CH694207A5

CH694207A5 - Procédé pour produire des plants de caféier transformés et des plants de caféier transgéniques.

Info

Publication number: CH694207A5
Application number: CH02326/99A
Authority: CH
Inventors: Hiroshi Sano; Tomonobu Kusano
Original assignee: Nara Inst Science & Technology
Priority date: 1998-12-28
Filing date: 1999-12-20
Publication date: 2004-09-15
Also published as: AU6545699A; JP3286733B2; AU729635B2; CA2291932C; CA2291932A1; JP2000245485A; US6392125B1

Description

Cette invention concerne un procédé pour produire des plants de caféier transformés stables. 2. Description de l'art connexe

Le caféier est un buisson ligneux important du point de vue commercial cultivé à grande échelle pour ses graines. Parmi plus de 80 espèces existantes, la plus importante du point de vue économique est Coffea arabica (2n-44) et C. canephora (2n-22). Dans le cas de C. arabica, la diversité génétique est limitée en culture conventionnelle à cause de ses caractéristiques d'autofécondation et les plantes sont hautement sensibles aux parasites et aux maladies. C. canephora, utilisé pour la fabrication de poudres de café solubles est une espèce allofécondée, mais sa production est de qualité médiocre. La culture conventionnelle des caféiers est difficile à cause du temps nécessaire pour que le buisson produise des graines.

Dans ces conditions, le génie génétique constitue une technique prometteuse pour l'amélioration génétique de variétés de caféiers, bien que l'obtention de plants de caféiers transgéniques par transformation génétique soit généralement considérée comme problématique.

La génération de plants par culture de tissus in vitro constitue un système de base pour permettre une transformation génétique et de nombreux rapports existent décrivant l'embryogenèse somatique dans les plants de caféier (Staritsky, 1970; Hatanaka et col. 1991; Mendénez-Yuffa et Garcia, 1996). Toutefois, les informations concernant la transformation génétique du caféier sont limitées. Barton et al. (1991) ont obtenu des transformants par électroporation à partir de protoplastes de C. arabica, mais les protoplastes cultivés ne se sont pas développés en plantes complètes. Spiral et al. (1993) a décrit une transformation du caféier C. canephora par co-cul-ture avec Agrobacterium rhizogenes, faisant appel à des embryons somatiques microcoupés. Toutefois, l'efficacité de la transformation était très faible. Van Boxtel et al.

(1995) ont décrit l'expression, mais uniquement transitoire, du gène de la GUS sur les surfaces des tissus de feuilles de caféier après une administration biolistique. Resumé de l'invention

Les transformations par Agrobacterium tumefaciens sont considérées comme étant les plus efficaces pour les plantes, à cause de la disponibilité des vecteurs. En dépit de cet avantage, aucun rapport n'a été publié décrivant une transformation réussie de caféiers, faisant appel à des souches d'Agrobacterium tumefaciens, sauf dans le cas de l'induction à basse fréquence de callus transgéniques GUS positifs décrite par Ocampo et Manzanera (1991).

Cette invention concerne une transformation génétique de Coffea canephora réussie grâce au fait que l'on a utilisé Agrobacterium tumefaciens EHA101 contenant plG121-Hm, sur des callus embryogéniques.

Les callus embryogéniques ont été induits à partir d'explants de feuilles de Coffea canephora sur un milieu pour plantes ligneuses de McCown (WPM) additionné de 5 mu M de N<6>-[2-isopentyl]-adénosine (2-iP). Ces callus ont été co-cultivés avec Agrobacterium tumefaciens EHA101 contenant plGI21-Hm renfermant le gène de la beta -glucuronidase (GUS), le gène de l'hygromycine phosphotransférase (HPT) et le gène de la néomycine phosphotransférase II (NPT II). La sélection de callus présumés transgéniques a été effectuée par une augmentation graduelle de la concentration en hygromycine (5, 50, 100 mg/ml). Les callus embryogéniques survivant sur un milieu contenant 100 mg/l d'hygromycine ont montré une réaction GUS positive forte avec une solution de X-gluc.

