CN107805642A - 一种多功能石墨烯基因载体的构建与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多功能石墨烯基因载体的构建方法,以小尺寸的本身具备荧光的石墨烯量子点为基本载体,通过功能化连接阳离子聚合物支链聚乙烯亚胺使其获得基因转染能力,同时由于其具备荧光能力可对未参与基因转染的阳离子聚合物部分进行示踪。本发明合成工艺简单,构建的多功能石墨烯基因载体毒性低,转染效率高,最高能达到80.57%,可同时实现基因转染与示踪,可应用到细胞生物学研究以及基因治疗领域中。
Description
技术领域
本发明属于无机化学及生物医学领域,涉及一种多功能石墨烯基因载体的构建与应用,具体涉及一种应用于基因转染和示踪的聚乙烯亚胺修饰的简单、高效、低毒的多功能石墨烯基因载体。
背景技术
石墨烯量子点作为纳米尺寸的石墨烯,不仅具备石墨烯本身的优良性质,同时由于边缘效应和小尺寸效应,可以表现出独特的光化学性质,并表现出低细胞毒性,优异的溶解性和良好的细胞相容性。此外,石墨烯量子点的边缘通常会含有羧基与羟基基团,可与生物分子作用结合。
基因转染技术是将纯化的外源DNA、RNA送入细胞内,并在细胞内表达的技术。基因转染载体分为两类,一类是非病毒载体,一类是病毒载体。病毒载体因为毒性大,靶向特异性差,制备工艺复杂应用受到限制;非病毒性载体其转染效果虽不及病毒性载体高,但其合成工艺简单,毒性低,应用范围广,受到人们广泛关注。
非病毒性载体,包括脂质体,阳离子聚合物,无机纳米载体。其中聚乙烯亚胺(PEI)作为一种可溶于水的阳离子聚合物受到人们广泛关注,PEI由单体(-CH2-CH2-NH-)构成,具有伯胺、仲胺、叔胺,并能在较宽的酸性条件下被质子化,使得PEI具有很强的与DNA结合能力,以及粘附细胞的能力。但是PEI本身具有大量阳离子基团会对细胞膜带来一定程度的损伤,使细胞产生溶血现象,因而具有一定的细胞毒性,在转染过程中不可避免得会伤害细胞。阳离子聚合物如聚乙烯亚胺体系,绝大多数聚合物分子处于游离状态,并不参与负载DNA,将这一部分游离态的阳离子聚合物负载到纳米粒子上时可降低其毒性(U.Lungwitz,et al.Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems [J].Eur J PharmBiopharm,2005,60(2):247-66.)。
因此,如何有效的将阳离子聚合物聚乙烯亚胺负载到纳米粒子上,降低PEI毒性的同时提高PEI类基因载体的转染效率,仍是当前基因转染试剂开发应用中的关键。
发明内容
本发明的目的是构建一种多功能石墨烯基因载体,以将石墨烯量子点作为基因载体,与阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)作用后,制备出一种低毒性、高效且具备示踪功能的多功能石墨烯基因载体。
实现上述目的的技术方案如下:
一种多功能石墨烯基因载体的构建方法,包括如下步骤:
将石墨烯量子点在水中超声分散,加入质量为石墨烯量子点的3-5倍、分子量为10000~25000的支链聚乙烯亚胺,超声分散均匀后加入质量为支链聚乙烯亚胺的50%-100%的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC),超声分散,室温下搅拌过夜,反应结束后过滤,透析,冻干,得到多功能石墨烯基因载体GQDs-PEI。
优选地,所述的支链聚乙烯亚胺与石墨烯量子点的质量比为3:1。
优选地,所述的支链聚乙烯亚胺的分子量为25000。
优选地,所述的透析过程中使用的透析袋的截留分子量为500D和1000D。
优选地,所述的超声时间为15~20min。
本发明在石墨烯量子点表面修饰PEI,降低了阳离子聚合物PEI的毒性,同时保留了其转染能力,制得的功能化石墨烯量子点毒性低,转染效率高,最高能达到80.57%,同时由于石墨烯量子点自身具备荧光性质可对转染过程进行进一步的呈现。
附图说明
图1为功能化石墨烯量子点的透射扫描电镜图。
图2为功能化石墨烯量子点的荧光测试图。
图3为实施例1(A)、实施例2(B)和实施例3(C)的功能化石墨烯基因载体在COS7细胞内对绿色荧光蛋白转染效果图。
图4为实施例1~6制备的功能化石墨烯基因载体MTT细胞毒性测试结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
