-巯基乙醇和无菌超纯水组成，所述WQ1酶解液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，作为一种具体配制方式，先将固体药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将酶解液的pH值调节至5.6～5.8，定容后置于50℃水浴10min，震荡混匀，平衡温度至24～28℃即可使用，使用前按需加入β-巯基乙醇；所述WQ1酶解液在多种植物材料如幼嫩的叶片、叶柄、茎段、胚轴、胚乳、根或愈伤组织等材料的细胞壁裂解中通用，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；所述WQ1酶解液应用于简单植物材料如拟南芥叶片，无需添加β-巯基乙醇，应用于富含多糖多酚或油脂的复杂植物材料如马铃薯叶片，可添加β-巯基乙醇，以减少细胞氧化损伤；所述WQ1酶解液可分装至无菌离心管中，在-80～-20℃长期保存，在-80℃下可有效保存一年以上，保存时应避免反复冻融；
所述WQ2保存液由140～154mM的NaCl、115～125mM的CaCl2·2H2O、0.2～4mM的MES、3～5mM的KCl、1～5mM的蔗糖、1～5mM的葡萄糖和无菌超纯水组成，所述WQ2保存液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，作为一种具体配制方式，先将各药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将缓冲液的pH值调节至5.6～5.8，定容后用0.2μm过滤器过滤除菌即可使用；所述WQ2保存液可有效防止原生质体破裂，适用于各类植物原生质体的保存，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；所述WQ2保存液可分装至无菌离心管中，在-80～-20℃长期保存，在-80℃下可有效保存一年以上，保存时应避免反复冻融；
所述WQ3重悬液由15～25mM的MgCl2·6H2O、300～600mM的D-Mannitol、2～4mM的MES和无菌超纯水组成，所述WQ3重悬液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，作为一种具体配制方式，先将各药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将重悬液的pH值调节至5.6～5.8，定容后0.2μm过滤器过滤除菌即可使用；所述WQ3重悬液适用于各类植物原生质体瞬时转化，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；所述WQ3重悬液可分装至无菌离心管中，在-80～-20℃长期保存，在-80℃下可有效保存一年以上，保存时应避免反复冻融；
所述WQ4转化液由100～300mM的CaCl2·2H2O、200～600mM的D-Mannitol、35％～40％(w/v)的PEG4000和无菌超纯水组成，所述WQ4转化液的配制过程中需调节pH值至5.6～10.0，作为一种具体配制方式，先准确称量CaCl2·2H2O、D-Mannitol和PEG4000并按此顺序加至含有2～5mL无菌超纯水的50mL无菌离心管中，继续加入无菌超纯水，震荡混合，置于65～75℃烘箱中加热溶解，充分涡旋溶解至透明澄清，定容后用1M的KOH将转化液的pH值调节至5.6～10.0，平衡温度至24～28℃即可使用；所述WQ4转化液适用于各类植物原生质体瞬时转化，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；所述WQ4转化液可现配现用，也可在4℃下有效保存两天，每次从4℃取出的转化液需平衡温度至24～28℃再使用；
所述方法包括原生质体制备方法和原生质体瞬时转化方法，所述原生质体制备方法包括酶解和纯化两个步骤，所述原生质体瞬时转化方法包括酶解、纯化、重悬、转化、漂洗和培养六个步骤，且所述原生质体制备方法和原生质体瞬时转化方法中的酶解和纯化步骤相同，各步骤详细如下：
(1)酶解：用刀片将多个新鲜幼嫩植物组织纵向划切成0.5～1mm的细丝或横向划切成0.5～1mm的细段，置于含有5～20mL WQ1酶解液的50mL烧杯中，在真空度为100～150mbar的真空腔室中避光渗透10min，将烧杯固定至转速为40～50rpm、温度为24～28℃的摇床避光培养酶解2～6h；收集原生质体前，提高摇床转速至80～100rpm，摇动1～5min，使原生质体充分释放；用经过WQ2保存液润洗过1次的200目网筛过滤，将滤液转移至50mL无菌离心管，分别用5mL的WQ2保存液清洗酶解器皿和未消化的植物组织2～3次，收集洗液并转入装滤液的离心管中待用；
(2)纯化：将步骤(1)收集原生质体混液的离心管至于离心机中，在温度为4℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用针管或吸管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入20mL WQ2保存液，轻摇重悬，在温度为4℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用针管或吸管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入10mL WQ2保存液，轻摇重悬，在温度为4℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用针管或吸管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入1mL WQ2保存液，轻摇重悬，在冰上静置20～30min；用针管或吸管吸除上清，沉淀为纯化的原生质体，在显微镜下检察原生质体状态；
(3)重悬：将步骤(2)纯化后的原生质体，在温度为4℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min沉淀原生质体；用针管或吸管吸除上清，用相应体积的WQ3重悬液重悬原生质体，调整原生质体密度至最优；
(4)转化：在2mL无菌圆底离心管底部加入10～20μL纯化后浓度为1～3μg/μL的质粒和200μL已调整密度的原生质体，轻摇混匀；沿管壁加入210～220μL的WQ4转化液，迅速轻摇混匀；在24～28℃环境下避光孵育5～30min，孵育期间可间歇轻摇混匀；沿管壁缓慢加入1.5mL的WQ2保存液，缓慢颠倒离心管混合样品以终止转化；
(5)漂洗：将终止转化的原生质体混合液在温度为24～28℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；去除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入2mL的WQ2保存液，缓慢颠倒离心管重悬原生质体，在温度为24～28℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；去除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入500μL的WQ2保存液，轻摇混匀；
(6)培养：将步骤(5)漂洗后的原生质体转入无菌细胞培养板，在24～28℃条件下避光静置培养12～48h，在荧光显微镜下观察分析。
进一步，所述步骤(1)中针对富含多糖多酚的复杂植物，可在幼苗期取材或选取多糖多酚含量较少的组织部位进行实验。