Les embryons somatiques ont été formés et on germé à partir de ces callus présumés transgéniques sur du milieu WPM contenant 5 mu M de 2-iP. Les plantules générées, ayant des pousses et des racines, ont été transférées sur un milieu contenant simultanément 100 mg/l d'hygromycine et 100 mg/l de kamamycine pour une sélection finale des plantes transgéniques. Les plantules sélectionnées présentaient une forte activité GUS dans les feuilles et dans les racines, comme cela était indiqué par une couleur bleu foncé. On a confirmé par PCR que le gène de la GUS et le gène de l'HTP ont été intégrés de manière stable dans le génome des plants de café.

Par ailleurs, les inventeurs ont réussi à produire des plantes transgéniques de Coffea arabica, dans lesquels le gène de la phosphinothricine acétyle transférase (BAR) a été incorporé pour apporter une résistance contre des herbicides. Commercialement, Coffea arabica est plus apprécié que Coffea canephora. Les callus embryogéniques dérivés de Coffea arabica ont été préparés à partir d'explants de feuilles de caféier sur le milieu de Murashige et Skoog (MS) complété avec 10 mu M de N<6>-[2-isopentyl]-adénosine (2-iP). Ces callus ont été co-cultivés avec Agrobacterium tumefaciens EHA101 contenant pSMBuba renfermant le gène de la BAR conférant une résistance à des herbicides et le gène de l'hygromycine phosphotransférase (HPT).

La sélection des callus présumés transgéniques a été effectuée par une augmentation graduelle de la concentration d'hygromycine (25, 50 mg/l). Les callus embryogéniques ont été entretenus sur un milieu MS contenant 50 mg/l d'hygromycine et 10 mu M de 2-iP. Une culture prolongée du callus embryogénique a produit des embryons somatiques. La germination des embryons somatiques est fortement augmentée par un traitement par du GA 3 , permettant un développement en plantules transgéniques après 2 mois de culture. Les callus transgéniques embryogéniques, les embryons somatiques et les plantules résistaient à 2 mg/l de bialaphos. Par contre, ceux non transformés étaient morts après 1 mois. La présence de gènes de la HTP et de la BAR dans ces plantules transgéniques a été confirmée par une PCR du génome et par des analyses northern.

Cette invention fournit également un procédé pour incorporer un gène exogène par une technique faisant appel à Agrobacterium tumefaciens. Les callus embryogéniques ont été obtenus à partir d'explants de feuilles de plants de caféier. Les callus embryogéniques ainsi obtenus ont été infectés par Agrobacterium tumefaciens contenant un plasmide renfermant un gène exogène à incorporer et le gène de l'hygromycine phosphotransférase (HPT). Les callus présumés transformés ont été sélectionnés en faisant appel à la résistance à l'hygromycine comme indicateur. Ensuite, les embryons somatiques ont été induits à partir des callus présumés transformés. Des plantules transformées peuvent être générées à partir des embryons somatiques ainsi obtenus.

Des plants de caféier appartenant à différentes espèces peuvent être transformés en utilisant le procédé de cette invention. De préférence, les espèces auxquelles les plants de caféier cultivés appartiennent sont: Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea liberica et Coffea dewevrei.

Théoriquement, un gène exogène quelconque peut être incorporé dans les plants de caféier par le procédé de cette invention. Les gènes exogènes incorporés peuvent, de préférence, être le gène de la caféine synthétase, un gène de résistance à des herbicides tels que le gène de la phosphinothricine acétyle transférase (BAR), un gène de résistance aux atteintes par les insectes tels qu'un gène de Bacillus thuringiensis et un gène de résistance à des maladies tel que le gène de la chitinase et le gène de la glucanase.

D'autres objets, traits caractéristiques et avantages de l'invention vont apparaître plus clairement à la lecture des descriptions suivantes. Il est entendu que les exemples et les descriptions ci-dessus des formes d'exécution détaillées ne sont pas destinés à limiter la portée de cette invention. Breve description des dessins La fig. 1 montre un callus de caféier embryogénique survivant sur un milieu WPM contenant 100 mg/l d'hygromycine après co-culture avec Agrobacterium tumefaciens EHA101. La fig. 2 illustre l'activité de la GUS rendue visible par coloration de callus embryogéniques transformés ou non transformés. La fig. 3 illustre la formation d'un embryon somatique, dérivé d'un callus embryogénique transformé.

