CN111518827B - 一种基于cdp的外源基因在植物中的瞬时表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CDP的外源基因在植物中的瞬时表达方法，属于植物基因工程领域。该表达方法操作简单，只需将CDP与质粒按照一定比例混合，直接浸泡活体根或者涂沫于叶片表面，CDP可以通过植物细胞壁进入植物组织细胞，从而实现外源基因的表达。CDP可在水稻、绿豆、拟南芥等多种植物上实现外源基因的稳定快速表达，具有普适性。碳点(CDs)表面含有丰富的羧基，其与PEI通过酰胺反应结合后，降低其表面电性，从而降低PEI的毒性。因此，CDP既具有PEI对DNA的结合与保护能力，同时兼具碳点极好的生物相容性。不同于农杆菌转化法，CDP可以在多种种类的植物上进行外源基因表达，且具有很高的转染效率和转染速度。

Description

一种基于CDP的外源基因在植物中的瞬时表达方法

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，尤其涉及一种基于CDP的外源基因在植物中的瞬时表达方法。

背景技术

随着全球人口的增长和对食品和药物需求的增加，植物基因工程已经成为一项重要的技术，其中外源功能基因的导入对农业有着重要的意义。

目前，常见的植物细胞瞬时基因表达技术有原生质体PEG导入法、基因枪等，这些现有技术操作复杂，且需要离体培养细胞或组织，且仅针对特定的植物受体范围，重要的是，无法实现植物活体在体表达，仅能应用于基因亚细胞定位等基础实验，通过此方法无法使得植物本身获得外源基因表达产物，因此设计新的基因载体及方法将质粒导入植物活体组织并高效表达对于实时获取基因表达的细胞定位、活体获得外源基因表达产物具有重要意义。最常用于动物细胞转染的是阳离子脂质体和阳离子聚合物，但由于其昂贵的价格限制了阳离子脂质体的应用，因此阳离子聚合物备受关注。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于CDP的外源基因在植物中的瞬时表达方法。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种基于CDP的外源基因在植物中的瞬时表达方法，包括如下步骤：

(1)将CDP溶液与质粒按照一定比例混合；

(2)将步骤(1)中制备的混合液喷洒或涂沫在植株叶片或浸泡植物根系进行外源基因的瞬时表达。

进一步的，所述步骤(1)中CDP溶液的制备方法如下：

(1)将两根石墨棒平行放置于超纯水中，两侧施加25v-30v直流电压，电解几周后，其中一个石墨被完全腐蚀后，将溶剂离心得到上清，然后用2500Da的纤维素滤膜去离子水透析上清液1-3天得到碳点溶液；

(2)向5-15ml浓度为0.5-1.5mg/ml的碳点溶液中加入30-50mg n-乙基-n-(3-二甲基氨基丙基)盐酸卡克二亚胺，反应1.5-3小时，再加入5ml浓度为3-7mg/ml的PEI水溶液,反应3-5小时后，使用纤维素半透膜在超纯去离子水中透析去除残留的PEI，最终得到CDP溶液。

进一步的，所述步骤(2)中碳点溶液浓度为1mg/ml。

进一步的，所述步骤(2)中PEI水溶液的浓度为5mg/ml。

进一步的，所述步骤(2)中将植株愈伤组织浸于CDP溶液与质粒的混合液中进行外源基因的瞬时表达。

进一步的，所述CDP中的PEI的分子量为10KD。

本发明还提供了上述瞬时表达方法在植物转基因中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

CDP转基因时，操作简单，无需精细的操作，只需将CDP与质粒按照一定比例混合，喷洒在植物表面。CDP尺寸在50nm左右，这使得它可以通过植物细胞壁进入植物组织，从而进行外源基因表达。CDP可在水稻、绿豆、小麦等多种植物上实现外源基因导入及高效表达，具有普适性。PEI能够高效的与DNA连接，并且保护DNA不被核酸酶降解，但是由于其带有较高正电荷，使得其具有较高的毒性，碳点(CDs)由于其表面含有丰富的羧基，使其呈电负性，碳点与PEI通过酰胺反应结合后，降低其表面电性，从而降低PEI的毒性。因此，CDP既具有PEI对DNA的结合与保护能力，同时兼具碳点极好的生物相容性。不同于农杆菌转化法，CDP可以在多个种类的植物上进行外源基因高效表达，且具有很高的转染效率和转染速度。