进一步，所述步骤(1)中在真空渗透之后应缓慢向真空腔室中充气。
进一步，所述步骤(3)中原生质体密度为1×103～1×107个细胞/mL。
进一步，所述步骤(4)中质粒转化为单种质粒转化、两种或三种质粒转化，若仅对一种质粒转化，则加入10～30μg质粒；若对两种质粒共同转化，则各取10～15μg纯化后的质粒混合加入；若对三种质粒共同转化，则各取10μg纯化后的质粒混合加入；并且，加入WQ4转化液的体积应为加入原生质体的体积与加入质粒的体积之和。
进一步，所述步骤(5)中最后一次添加WQ2保存液时，按照氨苄青霉素：WQ2保存液＝1：1000(v/v)的比例向WQ2保存液中添加浓度为100mg/mL的氨苄青霉素。
进一步，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于水稻、拟南芥、大豆、白菜、油菜、补血草、盐生草、竹子、小麦、青蒿、楸树、高粱、玉米、苹果、杉木、棉花、苋菜、油棕、马铃薯、番茄。
本发明还提供一种植物通用型原生质体制备试剂盒和瞬时转化试剂盒，所述试剂盒含有前述WQ1酶解液、WQ2保存液、WQ3重悬液、WQ4转化液中的至少一个组分。
本发明又提供一种植物通用型原生质体制备方法及植物通用型原生质体制备试剂盒在单子叶和双子叶植物原生质体制备中的应用。
本发明再提供一种植物通用型原生质体瞬时转化方法及植物通用型原生质体瞬时转化试剂盒在单子叶和双子叶植物原生质体瞬时转化中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法、试剂盒及应用，具有以下有益效果：
1、本发明首次公开了一种简便高效的植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法、试剂盒及应用，同时克服了现有技术多项不足，兼具通用性强、稳定性强、原生质体制备速度快、原生质体产量高、原生质体完整性好、转化效率高、操作简单、不依赖进口试剂、试剂种类少、节约成本、试剂能长期有效保存的优点，安全性强、应用范围广、应用价值高，适合推广。
2、本发明首次公开了一种不依赖进口试剂的植物原生质体制备和瞬时转化方法、试剂盒及应用，所述试剂为国产试剂或进口试剂，国产试剂包括D-Mannitol、MES、BSA、β-巯基乙醇、NaCl、KCl、MgCl2·6H2O、CaCl2.2H2O、KOH、PEG4000、蔗糖、葡萄糖，进口试剂包括纤维素酶R-10、离析酶R-10，其中所用试剂80％以上为国产试剂，突破了传统方法依赖进口试剂的技术限制，试剂购买方便，节约成本；并且将本方法中的国产试剂替换为高质量进口试剂，也能达到相同或相似的效果，通用性强，适用性广。
3、本发明首次公开了一种在单子叶植物和双子叶植物中通用的原生质体制备和瞬时转化方法及试剂盒，且本发明方法在单子叶植物和双子叶植物的原生质体中均实现了高效率瞬时转化，克服了传统方法仅适用于某一种或某几种植物的应用局限性。
4、本发明首次公开了一种植物原生质体制备及瞬时转化试剂和试剂盒的长期有效保存方法，克服了传统方法试剂保存缺陷。
5、本发明首次公开了一种马铃薯茎段原生质体的制备和瞬时转化方法及试剂盒，以多糖多酚含量较少的马铃薯幼苗茎段为材料，成功制备原生质体并完成质粒转化，而传统方法是以富含多糖多酚的马铃薯叶片为材料，细胞易遭受氧化损伤，转化效率较低，因此，本发明方法为马铃薯基因功能研究和遗传改良提供新的思路。
6、本发明首次公开了一种通用型植物细胞壁酶解液——WQ1酶解液，WQ1酶解液去除了传统方法中的氯化钾和氯化钙组分，成分简单、配制方便、效果稳定；WQ1酶解液在多个植物物种、多种植物组织器官的细胞壁裂解中通用性强，应用范围广泛，克服传统方法应用单一的缺陷；WQ1酶解液在-80～-20℃下长期保存后的酶解效率无明显改变，稳定性强，克服传统酶解液仅可短期保存的技术不足。
7、本发明首次公开了一种通用型植物原生质体保存液——WQ2保存液，WQ2保存液相较传统方法新增了蔗糖和葡萄糖组分，所培养的原生质体不易发生破裂，且转化效率高；WQ2保存液在多个植物物种、多种植物组织器官的原生质体纯化和培养中通用，应用范围广泛；WQ2保存液在-80～-20℃下长期保存后的应用效果无明显差异，稳定性强，克服传统方法仅可短期保存的技术不足。
8、本发明首次公开了一种通用型植物原生质体重悬液——WQ3重悬液，WQ3重悬液成分简单，相较传统方法适当提高了镁离子浓度，提升了转化效率；WQ3重悬液在多个植物物种、多种植物组织器官的原生质体转化中通用，应用范围广泛；WQ3重悬液在-80～-20℃下长期保存后的原生质体转化效率无明显变化，稳定性强，克服传统方法仅可短期保存的技术不足。
9、本发明首次公开了一种通用型植物原生质体转化液——WQ4转化液，WQ4转化液成分简单，相较传统方法增加了pH值调节过程，使WQ4转化液的pH值在5.6～10范围内，有效提高了转化效率；WQ4转化液在多个植物物种、多种植物组织器官的原生质体转化中通用，稳定性强，应用范围广泛。
10、本发明方法无需使用BSA溶液对各类容器进行预处理，效果理想，重复性高，操作简单。
11、本发明方法为开展植物大规模细胞培养、导入外源基因、单细胞测序及植物种质资源的遗传改良工作提供有力工具。
12、本发明方法为植物基因瞬时表达、启动子活性分析、转录因子与顺式作用元件相互作用、蛋白质间的相互作用以及蛋白质亚细胞定位等研究提供新的技术。
附图说明
图1是本发明方法在拟南芥叶片原生质体制备中的应用效果图。
图2是本发明方法在拟南芥叶片原生质体瞬时转化中的应用效果图。
图3是本发明方法在水稻幼苗原生质体制备中的应用效果图。
图4是本发明方法在水稻幼苗原生质体瞬时转化中的应用效果图。
图5是本发明方法在马铃薯茎段原生质体制备中的应用效果图。
图6是本发明方法在马铃薯茎段原生质体瞬时转化中的应用效果图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。下述实施例仅用于阐明本发明，不应理解为对本发明的限制；下述实施例中的实验方法均为常规方法；下述实施例中所用拟南芥材料、水稻材料及pAN580质粒由西南大学水稻研究所提供，马铃薯材料由薯类生物学与遗传育种重庆市重点实验室提供；下述实施例中的国产试剂D-Mannitol、MES、BSA、NaCl、KCl、MgCl2·6H2O、CaCl2.2H2O、KOH、PEG4000、蔗糖和葡萄糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司，β-巯基乙醇购自重庆骏伟广生物科技有限公司；下述实施例中的进口试剂纤维素酶R-10和离析酶R-10购自Yakult公司；下述实施例中所用的仪器设备均为分子生物学实验室常规仪器设备。在不背离本发明精神和实质的情况下，本领域技术人员对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明提供一种植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法，所述方法中采用了一种通用型植物细胞壁酶解液即WQ1酶解液、一种通用型植物原生质体保存液即WQ2保存液、一种通用型植物原生质体重悬液即WQ3重悬液及一种通用型植物原生质体转化液即WQ4转化液；所述WQ1酶解液由1.0％～3.0％(w/v)的纤维素酶R-10、0.25％～1.0％(w/v)的离析酶R-10、300～600mM的D-Mannitol、10～40mM的MES、0.1％～0.2％(w/v)的BSA、0％～0.05％(v/v)的β-巯基乙醇和无菌超纯水组成，所述WQ1酶解液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，作为一种具体配制方式，先将固体药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将酶解液的pH值调节至5.6～5.8，定容后置于50℃水浴10min，震荡混匀，平衡温度至24～28℃即可使用，使用前按需加入β-巯基乙醇；所述WQ1酶解液在多种植物材料如幼嫩的叶片、叶柄、茎段、胚轴、胚乳、根或愈伤组织等材料的细胞壁裂解中通用，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；所述WQ1酶解液应用于简单植物材料如拟南芥叶片，无需添加β-巯基乙醇，应用于富含多糖多酚或油脂的复杂植物材料如马铃薯叶片，可添加β-巯基乙醇，以减少细胞氧化损伤；所述WQ1酶解液可分装至无菌离心管中，在-80～-20℃长期保存，在-80℃下可有效保存一年以上，保存时应避免反复冻融；