La fig. 4 illustre l'activité GUS, mise en évidence par une coloration, chez des callus embryogéniques transformés ou non transformés. La fig. 5 montre des plantules cultivées sur un milieu WPM contenant simultanément 100 mg/l d'hygromycine et 100 mg/l de kanamycine. La fig. 6 montre des plantules présumées transgéniques résistant à l'hygromycine et à la kanamycine après transfert sur un milieu WPM additionné de 3% de saccharose. La fig. 7 illustre l'activité GUS, mise en évidence par une coloration, dans des feuilles dérivées de plants de caféier non transformés ou transformés. La fig. 8 illustre l'activité GUS, mise en évidence par une coloration, dans des racines dérivées de plants de caféier non transformés ou transformés. La fig. 9 montre des plantules de caféier transgéniques après mise en terre.

La fig. 10 illustre la fréquence de callus GUS positifs parmi les callus embryogéniques de caféiers survivant sur le milieu sélectif. La fig. 11 illustre la détection du gène de la GUS par PCR, les pistes T1 à T4 correspondant à des échantillons transformés et la piste N correspondant à un échantillon non transformé. La fig. 12 illustre la détection du gène de la HPT par PCR, les pistes T1 à T4 correspondant à des échantillons transformés et la piste N correspondant à un échantillon non transformé. La fig. 13 montre un callus embryogénique de caféier dérivé d'un explant de feuille de Coffea arabica. La fig. 14 montre des callus embryogéniques entretenus sur un milieu MS contenant 2-iP. La fig. 15 montre un callus embryogénique ayant survécu sur la surface de callus bruns non transformés.

La fig. 16 illustre la formation d'un embryon somatique à partir d'un callus embryogénique transformé de Coffea arabica. La fig. 17 montre un embryon somatique sur un milieu 1/2 MS contenant du GA 3 . La fig. 18 montre des plantules brunies cultivées sur un milieu1/2 MS contenant 2 mg/l de bialaphos. La fig. 19 illustre la résistance au bialaphos de plantules transgéniques. La fig. 20 montre des plantules transgéniques de Coffea arabica poussant sur un milieu 1/2 MS, dans des flacons. La fig. 21 illustre la détection du gène de la BAR par PCR, les pistes T1 à T4 correspondant à des échantillons transformés et la piste N correspondant à un échantillon non transformé.

La fig. 22 illustre la détection du gène de la HTP par PCR, les pistes T1 à T4 correspondant à des échantillons transformés et la piste N correspondant à un échantillon non transformé. Description detaillée des formes d'exécution forme d'exécution 1:

Production d'un plant de Coffea canephora, transformé Induction de callus embryogéniques

Des explants de feuilles de caféier (Coffea canephora) ont été préparés à partir de feuilles de buissons cultivés en serre, selon le procédé décrit antérieurement par Hatanaka et al. 1991. Les explants de feuilles ont été cultivés sur un agar pour plantes ligneuses (0,9%) préparé avec le milieu WPM constitué d'un mélange de sels pour plantes ligneuses selon McCown (Lloyd et McCown, 1981), de vitamines B 5 de Gamborg et al. (Gamborg et al., 1968), de saccharose 3% et de N<6>-[2-isopentyl]-adénosine (2-iP) 5 mu M. Le milieu a été ajusté à pH 5,7 avant un autoclavage à 120 DEG C pendant 15 minutes. La chambre de culture a été maintenue à 25 DEG C avec 18 heures d'éclairage à 24 mu moles m<-2>s<-1> (tubes fluorescents blancs). Transformation par Agrobacterium

Après 4 mois de la culture ci-dessus, les callus embryogéniques formés à partir des explants de feuilles ont été transférés sur un milieu de prolifération de callus (CM), qui contenait les sels MS (Murashige et Skoog, 1962), 0,25% de gomme gellane, de la vitamine B 5 , 3% de saccharose et 10 mu M d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D). Le milieu CM a également été ajusté à pH 5,7 avant l'autoclavage à 120 DEG C pendant 15 minutes. Agrobacterium tumefaciens EHA101 contenant plG121-Hm renfermant le gène de la beta -glucuronidase (GUS), le gène de l'hygromycine phosphotransférase (HTP) et le gène de la néomycine phosphotransférase II (NPT II) dans la région ADN-T du plasmide a été utilisé pour la transformation.

