CN117025663A - 基因瞬时表达方法及应用 - Google Patents
基因瞬时表达方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117025663A CN117025663A CN202311054041.4A CN202311054041A CN117025663A CN 117025663 A CN117025663 A CN 117025663A CN 202311054041 A CN202311054041 A CN 202311054041A CN 117025663 A CN117025663 A CN 117025663A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- expression
- transient expression
- expression cassette
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 91
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 99
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 19
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 claims abstract description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 4
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 19
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 42
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 241000234671 Ananas Species 0.000 description 5
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 3
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 3
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000238371 Sepiidae Species 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
- C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
- C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种基因瞬时表达方法及应用。本发明提供了一种基因瞬时表达方法，该方法以DNA为底物，通过PCR扩增获得完整的基因表达盒，大量节省了制备基因表达盒的时间；扩增的基因表达盒可以作为底物，在细胞或原生质体等表达系统中进行基因的瞬时表达，能提高转染成功率和表达效率，增加表达的基因片段量。本发明提供的基因瞬时表达方法不仅操作简便、实验周期大幅度缩短、瞬时表达效率极大提高，还大幅度增大了可验证的DNA片段(包括但不限于启动子序列，基因编码区及终止子序列)。另外，本发明提供的基因瞬时表达方法在原生质体较小物种(如兰花)的基因瞬时表达中获得了良好的表现。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种基因瞬时表达方法及应用。
背景技术
基因表达通常分为稳定表达和瞬时表达。稳定表达指外源表达盒整合进宿主细胞中，并且伴随着宿主细胞分裂、增殖而稳定的遗传下去。基因瞬时表达是指外源的DNA不整合到宿主基因组DNA，而在宿主细胞中的基因表达。外源基因在进入宿主细胞12个小时内就可以表达，且能持续达80小时左右。在基因的功能研究中，瞬时表达作为稳定表达的互补技术，可以快速的研究基因表达，蛋白质亚细胞定位，基因间互作甚至是部分基因的功能研究。
在植物中，基因瞬时表达的办法通常为原生质体转化、基因枪转化和农杆菌介导的转化办法。原生质体转化法为最常用的瞬时表达办法。然而，不同物种、不同组织的原生质体大小有非常大差异，且能吸收的DNA片段也有很大差异。大型的原生质体，如水稻的嫩叶细胞，可以将超过10kb的片段转入进原生质体中。而对于原生质体较小物种而言，转入大片段质粒非常困难，例如墨兰的原生质体约25um左右，菠萝的原生质体约15um左右，在转入约5kb的质粒，效率就非常的低。一个亚细胞定位的质粒通常包含细菌的复制起点(Ori)、筛选标签(主要为抗生素)、多克隆位点及其他一些表达元件，即非基因表达盒区域超过了3kb，占用了很多的空间。针对大片段序列的功能研究就难以进行。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基因瞬时表达方法，该基因瞬时表达方法基于聚合链式反应(PCR)产物快速制备基因瞬时表达盒，大量节省了制备基因表达盒的时间；然后将扩增后的基因表达盒转染至表达系统(如细胞或原生质体等)进行基因瞬时表达，能提高转染成功率和表达效率，增加表达的基因片段量。
