JPH0998684A - ユーカリプタス・グロブラスのクローン増殖方法 - Google Patents
ユーカリプタス・グロブラスのクローン増殖方法Info
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- JPH0998684A JPH0998684A JP7282376A JP28237695A JPH0998684A JP H0998684 A JPH0998684 A JP H0998684A JP 7282376 A JP7282376 A JP 7282376A JP 28237695 A JP28237695 A JP 28237695A JP H0998684 A JPH0998684 A JP H0998684A
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- shoot
- plant
- primordia
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 優れた、かつ有用な形質を持った植物を、そ
の形質を変異させることなく大量増殖させることが可能
な苗条原基法を用いて、植物体を効率よくクローン増殖
法を可能にすることにある。 【解決手段】 ユーカリプタス・グロブラスの生長点を
含む茎頂部、胚軸、子葉、葉、茎、根及び葉柄からなる
群から選ばれた少なくとも１種類の外植体よりサイトカ
イニン類である１−フェニル−３−（１，２，３−チジ
アゾル−５−イル）尿素を添加した人工培地で苗条原基
を誘導し、該苗条原基を抗オーキシン剤を含む人工培地
にて苗条を再生させるクローン増殖方法。
の形質を変異させることなく大量増殖させることが可能
な苗条原基法を用いて、植物体を効率よくクローン増殖
法を可能にすることにある。 【解決手段】 ユーカリプタス・グロブラスの生長点を
含む茎頂部、胚軸、子葉、葉、茎、根及び葉柄からなる
群から選ばれた少なくとも１種類の外植体よりサイトカ
イニン類である１−フェニル−３−（１，２，３−チジ
アゾル−５−イル）尿素を添加した人工培地で苗条原基
を誘導し、該苗条原基を抗オーキシン剤を含む人工培地
にて苗条を再生させるクローン増殖方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ユーカリプタス・
グロブラスのクローン増殖方法に関し、さらに詳しく
は、早生樹種であり、優れたパルプ適性を示すユーカリ
プタス・グロブラス（以下Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓと略記
する場合がある）は最重要樹種であり、世界各国で注目
を浴びる南方植林事業対象木である。本発明は、その優
れた、かつ有用な形質を持った植物を、その形質を変異
させることなく大量増殖させることが可能な苗条原基法
を用いて、植物体を効率よくクローン増殖させる方法に
関し、植物バイオテクノロジーを育種や繁殖等の農学分
野に広く応用する際に重要な技術である。
グロブラスのクローン増殖方法に関し、さらに詳しく
は、早生樹種であり、優れたパルプ適性を示すユーカリ
プタス・グロブラス（以下Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓと略記
する場合がある）は最重要樹種であり、世界各国で注目
を浴びる南方植林事業対象木である。本発明は、その優
れた、かつ有用な形質を持った植物を、その形質を変異
させることなく大量増殖させることが可能な苗条原基法
を用いて、植物体を効率よくクローン増殖させる方法に
関し、植物バイオテクノロジーを育種や繁殖等の農学分
野に広く応用する際に重要な技術である。
【０００２】
【従来の技術】苗条原基集塊は、優れた、かつ有用な形
質を持った植物を、その形質を変異させることなく大量
増殖させることが可能な細胞集塊であり、田中隆荘等
（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．，５８：６５〜７０，１９
８３）がキク科の一年生植物であるハプロパップスにつ
いて、その生長点を含む茎頂部を摘出して一定の温度と
照度そして回転数の下で垂直方向に回転培養して得た細
胞集塊について名付けられたものである。苗条原基集塊
から植物体を再生させる場合には、その一部を切り出し
て苗化培地に移植して培養する。
質を持った植物を、その形質を変異させることなく大量
増殖させることが可能な細胞集塊であり、田中隆荘等
（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．，５８：６５〜７０，１９
８３）がキク科の一年生植物であるハプロパップスにつ
いて、その生長点を含む茎頂部を摘出して一定の温度と
照度そして回転数の下で垂直方向に回転培養して得た細
胞集塊について名付けられたものである。苗条原基集塊
から植物体を再生させる場合には、その一部を切り出し
て苗化培地に移植して培養する。
【０００３】田中等は、一年生植物であるハプロパップ
ス（特開昭５９−１３２８２２号公報）、有用一年生植
物（特開昭５９−１３２８２３号公報）ステビア（特開
昭６１−９６９９４号公報）の増殖法へ苗条原基の応用
を提供した。一方、本発明者等は苗条原基を用いる方法
が木本性植物のクローン増殖にも有効であることを見い
出した（特開昭６３−７７２０号公報）。さらに本発明
者らは、これら方法を改良して無菌的に生育させる木本
性植物の生長点を含む茎頂部を摘出し、植物ホルモンと
して１−（２−クロル−４−ピリジル）−３−フェニル
尿素（以下４ＰＵと略記）を用いることによって、より
安定的に苗条原基集塊を作出する方法を見い出した（特
開平２−２６５４１９号公報）。
