CN114164232A - 一种电转染双壳贝类基因编辑的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于海洋生物学应用领域，具体划分至贝类分子遗传育种领域，涉及一种电转染双壳贝类基因编辑的方法，保持重组质粒浓度≥2μg/μl、sgRNA:Cas9蛋白＝2:1的体积比混合成RNP(sgRNA和Cas9蛋白复合物)，其中sgRNA工作浓度≥50ng/μl，Cas9工作浓度≥250ng/μl，采用电转染的方法应用于双壳贝类基因编辑中，电脉冲条件脉冲间隔1s，脉冲数2个，电极距离4mm，变化脉冲电压和脉冲时间处理，脉冲电压范围50V～500V，脉冲时间为100μs～1ms。本发明涉及方法可为双壳贝类基因功能验证及基因育种应用提供依据，具有操作简单、成本低、易推广等优点。

Description

一种电转染双壳贝类基因编辑的方法
技术领域
本发明属于海洋生物学应用领域，具体划分至贝类分子遗传育种领域，涉及一种电转染双壳贝类基因编辑的方法。
背景技术
在CRISPR/Cas系统基因编辑导入方法中，主要分为三大类，即生物转染(慢病毒、腺病毒等)、化学转染(脂质体、阳离子聚合物)、物理转染(电转染、显微注射、基因枪)。对比上述导入方法，生物转染的方法相对操作难度较低，然而存在细胞毒素残留可能；化学转染方法最突出的优点是操作简便，无需复杂技术要求，也不存在细胞毒素问题，然而其最大弊端是稳定性难以保证，转染效率相对较低；物理转染很大程度上降低此类毒素风险，在实际研究中具有较高的优先级。
贝类主要具有食用价值，因而需要选择一种效率高且毒性小的导入方法至关重要。目前，在贝类中基因编辑研究应用缺乏充足的应用案例，仅存的报道是以长牡蛎(Crassostrea gigas)为材料，借助显微注射技术开展，并且仅达到 120h(Li et al.,2021a；Li et al.,2021b；Yu et al.,2019)。显微注射方法，每次对单个受精卵进行精确操作，具有转化率高整合率高的特点。然而，由于双壳类的受精卵比较小，直径一般仅在60μm左右，并且注射后存活率低，即使是操作熟练的技术人员也难以在发育至4细胞前完成保证存活的受精卵量。由此可见，利用显微注射开展双壳类的基因编辑技术难度比较大，应用前景不够理想。
电转染方法是利用可控的脉冲电场使细胞膜产生暂时的孔洞，促使一些非渗透的外源大分子如DNA、蛋白质和药物等进入细胞。目前，电转染方法主要应用于疫苗生产、转基因表达、酶的替代和癌症控制等方面。然而电转染方法在贝类的基因编辑中还没有成功应用的报道。
发明内容
为填补现有技术的空白，本发明以双壳贝类受精卵为操作对象，利用电转染方式实现对其基因编辑，具有操作简单、成本低、易推广等优点，旨在解决贝类基因编辑应用难的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种电转染双壳贝类基因编辑的方法，包括如下步骤：
A、sgRNA的设计及体外检测；
B、将sgRNA与Cas9配合形成可电转染表达体；
C、利用所述可电转染表达体，以受精卵到8细胞为对象进行电转染，获得基因编辑贝类。
面对双壳贝类受精卵极小且脆弱的情况，本发明采用CRISPR/Cas9操作流程设计并检验靶基因sgRNA，构建sgRNA/Cas9共表达载体或核酸蛋白复合物(RNP)的制备。首先优化电脉冲参数、转染比例等条件，采用电转染方法将共表达载体或RNP导入双壳贝类的受精卵内，然后进行常规孵化和幼虫培育，在不同发育阶段对编辑效果进行荧光观察和测序鉴定等检测。具体步骤如下：
1、明确靶基因结构：确定靶基因内含子、外显子区域。
2、设计相应靶基因sgRNA：设计并进行体外切割检验。
3、构建重组质粒或RNP制备：将设计的正链sgRNA序列和负链sgRNA 序列退火形成双链，与线性化载体pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)质粒连接后，待转染；也可以将设计的sgRNA反转录与Cas9蛋白混合成RNP待转入受精卵。
实验证实了对于电转染双壳贝类基因编辑，需要在受精卵-8细胞阶段内进行操作，超过8阶段后，细胞过于成熟，编辑效果不佳，编辑后难以受精和孵化。