所述WQ2保存液由140～154mM的NaCl、115～125mM的CaCl2·2H2O、0.2～4mM的MES、3～5mM的KCl、1～5mM的蔗糖、1～5mM的葡萄糖和无菌超纯水组成，所述WQ2保存液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，作为一种具体配制方式，先将各药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将缓冲液的pH值调节至5.6～5.8，定容后用0.2μm过滤器过滤除菌即可使用；所述WQ2保存液可有效防止原生质体破裂，适用于各类植物原生质体的保存，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；所述WQ2保存液可分装至无菌离心管中，在-80～-20℃长期保存，在-80℃下可有效保存一年以上，保存时应避免反复冻融；
所述WQ3重悬液由15～25mM的MgCl2·6H2O、300～600mM的D-Mannitol、2～4mM的MES和无菌超纯水组成，所述WQ3重悬液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，作为一种具体配制方式，先将各药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将重悬液的pH值调节至5.6～5.8，定容后用0.2μm过滤器过滤除菌即可使用；所述WQ3重悬液适用于各类植物原生质体瞬时转化，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；所述WQ3重悬液可分装至无菌离心管中，在-80～-20℃长期保存，在-80℃下可有效保存一年以上，保存时应避免反复冻融；
所述WQ4转化液由100～300mM的CaCl2·2H2O、200～600mM的D-Mannitol、35％～40％(w/v)的PEG4000和无菌超纯水组成，所述WQ4转化液的配制过程中需调节pH值至5.6～10.0，作为一种具体配制方式，先准确称量CaCl2·2H2O、D-Mannitol和PEG4000并按此顺序加至含有2～5mL无菌超纯水的50mL无菌离心管中，继续加入无菌超纯水，震荡混合，置于65～75℃烘箱中加热溶解，充分涡旋溶解至透明澄清，定容后用1M的KOH将转化液的pH值调节至5.6～10.0，平衡温度至24～28℃即可使用；所述WQ4转化液适用于各类植物原生质体瞬时转化，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；所述WQ4转化液可现配现用，也可在4℃下有效保存两天，每次从4℃取出的转化液需平衡温度至24～28℃再使用；
所述方法包括原生质体制备方法和原生质体瞬时转化方法，所述原生质体制备方法包括酶解和纯化两个步骤，所述原生质体瞬时转化方法包括酶解、纯化、重悬、转化、漂洗和培养六个步骤，且所述原生质体制备方法和原生质体瞬时转化方法中的酶解和纯化步骤相同，各步骤详细如下：
(1)酶解：用刀片将多个例如4～10个新鲜幼嫩植物组织纵向划切成0.5～1mm的细丝或横向划切(采用划切法可有效降低细胞破损率)成0.5～1mm的细段，置于含有5～20mLWQ1酶解液的50mL烧杯中，在真空度为100～150mbar的真空腔室中避光渗透10min，将烧杯固定至转速为40～50rpm、温度为24～28℃的摇床避光培养酶解2～6h；收集原生质体前，提高摇床转速至80～100rpm，摇动1～5min，使原生质体充分释放；用经过WQ2保存液润洗过1次的200目网筛过滤，将滤液转移至50mL无菌离心管，分别用5mL的WQ2保存液清洗酶解器皿和未消化的植物组织2～3次，收集洗液并转入装滤液的离心管中待用；
(2)纯化：将步骤(1)收集原生质体混液的离心管至于离心机中，在温度为4℃(离心温度设置为4℃可有效保持原生质体活力，温度过高或过低均会影响后续转化效率)、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用针管或吸管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入20mL WQ2保存液，轻摇重悬，在温度为4℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用针管或吸管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入10mL WQ2保存液，轻摇重悬，在温度为4℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用针管或吸管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入1mL WQ2保存液，轻摇重悬，在冰上静置20～30min；用针管或吸管吸除上清，沉淀为纯化的原生质体，在显微镜下检察原生质体状态；
(3)重悬：将步骤(2)纯化后的原生质体，在温度为4℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min沉淀原生质体；用针管或吸管吸除上清，用相应体积的WQ3重悬液重悬原生质体，调整原生质体密度至最优；
(4)转化：在2mL无菌圆底离心管底部加入10～20μL纯化后浓度为1～3μg/μL的质粒和200μL已调整密度的原生质体，轻摇混匀；沿管壁加入210～220μL的WQ4转化液，迅速轻摇混匀；在24～28℃环境下避光孵育5～30min，孵育期间可间歇轻摇混匀；沿管壁缓慢加入1.5mL的WQ2保存液，缓慢颠倒离心管混合样品以终止转化；
(5)漂洗：将终止转化的原生质体混合液在温度为24～28℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；去除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入2mL的WQ2保存液，缓慢颠倒离心管重悬原生质体，在温度为24～28℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；去除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入500μL的WQ2保存液，轻摇混匀；
(6)培养：将步骤(5)漂洗后的原生质体转入无菌细胞培养板(24孔)，在24～28℃条件下避光静置培养12～48h，在荧光显微镜下观察分析。