ス（特開昭５９−１３２８２２号公報）、有用一年生植
物（特開昭５９−１３２８２３号公報）ステビア（特開
昭６１−９６９９４号公報）の増殖法へ苗条原基の応用
を提供した。一方、本発明者等は苗条原基を用いる方法
が木本性植物のクローン増殖にも有効であることを見い
出した（特開昭６３−７７２０号公報）。さらに本発明
者らは、これら方法を改良して無菌的に生育させる木本
性植物の生長点を含む茎頂部を摘出し、植物ホルモンと
して１−（２−クロル−４−ピリジル）−３−フェニル
尿素（以下４ＰＵと略記）を用いることによって、より
安定的に苗条原基集塊を作出する方法を見い出した（特
開平２−２６５４１９号公報）。
【０００４】また、本発明の共同研究者は木本性植物の
苗条原基を誘導する際の無菌苗の外植体は生長点を含む
茎頂部以外の栄養器官からも苗条原基を効率的に作出
し、遺伝的に優秀な木本性植物体を安定かつ大量に増殖
させることが可能なことも報告している（特開平５−２
３６８３２号公報）。しかしながら、Ｅ．ｇｌｏｂｕｌ
ｕｓにおいてはこれらの方法を用いても効率的に苗条原
基を作出することが難しく、また苗条原基を誘導する
際、外植体が傷害を受けるため黒変化が著しく、本発明
者等が現在まで経験してきた他種のユーカリとは、ホル
モンの要求性が異なることが判明した。Ｅ．ｇｌｏｂｕ
ｌｕｓの苗条原基誘導時の適正な植物ホルモンの組成、
濃度を、また該苗条原基からの苗条誘導を行う際の人工
培地を厳密に調整することによってクローン増殖が効率
的に行えると考えられた。
苗条原基を誘導する際の無菌苗の外植体は生長点を含む
茎頂部以外の栄養器官からも苗条原基を効率的に作出
し、遺伝的に優秀な木本性植物体を安定かつ大量に増殖
させることが可能なことも報告している（特開平５−２
３６８３２号公報）。しかしながら、Ｅ．ｇｌｏｂｕｌ
ｕｓにおいてはこれらの方法を用いても効率的に苗条原
基を作出することが難しく、また苗条原基を誘導する
際、外植体が傷害を受けるため黒変化が著しく、本発明
者等が現在まで経験してきた他種のユーカリとは、ホル
モンの要求性が異なることが判明した。Ｅ．ｇｌｏｂｕ
ｌｕｓの苗条原基誘導時の適正な植物ホルモンの組成、
濃度を、また該苗条原基からの苗条誘導を行う際の人工
培地を厳密に調整することによってクローン増殖が効率
的に行えると考えられた。
【０００５】このため、本発明者等はさらに安定的に
Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓから苗条原基を誘導し、苗条原基
からクローン増殖させる方法について鋭意研究した。植
物ホルモンのサイトカイニン類は不定芽の分化に働くと
知られており、その中でも１−フェニル−３−（１，
２，３−チジアゾル−５−イル）尿素（チジアズロン、
シグマ社製、以下ＴＤＺと略記）はそれ自身ではサイト
カイニンの活性を有すると同時に、内性的なサイトカイ
ニンの合成を促進するものであり、Ｖａｎ Ｎｉｅｕｗ
ｅｒｋらは、この物質がリンゴの茎頂培養におけるシュ
ートの増殖を促進させることを報告している（Ｈｏｒｔ
ｓｃｉｅｎｃｅ２１、５１６（1986））。
Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓから苗条原基を誘導し、苗条原基
からクローン増殖させる方法について鋭意研究した。植
物ホルモンのサイトカイニン類は不定芽の分化に働くと
知られており、その中でも１−フェニル−３−（１，
２，３−チジアゾル−５−イル）尿素（チジアズロン、
シグマ社製、以下ＴＤＺと略記）はそれ自身ではサイト
カイニンの活性を有すると同時に、内性的なサイトカイ
ニンの合成を促進するものであり、Ｖａｎ Ｎｉｅｕｗ
ｅｒｋらは、この物質がリンゴの茎頂培養におけるシュ
ートの増殖を促進させることを報告している（Ｈｏｒｔ
ｓｃｉｅｎｃｅ２１、５１６（1986））。
【０００６】またリンゴ（Ｆａｓｏｌｏ，Ｆ．，Ｚｉｍ
ｍｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．＆Ｆｏｒｄｈａｍ，Ｉ．：Ｐｌ
ａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ
Ｃｕｌｔｕｒｅ１６，７５（１９８９））、ナシ（Ｃ
ｈｅｖｅａｒ，Ｅ．，Ｓｋｉｒｖｉｎ，Ｒ．Ｍ．，Ａｂ
ｕ−Ｑａｏｕｄ，Ｈ．Ａ．，Ｋｏｒｄａｎ，Ｓ．Ｓ．＆
Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｇ：Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒ
ｅｐｏｒｔｓ７，６８８（１９８９））において葉片か
らの不定芽分化に効果があることも報告されている。
ｍｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．＆Ｆｏｒｄｈａｍ，Ｉ．：Ｐｌ
ａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ
Ｃｕｌｔｕｒｅ１６，７５（１９８９））、ナシ（Ｃ
ｈｅｖｅａｒ，Ｅ．，Ｓｋｉｒｖｉｎ，Ｒ．Ｍ．，Ａｂ
ｕ−Ｑａｏｕｄ，Ｈ．Ａ．，Ｋｏｒｄａｎ，Ｓ．Ｓ．＆
Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｇ：Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒ
ｅｐｏｒｔｓ７，６８８（１９８９））において葉片か
らの不定芽分化に効果があることも報告されている。
【０００７】最近では、すすき類の腋芽形成でＴＤＺと
ベンジルアデニン（ＢＡ）が相乗作用することを報告し
ている（Ｊｅａｎｅｔｔｅ Ｍｏｌｌｅｒ Ｎｉｅｌｓ