相比起显微注射，电转染方法利用电脉冲产生暂时性孔洞使外源物质进入细胞，一次可以对成千上万个双壳类的受精卵进行操作，不仅难度较低，而且还可以在短时间内进行大量的导入操作，因此，应用前景非常广阔。
优选的，所述可电转染表达体包括sgRNA/Cas9共表达载体、sgRNA/Cas9 核酸蛋白复合物中一种或多种。
优选的，所述sgRNA/Cas9核酸蛋白复合物包括如下组分与体积比：sgRNA: Cas9蛋白＝2:1。
优选的，所述sgRNA/Cas9核酸蛋白复合物中，sgRNA工作浓度≥50ng/μl， Cas9工作浓度≥250ng/μl。
sgRNA：Cas9蛋白＝2:1的体积比混合成RNP(sgRNA和Cas9蛋白复合物)，其中sgRNA工作浓度保持≥50ng/μl，Cas9工作浓度保持≥250ng/μl。
优选的，所述sgRNA/Cas9共表达载体为重组质粒，浓度≥2μg/μl。
优选的，所述sgRNA/Cas9共表达载体，包括如下步骤制备：将设计的正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成双链，与线性化载体 pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)质粒连接后，获得所述sgRNA/Cas9共表达载体。
优选的，所述电转染的具体操作为：将受精卵到8细胞装入电击杯中，设置脉冲间隔1s，脉冲数2个，电极距离4mm，脉冲电压范围50V～500V，脉冲时间为100μs～1ms，使所述可电转染表达体进入细胞。
优化最佳脉冲参数：将800μl(≥2×103个/ml)受精卵到8细胞装入电击杯中，按实验设计电脉冲条件脉冲间隔1s，脉冲数2个，电极距离4mm，变化脉冲电压和脉冲时间处理，脉冲电压范围50V～500V，分别为50V、100V、150V、 200V、250V、300V、350V、400V、450V、500V共10组，保证电击过程不出现电火花、保证受精卵到8细胞完整性、活动性大于50％的脉冲时间极限值，显微镜观察电击后受精卵分裂状态，统计孵化率。
脉冲电压过低、脉冲时间过短，难以成功完成基因编辑；而双壳贝类受精卵又极小且脆弱，脉冲电压过高、脉冲时间过长，又容易导致受精卵破裂。经过长期的研究确定，脉冲电压范围50V～500V，脉冲时间为100μs～1ms，可以使所述可电转染表达体成功进入细胞内，成功完成基因编辑。
优选的，受精卵到8细胞的浓度≥2×103个/ml，脉冲电压范围为 250V～400V，脉冲时间为200μs～400μs，使所述可电转染表达体进入细胞。
经过研究发现，当受精卵到8细胞的浓度≥2×103个/ml，脉冲电压范围为 250V～400V，脉冲时间为200μs～400μs，电击后受精卵分裂状态最好，受精率能保持在80～90％，孵化率能达到90％以上。
优选的，还包括如下步骤：
D、对所述基因编辑贝类进行基因编辑效果检验，包括荧光观察、Sanger 测序中的一种或多种。
将电击后受精卵孵化，收集D-型幼虫，检测壳长等生长指标，用荧光显微镜观察GFP表达,提取单个幼虫基因组DNA，进行测序鉴定，提取大量幼虫RNA，进行qPCR实验，检测目标基因表达情况。
与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：
1、操作简单。本发明只需要电转仪即可短时间对受精卵到8细胞完成转染，设备要求简单、技术难度低、用时短，因而操作简单。
2、成本低。电转器皿可重复利用。
3、易推广。由于贝类的受精卵较小，采用显微注射方式具有技术要求严格、大批量操作困难、应用前景受局限等不足。而本发明在短时间内即可对上百万甚至上千万受精卵完成转染，进行大规模操作，易推广，应用前景广阔。
附图说明
图1为靶基因结构分析。
图2为相关sgRNA信息。
图3为体外切割效率检验电泳图。
图4为电转染实验基本步骤。
图5为sanger测序结果。
图6为质粒构建示意图。
图7为10d幼虫荧光及生长图。
图8为10d幼虫壳长数据。
图9为靶基因的相对表达量。
图10为40d稚贝荧光图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：