Des sous-cultures fraîches de callus embryogénique (3 jours de culture) ont été co-cultivées dans une suspension bactérienne (absorbance de 0,6 à 600 nm) pendant 30 minutes à 25 DEG C dans un milieu liquide WPM contenant 5 mu M de 2-iP et 50 mg/l d'acétosyringone, ensuite ces callus ont été transférés sur un agar préparé avec un milieu WPM contenant 50 mg/l d'acétosyringone, 3% de saccharose et 5 mu M de 2-iP à 25 DEG C et conservés à l'obscurité pendant quatre jours. Pour éliminer les bactéries, les callus ont été lavés 5 fois avec de l'eau stérilisée, et ensuite une fois avec de l'eau contenant 300 mg/l de céfotaxime.

Ensuite, les callus embryogéniques ont été cultivés sur un agar préparé avec un milieu WPM contenant 300 mg/l de céfotaxime, 5 mg/l d'hygromycine et 5 mu M de 2-iP et cultivés à nouveau sur le même milieu, qui était changé à des intervalles de 2 semaines. Après 2 mois de culture, les callus embryogéniques ont été transférés sur un milieu frais avec une concentration augmentée en hygromycine (50 mg/l). Après 2 mois de culture, chaque lignée de callus embryogéniques a été maintenue en la transférant sur un agar préparé fraîchement préparé avec du milieu WPM contenant 5 mu M de 2-iP et 100 mg/l d'hygromycine. Embryogenèse somatique et génération des plants

Après la sélection à la concentration de 100 mg/l d'hygromycine, les callus embryogéniques ont été transférés sur du milieu WPM contenant 5 mu M de 2-iP dans des boîtes de pétri en plastique de 10 x 2 cm. Des embryons partiellement germes (environ 1-2 cm de longueur) ont été transférés sur un agar préparé avec un milieu WPM exempt de phytohormone et contenant simultanément 100 mg/l d'hygromycine et 100 mg/l de kanamycine, en vue d'une sélection finale de plantules transgéniques. Après sélection, elles ont été cultivées sur un agar préparé avec du milieu WPM et ne contenant pas de régulateurs de croissance pour assurer une croissance continue dans des flacons de culture de 300 ml.

Les plantules avec aussi bien des pousses que des racines ont été transférées dans des pots en plastique contenant du terreau et de la tourbe de mousse (1: 1 v/v) dans une serre. Recherche histochimique de la GUS

Des essais histochimiques pour mettre en évidence la présence de la GUS ont été effectués pour identifier les callus embryogéniques, les embryons somatiques, les feuilles et les racines de plantules résistants à l'hygromycine, conformément à la méthode de Van Boxtel et al. (1995). Pour la coloration, les matériaux ont été incubés dans une solution de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- beta -D-glucuronide (X-gluc) avec une composition modifiée pour contenir 50 mM de Na 2 HPO 4 , 10 mM de Na 2 EDTA, 0,3% de Triton X-100, 0,5 mM de K 3 Fe(CN) 6 , 0,5 mM de K 4 Fe(CN) 6 et des antioxydants (0,5% de caféine, 1% de PVP et 1% d'ascorbate de sodium). Après 16 heures à 37 DEG C, ces explants ont été immergés dans de l'éthanol à 99,5% pour extraire la chlorophylle et observés sous un microscope permettant des dissections.

Transformation provoquée par Agrobacterium et embryogenèse somatique

Des callus friables et jaunes (fig. 1) ont été obtenus à partir d'explants de feuilles de caféier (Coffea canephora) après 4 mois de culture sur un agar préparé avec un milieu WPM contenant 5 mu M de 2-iP. Les callus embryogéniques ont été co-cultivés avec Agrobacterium tumefaciens EHA101, une ligne supervirulente pour la transformation du riz (Hiei et al. 1994; Yokoi et al. 1996) dans du milieu WPM contenant 50 mg/l d'acétosyringone et 5 mu M de 2-iP, pendant 30 minutes. Après lavage avec de l'eau stérile, les callus embryogéniques ont été transférés sur un milieu solide CM contenant 50 mg/l d'acétosyringone et maintenus dans l'obscurité pendant 4 jours. Il avait été trouvé que le traitement par l'acétosyringone est hautement efficace pour augmenter l'efficacité de la transformation (James et al. 1993).