ｅｎ，Ｊｕｒｇｅｎ Ｈａｎｓｅｎ ＆ Ｋｉｒｅｔｅ
ｎ Ｂｒａｎ ｄｔ：Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ
ｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｌ４１，１
６５−１７０（１９９５））。また、ＴＤＺは木本性植
物のプロトプラストの培養の際にも効果があることが知
られている（特開平７−７５４５８号公報、特開平７−
９９８５５号公報）。
ベンジルアデニン（ＢＡ）が相乗作用することを報告し
ている（Ｊｅａｎｅｔｔｅ Ｍｏｌｌｅｒ Ｎｉｅｌｓ
ｅｎ，Ｊｕｒｇｅｎ Ｈａｎｓｅｎ ＆ Ｋｉｒｅｔｅ
ｎ Ｂｒａｎ ｄｔ：Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ
ｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｌ４１，１
６５−１７０（１９９５））。また、ＴＤＺは木本性植
物のプロトプラストの培養の際にも効果があることが知
られている（特開平７−７５４５８号公報、特開平７−
９９８５５号公報）。
【０００８】また、２，３，５−トリヨード安息香酸
（以下ＴＩＢＡと略記）は抗オーキシン剤のひとつとし
て知られており（倉石ら、１９７６ 植物ホルモン Ｐ
２３−２７ 東京大学出版会）、タロイモ（さといも
科）の植物体再生に効果があるとされている（Ｎｙｍａ
ｎ，Ｌ．Ｐ．ａｎｄ Ａｒｄｉｔｔｉ，Ｊ．：Ａｎｎａ
ｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ５４，４５９−４６６，（１
９８４））。本発明者らが既に報告した苗条原基法をも
とに上記の新しい知見を鋭意検討した結果、ＴＤＺを含
む培地で苗条原基を誘導し、該苗条原基を抗オーキシン
であるＴＩＢＡを用いた人工培地に移植して苗条を誘導
することにより、より安定的に苗条原基から植物体を再
生させることが可能になった。
（以下ＴＩＢＡと略記）は抗オーキシン剤のひとつとし
て知られており（倉石ら、１９７６ 植物ホルモン Ｐ
２３−２７ 東京大学出版会）、タロイモ（さといも
科）の植物体再生に効果があるとされている（Ｎｙｍａ
ｎ，Ｌ．Ｐ．ａｎｄ Ａｒｄｉｔｔｉ，Ｊ．：Ａｎｎａ
ｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ５４，４５９−４６６，（１
９８４））。本発明者らが既に報告した苗条原基法をも
とに上記の新しい知見を鋭意検討した結果、ＴＤＺを含
む培地で苗条原基を誘導し、該苗条原基を抗オーキシン
であるＴＩＢＡを用いた人工培地に移植して苗条を誘導
することにより、より安定的に苗条原基から植物体を再
生させることが可能になった。
【０００９】一方、特開平６−１３３６５７号公報にお
いてＥ．ｇｌｏｂｕｌｕｓの大量クローン増殖の例示が
されている。しかしながら本発明とは人工培地組成が全
く異なり、本発明者らのＥ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ苗条原基
誘導時のＴＤＺの使用、該苗条原基の苗化誘導時の抗オ
ーキシンの添加を用いて植物体を効率よく再生させると
いうことは本発明者に関わる新規な知見である。
いてＥ．ｇｌｏｂｕｌｕｓの大量クローン増殖の例示が
されている。しかしながら本発明とは人工培地組成が全
く異なり、本発明者らのＥ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ苗条原基
誘導時のＴＤＺの使用、該苗条原基の苗化誘導時の抗オ
ーキシンの添加を用いて植物体を効率よく再生させると
いうことは本発明者に関わる新規な知見である。
【００１０】即ち，本発明者らは、（１）Ｅ．ｇｌｏｂ
ｕｌｕｓ苗条原基誘導時にＴＤＺを添加した人工液体培
地中で苗条原基を効率的に得ることができること、
（２）該苗条原基から苗条を誘導する際、ＴＩＢＡを含
む人工培地で効率的に苗化させることができること、さ
らに（１）、（２）の方法を組み合わせて行うことによ
って多数のクローン植物体を得るという有効技術を見い
出した。
ｕｌｕｓ苗条原基誘導時にＴＤＺを添加した人工液体培
地中で苗条原基を効率的に得ることができること、
（２）該苗条原基から苗条を誘導する際、ＴＩＢＡを含
む人工培地で効率的に苗化させることができること、さ
らに（１）、（２）の方法を組み合わせて行うことによ
って多数のクローン植物体を得るという有効技術を見い
出した。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、組織培養に
よる効率的なクローン増殖が非常に困難であるとされて
きたＥ．ｇｌｏｂｕｌｕｓにおいて、ＴＤＺを含む人工
培地を用いて苗条原基を誘導し、該苗条原基から苗条を
再生させる際にＴＩＢＡを用いることにより効率的にク
ローン増殖を行う方法を提供することを目的とする。
よる効率的なクローン増殖が非常に困難であるとされて
きたＥ．ｇｌｏｂｕｌｕｓにおいて、ＴＤＺを含む人工
培地を用いて苗条原基を誘導し、該苗条原基から苗条を
再生させる際にＴＩＢＡを用いることにより効率的にク
ローン増殖を行う方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、ユーカリプタ
ス・グロブラスの生長点を含む茎頂部、胚軸、子葉、
葉、茎、根、葉柄などから選ばれた１種類の外植体を、
植物ホルモンとしてサイトカイニン類である１−フェニ
ル−３−（１，２，３−チジアゾル−５−イル）尿素を
含む人工培地を使用して光照射下、回転培養することに
よって苗条原基を誘導し、該苗条原基を抗オーキシン剤
を含む人工培地に移植し苗条を再生させることを特徴と