具体的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种基因瞬时表达方法，包括如下步骤：
S1、以DNA为底物，通过PCR扩增获得完整的基因表达盒；所述完整的基因表达盒包括启动子序列、编码区序列和终止子序列；
S2、将PCR扩增产物转染至靶表达系统，实现基因瞬时表达。
本发明通过聚合链式反应制备细胞内基因瞬时表达盒，不仅操作简便、实验周期大幅度缩短、瞬时表达效率极大提高，还大幅度增大了可验证的DNA片段(包括但不限于启动子序列，基因编码区及终止子序列)。
另外，本发明提供的基因瞬时表达方法在原生质体较小物种(如兰花、菠萝)的基因瞬时表达中获得了良好的表现。
本发明利用聚合链式反应，从模版DNA中扩增获得DNA表达盒。
在本发明中，所述模版DNA可以是包含DNA底物的缓冲液，也可以是包含DNA的微生物、植物组织、动物组织。
在本发明中，所述包含模版DNA的缓冲液包括但不限于线性DNA片段，双链DNA片段，多链(大于等于三链)DNA片段，DNA与RNA杂和的片段，环状DNA序列，正常天然DNA结构，修饰过的DNA结构等。
在本发明中，所述DNA片段来源可以是天然的动植物DNA或微生物DNA，也可以是化学或生物合成DNA，包括正常DNA结构及修饰过的DNA结构。
在本发明中，作为底物的DNA包括完整的基因表达盒以及基因表达盒各个片段。扩增的基因表达盒包括但不限于启动子序列、转录序列和终止子序列。
其中：
启动子序列是具有启动基因转录功能的DNA序列，包括但不限于已知的启动子DNA序列，经过改造的启动子DNA序列，尚未鉴定但可以启动基因表达的DNA序列。
具备转录功能的DNA序列可以转录出信使mRNA，并能翻译出小肽、多肽及蛋白的DNA序列；或者可以转录出非编码RNA的DNA序列，所述非编码RNA包括但不限于pri-miRNA，pri-siRNA，tRNA等。
终止子序列是具有终止基因转录功能的DNA序列，包括已知基因的终止子序列，未知基因的终止子序列。
在本发明中，作为底物的DNA还可以包括非编码区域UTR序列，所述非编码区UTR序列是用于影响基因转录效率、转录长短、翻译效率的DNA序列。其位置可在基因转录区域前、基因转录区域中或基因转录区域后。
在本发明中，作为底物的DNA包括反应时直接添加的DNA，也包括反应前未直接添加但在反应过程中出现的DNA，例如RT-PCR反应(Reverse Transcription-PolymeraseChain Reaction)，将RNA反转录成DNA，再利用DNA进行后续的扩增。
本发明提供的基因瞬时表达方法通过聚合链式反应扩增完整的基因表达盒序列，扩增的基因表达盒可以作为底物，在细胞中进行基因的瞬时表达。
在本发明所述基因瞬时表达方法方法中：
优选的，步骤S1所述完整的基因表达盒长度≤4kb；
更优选的，步骤S1所述完整的基因表达盒长度为1-3kb。
进一步优选的，步骤S1所述完整的基因表达盒序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，步骤S2中用于转染的PCR扩增产物浓度≥0.1μg/μl；
更优选的，步骤S2中用于转染的PCR扩增产物浓度为0.4-1.5μg/μl。
优选的，步骤S1所述底物为人工构建表达载体；
更优选的，所述人工构建表达载体由35S启动子、eGFP基因编码序列和NOS终止子顺次连接至中间载体获得。
本发明对所述中间载体的具体来源不作特别限定，本领域任意来源的中间载体均可用于本发明所述方法。
进一步优选的，所述人工构建表达载体的序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，步骤S1选用M13通用引物对进行PCR扩增；
进一步优选的，所述M13通用引物对的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
优选的，步骤S2所述靶表达系统为原生质体；
更优选的，所述原生质体包括兰花原生质体。
在本发明更为优选的具体实施方式中，所述基因瞬时表达方法包括如下步骤：
(1)制备表达盒扩增的DNA底物：将35S启动，eGFP(或包含eGFP)的基因编码序列，NOS终止子序列按顺序扩增，并连接到中间载体上；
(2)以中间产物为底物，利用高保真酶，通过PCR的办法将完整的基因表达盒(35S序列+基因编码序列+NOS终止子序列)进行扩增；