对比例1:功能化石墨烯量子点用于基因转染:
(1)制备功能化石墨烯量子点
取1mg石墨烯量子点溶于水并超声5min,在溶液中加入1mg分子量为1200的支链PEI,超声10min,向溶液中加入0.5mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC),超声20min,室温搅拌过夜。用220nm的聚四氟乙烯滤膜进行过滤,所得溶液分别使用500D和1000D的透析袋进行透析,而后将溶液冻干即得到纯化的GQDs-PEI。
(2)细胞成像
消化COS7细胞,并将其接种于24孔板中,每孔300uL并于培养箱中(37℃、5%CO2)培养24h,取出细胞培养板,弃去各孔上清,并用PBS缓冲溶液洗涤细胞一次,然后向孔中加入完全培养液。其中对照组每孔300uL,实验组每孔270uL外加30uL的GQDs-PEI溶液(1mg/mL)在孵育箱中培养24h,移除培养液。用共聚焦显微镜观察,细胞内出现蓝色荧光。
(3)基因转染效率评价
将COS7细胞培养在24孔板中,使其细胞密度达到60%,每孔加入500uL的完全培养基。取1ug质粒加入每个小离心管,配制负载绿色荧光蛋白基因的功能化石墨烯量子点(10mg/mL)并分别加入2uL,4uL,6uL,12uL至上述离心管,加入100uL的PBS进行稀释,吹打均匀复合20min,每个离心管补充加入200uL不完全培养基,轻轻摇晃并将混合溶液加入至培养好的24孔板中。4h后换液,加入900uL的完全培养液,放于37℃的5%CO2孵育箱培养24h。用激光共聚焦显微镜观察蓝色部分为未表达绿色荧光蛋白的GQDs-PEI部分,同时观察绿色荧光蛋白表达量,使用流式细胞仪进行荧光检测绿色荧光蛋白的转染效果,最优转染效率为2.13%。
(4)细胞毒性评价
将COS7细胞按照每孔6000个细胞的密度接种在96孔板中,在37℃的5%CO2孵育箱培养24h,使用完全培养基配制10μg/mL的GQDs-PEI溶液与细胞共同培养。对照组为不加GQDs-PEI的细胞。孵育箱培养24h后,于每孔中加入20μL MTT溶液(5mg/mL),继续培养4h;然后去除旧培养基,在每孔中加入150μL DMSO(二甲基亚砜),振荡10min待沉淀物溶解后,使用Bio-Rad酶标仪在490nm波长下从测定各个孔的吸光值。细胞存活率为96.13%。
对比例2:功能化石墨烯量子点用于基因转染
制备功能化石墨烯量子点,除加入支链PEI量增加至3mg其他实施步骤与对比例1相同。结果证明该功能化石墨烯量子点具备示踪能力,且最优转染效率为3.36%,细胞存活率为94.87%。
对比例3:功能化石墨烯量子点用于基因转染
制备功能化石墨烯量子点,除加入支链PEI量增加至5mg其他实施步骤与对比例1相同。结果证明该功能化石墨烯量子点具备示踪能力,且最优转染效率为5.28%,细胞存活率为93.68%。
对比例4:功能化石墨烯量子点用于基因转染
制备功能化石墨烯量子点,除加入支链PEI改变为1800分子量的支链PEI其他实施步骤与对比例1相同。结果证明该功能化石墨烯量子点具备示踪能力,且最优转染效率为8.72%,细胞存活率为93.21%。
对比例5:功能化石墨烯量子点用于基因转染
制备功能化石墨烯量子点,除加入支链PEI量增加至3mg其他实施步骤与对比例4相同。结果证明该功能化石墨烯量子点具备示踪能力,且最优转染效率为15.25%,细胞存活率为92.12%。
对比例6:功能化石墨烯量子点用于基因转染
制备功能化石墨烯量子点,除加入支链PEI量增加至5mg其他实施步骤与对比例4相同。结果证明该功能化石墨烯量子点具备示踪能力,且最优转染效率为10.76%,细胞存活率为90.46%。
实施例1:功能化石墨烯量子点用于基因转染
制备功能化石墨烯量子点,除加入支链PEI改变为25000分子量的支链PEI其他实施步骤与对比例1相同。功能化石墨烯量子点的透射扫描电镜图像如图1,可看到功能化石墨烯量子点分散较均匀。并且功能化石墨烯量子点荧光测试图像如图2,证明功能化石墨烯量子点具备很好的荧光性能。使用流式细胞仪测定其最优转染效率为51.63%,其中转染图像用共聚焦显微镜观察结果如图3A-1,其中散列分布的点状部分为转染后细胞部分,肉眼观察可看到转染部分大约为细胞的50%左右。细胞亮场图像为3A-2,可看到cos7细胞轮廓清晰,且细胞分布较均匀。细胞毒性测试结果如图4,其中0为空白对照组。实例1的细胞存活率为91.65%,并且观察细胞毒性测试结果可看出随PEI分子量以及PEI用量的增加,细胞存活率有一定程度的降低,然而细胞存活率最低为87.85%,远高于单独使用PEI的实例7,这说明功能化石墨烯量子点的确降低了PEI的毒性。