するユーカリプタス・グロブラスのクローン増殖方法に
関する。
ス・グロブラスの生長点を含む茎頂部、胚軸、子葉、
葉、茎、根、葉柄などから選ばれた１種類の外植体を、
植物ホルモンとしてサイトカイニン類である１−フェニ
ル−３−（１，２，３−チジアゾル−５−イル）尿素を
含む人工培地を使用して光照射下、回転培養することに
よって苗条原基を誘導し、該苗条原基を抗オーキシン剤
を含む人工培地に移植し苗条を再生させることを特徴と
するユーカリプタス・グロブラスのクローン増殖方法に
関する。
【００１３】また、本発明は、苗条原基を誘導する際に
少なくとも１種類のオーキシン類を含む培地を使用する
ことを特徴とする増殖方法に関する。さらに、本発明
は、抗オーキシン剤として２，３，５−トリヨード安息
香酸を用いることを特徴とする増殖方法に関する。すな
わち、本発明は、ユーカリプタス・グロブラスの生長点
を含む茎頂部、胚軸、子葉、葉、茎、根及び葉柄からな
る群から選ばれた１種類の外植体を、植物ホルモンとし
てオーキシン類であるインドール酪酸を０．０１〜５ｍ
ｇ／ｌの濃度で、かつサイトカイニン類として１−フェ
ニル−３−（１，２，３−チジアゾル−５−イル）尿素
を０．００１〜５ｍｇ／ｌの濃度で含む人工培地を使用
して光照射下、回転培養することによって苗条原基を誘
導し、該苗条原基を２，３，５−トリヨード安息香酸を
０．０１〜１０μＭの濃度で含む人工培地で苗化させる
ことを特徴とするクローン増殖方法に関する。
少なくとも１種類のオーキシン類を含む培地を使用する
ことを特徴とする増殖方法に関する。さらに、本発明
は、抗オーキシン剤として２，３，５−トリヨード安息
香酸を用いることを特徴とする増殖方法に関する。すな
わち、本発明は、ユーカリプタス・グロブラスの生長点
を含む茎頂部、胚軸、子葉、葉、茎、根及び葉柄からな
る群から選ばれた１種類の外植体を、植物ホルモンとし
てオーキシン類であるインドール酪酸を０．０１〜５ｍ
ｇ／ｌの濃度で、かつサイトカイニン類として１−フェ
ニル−３−（１，２，３−チジアゾル−５−イル）尿素
を０．００１〜５ｍｇ／ｌの濃度で含む人工培地を使用
して光照射下、回転培養することによって苗条原基を誘
導し、該苗条原基を２，３，５−トリヨード安息香酸を
０．０１〜１０μＭの濃度で含む人工培地で苗化させる
ことを特徴とするクローン増殖方法に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳しく説明
する。 本発明で用いるＥ．ｇｌｏｂｕｌｕｓの組織片の作出方
法 ユーカリプタス・グロブラスの植物体の各器官を通常の
殺菌方法で殺菌するか、または無菌的に養成した植物体
の各器官を無菌的に摘出したものを用いる。
する。 本発明で用いるＥ．ｇｌｏｂｕｌｕｓの組織片の作出方
法 ユーカリプタス・グロブラスの植物体の各器官を通常の
殺菌方法で殺菌するか、または無菌的に養成した植物体
の各器官を無菌的に摘出したものを用いる。
【００１５】苗条原基の誘導方法：無菌的になった外植
体を、基本培地として、例えばＷＰＭ（Ｌｏｙｄ ＆
ＭｃＣｏｗｎ Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏ
ｐ．Ｓｏｃ．３０：４２１−４２７（１９８０））、Ｂ
５（Ｇａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ
Ｒｅｓ．５０：１５１−１５８（１９６８））、ＭＳ
（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．Ｐｌａｎｔ １５：４７３−４９７（１９６２））
培地等に、植物ホルモンであるサイトカイニン類として
ＴＤＺ、４ＰＵ、ベンジルアデニン（ＢＡ）カイネチ
ン、ゼアチン等を、またオーキシン類としてナフタレン
酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
（２，４−Ｄ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）あるいはイ
ンドール酢酸（ＩＡＡ）等と、炭酸源を添加した液体培
地の中で竪型回転培養を行う。培養条件は１〜１０ｒｐ
ｍの回転速度、下辺が１，０００〜２，０００ルクス
で、上辺が１０，０００〜２０，０００ルクスの照度、
１５〜３０℃の温度とし、竪型回転培養をすることによ
り４０〜１２０日で苗条原基が得られる。
体を、基本培地として、例えばＷＰＭ（Ｌｏｙｄ ＆
ＭｃＣｏｗｎ Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏ
ｐ．Ｓｏｃ．３０：４２１−４２７（１９８０））、Ｂ
５（Ｇａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ
Ｒｅｓ．５０：１５１−１５８（１９６８））、ＭＳ
（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．Ｐｌａｎｔ １５：４７３−４９７（１９６２））
培地等に、植物ホルモンであるサイトカイニン類として
ＴＤＺ、４ＰＵ、ベンジルアデニン（ＢＡ）カイネチ
ン、ゼアチン等を、またオーキシン類としてナフタレン
酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
（２，４−Ｄ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）あるいはイ
ンドール酢酸（ＩＡＡ）等と、炭酸源を添加した液体培
地の中で竪型回転培養を行う。培養条件は１〜１０ｒｐ
ｍの回転速度、下辺が１，０００〜２，０００ルクス
で、上辺が１０，０００〜２０，０００ルクスの照度、
１５〜３０℃の温度とし、竪型回転培養をすることによ