(3)通过割胶回收试剂盒将PCR产物进行割胶回收，用ddH2O溶解，使基因表达盒的浓度大于0.4ug/ul(更优选大于1ug/ul)。
第二方面，本发明提供了所述基因瞬时表达方法，或者用于所述基因瞬时表达方法的生物材料采用所述基因瞬时表达方法在非疾病诊断和治疗目的的外源基因表达中的应用。
在本发明中，所述基因瞬时表达方法的应用范围包括但不限于植物细胞、动物细胞。
在本发明中，所述基因瞬时表达方法应用于动植物中基因瞬时表达的相关产品，包括但不限于基因亚细胞定位相关产品、基因的功能类研究相关产品，基因相互作用相关产品，非编码基因功能研究相关产品，启动子序列的功能研究相关产品、终止子序列的功研究相关产品，非翻译区序列的功能研究相关产品。
在本发明中，所述应用的方式优选包括基因亚细胞定位、基因功能预测、基因相互作用中的至少一种；
更优选的，所述基因功能预测包括非编码基因功能预测、启动子序列功能预测、终止子序列功能预测、非翻译区序列功能预测中的至少一种。
DNA片段越大越难进入到原生质体，本发明提供的基因瞬时表达方法利用PCR法制备表达盒，该表达盒只包含了启动子、表达区域和终止子，可以极大提高进入细胞的DNA片段。基于该优点，将本发明所述基因瞬时表达方法应用于因DNA片段问题而未能做成功的特殊实验用途的试剂盒开发，具有广阔前景。
有益效果：
本发明提供了一种基因瞬时表达方法，该方法以DNA为底物，通过PCR扩增获得完整的基因表达盒，大量节省了制备基因表达盒的时间；扩增的基因表达盒可以作为底物，在细胞或原生质体等表达系统中进行基因的瞬时表达，能提高转染成功率和表达效率，增加表达的基因片段量。本发明提供的基因瞬时表达方法不仅操作简便、实验周期大幅度缩短、瞬时表达效率极大提高，还大幅度增大了可验证的DNA片段(包括但不限于启动子序列，基因编码区及终止子序列)。另外，本发明提供的基因瞬时表达方法在原生质体较小物种(如兰花)的基因瞬时表达中获得了良好的表现。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1为本发明实施例1所述激光共聚焦显微镜观察结果。图1中的A图以亚细胞定位载体pAN580作为基因瞬时表达盒；图1中的B图以PCR产物作为基因瞬时表达的表达盒。
图2为本发明实施例2所述LSM710共聚焦激光扫描显微镜观察eGFP蛋白的荧光结果。图2中A图的表达盒为pAN580转染的原生质体；图2中B图的表达盒为PCR产物转染的原生质体。
图3为本发明实施例3所述LSM710共聚焦激光扫描显微镜观察eGFP蛋白的荧光结果。图3中A图的3975bp的长表达盒由引物对Long_F/Long_R扩增制备，图3中B图的1489bp的短表达盒为引物对Short_F/Short_R扩增制备。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
实施例1—PCR产物表达盒转染兰花原生质体效率评测
本实施例提供了一种基因瞬时表达方法，具体包括如下步骤：
(1)表达盒底物制备
①质粒表达盒制备:
实验室用的亚细胞定位载体pAN580，包含35S，eGFP，NOS终止子完整的表达盒，载体大小约4.7kb(序列如SEQ ID NO:2所示)。
制备办法如下：
质粒转化及扩增：将存放于-80度的感受态大肠杆菌(DH5a)于冰上融化，取pAN580质粒500ng加入融化的感受态细菌中30分钟，之后42度热激30秒后立即放于冰上2分钟，之后加入LB培养基在摇床上37度，200转/分培养30分钟，之后在含有卡纳抗生素的LB平板培养基上涂板，37度过夜培养，第二天挑取单菌落测序。将测序正确单菌落加入到含有氨卞的LB培养基中过夜大摇培养16h左右。取150ml的菌液，12,000rpm离心弃上清，沉淀及为收集的细菌。
提取亚细胞定位载体：利用康为世纪公司大提质粒的试剂盒(货号：CW2104M)提取用于瞬时表达的载体物质。约耗时1小时左右。
②PCR产物表达盒制备：用载体pAN580作为底物，用高保真酶进行PCR扩增，通过割胶回收，PCR产物包含35S，eGFP，NOS终止子完整的表达盒，大小约为2kb(序列如SEQ ID NO:1所示)。
制备方法如下：
PCR扩增：pAN580表达盒外围含有M13通用引物。本发明以pAN580作为模版，M13(序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示)作为引物，利用高保真酶扩增PCR产物。本次表达盒利用诺维赞公司高保真酶进行扩增(货号：P510-01)，根据试剂盒提供的扩增体系和扩增方法进行表达盒的扩增。本次表达盒片段大小1980bp，扩增总时长约为30分钟。共扩增100ul的溶液。
回收PCR产物：利用诺维赞割胶回收试剂盒(产品名称：FastPure Gel DNAExtraction Mini Kit；货号：DC301)，回收PCR产物，约耗时1小时左右。
(2)兰花原生质体转化