作为具体实施例，所述步骤(1)中针对富含多糖多酚的复杂植物，可在幼苗期取材或选取多糖多酚含量较少的组织部位进行实验，由此可以解决传统技术方法在富含多糖多酚的复杂植物物种中不通用的技术缺陷。
作为具体实施例，所述步骤(1)中在真空渗透之后应缓慢向真空腔室中充气，由此可以避免气压骤变对细胞造成损伤。
作为具体实施例，所述步骤(1)中所取植物组织的量不是固定的，可以根据实际需求取用，从而避免因材料过多导致酶解不充分的现象；可根据植物材料性质不同调整酶解时间，例如拟南芥叶片材料酶解2h即可，而水稻幼苗材料酶解4h为宜，在一定时间内，延长酶解时间可提高原生质体得率。
作为具体实施例，所述步骤(3)中，研究目的不同，所需原生质体的密度不同，常用的原生质体密度为1×103～1×107个细胞/mL。
作为具体实施例，所述步骤(4)中，高纯度质粒有助于提升转化效率，若仅对一种质粒转化，则加入10～30μg质粒；若对两种质粒共同转化，则各取10～15μg纯化后的质粒混合加入；若对三种质粒共同转化，则各取10μg纯化后的质粒混合加入，由此可提高转化效率；并且，加入WQ4转化液的体积应为加入原生质体的体积与加入质粒的体积之和，例如加入200μL原生质体、10μL质粒，则应加入210μL的WQ4转化液，若加入200μL原生质体、20μL质粒，则应加入220μL的WQ4转化液，由此可平衡转化体系的渗透压。
作为具体实施例，所述步骤(5)中最后一次添加WQ2保存液时，按照氨苄青霉素：WQ2保存液＝1：1000(v/v)的比例向WQ2保存液中添加浓度为100mg/mL的氨苄青霉素，由此可有效防止培养过程中滋生细菌。
作为具体实施例，所述步骤(2)、(3)、(5)中离心力过低无法沉淀原生质体，离心力过高会导致原生质体变形或破裂，由此离心力设置在100～200g范围为宜，并且，离心机的升速和降速均应设置在5以下，以升速3、降速3为宜。
作为具体实施例，所述步骤(6)中，在用本发明提供的WQ2保存液进行原生质体培养时，无需对细胞培养器皿进行BSA溶液预处理，且培养1周时间未出现原生质体粘附细胞培养板的现象；本发明提供的WQ2保存液可有效保持原生质体完整性，在转入带有GFP荧光信号的空载后，培养48小时仍可观察到明显的GFP信号，且转化后继续培养1周时间未出现明显的原生质体破裂现象。
作为具体实施例，所述步骤(1)～(6)中，采用平头长针管或钝头吸管轻缓移液，由此可以减少原生质体破损。
作为具体实施例，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于水稻、拟南芥、大豆、白菜、油菜、补血草、盐生草、竹子、小麦、青蒿、楸树、高粱、玉米、苹果、杉木、棉花、苋菜、油棕、马铃薯、番茄。作为优选实施例，所述单子叶植物为水稻，所述双子叶植物为拟南芥、马铃薯。
本发明还提供一种植物通用型原生质体制备试剂盒和瞬时转化试剂盒，所述试剂盒含有前述WQ1酶解液、WQ2保存液、WQ3重悬液、WQ4转化液中的至少一个组分，即所述试剂盒含有上述WQ1酶解液，或含有上述WQ2保存液，或含有上述WQ3重悬液，或含有上述WQ4转化液，或同时含有上述WQ1酶解液和WQ2保存液，或同时含有WQ1酶解液和WQ3重悬液，或同时含有WQ1酶解液和WQ4转化液，或同时含有WQ2保存液和WQ3重悬液，或同时含有WQ2保存液和WQ4转化液，或同时含有WQ3重悬液和WQ4转化液，或同时含有WQ1酶解液、WQ2保存液和WQ3重悬液，或同时含有WQ1酶解液、WQ2保存液和WQ4转化液，或同时含有WQ1酶解液、WQ3重悬液和WQ4转化液，或同时含有WQ2保存液、WQ3重悬液和WQ4转化液，或同时含有WQ1酶解液、WQ2保存液、WQ3重悬液和WQ4转化液。
本发明又提供一种植物通用型原生质体制备方法及植物通用型原生质体制备试剂盒在单子叶和双子叶植物原生质体制备中的应用。
本发明再提供一种植物通用型原生质体瞬时转化方法及植物通用型原生质体瞬时转化试剂盒在单子叶和双子叶植物原生质体瞬时转化中的应用。
实施例1：拟南芥叶片原生质体的制备及瞬时转化
(一)原生质体制备及瞬时转化试剂的配制：
(1)配制WQ1酶解液：WQ1酶解液由1.0％～3.0％(w/v)的纤维素酶R-10、0.25％～1.0％(w/v)的离析酶R-10、300～600mM的D-Mannitol、10～40mM的MES、0.1％～0.2％(w/v)的BSA、0％～0.05％(v/v)的β-巯基乙醇和无菌超纯水组成，所述WQ1酶解液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，先将固体药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将酶解液的pH值调节至5.6～5.8，定容后置于50℃水浴10min，震荡混匀，平衡温度至24～28℃即可使用，使用前按需加入β-巯基乙醇，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；在本实施例中设置为1.5％(w/v)的纤维素酶R-10、0.5％(w/v)的离析酶R-10、500mM的D-Mannitol、20mM的MES、0.2％(w/v)的BSA、0％(v/v)的β-巯基乙醇以及无菌超纯水，WQ1酶解液的pH值为5.7。
(2)配制WQ2保存液：WQ2保存液由140～154mM的NaCl、115～125mM的CaCl2·2H2O、0.2～4mM的MES、3～5mM的KCl、1～5mM的蔗糖、1～5mM的葡萄糖和无菌超纯水组成，所述WQ2保存液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，先将各药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将缓冲液的pH值调节至5.6～5.8，定容后用0.2μm过滤器过滤除菌即可使用，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；在本实施例中设置为154mM的NaCl、125mM的CaCl2·2H2O、0.2mM的MES、5mM的KCl、2.5mM的蔗糖、5mM的葡萄糖以及无菌超纯水，WQ2保存液的pH值为5.7。
(3)配制WQ3重悬液：WQ3重悬液由15～25mM的MgCl2·6H2O、300～600mM的D-Mannitol、2～4mM的MES和无菌超纯水组成，所述WQ3重悬液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，先将各药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将重悬液的pH值调节至5.6～5.8，定容后0.2μm过滤器过滤除菌即可使用，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；在本实施例中设置为20mM的MgCl2·6H2O、400mM的D-Mannitol、4mM的MES以及无菌超纯水，WQ3重悬液的pH值为5.7。
(4)配制WQ4转化液：WQ4转化液由100～300mM的CaCl2·2H2O、200～600mM的D-Mannitol、35％～40％(w/v)的PEG4000和无菌超纯水组成，所述WQ4转化液的配制过程中需调节pH值至5.6～10.0，先准确称量CaCl2·2H2O、D-Mannitol和PEG4000并按此顺序加至含有2～5mL无菌超纯水的50mL无菌离心管中，继续加入无菌超纯水，震荡混合，置于65～75℃烘箱中加热溶解，充分涡旋溶解至透明澄清，定容后用1M的KOH将转化液的pH值调节至5.6～10.0，平衡温度至24～28℃即可使用，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；在本实施例中设置为100mM的CaCl2·2H2O、200mM的D-Mannitol、40％(w/v)的PEG4000以及无菌超纯水，WQ4转化液的pH值为7.5。