り４０〜１２０日で苗条原基が得られる。
【００１６】苗化方法：回転培養して得られた苗条原基
を、苗化培地、例えば、Ｂ５培地、ＭＳ培地等に植物ホ
ルモン類として、例えばＢＡ、４ＰＵ、カイネチン、ゼ
アチン、ＴＤＺ等のサイトカイニン類とＴＩＢＡ、およ
び炭素源を添加した固体培地で培養する。１５〜３０℃
の温度、１，０００〜４，０００ルクスの照度、１２〜
１６時間の照明下で静置培養すると約６０日間後に不定
苗条が得られる。
を、苗化培地、例えば、Ｂ５培地、ＭＳ培地等に植物ホ
ルモン類として、例えばＢＡ、４ＰＵ、カイネチン、ゼ
アチン、ＴＤＺ等のサイトカイニン類とＴＩＢＡ、およ
び炭素源を添加した固体培地で培養する。１５〜３０℃
の温度、１，０００〜４，０００ルクスの照度、１２〜
１６時間の照明下で静置培養すると約６０日間後に不定
苗条が得られる。
【００１７】発根方法：苗化によって得られた不定苗条
を、発根培地、例えば、Ｂ５培地、ＭＳ培地等に植物ホ
ルモン類として、例えばＮＡＡ、２，４−Ｄ、ＩＢＡ、
ＩＡＡ等のオーキシン類とポリビニルピロリドン（ＰＶ
Ｐ）および炭素源を添加した固体培地で培養する。培養
は２０〜３０℃の温度、１，０００〜４，０００ルクス
の照度、１２〜１６時間の照明下で静置培養することに
より発根させ、通常の順化法で完全な植物体を得ること
ができる。 クローン同定法：再分化した植物個体からそれぞれ染色
体ＤＮＡを単離して、ランダムプライマーを用いたＰＣ
Ｒ反応により、クローン性の判定を行った。
を、発根培地、例えば、Ｂ５培地、ＭＳ培地等に植物ホ
ルモン類として、例えばＮＡＡ、２，４−Ｄ、ＩＢＡ、
ＩＡＡ等のオーキシン類とポリビニルピロリドン（ＰＶ
Ｐ）および炭素源を添加した固体培地で培養する。培養
は２０〜３０℃の温度、１，０００〜４，０００ルクス
の照度、１２〜１６時間の照明下で静置培養することに
より発根させ、通常の順化法で完全な植物体を得ること
ができる。 クローン同定法：再分化した植物個体からそれぞれ染色
体ＤＮＡを単離して、ランダムプライマーを用いたＰＣ
Ｒ反応により、クローン性の判定を行った。
【００１８】
【実施例】以下、実施例によって本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１ 供試植物の養成：Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓの無菌苗を作出
するために、まず成熟した種子を選んで７倍に希釈した
アンチホルミンで１時間殺菌し、７０％エタノールに２
分間、さらに５倍に希釈したアンチホルミンに２０分間
浸漬して殺菌後、滅菌水で３回洗浄した。これをＢ５培
地に、３％のショ糖および０．６％の寒天を含む無菌播
種用の培地に植え付けた。培養は２７℃の温度、４，０
００ルクスの照度、１６時間の明条件下で培養して無菌
苗とした。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１ 供試植物の養成：Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓの無菌苗を作出
するために、まず成熟した種子を選んで７倍に希釈した
アンチホルミンで１時間殺菌し、７０％エタノールに２
分間、さらに５倍に希釈したアンチホルミンに２０分間
浸漬して殺菌後、滅菌水で３回洗浄した。これをＢ５培
地に、３％のショ糖および０．６％の寒天を含む無菌播
種用の培地に植え付けた。培養は２７℃の温度、４，０
００ルクスの照度、１６時間の明条件下で培養して無菌
苗とした。
【００１９】苗条原基の作出方法：植え付けてから約２
週間後の実生苗を滅菌水に０．１％のＰＶＰを加えた液
体中で生長点を含む茎頂部を、ナイフとピンセットを用
いて無菌的に摘出し、これをＢ５の基本培地に３％のシ
ョ糖を加えて、植物ホルモンとして０．０１〜５ｍｇ／
ｌの濃度のＩＢＡと０．００１〜５ｍｇ／ｌの濃度のＴ
ＤＺを組み合わせ、さらに添加物として２ｍｇ／ｌのグ
リシンを加えてｐＨ５．６に調整した液体培地に植え付
けた。これを２８℃の温度で、下辺が２，０００ルクス
上辺が２０，０００ルクスの照度、そして２ｒｐｍの回
転数で竪型回転培養した。その結果、０．２ｍｇ／ｌの
ＩＢＡと０．５ｍｇ／ｌのＴＤＺを組み合わせた培地
で、竪型回転培養することによって、培養１２０日目で
苗条原基が形成された（図１）。
週間後の実生苗を滅菌水に０．１％のＰＶＰを加えた液
体中で生長点を含む茎頂部を、ナイフとピンセットを用
いて無菌的に摘出し、これをＢ５の基本培地に３％のシ
ョ糖を加えて、植物ホルモンとして０．０１〜５ｍｇ／
ｌの濃度のＩＢＡと０．００１〜５ｍｇ／ｌの濃度のＴ
ＤＺを組み合わせ、さらに添加物として２ｍｇ／ｌのグ
リシンを加えてｐＨ５．６に調整した液体培地に植え付
けた。これを２８℃の温度で、下辺が２，０００ルクス
上辺が２０，０００ルクスの照度、そして２ｒｐｍの回
転数で竪型回転培養した。その結果、０．２ｍｇ／ｌの
ＩＢＡと０．５ｍｇ／ｌのＴＤＺを組み合わせた培地
で、竪型回転培養することによって、培養１２０日目で
苗条原基が形成された（図１）。
【００２０】苗条原基の苗化発根法：回転培養して得ら
れた苗条原基をＢ５培地に植物ホルモンとしてサイトカ
イニンの１種類であるＢＡを０．０３〜１ｍｇ／ｌと、
添加物として０．０１〜１０μＭのＴＩＢＡ、さらにシ
ョ糖を３％と寒天０．６％を添加し、次いでｐＨ５．６
に調整した苗化培地に置床した。そして、２７℃の温
度、照度４，０００ルクスで１６時間の明条件下で培養
した。１ヶ月毎に新鮮な苗化培地に継代を行った。その
中でも０．３ｍｇ／ｌＢＡと０．１μＭのＴＩＢＡを添
加した培地に置床した苗条原基から、培養開始より６０
日目で葉原基様のものが出現し、さらに新鮮な苗化培地