表达盒浓度：pAN580载体大小约为4.7kb，PCR产物表达盒大小约为2kb，为了使得两种表达盒浓度一致，pAN580载体溶液的浓度配成940ng/ul，PCR产物表达盒浓度配成400ng/ul。
原生质体制备：取新鲜叶基软嫩部分，清水洗干净组织沥干放在滤纸上，充分切碎组织，放入酶解液中，缓慢摇匀保证样品浸入酶解液，防治氧化。酶解液放入摇床28℃，30rpm摇6h。酶解结束后，加20ml W5溶液后缓慢摇匀。150μM尼龙网折成漏斗状，放在50ml离心管中，过滤酶解液。200rpm离心3min，吸管吸走W5，加5ml MMG至管中，轻柔混匀，把溶液倒入下一个沉淀管中，至所有原生质体收集于一管内。冰浴0.5h、镜检。
表达盒转染原生质体：于2ml圆底离心管中加入10μl表达盒+100μl原生质体(剪枪头转移)+110ul PEG，冰外加PEG，上下轻柔颠倒混匀；室温避光10min；加两倍体积440ul，W5于离心管中，混匀终止反应；300rpm离心3min去上清；再加1ml W5混匀，300rpm离心3min，去上清；1ml WI混匀，把溶液移至6孔培养板，1孔1样；培养板放入保湿盒中，23℃避光培养18～24小时；转移培养板溶液至2ml离心管中(剪枪头)；300rpm离心3min，取上清；加500ul W5重悬镜检。
(3)激光共聚焦显微镜观察及结果
孵育好的原生质体，用50μg/mL DAPI对原生质体进行染色10min，再用LSM710共聚焦激光扫描显微镜观察eGFP蛋白的荧光。结果如图1所示。图1中A图的表达盒为pAN580转染的原生质体，B图的表达盒为PCR产物转染的原生质体。
重复三次实验，均获得相似结果：在同等倍速大小的视野类，观测到PCR产物表达盒具备更多散发荧光的细胞，且细胞的荧光在单个细胞内的覆盖度要普遍高于pAN580载体表达盒转染的原生质体。
实施例2—PCR产物表达盒在菠萝原生质体中的效率评测
(1)表达盒底物制备
①质粒表达盒制备：(具体方法见实施例1“(1)表达盒底物制备—①质粒表达盒制备”)
②PCR产物表达盒制备(具体方法见实施例1“(1)表达盒底物制备—②PCR产物表达盒制备”)
(2)菠萝原生质体转化
表达盒浓度：pAN580载体大小约为4.7kb，PCR产物表达盒大小约为2kb，为了使得两种表达盒浓度一致，pAN580载体溶液的浓度配成940ng/ul，PCR产物表达盒浓度配成400ng/ul。
原生质体制备：选择完全伸展的菠萝幼叶，清水洗干净组织沥干放在滤纸上，充分切碎组织，放入酶解液中，缓慢摇匀保证样品浸入酶解液，防治氧化。酶解液放入摇床25℃，30rpm摇6h。酶解结束后，加等体积W5溶液后缓慢摇匀。100目尼龙网折成漏斗状，放在50ml离心管中，过滤酶解液。100g离心2min后弃上清，加5ml MMG至管中，轻柔混匀，把溶液倒入下一个沉淀管中，至所有原生质体收集于一管内。冰浴0.5h、镜检。
表达盒转染原生质体：于2ml圆底离心管中加入10μl表达盒+100μl原生质体(剪枪头转移)+110ul PEG，冰外加PEG，上下轻柔颠倒混匀；室温避光10min；加两倍体积440ul，W5于离心管中，混匀终止反应；300rpm离心3min去上清；再加1ml W5混匀，300rpm离心3min，去上清；1ml WI混匀，把溶液移至6孔培养板，1孔1样；培养板放入保湿盒中，23℃避光培养18～24小时；转移培养板溶液至2ml离心管中(剪枪头)；300rpm离心3min，取上清；加500ul W5重悬镜检。
(3)激光共聚焦显微镜观察及结果
孵育好的原生质体，用50μg/mL DAPI对原生质体进行染色10min，再用LSM710共聚焦激光扫描显微镜观察eGFP蛋白的荧光。结果如图2所示。图2中A图的表达盒为pAN580转染的原生质体，图2中B图的表达盒为PCR产物转染的原生质体。
重复三次实验，均获得相似结果：在同等倍速大小的视野类，观测到PCR产物表达盒具备更多散发荧光的细胞，且细胞的荧光在单个细胞内的覆盖度要普遍高于pAN580载体表达盒转染的原生质体。
实施例3—不同引物制备的PCR产物表达盒效率评测
(1)不同引物的PCR扩增
用载体pAN580作为底物，用引物对Long_F(SEQ ID NO:5)及Long_R(SEQ ID NO:6)扩增的为长片段(SEQ ID NO:7)，长度为3975bp；用引物对Short_F(SEQ ID NO:8)及Short_R(SEQ ID NO:9)扩增的为短片段(SEQ ID NO:10)，长度约为1489bp。扩增的PCR产物都包含了35S，eGFP，NOS终止子完整的表达盒。本次表达盒利用诺维赞公司高保真酶进行扩增(货号：P510-01)，根据试剂盒提供的扩增体系和扩增方法进行表达盒的扩增。引物对Long_F/Long_R扩增的表达盒片段大小3975bp，引物对Short_F/Short_R扩增的表达盒片段大小1489bp，分别扩增100ul的溶液。