(二)拟南芥叶片原生质体的制备及瞬时转化：
(1)按本实施例中(一)所述方法配制原生质体制备及瞬时转化试剂。
(2)酶解：从每株正常培养3～4周的拟南芥莲座叶中剪取2～3片全展叶，共选取8片叶子，用锋利的手术刀片将叶片纵向划切成0.5mm的细丝，置于含有5mL WQ1酶解液的50mL烧杯中，在真空度为100mbar的真空腔室中避光渗透10min，将烧杯固定至转速为45rpm、温度为24℃的摇床避光培养酶解2h；收集原生质体前，提高摇床转速至80rpm，摇动1min，使原生质体充分释放；用经过WQ2保存液润洗过1次的200目网筛过滤，将滤液转移至50mL无菌离心管，分别用5mL的WQ2保存液清洗酶解器皿和未消化的植物组织2～3次，收集洗液并转入装滤液的离心管中待用。
(3)纯化：将步骤(2)收集原生质体混液的离心管至于离心机中，在温度为4℃、离心力为100g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用平头长针管(16号、200mm长)吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入20mL WQ2保存液，轻摇重悬，在温度为4℃、离心力为100g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用平头长针管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入10mL WQ2保存液，轻摇重悬，在温度为4℃、离心力为100g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用平头长针管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入1mL WQ2保存液，轻摇重悬，在冰上静置30min；用平头长针管吸除上清，沉淀为纯化的拟南芥叶片原生质体，在显微镜下检察原生质体状态。
(4)重悬：将步骤(3)纯化后的拟南芥叶片原生质体，在温度为4℃、离心力为100g、升速为3、降速为3条件下离心2min沉淀原生质体；用平头长针管吸除上清，用相应体积的WQ3重悬液重悬原生质体，调整原生质体密度至1×105个细胞/mL。
(5)转化：在2mL无菌圆底离心管底部加入10μL(20μg)纯化后的pAN580质粒(含有完整的35S启动子-GFP编码框-终止子基因表达盒)和200μL已调整密度的原生质体，轻摇混匀；沿管壁加入210μL的WQ4转化液，迅速轻摇混匀；在24℃环境下避光孵育5min；沿管壁缓慢加入1.5mL的WQ2保存液，缓慢颠倒离心管混合样品以终止转化。
(6)漂洗：将终止转化的原生质体混合液在温度为24℃、离心力为100g、升速为3、降速为3条件下离心2min；去除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入2mL的WQ2保存液，缓慢颠倒离心管重悬原生质体，在温度为24℃、离心力为100g、升速为3、降速为3条件下离心2min；去除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入500μL的WQ2保存液，轻摇混匀。
(7)培养：将步骤(6)漂洗后的原生质体转入无菌细胞培养板(24孔)，在24℃条件下避光静置培养16h，在荧光显微镜下观察分析。
(三)结果分析：
(1)拟南芥叶片原生质体制备效果如图1所示，原生质体产量高，纯化后的原生质体密度大于1×108个细胞/mL，原生质体完整率高于90％，数次重复结果稳定。
(2)拟南芥叶片原生质体瞬时转化效果如图2所示，原生质体完整性好，转化效率大于95％，GFP荧光信号强，数次重复结果稳定，且继续培养48小时仍可观察到明显的GFP信号，继续培养1周时间未出现明显的原生质体破裂现象。
(3)将所述WQ1酶解液、WQ2保存液和WQ3重悬液在-80℃保存1年之后再用于上述实验，发现原生质体制备和瞬时转化效果无明显差异，说明本发明方法稳定性好。
(4)将本发明实施例2、实施例3的原生质体制备和瞬时转化方法，应用于水稻幼苗的原生质体制备和瞬时转化，也取得了相似的效果，说明本发明方法通用性强。
实施例2：水稻幼苗原生质体的制备及瞬时转化
(一)原生质体制备及瞬时转化试剂的配制：
(1)配制WQ1酶解液：WQ1酶解液由1.0％～3.0％(w/v)的纤维素酶R-10、0.25％～1.0％(w/v)的离析酶R-10、300～600mM的D-Mannitol、10～40mM的MES、0.1％～0.2％(w/v)的BSA、0％～0.05％(v/v)的β-巯基乙醇和无菌超纯水组成，所述WQ1酶解液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，先将固体药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将酶解液的pH值调节至5.6～5.8，定容后置于50℃水浴10min，震荡混匀，平衡温度至24～28℃即可使用，使用前按需加入β-巯基乙醇，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；在本实施例中设置为2％(w/v)的纤维素酶R-10、0.7％(w/v)的离析酶R-10、600mM的D-Mannitol、10mM的MES、0.1％(w/v)的BSA、0％(v/v)的β-巯基乙醇以及无菌超纯水，WQ1酶解液的pH值为5.7。
(2)配制WQ2保存液：WQ2保存液由140～154mM的NaCl、115～125mM的CaCl2·2H2O、0.2～4mM的MES、3～5mM的KCl、1～5mM的蔗糖、1～5mM的葡萄糖和无菌超纯水组成，所述WQ2保存液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，先将各药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将缓冲液的pH值调节至5.6～5.8，定容后0.2μm过滤器过滤除菌即可使用，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；在本实施例中设置为154mM的NaCl、125mM的CaCl2·2H2O、2mM的MES、5mM的KCl、2.5mM的蔗糖、2.5mM的葡萄糖以及无菌超纯水，WQ2保存液的pH值为5.7。
(3)配制WQ3重悬液：WQ3重悬液由15～25mM的MgCl2·6H2O、300～600mM的D-Mannitol、2～4mM的MES和无菌超纯水组成，所述WQ3重悬液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，先将各药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将重悬液的pH值调节至5.6～5.8，定容后0.2μm过滤器过滤除菌即可使用，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；在本实施例中设置为20mM的MgCl2·6H2O、600mM的D-Mannitol、2mM的MES以及无菌超纯水，WQ3重悬液的pH值为5.7。