へ継代すると、１２０日目には多数の苗条の再生が認め
られた（図２）。
れた苗条原基をＢ５培地に植物ホルモンとしてサイトカ
イニンの１種類であるＢＡを０．０３〜１ｍｇ／ｌと、
添加物として０．０１〜１０μＭのＴＩＢＡ、さらにシ
ョ糖を３％と寒天０．６％を添加し、次いでｐＨ５．６
に調整した苗化培地に置床した。そして、２７℃の温
度、照度４，０００ルクスで１６時間の明条件下で培養
した。１ヶ月毎に新鮮な苗化培地に継代を行った。その
中でも０．３ｍｇ／ｌＢＡと０．１μＭのＴＩＢＡを添
加した培地に置床した苗条原基から、培養開始より６０
日目で葉原基様のものが出現し、さらに新鮮な苗化培地
へ継代すると、１２０日目には多数の苗条の再生が認め
られた（図２）。
【００２１】次に得られた苗条を発根させるためにＢ５
培地に植物ホルモンとして０．１ｍｇ／ｌのＩＢＡ、添
加物として０．１％のＰＶＰ、３％のショ糖、さらに
０．６％の寒天を含み、ｐＨ５．６に調整した発根培地
に移植し、上記と同様の条件下で静置培養を行った。そ
の結果、３０日目には発根して通常の順化方法で完全な
植物体となった。
培地に植物ホルモンとして０．１ｍｇ／ｌのＩＢＡ、添
加物として０．１％のＰＶＰ、３％のショ糖、さらに
０．６％の寒天を含み、ｐＨ５．６に調整した発根培地
に移植し、上記と同様の条件下で静置培養を行った。そ
の結果、３０日目には発根して通常の順化方法で完全な
植物体となった。
【００２２】ＰＣＲ法を用いた再生植物体の確認：再生
された植物体についてクローンの確認を行った。Ｅｄｗ
ａｒｄｓらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１９：１３４９，１９９１）により植物体からの
染色体ＤＮＡの抽出を行った。次いでＷｉｌｌｉａｍｓ
らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
８：６５３１，１９９０））を用いてＰＣＲ反応を行
い、増幅されたＤＮＡ断片をポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により分離、確認した。なお、ＰＣＲプライマ
ーとして１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド６種を用い
た。これはブリティッシュコロンビア大学（カナダ）に
おいてＰＣＲプライマーとして公表されているものの一
部と同等である。ＰＣＲ反応後のバンドパターン解析の
結果、すべてのプライマーについて供試個体は同じバン
ドパターンを与えたことから、これらは全て同一クロー
ンであることが示された。
された植物体についてクローンの確認を行った。Ｅｄｗ
ａｒｄｓらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１９：１３４９，１９９１）により植物体からの
染色体ＤＮＡの抽出を行った。次いでＷｉｌｌｉａｍｓ
らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
８：６５３１，１９９０））を用いてＰＣＲ反応を行
い、増幅されたＤＮＡ断片をポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により分離、確認した。なお、ＰＣＲプライマ
ーとして１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド６種を用い
た。これはブリティッシュコロンビア大学（カナダ）に
おいてＰＣＲプライマーとして公表されているものの一
部と同等である。ＰＣＲ反応後のバンドパターン解析の
結果、すべてのプライマーについて供試個体は同じバン
ドパターンを与えたことから、これらは全て同一クロー
ンであることが示された。
【００２３】実施例２ 供試材料の無菌苗を作出するために実施例１記載の方法
と同様にして無菌苗を調整した。植え付けてから約２週
間後の実生苗の胚軸の外植体をナイフとピンセットを用
いて無菌的に摘出し、実施例１の方法に従って培養し
た。その結果、同様の過程で各外植体に由来する苗条原
基が作出され、そしてその得られた苗条原基より苗化し
通常の順化方法で完全な植物体となった。
と同様にして無菌苗を調整した。植え付けてから約２週
間後の実生苗の胚軸の外植体をナイフとピンセットを用
いて無菌的に摘出し、実施例１の方法に従って培養し
た。その結果、同様の過程で各外植体に由来する苗条原
基が作出され、そしてその得られた苗条原基より苗化し
通常の順化方法で完全な植物体となった。
【００２４】比較例１ Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓの無菌苗より摘出した茎頂点、ま
たは胚軸等の外植体をＢ５基本培地に表１に示す植物ホ
ルモンを含む苗条原基誘導培地を作製して、実施例１に
記載した方法で苗条原基誘導を行った。その結果、植物
ホルモンのサイトカイニンとしてキネチン、ＢＡを添加
した場合早生分枝を形成した。一方、ＴＤＺと４ＰＵを
使用した場合には緑色で表面は突起状の組織形態を持っ
た苗条原基が形成されたが、その組織集塊は培養を繰り
返すと枯死した。一方、ＴＤＺを使用した方がより良好
な苗条原基を形成した。次いでＴＤＺに対してのオーキ
シン類の検討を行った結果、ＩＡＡ添加区では外植体は
生長せずに褐変化してしまい、２，４−Ｄ添加区では外
植体は枯死に至る。ＮＡＡを添加した区では苗条原基様
の形態はとるが、誘導期間が長くなるに従って徐々に褐
変し苗条原基形成には至らなかった。苗条原基作出に及
ぼすホルモンの影響を表１に示す。
たは胚軸等の外植体をＢ５基本培地に表１に示す植物ホ
ルモンを含む苗条原基誘導培地を作製して、実施例１に
記載した方法で苗条原基誘導を行った。その結果、植物