回收PCR产物：利用诺维赞割胶回收试剂盒(产品名称：FastPure Gel DNAExtraction Mini Kit；货号：DC301)，回收PCR产物。
(2)兰花原生质体转化(具体方法见实施例1“(2)兰花原生质体转化”)
(3)激光共聚焦显微镜观察及结果
孵育好的原生质体，用50μg/mL DAPI对原生质体进行染色10min，再用LSM710共聚焦激光扫描显微镜观察eGFP蛋白的荧光。结果如图3所示。图3中A图的3975bp的长表达盒由引物对Long_F/Long_R扩增制备，图3中B图的1489bp的短表达盒为引物对Short_F/Short_R扩增制备。
重复三次实验，均获得相似结果：在同等倍速大小的视野类，观测到，3975bp的长表达盒和1489bp的短表达盒都能检测到散发着荧光的细胞，但1489bp的短表达盒转染的原生质体中散发荧光的细胞数量要多于长表达盒转染的原生质体。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.基因瞬时表达方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、以DNA为底物，通过PCR扩增获得完整的基因表达盒；所述完整的基因表达盒包括启动子序列、编码区序列和终止子序列；
S2、将PCR扩增产物转染至靶表达系统，实现基因瞬时表达。
2.根据权利要求1所述基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤S1所述完整的基因表达盒长度≤4kb；
优选的，步骤S1所述完整的基因表达盒长度为1-3kb。
3.根据权利要求2所述基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤S1所述完整的基因表达盒序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1-3任意一项所述基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤S2中用于转染的PCR扩增产物浓度≥0.1μg/μl；
优选的，步骤S2中用于转染的PCR扩增产物浓度为0.4-1.5μg/μl。
5.根据权利要求1-4任意一项所述基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤S1所述底物为人工构建表达载体；
优选的，所述人工构建表达载体由35S启动子、eGFP基因编码序列和NOS终止子顺次连接至中间载体获得。
6.根据权利要求5所述基因瞬时表达方法，其特征在于，所述人工构建表达载体的序列如SEQ ID NO:2所示。
7.根据权利要求6所述基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤S1选用M13通用引物对进行PCR扩增。
8.根据权利要求7所述基因瞬时表达方法，其特征在于，所述M13通用引物对的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
9.根据权利要求1-8任意一项所述基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤S2所述靶表达系统为原生质体；
优选的，所述原生质体包括兰花原生质体。
10.权利要求1-9任意一项所述基因瞬时表达方法，或者用于权利要求1-9任意一项所述基因瞬时表达方法的生物材料采用权利要求1-9任意一项所述基因瞬时表达方法在非疾病诊断和治疗目的的外源基因表达中的应用，其特征在于，所述应用的方式包括基因亚细胞定位、基因功能预测、基因相互作用中的至少一种；
优选的，所述基因功能预测包括非编码基因功能预测、启动子序列功能预测、终止子序列功能预测、非翻译区序列功能预测中的至少一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311054041.4A CN117025663A (zh) | 2023-08-21 | 2023-08-21 | 基因瞬时表达方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311054041.4A CN117025663A (zh) | 2023-08-21 | 2023-08-21 | 基因瞬时表达方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117025663A true CN117025663A (zh) | 2023-11-10 |
Family
ID=88638927