(4)配制WQ4转化液：WQ4转化液由100～300mM的CaCl2·2H2O、200～600mM的D-Mannitol、35％～40％(w/v)的PEG4000和无菌超纯水组成，所述WQ4转化液的配制过程中需调节pH值至5.6～10.0，先准确称量CaCl2·2H2O、D-Mannitol和PEG4000并按此顺序加至含有2～5mL无菌超纯水的50mL无菌离心管中，继续加入无菌超纯水，震荡混合，置于65～75℃烘箱中加热溶解，充分涡旋溶解至透明澄清，定容后用1M的KOH将转化液的pH值调节至5.6～10.0，平衡温度至24～28℃即可使用，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；在本实施例中设置为200mM的CaCl2·2H2O、200mM的D-Mannitol、40％(w/v)的PEG4000以及无菌超纯水，WQ4转化液的pH值为8.5。
(二)水稻幼苗原生质体的制备及瞬时转化：
(1)按本实施例中(一)所述方法配制原生质体制备及瞬时转化试剂。
(2)酶解：从正常培养或黑暗培养1～2周的水稻幼苗中剪取地上部分，共选取10株幼苗，用锋利的手术刀片将幼苗横向划切成0.5mm的细段，置于含有20mL WQ1酶解液的50mL烧杯中，在真空度为150mbar的真空腔室中避光渗透10min，将烧杯固定至转速为40rpm、温度为28℃的摇床避光培养酶解4h；收集原生质体前，提高摇床转速至100rpm，摇动5min，使原生质体充分释放；用经过WQ2保存液润洗过1次的200目网筛过滤，将滤液转移至50mL无菌离心管，分别用5mL的WQ2保存液清洗酶解器皿和未消化的植物组织2～3次，收集洗液并转入装滤液的离心管中待用。
(3)纯化：将步骤(2)收集原生质体混液的离心管至于离心机中，在温度为4℃、离心力为200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用平头长针管(16号、200mm长)吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入20mL WQ2保存液，轻摇重悬，在温度为4℃、离心力为200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用平头长针管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入10mL WQ2保存液，轻摇重悬，在温度为4℃、离心力为200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用平头长针管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入1mL WQ2保存液，轻摇重悬，在冰上静置30min；用平头长针管吸除上清，沉淀为纯化的拟南芥叶片原生质体，在显微镜下检察原生质体状态。
(4)重悬：将步骤(3)纯化后的水稻幼苗原生质体，在温度为4℃、离心力为200g、升速为3、降速为3条件下离心2min沉淀原生质体；用平头长针管吸除上清，用相应体积的WQ3重悬液重悬原生质体，调整原生质体密度至1×106个细胞/mL。
(5)转化：在2mL无菌圆底离心管底部加入20μL(20μg)纯化后的pAN580质粒(含有完整的35S启动子-GFP编码框-终止子基因表达盒)和200μL已调整密度的原生质体，轻摇混匀；沿管壁加入220μL的WQ4转化液，迅速轻摇混匀；在28℃环境下避光孵育30min；沿管壁缓慢加入1.5mL的WQ2保存液，缓慢颠倒离心管混合样品以终止转化。
(6)漂洗：将终止转化的原生质体混合液在温度为28℃、离心力为200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；去除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入2mL的WQ2保存液，缓慢颠倒离心管重悬原生质体，在温度为28℃、离心力为200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；去除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入500μL的WQ2保存液，轻摇混匀。
(7)培养：将步骤(6)漂洗后的原生质体转入无菌细胞培养板(24孔)，在28℃条件下避光静置培养16h，在荧光显微镜下观察分析。
(三)结果分析：
(1)水稻幼苗原生质体制备效果如图3所示，原生质体产量高，纯化后的原生质体密度大于1×108个细胞/mL，原生质体完整率高于90％，数次重复结果稳定。
(2)水稻幼苗原生质体瞬时转化效果如图4所示，原生质体完整性好，转化效率大于95％，GFP荧光信号强，数次重复结果稳定。
(3)将所述WQ1酶解液、WQ2保存液和WQ3重悬液在-80℃保存1年之后再用于上述实验，发现原生质体制备和瞬时转化效果无明显变化，说明本发明方法稳定性好。
(4)将本发明实施例1、实施例3的原生质体制备和瞬时转化方法，应用于水稻幼苗的原生质体制备和瞬时转化，也取得了相似的效果，说明本发明方法通用性强。
实施例3：马铃薯茎段原生质体的制备及瞬时转化
(一)原生质体制备及瞬时转化试剂的配制：
(1)配制WQ1酶解液：WQ1酶解液由1.0％～3.0％(w/v)的纤维素酶R-10、0.25％～1.0％(w/v)的离析酶R-10、300～600mM的D-Mannitol、10～40mM的MES、0.1％～0.2％(w/v)的BSA、0％～0.05％(v/v)的β-巯基乙醇和无菌超纯水组成，所述WQ1酶解液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，先将固体药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将酶解液的pH值调节至5.6～5.8，定容后置于50℃水浴10min，震荡混匀，平衡温度至24～28℃即可使用，使用前按需加入β-巯基乙醇，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；在本实施例中设置为2％(w/v)的纤维素酶R-10、0.8％(w/v)的离析酶R-10、400mM的D-Mannitol、20mM的MES、0.2％(w/v)的BSA、0.05％(v/v)的β-巯基乙醇以及无菌超纯水，WQ1酶解液的pH值为5.7。
(2)配制WQ2保存液：WQ2保存液由140～154mM的NaCl、115～125mM的CaCl2·2H2O、0.2～4mM的MES、3～5mM的KCl、1～5mM的蔗糖、1～5mM的葡萄糖和无菌超纯水组成，所述WQ2保存液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，先将各药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将缓冲液的pH值调节至5.6～5.8，定容后0.2μm过滤器过滤除菌即可使用，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；在本实施例中设置为147mM的NaCl、115mM的CaCl2·2H2O、4mM的MES、3mM的KCl、5mM的蔗糖、5mM的葡萄糖以及无菌超纯水，WQ2保存液的pH值为5.7。