ホルモンのサイトカイニンとしてキネチン、ＢＡを添加
した場合早生分枝を形成した。一方、ＴＤＺと４ＰＵを
使用した場合には緑色で表面は突起状の組織形態を持っ
た苗条原基が形成されたが、その組織集塊は培養を繰り
返すと枯死した。一方、ＴＤＺを使用した方がより良好
な苗条原基を形成した。次いでＴＤＺに対してのオーキ
シン類の検討を行った結果、ＩＡＡ添加区では外植体は
生長せずに褐変化してしまい、２，４−Ｄ添加区では外
植体は枯死に至る。ＮＡＡを添加した区では苗条原基様
の形態はとるが、誘導期間が長くなるに従って徐々に褐
変し苗条原基形成には至らなかった。苗条原基作出に及
ぼすホルモンの影響を表１に示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】比較例２ 実施例１、２で示したような方法で作出された苗条原基
から苗条を再生させる際に使用する培地として実施例１
に示した苗化培地からＴＩＢＡのみを除いた培地を使用
したところ、表２に示すように全く苗条は得られなかっ
た。表２中の記号は◎：苗化、○：カルス増殖盛ん→苗
化せず、△：カルス増殖→褐変、×：褐変を示す。
から苗条を再生させる際に使用する培地として実施例１
に示した苗化培地からＴＩＢＡのみを除いた培地を使用
したところ、表２に示すように全く苗条は得られなかっ
た。表２中の記号は◎：苗化、○：カルス増殖盛ん→苗
化せず、△：カルス増殖→褐変、×：褐変を示す。
【００２７】
【表２】
【００２８】
【発明の効果】組織培養が困難とされてきたＥ．ｇｌｏ
ｂｕｌｕｓの組織培養による植物体の再生を確立するこ
とは、優良クローン増殖、遺伝子導入を含めた細胞育種
などの応用技術を実現するためにも必要不可欠なもので
あった。本発明によって有用でかつ優れた遺伝子を持っ
た植物体をその形質を変異させることなく、効率よくし
かも安定的にクローンを増殖させることが可能になっ
た。すなわち、効率的なクローン増殖が困難であったこ
とが極めて多かったＥ．ｇｌｏｂｕｌｕｓにおいて、Ｔ
ＤＺを用いて苗条原基を誘導し、得られ苗条原基をＴＩ
ＢＡを添加した培地で培養することによって安定してク
ローン苗の作出し、生産をすることが可能になった。
ｂｕｌｕｓの組織培養による植物体の再生を確立するこ
とは、優良クローン増殖、遺伝子導入を含めた細胞育種
などの応用技術を実現するためにも必要不可欠なもので
あった。本発明によって有用でかつ優れた遺伝子を持っ
た植物体をその形質を変異させることなく、効率よくし
かも安定的にクローンを増殖させることが可能になっ
た。すなわち、効率的なクローン増殖が困難であったこ
とが極めて多かったＥ．ｇｌｏｂｕｌｕｓにおいて、Ｔ
ＤＺを用いて苗条原基を誘導し、得られ苗条原基をＴＩ
ＢＡを添加した培地で培養することによって安定してク
ローン苗の作出し、生産をすることが可能になった。
【図１】生物の形態の１つである、Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕ
ｓの無菌苗から摘出した組織片から０．５ｍｇ／ｌＴＤ
Ｚと０．２ｍｇ／ｌＩＢＡを組み合わせた人工培地を使
用して誘導した苗条原基を表す写真である。
ｓの無菌苗から摘出した組織片から０．５ｍｇ／ｌＴＤ
Ｚと０．２ｍｇ／ｌＩＢＡを組み合わせた人工培地を使
用して誘導した苗条原基を表す写真である。
【図２】生物の形態の１つである、図１の該苗条原基を
０．３ｍｇ／ｌＢＡと０．１μＭのＴＩＢＡを添加した
培地に置床し、培養開始より１２０日目で多数の苗条の
再生を示す写真である。
０．３ｍｇ／ｌＢＡと０．１μＭのＴＩＢＡを添加した
培地に置床し、培養開始より１２０日目で多数の苗条の
再生を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 伊藤 一弥 三重県亀山市能褒野町24−９ 新王子製紙 株式会社林木育種研究所亀山研究室内
Claims (4)
- 【請求項１】 ユーカリプタス・グロブラスの生長点を
含む茎頂部、胚軸、子葉、葉、茎、根及び葉柄からなる
群から選ばれた少なくとも１種類の外植体を、植物ホル
モンとしてサイトカイニン類である１−フェニル−３−
（１，２，３−チジアゾル−５−イル）尿素を含む人工
培地を使用して光照射下、回転培養することによって苗
条原基を誘導し、該苗条原基を抗オーキシン剤を含む人
工培地に移植し苗条を再生させることを特徴とするユー
カリプタス・グロブラスのクローン増殖方法。 - 【請求項２】 苗条原基を誘導する際に少なくとも１種
類のオーキシン類を含む培地を使用することを特徴とす
る請求項１に記載の増殖方法。 - 【請求項３】 抗オーキシン剤として２，３，５−トリ
ヨード安息香酸を用いることを特徴とする請求項１記載
の増殖方法。 - 【請求項４】 ユーカリプタス・グロブラスの生長点を
含む茎頂部、胚軸、子葉、葉、茎、根及び葉柄からなる
群から選ばれた少なくとも１種類の外植体を、植物ホル
モンとしてオーキシン類であるインドール酪酸を０．０
１〜５ｍｇ／ｌの濃度で、かつサイトカイニン類として
１−フェニル−３−（１，２，３−チジアゾル−５−イ
ル）尿素を０．００１〜５ｍｇ／ｌの濃度で含む人工培
地を使用して光照射下、回転培養することによって苗条
原基を誘導し、該苗条原基を２，３，５−トリヨード安
息香酸を０．０１〜１０μＭの濃度で含む人工培地で苗