实施例2:功能化石墨烯量子点用于基因转染
制备功能化石墨烯量子点,除加入支链PEI量增加至3mg其他实施步骤与实例1相同。使用流式细胞仪测定其最优转染效率为80.57%,其中转染图像用共聚焦显微镜观察结果如图3B-1,其中散列分布的点状部分为转染后细胞部分,肉眼观察可看到转染部分大约为细胞的80%左右。亮场图像为3B-2,可看到cos7细胞轮廓清晰,且细胞分布较均匀。细胞毒性测试结果如图4中实例2,细胞存活率为89.34%。
实施例3:功能化石墨烯量子点用于基因转染
制备功能化石墨烯量子点,除加入支链PEI量增加至5mg其他实施步骤与实例1相同。使用流式细胞仪测定其最优转染效率为74.13%,其中转染图像用共聚焦显微镜观察结果如图3C-1,其中散列分布的点状部分为转染后细胞部分,肉眼观察可看到转染部分大约为细胞的70%左右。亮场图像为3C-2,可看到cos7细胞轮廓清晰,且细胞分布较均匀。细胞毒性测试结果如图4中实例3,细胞存活率为87.85%。
实施例4:功能化石墨烯量子点用于基因转染
制备功能化石墨烯量子点,除加入支链PEI改变为10000分子量的支链PEI其他实施步骤与对比例1相同;使用流式细胞仪测定其最优转染效率为最优转染效率为39.16%,细胞毒性测试结果如图4中实例4,细胞存活率为92.09%。
实施例5:功能化石墨烯量子点用于基因转染
制备功能化石墨烯量子点,除加入支链PEI改变为10000分子量的支链PEI其他实施步骤与对比例2相同;使用流式细胞仪测定其最优转染效率为最优转染效率为73.82%,细胞毒性测试结果如图4中实例5,细胞存活率为90.34%。
实施例6:功能化石墨烯量子点用于基因转染
制备功能化石墨烯量子点,除加入支链PEI改变为10000分子量的支链PEI其他实施步骤与对比例3相同;使用流式细胞仪测定其最优转染效率为最优转染效率为69.27%,细胞毒性测试结果如图4中实例6,细胞存活率为89.68%。
实施例7:PEI用于基因转染
将功能化石墨烯量子点替换为分子量为25000的支链PEI,转染步骤与细胞成像步骤与对比例1相同。结果证明分子量为25000的支链PEI不具备示踪能力,最优转染效率为75.31%,细胞存活率为28.45%。细胞毒性测试结果如图4中实例7,细胞毒性测试结果如图4中实例7,细胞存活率为28.45%。
Claims (7)
1.一种多功能石墨烯基因载体的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
将石墨烯量子点在水中超声分散,加入质量为石墨烯量子点的3-5倍、分子量为10000~25000的支链聚乙烯亚胺,超声分散均匀后加入质量为支链聚乙烯亚胺的50%-100%的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺,超声分散,室温下搅拌过夜,反应结束后过滤,透析,冻干,得到多功能石墨烯基因载体GQDs-PEI。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述的支链聚乙烯亚胺与石墨烯量子点的质量比为3:1。
3.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述的支链聚乙烯亚胺的分子量为25000。
4.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述的透析过程中使用的透析袋的截留分子量为500D和1000D。
5.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述的超声时间为15~20min。
6.根据权利要求1至5任一所述的构建方法构建的多功能石墨烯基因载体。
7.根据权利要求6所述的多功能石墨烯基因载体在基因转染中的应用。
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GR01 | Patent grant | ||
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