(3)配制WQ3重悬液：WQ3重悬液由15～25mM的MgCl2·6H2O、300～600mM的D-Mannitol、2～4mM的MES和无菌超纯水组成，所述WQ3重悬液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，先将各药品准确称量后溶于无菌超纯水中，用1M的KOH将重悬液的pH值调节至5.6～5.8，定容后0.2μm过滤器过滤除菌即可使用，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；在本实施例中设置为15mM的MgCl2·6H2O、600mM的D-Mannitol、4mM的MES以及无菌超纯水，WQ3重悬液的pH值为5.7。
(4)配制WQ4转化液：WQ4转化液由100～300mM的CaCl2·2H2O、200～600mM的D-Mannitol、35％～40％(w/v)的PEG4000和无菌超纯水组成，所述WQ4转化液的配制过程中需调节pH值至5.6～10.0，先准确称量CaCl2·2H2O、D-Mannitol和PEG4000并按此顺序加至含有2～5mL无菌超纯水的50mL无菌离心管中，继续加入无菌超纯水，震荡混合，置于65～75℃烘箱中加热溶解，充分涡旋溶解至透明澄清，定容后用1M的KOH将转化液的pH值调节至5.6～10.0，平衡温度至24～28℃即可使用，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果；在本实施例中设置为300mM的CaCl2·2H2O、400mM的D-Mannitol、35％(w/v)的PEG4000以及无菌超纯水，WQ4转化液的pH值为5.6。
(二)马铃薯茎段原生质体的制备及瞬时转化：
(1)按本实施例中(一)所述方法配制原生质体制备及瞬时转化试剂。
(2)酶解：从在1/2CS培养基(CN110754366B一种广适性植物组织培养基及1/2培养基)上正常培养2～3周的马铃薯脱毒苗中剪取茎段，共选取10个茎段，用锋利的手术刀片将幼嫩茎段横向划切成0.5mm的细段，置于含有20mL WQ1酶解液的50mL烧杯中，在真空度为100mbar的真空腔室中避光渗透10min，将烧杯固定至转速为45rpm、温度为26℃的摇床避光培养酶解4h；收集原生质体前，提高摇床转速至80rpm，摇动1min，使原生质体充分释放；用经过WQ2保存液润洗过1次的200目网筛过滤，将滤液转移至50mL无菌离心管，分别用5mL的WQ2保存液清洗酶解器皿和未消化的植物组织2～3次，收集洗液并转入装滤液的离心管中待用。
(3)纯化：将步骤(2)收集原生质体混液的离心管至于离心机中，在温度为4℃、离心力为150g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用平头长针管(16号、200mm长)吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入20mL WQ2保存液，轻摇重悬，在温度为4℃、离心力为150g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用平头长针管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入10mL WQ2保存液，轻摇重悬，在温度为4℃、离心力为150g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用平头长针管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入1mL WQ2保存液，轻摇重悬，在冰上静置30min；用平头长针管吸除上清，沉淀为纯化的马铃薯茎段原生质体，在显微镜下检察原生质体状态。
(4)重悬：将步骤(3)纯化后的马铃薯茎段原生质体，在温度为4℃、离心力为150g、升速为3、降速为3条件下离心2min沉淀原生质体；用平头长针管吸除上清，用相应体积的WQ3重悬液重悬原生质体，调整原生质体密度至1×103个细胞/mL。
(5)转化：在2mL无菌圆底离心管底部加入10μL(20μg)纯化后的pAN580质粒(含有完整的35S启动子-GFP编码框-终止子基因表达盒)和200μL已调整密度的原生质体，轻摇混匀；沿管壁加入210μL的WQ4转化液，迅速轻摇混匀；在26℃环境下避光孵育30min；沿管壁缓慢加入1.5mL的WQ2保存液，缓慢颠倒离心管混合样品以终止转化。
(6)漂洗：将终止转化的原生质体混合液在温度为26℃、离心力为150g、升速为3、降速为3条件下离心2min；去除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入2mL的WQ2保存液，缓慢颠倒离心管重悬原生质体，在温度为26℃、离心力为150g、升速为3、降速为3条件下离心2min；去除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入500μL的WQ2保存液，轻摇混匀。
(7)培养：将步骤(6)漂洗后的原生质体转入无菌细胞培养板(24孔)，在26℃条件下避光静置培养16h，在荧光显微镜下观察分析。
(三)结果分析：
(1)马铃薯茎段原生质体制备效果如图5所示，原生质体产量高，纯化后的原生质体密度大于1×106个细胞/mL，原生质体完整率高于80％，数次重复结果稳定。
(2)马铃薯茎段原生质体瞬时转化效果如图6所示，原生质体完整性好，转化效率大于70％，GFP荧光信号强，数次重复结果稳定。
(3)将所述WQ1酶解液、WQ2保存液和WQ3重悬液在-80℃保存1年之后再用于上述实验，发现原生质体制备和瞬时转化效果无明显变化，说明本发明方法稳定性好。
(4)将本发明实施例1、实施例2的原生质体制备和瞬时转化方法，应用于水稻幼苗的原生质体制备和瞬时转化，也取得了相似的效果，说明本发明方法通用性强。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法，其特征在于，所述方法中采用了一种通用型植物细胞壁酶解液即WQ1酶解液、一种通用型植物原生质体保存液即WQ2保存液、一种通用型植物原生质体重悬液即WQ3重悬液及一种通用型植物原生质体转化液即WQ4转化液，所述WQ1酶解液由1.0％～3.0％(w/v)的纤维素酶R-10、0.25％～1.0％(w/v)的离析酶R-10、300～600mM的D-Mannitol、10～40mM的MES、0.1％～0.2％(w/v)的BSA、0％～0.05％(v/v)的β-巯基乙醇和无菌超纯水组成，所述WQ1酶解液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，在-80～-20℃长期保存；所述WQ2保存液由140～154mM的NaCl、115～125mM的CaCl2·2H2O、0.2～4mM的MES、3～5mM的KCl、1～5mM的蔗糖、1～5mM的葡萄糖和无菌超纯水组成，所述WQ2保存液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，过滤除菌后在-80～-20℃长期保存；所述WQ3重悬液由15～25mM的MgCl2·6H2O、300～600mM的D-Mannitol、2～4mM的MES和无菌超纯水组成，所述WQ3重悬液的配制过程中需调节pH值至5.6～5.8，过滤除菌后在-80～-20℃长期保存；所述WQ4转化液由100～300mM的CaCl2·2H2O、200～600mM的D-Mannitol、35％～40％(w/v)的PEG4000和无菌超纯水组成，所述WQ4转化液的配制过程中需调节pH值至5.6～10.0，所述WQ4转化液可现配现用，也可在4℃下有效保存两天；所述方法包括原生质体制备方法和原生质体瞬时转化方法，所述原生质体制备方法包括酶解和纯化两个步骤，所述原生质体瞬时转化方法包括酶解、纯化、重悬、转化、漂洗和培养六个步骤，且所述原生质体制备方法和原生质体瞬时转化方法中的酶解和纯化步骤相同，各步骤详细如下：