Pour éliminer les bactéries restantes, les callus embryogéniques ont été transférés sur un milieu WPM contenant 300 mg/l de céfotaxime, 5 mg/l d'hygromycine et 5 mu M de 2-ip. Après 2 mois de culture, environ 90% de callus (267 parmi 298 callus) ont survécu sur un milieu WPM avec 5 mg/l hygromycine et 96 callus (36,0%) ont montré la présence de tâches bleues après l'immersion dans la solution de X-gluc, dues à la GUS (fig. 10). Ensuite, les callus survivants ont été transférés sur le même milieu contenant 50 mg/l d'hygromycine. Après 2 mois de culture, 81 (43,3%) des 187 callus qui ont survécu sur un milieu contenant 50 mg/l d'hygromycine avaient des points bleus après réaction avec le X-gluc (fig. 10).

Ces 187 callus ont été transférés sur un milieu WPM contenant 100 mg/l d'hygromycine et 131 callus (70,1%) ont continué a proliférer même après 2 mois d'incubation. Quand on a fait réagir les callus embryogéniques résistants à l'hygromycine avec le X-gluc, 90 callus (68,7%) ont présenté une réaction GUS positive forte (fig. 2, flèche, fig. 10). Par contre, les callus embryogéniques sans co-culture ne présentaient aucune activité GUS (fig. 2, tête de flèche).

Après la sélection des callus embryogéniques survivant en présence de 100 mg/l d'hygromycine, les callus embryogéniques ont été transférés sur un milieu WPM contenant 5 mu M de 2-iP. De nombreux embryons somatiques ont été formés à partir de callus présumés transgéniques après deux mois de culture (fig. 3). La réaction avec le X-gluc a montré que les embryons somatiques (fig. 4, flèche) formés à partir de callus embryogéniques résistant à l'hygromycine étaient positifs. Les embryons somatiques de callus embryogéniques non transformés (fig. 4, tête de flèche) étaient négatifs au colorant, sauf pour la réaction intrinsèque donnant une coloration bleu -pâle. En effet, Van Boxtel et al., 1995 avait trouvé qu'une activité intrinsèque du type GUS était observée dans des embryons somatiques mature et immature du caféier.

Production de plantules transgéniques

Les embryons somatiques germaient et généraient des plantules avec des pousses et des racines après transfert sur un milieu WPM dépourvu de régulateurs de croissance. Pour l'évaluation finale des plantules transgéniques, les plantules (1-2 cm de longueur) ont été transférées sur un milieu WPM contenant simultanément 100 mg/l d'hygromycine et 100 mg/l de kanamycine. Sur ce milieu, les plantules non transformées ne se sont pas développées du tout et ont bruni rapidement (fig. 5, tête de flèche), alors que les plantules transformées se développaient très bien (fig. 5, flèche). En particulier, les -racines se sont bien développées sans diminution de la croissance et sans brunissement. Quatre- vingt-sept pour-cent de plantules ont survécu sur ce milieu.

Après transfert sur un milieu sans régulateurs de croissance dans des boîtes de pétri (fig. 6) ou dans des flacons de culture de 300 ml, ces plantules se sont développées à environ 7 cm de hauteur avec environ 6-10 feuilles et elles ont formé des racines bien développées après 3-5 mois de culture. Les plantules transgéniques ont été transférées sur un mélange de terreau autoclavé, dans une serre. La plupart des plants ont survécu sans flétrir et sans perte de leur couleur verte (fig. 9).

Il s'est avéré que les feuilles (fig. 7, flèche) et les racines (fig. 8, flèche des plantules) présumées transgéniques présentaient une couleur bleu foncé produite par la réaction avec le X-gluc. Des explants de plantules non transformées (fig. 7-8, tête de flèche) ne réagissaient pas avec X-gluc. Alors que les feuilles des tissus des plantules transformées n'ont pas toujours été colorées par l'action du X-gluc, les racines ont toujours produit une réaction à la GUS fortement positive. En outre, les blessures chirurgicale des surfaces des feuilles ont augmenté l'intensité de la réaction positive (fig. 7) suggérant un effet de blocage du cuticule bien développé de la feuille de café. Analyse PCR du gène de la GUS et du gène de la HPT

L'extraction de l'ADN de feuilles de plantules de caféier ayant une activité GUS positive a été effectuée selon la méthode décrite par Kikuchi et al., 1998 en utilisant une procédure faisant appel au chlorure de benzyle, modifiée (addition de 3% de 2-mercaptoéthanol dans la solution 1) (coffret ISOPLANT, Wako Co.). Les amorces utilisées pour amplifier le gène de la GUS étaient 5'-AATTGATCAGCGTTGGTGG-3' et 5'-ACGCGTGGTTACAGTCTTGC-3' et celles utilisées pour le gène de la HTP étaient 5'-GCGTGACCTATTGCATCTCC-3' et 5'-TTCTACACAGCCATCG- GTCC-3'.