化させることを特徴とする請求項１に記載の増殖方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28237695A JP3198895B2 (ja) | 1995-10-05 | 1995-10-05 | ユーカリプタス・グロブラスのクローン増殖方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28237695A JP3198895B2 (ja) | 1995-10-05 | 1995-10-05 | ユーカリプタス・グロブラスのクローン増殖方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0998684A true JPH0998684A (ja) | 1997-04-15 |
| JP3198895B2 JP3198895B2 (ja) | 2001-08-13 |
Family
ID=17651600
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28237695A Expired - Fee Related JP3198895B2 (ja) | 1995-10-05 | 1995-10-05 | ユーカリプタス・グロブラスのクローン増殖方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3198895B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1050209A2 (en) | 1999-05-07 | 2000-11-08 | Oji Paper Company Limited | Process for transformation of mature trees of eucalyptus plants |
| WO2001020972A1 (en) * | 1999-09-21 | 2001-03-29 | Woody Plant Biotech Aps | Method for maturation of conifer somatic embryos |
| US6897065B1 (en) | 1999-09-21 | 2005-05-24 | Woody Plant Biotech Aps | Method for maturation of conifer somatic embryos |
| KR101035036B1 (ko) * | 2011-01-28 | 2011-05-19 | 경상대학교산학협력단 | 억새 성숙종자로부터의 식물체 재분화 방법 |
| CN105660397A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-06-15 | 杭州市园林绿化股份有限公司 | 一种灯笼树组培苗高频再生快速繁殖方法 |
| CN116548307A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-08-08 | 青岛农业大学 | 一种基于叶片诱导的紫花苜蓿再生的方法及其培养基 |
-
1995
- 1995-10-05 JP JP28237695A patent/JP3198895B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1050209A2 (en) | 1999-05-07 | 2000-11-08 | Oji Paper Company Limited | Process for transformation of mature trees of eucalyptus plants |
| EP1050209A3 (en) * | 1999-05-07 | 2002-02-06 | Oji Paper Company Limited | Process for transformation of mature trees of eucalyptus plants |
| US6563024B1 (en) | 1999-05-07 | 2003-05-13 | Oji Paper Co., Ltd. | Process for transformation of mature trees of Eucalyptus plants |
| WO2001020972A1 (en) * | 1999-09-21 | 2001-03-29 | Woody Plant Biotech Aps | Method for maturation of conifer somatic embryos |
| US6897065B1 (en) | 1999-09-21 | 2005-05-24 | Woody Plant Biotech Aps | Method for maturation of conifer somatic embryos |
| KR101035036B1 (ko) * | 2011-01-28 | 2011-05-19 | 경상대학교산학협력단 | 억새 성숙종자로부터의 식물체 재분화 방법 |
| CN105660397A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-06-15 | 杭州市园林绿化股份有限公司 | 一种灯笼树组培苗高频再生快速繁殖方法 |
| CN116548307A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-08-08 | 青岛农业大学 | 一种基于叶片诱导的紫花苜蓿再生的方法及其培养基 |
| CN116548307B (zh) * | 2023-05-12 | 2024-01-26 | 青岛农业大学 | 一种基于叶片诱导的紫花苜蓿再生的方法及其培养基 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3198895B2 (ja) | 2001-08-13 |
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