附图说明

图1为实施例1中碳点的TEM扫描图。

图2为实施例1中CDP的TEM扫描图。

图3为实施例2中293T细胞活性图。

图4为实施例3中水稻的播种长度和根数的统计图。

图5为实施例4中CDP或PEI处理293T后的荧光显微镜图。

图6为实施例4中CDP或PEI处理Hela细胞后的荧光显微镜图。

图7为实施例5中不同分子量的PEI合成的CDP转染后的荧光显微镜图。

图8为实施例6中水稻愈伤组织转基因结果对比图。

图9为实施例6中水稻愈伤组织转基因转化效率对比图。

图10为实施例7中mcherry基因表达的荧光显微镜图。

图11为实施例8小麦叶片GFP基因瞬时表达荧光图。

图12为实施例8小麦叶片real-timePCR检测图。

图13为实施例8中GFP的western blotting检测图。

图14为为实施例9中绿豆叶片GFP基因瞬时表达荧光图。

具体实施方式

实施例1

CDP合成方法如下：

(1)采用电化学腐蚀法制备碳点(CDs)：将两根高纯石墨棒平行放置于1000ml的超纯水断路器中，两侧施加25v-30v直流电压，电解几周后，其中一个石墨被完全腐蚀后，将溶剂离心得到上清，然后用纤维素滤膜(2500Da)去离子水透析上清液2天得到碳点溶液，该碳点表面富含羧基，粒径为4nm-6nm，如图1所示；

(2)向10ml碳点溶液(1mg/ml)中加入30-50mg n-乙基-n-(3-二甲基氨基丙基)盐酸卡克二亚胺(EDC)，反应2小时以激活羧基，再加入5ml浓度为5mg/ml的聚乙烯亚胺(PEI)水溶液,反应4小时后，透析溶液2天去除残留的PEI，最终得到CDP溶液，CDP在水溶液中分散均匀，粒径多分布在15nm-20nm，如图2所示，其中PEI的分子量为10KD。

实施例2

CDP的毒性测试过程如下：

为评估CDP的毒性，分别用浓度为1、2、3、4、5、6、7mg/L的PEI(分子量10KD)和CDP(PEI的分子量为10KD)孵育293T细胞。细胞培养24小时，通过CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒测试细胞活性，结果如图3所示。尽管CDP的浓度高达7mg/L，细胞仍具有较高的活性，而此浓度下PEI杀死了大部分的细胞。结果表明，与PEI相比，CDP具有更低的细胞毒性和更好的生物相容性。PEI的毒性是由于其表面的高密度阳离子电荷，当PEI与碳点(CDs)结合时，CDs表面的负电荷大幅降低了PEI的阳离子电荷密度。

实施例3

为了测试CDP对植物是否存在毒害作用，本实施例采用CDP处理水稻。使用10mg/lCDP(后续转基因使用浓度的30倍)溶液，20度浸泡水稻种子至露白，转移至垫有纱布的培养皿中，保持湿润，37度催芽12小时，去除不发芽种子，加入CDP溶液，使得根尖浸没在溶液中，以水作为对照，一周后统计。通过比较CDP处理组和对照组植物根茎的情况来评估CDP的毒性，结果如图4所示。从图4可以看出，CDP处理的水稻与对照相比，水稻的播种长度和根数没有差异，这提示CDP对植物基本没有副作用。

实施例4

本实施例对CDP与PEI的转染效率进行了比较，CDP中PEI的分子量为10KD，过程如下：

4ul CDP溶液(1ug/mL)或4ulPEI溶液(1ug/mL，分子量为10KD)与1ug EGFP质粒在100ul培养基中混匀静置20分钟后加入动物细胞293T中培养14小时，显微镜下观察EGFP表达情况，结果如图5所示，质粒EGFP已经被翻译并表达为绿色荧光蛋白，在488nm激光照射下，绿色荧光蛋白可以发出绿光，通过绿色细胞的数量来判断转染效率。由图5可知，CDP对293T细胞的转染效率要优于PEI。PEI组的死亡细胞也比CDP组多，这说明与PEI相比，CDP毒性更小。

4ul CDP溶液(1ug/mL)或4ulPEI溶液(1ug/mL，分子量为10KD)与1ug EGFP质粒在100ul培养基中混匀静置20分后加入Hela细胞中培养14小时，显微镜下观察EGFP表达情况，结果如图6所示，由图6可知，CDP对Hela细胞的转染效果也优于PEI。

实施例5

本实施例对不同分子量的PEI合成的CDP转染效果进行了比较，步骤如下：

分别以分子量为0.6KD、1.2KD、10KD和25KD的PEI为原料合成CDP，293T细胞在培养皿中培养，使用不含胎牛血清的DMEM代替培养基，上述含有不同分子量PEI的CDP和质粒GFP分别在DMEM中以氮/磷(N/P)比为2的比例混合，孵育20min后加入培养皿中。在孵育4小时后，用含有胎牛血清的新培养基代替原来的培养基，继续培养24小时后，可以观察到绿色荧光蛋白在细胞表达。CDP中的PEI分子量会影响其转染效率，不同分子量的PEI合成的CDP转染效果对比结果如图7所示。由图7可知，在相同转染条件下，PEI-10KD转染效果最佳。