Le mélange réactionnel pour la PCR a été incubé dans un appareil de cyclage thermique de l'ADN (Perkin Elmer Cetus, 9700) dans les conditions suivantes: 96 DEG C pendant 5 minutes, puis 30 cycles à 94 DEG C pendant 30 secondes, 58 DEG C pendant 30 secondes et 72 DEG C pendant 2 minutes, avec une prolongation finale de 5 minutes à 72 DEG C.

L'examen par PCR des feuilles GUS positives de plantules transgéniques (T) a montré la présence de fragments amplifiés coïncidant avec le gène de la GUS (515 pb sur la fig. 11) et le gène de la HTP (713 pb sur la fig. 12). Dans les plantules non transformées (N), ni le gène de la GUS ni celui de l'HTP n'étaient détectables.

FORME D'EXECUTION 2: Production du transformant de Coffea arabica avec une résistance aux herbicides. Induction des callus embryogéniques

Des explants de feuilles de caféier (Coffea arabica) ont été préparés à partir de feuilles d'arbustes cultivés en serre, selon une méthode décrite précédemment (Hatanaka et al., 1991). Les explants de feuilles ont été cultivés sur un agar selon Murashige et Skoog (0,9%) (Murashige et Skoog, 1962) contenant les vitamines B 5 de Gamborg (Gamborg et al., 1968), 3% de saccharose et 10 mu M de N<6>-[2-isopentényl]-adénosine (2-iP). Le pH du milieu a été ajusté à pH 5,7 avant un autoclavage à 120 DEG C pendant 15 minutes. La chambre de culture a été maintenue à 25 DEG C avec un éclairage de 16 heures à 24 mu moles m<-><2>s<-1> (tubes fluorescents blancs). Transformation par Agrobacterium

Après sélection des callus embryogéniques, ces callus ont été sous-cultivés par des cycles successifs de 2 semaines sur du milieu MS complété par 0,9% d'agar de la vitamine B 5 , 3% de saccharose et 10 mu M 2-iP, afin d'induire des callus embryogéniques friables. On a utilisé pour la transformation la souche EHA 101 d'Agrobacterium tumefaciens portant pSMBuba renfermant le gène de la BAR et le gène de l'hygromycine phosphotransférase (HPT) dans la région ADN-T du plasmide.

Les callus embryogéniques fraîchement sous-cultivés (3 jours de culture) ont été co-cultivés avec une suspension bactérienne (absorbance de 0,6 à 600 nm) pendant 30 min à 25 DEG C dans du milieu liquide SM contenant 10 mu M 2-iP et 10 mg/l d'acétosyringone et ensuite, ces callus ont été transférés sur un agar préparé avec un milieu MS contenant 10 mg/l d'acétosyringone, 3% de saccharose et 10 mu M de 2-iP, à 25 DEG C, à l'obscurité et pendant quatre jours. Pour éliminer les bactéries, les callus ont été lavés 5 fois avec de l'eau stérile, et ceci a été suivi par un lavage avec de l'eau contenant 300 mg/l de céfotaxime.

Ensuite, les callus embryogéniques ont été cultivés sur un agar préparé avec un milieu MS contenant 300 mg/l de céfota-xime et 10 mu M 2-iP et sous-cultivés sur le même milieu à des intervalles de temps de deux semaines. Après 2 mois de culture, les callus embryogéniques ont été transférés sur du milieu MS frais contenant de l'hygromycine (25 mg/l) pendant une durée d'un mois. Ensuite, chaque lignée de callus embryogéniques a été entretenue par transfert sur un agar préparé fraîchement avec du milieu MS contenant 10 mu M de 2-iP et 50 mg/l d'hygromycine, pendant un cycle de culture de trois semaines. Embryogenèse somatique et génération de plants