(1)酶解：用刀片将多个新鲜幼嫩植物组织纵向划切成0.5～1mm的细丝或横向划切成0.5～1mm的细段，置于含有5～20mL WQ1酶解液的50mL烧杯中，在真空度为100～150mbar的真空腔室中避光渗透10min，将烧杯固定至转速为40～50rpm、温度为24～28℃的摇床，避光培养酶解2～6h；收集原生质体前，提高摇床转速至80～100rpm，摇动1～5min，使原生质体充分释放；用经过WQ2保存液润洗过1次的200目网筛过滤，将滤液转移至50mL无菌离心管，分别用5mL的WQ2保存液清洗酶解器皿和未消化的植物组织2～3次，收集洗液并转入装滤液的离心管中待用；
(2)纯化：将步骤(1)收集原生质体混液的离心管至于离心机中，在温度为4℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用针管或吸管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入20mL WQ2保存液，轻摇重悬，在温度为4℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用针管或吸管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入10mLWQ2保存液，轻摇重悬，在温度为4℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；用针管或吸管吸除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入1mL WQ2保存液，轻摇重悬，在冰上静置20～30min；用针管或吸管吸除上清，沉淀为纯化的原生质体，在显微镜下检察原生质体状态；
(3)重悬：将步骤(2)纯化后的原生质体，在温度为4℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min沉淀原生质体；用针管或吸管吸除上清，用相应体积的WQ3重悬液重悬原生质体，调整原生质体密度至最优；
(4)转化：在2mL无菌圆底离心管底部加入10～20μL纯化后浓度为1～3μg/μL的质粒和200μL已调整密度的原生质体，轻摇混匀；沿管壁加入210～220μL的WQ4转化液，迅速轻摇混匀；在24～28℃环境下避光孵育5～30min，孵育期间可间歇轻摇混匀；沿管壁缓慢加入1.5mL的WQ2保存液，缓慢颠倒离心管混合样品以终止转化；
(5)漂洗：将终止转化的原生质体混合液在温度为24～28℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；去除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入2mL的WQ2保存液，缓慢颠倒离心管重悬原生质体，在温度为24～28℃、离心力为100～200g、升速为3、降速为3条件下离心2min；去除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入500μL的WQ2保存液，轻摇混匀；
(6)培养：将步骤(5)漂洗后的原生质体转入无菌细胞培养板，在24～28℃条件下避光静置培养12～48h，在荧光显微镜下观察分析。
2.根据权利要求1所述的植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤(1)中针对富含多糖多酚的复杂植物，可在幼苗期取材或选取多糖多酚含量较少的组织部位进行实验。
3.根据权利要求1所述的植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤(1)中在真空渗透之后应缓慢向真空腔室中充气。
4.根据权利要求1所述的植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤(3)中原生质体密度为1×103～1×107个细胞/mL。
5.根据权利要求1所述的植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤(4)中质粒转化为单种质粒转化、两种或三种质粒转化，若仅对一种质粒转化，则加入10～30μg质粒；若对两种质粒共同转化，则各取10～15μg纯化后的质粒混合加入；若对三种质粒共同转化，则各取10μg纯化后的质粒混合加入；并且，加入WQ4转化液的体积应为加入原生质体的体积与加入质粒的体积之和。
6.根据权利要求1所述的植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤(5)中最后一次添加WQ2保存液时，按照氨苄青霉素：WQ2保存液＝1：1000(v/v)的比例向WQ2保存液中添加浓度为100mg/mL的氨苄青霉素。
7.根据权利要求1所述的植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于水稻、拟南芥、大豆、白菜、油菜、补血草、盐生草、竹子、小麦、青蒿、楸树、高粱、玉米、苹果、杉木、棉花、苋菜、油棕、马铃薯、番茄。
8.植物通用型原生质体制备试剂盒和瞬时转化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1中所述WQ1酶解液、WQ2保存液、WQ3重悬液、WQ4转化液中的至少一个组分。
9.如权利要求1所述植物通用型原生质体制备方法及如权利要求8所述植物通用型原生质体制备试剂盒在单子叶和双子叶植物原生质体制备中的应用。
10.如权利要求1所述植物通用型原生质体瞬时转化方法及如权利要求8所述植物通用型原生质体瞬时转化试剂盒在单子叶和双子叶植物原生质体瞬时转化中的应用。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN113897328A (zh) * | 2020-07-06 | 2022-01-07 | 北京市农林科学院 | 一种制备苋菜原生质体的方法及其应用 |
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| CN109355246A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-02-19 | 河南农业大学 | 一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用 |
| CN113249296A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-08-13 | 安徽农业大学 | 一种茶树新鲜组织原生质体的分离与纯化方法 |
| CN114480248A (zh) * | 2022-01-18 | 2022-05-13 | 南通大学 | 一种甘蔗茎组织原生质体的制备方法和应用 |
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Patent Citations (3)
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