以华贵栉孔扇贝为例，进行电转染双壳贝类基因编辑实验。
时间：2020年10月
2020年10月，从广东省汕头市南澳岛海域养殖的8月龄华贵栉孔扇贝中，挑选金色品系性腺饱满的雌雄个体；其具体步骤如下：
1、靶基因结构分析。
根据本课题组已公布的转录组信息以及未公布的基因组信息共同分析基因序列，明确与类胡萝卜素类积累相关基因SRB-like-3共具有10个内含子区和11 个外显子区域(如图1A所示)，其中外显子与CDS序列重合；肌肉生长抑制素基因MSTN共有2个内含子区，3个外显子，其中3号外显子略大于CDS区(如图1B所示)。
2、获得根据基因序列分析及sgRNA设计原则，针对每个基因设计非跨外显子的sgRNA序列(如图2所示)，经体外检验筛选出特异性作用靶位点sgRNA， SRB3-sgRNA-2及MSTN-sgRNA-2(如图3所示)A所示为SRB3-sgRNA-1及 MSTN-sgRNA-1切割检验结果，其中1、5号孔位均为DL2000plus Marker，2 号为经过SRB3-sgRNA-1切割的MSTN片段，3号为经过MSTN-sgRNA-1切割的MSTN片段，4号为未经任何切割实验的MSTN片段，6号为经过 MSTN-sgRNA-1切割的SRB-like-3片段，7号为经过SRB3-sgRNA-1切割的 SRB-like-3片段，8号为未经任何切割实验的SRB-like-3片段。结果显示，2、3、 6、7号均显示两条条带，无论MSTN还是SRB-like-3基因片段均被 MSTN-sgRNA-1和SRB3-sgRNA-1切割为约750bp和150bp两条条带，。B所示为SRB3-sgRNA-2及MSTN-sgRNA-2切割检验结果，其中1、5号孔位均为 DL2000Marker，2号为经过MSTN-sgRNA-2切割的SRB-like-3片段，3号为经过SRB3-sgRNA-2切割的SRB-like-3片段，4号为未经任何切割实验的 SRB-like-3片段，6号为SRB3-sgRNA-2切割后的MSTN片段，7号为经过 MSTN-sgRNA-2切割的MSTN片段，8号为未经任何切割实验的MSTN片段。结果显示，只有3、7号显示出与对照不同的切割序列，其中3号显示约1Kbp 及约750bp两条条带，而7号显示1条约为750bp条带。2号与4号显示的一致均为约1.7Kbp单条条带，而6、8号显示一致均为约1Kbp单条条带进行转录后与Cas9蛋白2:1的体积比混合成RNP。
3、受精卵获取
1)亲贝预处理
挑选性腺饱满成熟的雌雄个体，仔细清理贝壳表面附着物，于室内暂养。
2)雌雄个体催产并受精
本研究使用升温催熟的方法，将亲贝阴干1h，每个亲贝单独置于1个洁净的10L聚乙烯桶中，加入过滤灭菌海水，放在阳光下待其自然排精排卵。必要时，也可以在亲贝性腺内注射五羟色胺(5-HT)溶液(0.5mM，0.1ml)进行人工催产。待排卵排精后，用500目的筛绢洗卵，将卵子和精子分别收集在两个 1L的烧杯中，随后受精并观察，收集受精卵，待用。
4、电转染操作。操作流程如图4所示，使sgRNA工作浓度保持≥50ng/μl， Cas9工作浓度保持≥250ng/μl，将RNP加入高密度受精卵中充分混合设置电击参数400V，200μs，将800μl(≥2×103个/ml)受精卵装入电击杯中，在受精卵 -8细胞阶段间进行电转染操作，注意全程无菌操作，佩戴口罩，尤其在RNP操作时格外注意，防止sgRNA降解及RNP污染。设置不添加RNP的等密度同批次受精卵作空白对照。收集D-型幼虫，进行单个幼虫基因组DNA提取和测序鉴定，结果如图5所示。
实施例2：
以华贵栉孔扇贝为例，进行电转染双壳贝类基因编辑实验。
时间：2021年4月
2021年4月，从广东省汕头市南澳岛海域养殖的8月龄华贵栉孔扇贝中，挑选金色品系性腺饱满的雌雄个体；其具体步骤如下
1、构建重组质粒。根据实施例1中设计sgRNA进行合成，退火形成双链，与经BbsⅠ酶切线性化的pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)质粒连接，结构示意图如图6。
2、受精卵获取步骤同实施例1.