Pour induire les embryons somatiques, les callus embryogéniques entretenus sur du milieu MS avec 10 mu M de 2-iP ont été transférés sur du milieu MS contenant 3 mu M de 2-iP. Les embryons somatiques se sont développés de manière spontanée à partir des callus embryogéniques. Après sélection des embryons somatiques, ceux-ci ont été cultivés sur un agar préparé avec du milieu 1/2 MS contenant 10 mu M de GA 3 , pour assurer leur germination. Après 3 semaines de culture, les plantules ont été transférées sur un agar préparé avec du milieu 1/2 MS, dans des flacons Erlenmeyer de 300 ml, pour assurer leur développement. Observation de la résistance au bialaphos

Les callus embryogéniques, les embryons somatiques et les plantules résistants à l'hygromycine, survivant sur un milieu contenant 50 mg/l d'hygromycine ont été transférés sur du milieu 1/2 MS contenant 2 mg/l de bialaphos. Après un mois de culture, on a déterminé le taux de survie. Analyse PCR du gène de la BAR et du gène de l'HPT

L'extraction de l'ADN de plantules de caféier résistant à l'hygromycine a été effectuée selon la méthode décrite par Kikuchi et col., 1998, en utilisant une procédure faisant appel à du chlorure de benzyle, mais modifiée (addition de 3% de 2-mercaptoéthanol dans la solution 1) (coffret ISOPLANT, Wako Co.). Les amorces pour amplifier le gène de la BAR étaient 5'-ATGAGCCCAGAACGACGCCCG-3' (direct) et 5'-GCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCC-3' (inverse) et celles pour amplifier le gène de l'HPT étaient 5'-GCGTGACCTATTGCATCTCC-3' (direct) et 5'-TTCTACACAGCCATCGGTCC-3' (inverse).

Le mélange réactionnel pour PCR a été incubé dans un appareil de cyclage thermique de l'ADN (Perkin Elmer Cetus, 9700) dans les conditions suivantes: 96 DEG C pendant 5 minutes, puis 30 cycles à 94 DEG C pendant 30 secondes, 58 DEG C pendant 30 secondes et 72 DEG C pendant 2 minutes avec une prolongation finale de 5 minutes à 72 DEG C. Transformation produite par Agrobacterium et embryogenèse somatique

Des callus embryogéniques jaunes (fig. 13) ont été obtenus à partir excision de bords d'explants de feuilles de caféier (Coffea arabica) après 4 mois de culture sur un agar préparé avec du milieu MS contenant 10 mu M 2-iP. Ces callus ont été sélectionnés et entretenus sur ce milieu par un cycle de sous-culture de 3 semaines (fig. 14). Les callus embryogéniques ont été co-cultivés avec Agrobacterium tumefaciens EHA 101 dans un milieu liquide MS contenant 10 mg/l d'acétosyringone et 10 mu M de 2-iP et transférés sur un milieu MS solide contenant 10 mg/l d'acétosyringone et 10 mu M de 2-iP à l'obscurité pendant 4 jours. Pour éliminer les bactéries restantes, les callus embryogéniques co-cultivés ont été transférés sur un milieu MS contenant 300 mg/l de céfotaxime et 10 mu M de 2-iP.

Après 2 mois de culture, ces callus ont été transférés sur le même milieu contenant 25 mg/l d'hygromycine. Après 2 mois de culture, les callus embryogéniques survivants ont été transférés sur un milieu MS contenant 50 mg/l d'hygromycine.

Après sélection des callus embryogéniques survivant en présence de 50 mg/l d'hygromycine (fig. 15) ces callus ont été transférés sur un agar réalisé avec un milieu MS contenant 2 mg/l de bialaphos. Dans 33% des callus embryogéniques, la prolifération et la couleur n'ont pas été influencées par le traitement par le bialaphos. Par contre, dans le cas des callus non transformés, la couleur des callus devenait rapidement brune et ces callus ne se sont pas maintenus au-delà de 2 semaines de culture.