实施例6

本实施例利用CDP进行水稻愈伤组织转基因，过程如下：

(1)制备CDP转基因混合剂：

充分混合，37度，温育30分钟。

(2)将水稻愈伤组织浸于上述混合液中，-90kpa真空处理45-180分钟不等，结束后取出愈伤组织，置新诱导培养基上恢复2天，GUS染色法检测转化效率，结果如图8和9所示，图8A为未转染对照，8B为转染120min的水稻愈伤组织，由图9可知，120分钟的效果最佳，达90％以上。传统农杆菌方法转化效率一般为5％左右。

实施例7

本实施例利用CDP进行水稻根尖报告基因的瞬时表达，过程如下：

(1)制备CDP转基因混合剂：

充分混合，37度，温育30分钟。

(3)将水稻幼苗根直接浸入溶液中，24后荧光显微镜检测mcherry基因表达情况，结果如图10所示，由图10可知80％以上的根尖细胞均表达出了强烈的mCherry(红色荧光)信号，表明CDP能够成功将质粒DNA带入细胞并高效表达。已有的植物细胞瞬时表达方法均需要分离组织，提取细胞，消解掉细胞壁形成原生质体后，使用PEG等方法将质粒DNA带入细胞，仅作为基因亚细胞定位使用，无法实时观察基因在活性上的动态表达情况。目前植物上尚无同类方法能够直接在活体细胞上实现基因瞬时高效表达。此方法暂无同类方法比较，属首创，之前并没有报导过有类似活体转基因成功的案例。本实施例填补了植物活体瞬时转基因的空白。

实施例8

本实施例利用CDP进行小麦叶片报告基因的瞬时表达，过程如下：

(1)制备CDP转基因混合剂：

充分混合，37度，温育30分钟。

(2)上述溶液涂沫于小麦叶片上，每天上午下午各一次，连续两天，荧光显微镜检测GFP表达情况，结果如图11A-F，可知，80％以上叶片细胞表达出了强烈的GFP信号，表明CDP能够成功将质粒DNA带入细胞并高效表达。上述处理后小麦叶片，液N速冻研磨破碎组织细胞，Trizol法提取总RNA，经DNA酶DNaseI处理降解DNA后，取2μg总RNA，反转录成cDNA，使用GFP基因特异引物(GFP-F SEQ ID NO.1:TTCTGGGCCATAAAATGGAA,GFP-R SEQ ID NO.2:CGGGGTGTTCTGCTGATAAT)进行Real-time PCR检测GFP基因表达，结果如图12，图中所示A为扩增产物的融解曲线，为单一峰，B为扩增曲线，显示GFP基因在叶片中表达良好。图13为GFP的western blotting检测图。处理后小麦叶片液N速冻研磨破碎组织细胞，RIPA蛋白提取液提取总蛋白，按照标准western blotting实验方法进行电泳分离及转膜。使用GFP蛋白抗体(Abcam,ab13970)杂交，以未处理叶片蛋白为对照。结果表明，处理后小麦叶片中有大量GFP蛋白累积。

实施例9

本实施例利用CDP进行绿豆叶片报告基因的瞬时表达，过程如下：

(1)制备CDP转基因混合剂：

充分混合，37度，温育30分钟。

(2)上述溶液涂沫于绿豆叶片上，每天上午下午各一次，连续两天，荧光显微镜检测GFP表达情况，结果如图14，可知80％以上叶片细胞表达出了强烈的GFP信号，表明CDP能够成功将质粒DNA带入细胞并高效表达。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 苏州大学,苏州劢桥至诚生物科技有限公司

<120> 一种基于CDP的外源基因在植物中的瞬时表达方法

<130> 2020.4.30

<141> 2020-05-06

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ttctgggcca taaaatggaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

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Claims (3)

1.一种基于CDP的外源基因在植物中的瞬时表达方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将CDP溶液与质粒按照一定比例混合；

(2)将步骤(1)中制备的混合液浸泡植物根或者涂沫在叶片表面进行外源基因的瞬时表达；

所述步骤(1)中CDP溶液的制备方法如下：

①将两根石墨棒平行放置于超纯水中，两侧施加25v-30v直流电压，电解几周后，其中一个石墨被完全腐蚀后，将溶剂离心得到上清，然后用2500Da的纤维素滤膜去离子水透析上清液1-3天得到碳点溶液；

②向5-15ml浓度为1mg/ml的碳点溶液中加入30-50mg n-乙基-n-(3-二甲基氨基丙基)盐酸卡克二亚胺，反应1.5-3小时，再加入5ml浓度为5mg/ml的PEI水溶液,反应3-5小时后，使用纤维素半透膜在超纯去离子水中透析去除残留的PEI，最终得到CDP溶液；

所述CDP中的PEI的分子量为10KD。

2.根据权利要求1所述的基于CDP的外源基因在植物中的瞬时表达方法，其特征在于，所述步骤(2)中将植株愈伤组织浸于CDP溶液与质粒的混合液中进行外源基因的瞬时表达。

3.权利要求1-2中任一项所述的瞬时表达方法在植物转基因中的应用。

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