3、电转染操作：保持重组质粒浓度≥2μg/μl，加入高密度受精卵中充分混合设置电击参数250V，400μs，将800μl(≥2×103个/ml)受精卵装入电击杯中，在受精卵-8细胞阶段间进行电转染操作。
4、检测基因编辑效果：将上述电击后10d幼虫，用荧光显微镜观察到GFP (如图7所示)，测量壳长对照组与MSTN编辑组有显著差异(P<0.05)(如图8所示)，提取RNA，进行qPCR实验，结果如图9所示；40d稚贝用荧光显微镜观察到GFP(如图10所示)。荧光观测结果可以看出，电击后的贝类，出现明显的荧光特征，证实基因编辑成功。
上述实施例中，本发明方法可以实现短时间大批量基因编辑操作，且可存活至稚贝阶段，成本低、操作简单，具有良好应用前景。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种电转染双壳贝类基因编辑的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、sgRNA的设计及体外检测；
B、将sgRNA与Cas9配合形成可电转染表达体；
C、利用所述可电转染表达体，以受精卵到8细胞为对象进行电转染，获得基因编辑贝类。
2.根据权利要求1所述电转染双壳贝类基因编辑的方法，其特征在于，所述可电转染表达体包括sgRNA/Cas9共表达载体、sgRNA/Cas9核酸蛋白复合物中一种或多种。
3.根据权利要求2所述电转染双壳贝类基因编辑的方法，其特征在于，所述sgRNA/Cas9核酸蛋白复合物包括如下组分与体积比：sgRNA:Cas9蛋白＝2:1。
4.根据权利要求2所述电转染双壳贝类基因编辑的方法，其特征在于，所述sgRNA/Cas9核酸蛋白复合物中，sgRNA工作浓度≥50ng/μl，Cas9工作浓度≥250ng/μl。
5.根据权利要求2所述电转染双壳贝类基因编辑的方法，其特征在于，所述sgRNA/Cas9共表达载体为重组质粒，浓度≥2μg/μl。
6.根据权利要求2所述电转染双壳贝类基因编辑的方法，其特征在于，所述sgRNA/Cas9共表达载体，包括如下步骤制备：将设计的正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成双链，与线性化载体pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)质粒连接后，获得所述sgRNA/Cas9共表达载体。
7.根据权利要求1所述电转染双壳贝类基因编辑的方法，其特征在于，所述电转染的具体操作为：将受精卵到8细胞装入电击杯中，设置脉冲间隔1s，脉冲数2个，电极距离4mm，脉冲电压范围50V～500V，脉冲时间为100μs～1ms，使所述可电转染表达体进入细胞。
8.根据权利要求7所述电转染双壳贝类基因编辑的方法，其特征在于，受精卵到8细胞的浓度≥2×103个/ml，脉冲电压范围为250V～400V，脉冲时间为200μs～400μs，使所述可电转染表达体进入细胞。
9.根据权利要求1所述电转染双壳贝类基因编辑的方法，其特征在于，还包括如下步骤：
D、对所述基因编辑贝类进行基因编辑效果检验，包括荧光观察、Sanger测序中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述电转染华贵栉孔扇贝基因编辑的方法，其特征在于，所述双壳贝类为华贵栉孔扇贝。
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CN114703174A (zh) * 2022-04-12 2022-07-05 中国科学院海洋研究所 快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法及应用
CN114703231A (zh) * 2022-04-12 2022-07-05 中国科学院海洋研究所 长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法及应用
CN114703231B (zh) * 2022-04-12 2023-10-24 中国科学院海洋研究所 长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法及应用
CN114703174B (zh) * 2022-04-12 2023-10-24 中国科学院海洋研究所 快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法及应用

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