Pour induire les embryons somatiques à partir de callus embryogéniques, les callus embryogéniques ont été transférés sur un milieu MS contenant 3 mu M de 2-iP. Une culture prolongée des callus embryogéniques a stimulé la formation d'embryons somatiques à partir de cellules embryogéniques. Un cycle de sous-culture supérieur à un mois a permis l'induction d'embryons somatiques à partir des callus. De nombreux embryons somatiques ont été formés à partir des callus présumés transgéniques après 2 mois de culture (fig. 16). Germination de plantules transgéniques

Quand des embryons somatiques ont été transférés sur un milieu 1/2 MS contenant 10 mu M de GA3, la fréquence des germinations était fortement augmentée. Tous les embryons (100%) sont devenus verts après 3 semaines de culture sur un milieu contenant du GA 3 (fig. 17). Par contre, après 3 semaines de culture sur un milieu exempt de GA 3 , seulement 37% des embryons somatiques étaient devenus verts et la vitesse de germination des embryons somatiques était très basse. Les embryons somatiques et les plantules ayant survécu à 50 mg/l d'hygromycine étaient également résistants à 2 mg/l de bialaphos. Quatre-vingt-trois pour-cent des embryons somatiques et 92% des plantules se sont développés normalement en présence de 2 mg/l de bialaphos sans changement de couleur ou de capacité de croissance (fig. 19).

Par contre, dans le cas des embryons somatiques et des plantules non transformés, la plupart avaient bruni ou étaient morts après un ou deux mois de culture (fig. 18). Les plantules ayant survécu ont été transférées sur un milieu 1/2 MS dans des flacons de culture de 300 ml, pour poursuivre la croissance (fig. 20).

L'examen des plantules transgéniques (T) par PCR génomique a mis en évidence des fragments amplifiés coïncidant avec le gène de la BAR (bande à 362 pb sur la fig. 21) et avec le gène de la HPT (bande à 713 pb sur la fig. 22). Dans le cas des plantules non transformées (N), ni le gène de la BAR, ni celui de la HPT n'étaient détectables (fig. 21, fig. 22). Références

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Claims

1. Procédé pour produire un plant de caféier transformé, le procédé comprenant les étapes consistant à: infecter un callus embryogénique d'un plant de caféier avec Agrobacterium comprenant un vecteur renfermant un gène exogène pour produire un callus embryogénique transformé, à former un embryon somatique à partir dudit callus embryogénique transformé et à générer un plant de caféier transformé à partir dudit embryon somatique.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'Agrobacterium appartient à l'espèce Agrobacterium tumefaciens.

3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel ledit plant de caféier est choisi dans le groupe constitué par Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea liberica et Coffea dewevrei.

4.

Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit gène exogène est choisi dans le groupe constitué par un gène de résistance à des herbicides, un gène de résistance à des insectes et un gène de résistance à une maladie.

5. Procédé selon la revendication 3, dans lequel ledit gène exogène est choisi dans le groupe constitué par un gène de résistance à des herbicides, un gène de résistance à des insectes et un gène de résistance à une maladie.

6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit gène exogène est choisi dans le groupe constitué par le gène de la phosphinothricine acétyle transférase, le gène de la caféine synthétase, un gène de Bacillus thuringiensis, le gène de la chitinase et le gène de la glucanase.

7.

Procédé selon la revendication 3, dans lequel ledit gène exogène est choisi dans le groupe constitué par le gène de la phosphinothricine acétyle transférase, le gène de la caféine synthétase, un gène de Bacillus thuringiensis, le gène de la chitinase et le gène de la glucanase.

8. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le procédé comprend, en outre, les étapes consistant à produire des explants de feuilles de plants de caféier et à induire ledit callus embryogénique à partir desdits explants de feuilles, avant l'infection.

9. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit callus embryogénique transformé est cultivé dans un milieu contenant N<6>-[2-isopentyl]-adénosine pour former ledit embryon somatique.

10.

Procédé selon la revendication 1, dans lequel le procédé comprend, en outre, une étape consistant à sélectionner ledit callus embryogénique transformé avant de former ledit embryon somatique.

11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel ledit vecteur contient, en outre, un gène disponible pour la sélection dudit callus embryogénique transformé.

12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel ledit vecteur est le vecteur binaire plG121-Hm, contenant le gène de la beta -glucuronidase, le gène de l'hygromycine phosphotransférase et le gène de la néomycine phosphotransférase II.

13. Procédé selon la revendication 11, dans lequel ledit vecteur est le vecteur binaire pSMBuba, contenant le gène de la phosphinothricine acétyle transférase et le gène de l'hygromycine phosphotransférase:

14.

Plant de caféier transgénique pouvant être produit par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.

15. Plant transgénique selon la revendication 14, dans lequel ledit plant de caféier est un plant de Coffea arabica.