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311054041.4A Pending CN117025663A (zh) | 2023-08-21 | 2023-08-21 | 基因瞬时表达方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117025663A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117683807A (zh) * | 2023-12-16 | 2024-03-12 | 韶关学院 | 一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法、系统及应用 |
-
2023
- 2023-08-21 CN CN202311054041.4A patent/CN117025663A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117683807A (zh) * | 2023-12-16 | 2024-03-12 | 韶关学院 | 一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法、系统及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107893076A (zh) | CRISPR‑Cas9靶向敲除人乳腺癌细胞RASSF2基因及其特异性的sgRNA | |
| CN117025663A (zh) | 基因瞬时表达方法及应用 | |
| CN111778252B (zh) | 一种靶向敲除SST基因的sgRNA及其CRISPR/Cas9系统和应用 | |
| CN109750035B (zh) | 靶向并引导Cas9蛋白高效切割TCR及B2M基因座的sgRNA | |
| Heenatigala et al. | Development of efficient protocols for stable and transient gene transformation for Wolffia globosa using Agrobacterium | |
| WO2016038670A1 (ja) | 細胞解析装置およびそれを用いた細胞解析方法 | |
| CN115386530A (zh) | 植物叶片原生质体的快速制备和转化方法、试剂盒及应用 | |
| CN115433740A (zh) | 一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法 | |
| CN110684769B (zh) | 一种长牡蛎EF-1α启动子及其重组载体和应用 | |
| CN114164232A (zh) | 一种电转染双壳贝类基因编辑的方法 | |
| CN110819592A (zh) | 一种通用供体干细胞及其制备方法 | |
| CN108034664A (zh) | 一种白花虎眼万年青Qt DCAF8基因及应用 | |
| CN116024321B (zh) | 一种鉴定植物体内转录因子结合位点的方法及应用 | |
| CN108977553B (zh) | 蛋鸭环状RNA circ_13267及其检测试剂、方法与应用 | |
| CN106811484B (zh) | 一种牛pdhb基因腺病毒干扰载体构建及其鉴定方法 | |
| CN108977554B (zh) | 蛋鸭环状RNA circ_13034及其检测试剂、方法与应用 | |
| CN109055379B (zh) | 一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法 | |
| CN116622777A (zh) | 基因编辑构建体及其应用 | |
| Zhou et al. | Expanding the molecular toolbox for Zygnematophyceae–transient genetic transformation of the desmid Micrasterias radians var. evoluta | |
| EP2537928B1 (en) | Novel promoter for use in transformation of algae | |
| CN115386531A (zh) | 植物通用型原生质体制备和瞬时转化方法、试剂盒及应用 | |
| CN112553198B (zh) | 一种有活性的落叶松增强子、获取及鉴定方法 | |
| CN112553197B (zh) | 一种有活性的落叶松启动子、获取及鉴定方法 | |
| CN105002217B (zh) | 用于制备永生化细胞的转座子载体、系统及其使用方法 | |
| CN110628818B (zh) | 一种鱼类皮肤粘液腺生物反应器的制备方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |