CN104140981A - 一种高效、低毒的石墨烯多功能载体的构建及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域。利用石墨烯易于进行各种功能化的特点，将小尺寸氧化石墨烯进行合理的多功能化，构建了一种高效、低毒的石墨烯多功能载体，可同时实现基因转染、生物活性分子输送、蛋白质纯化三种功能中的任意两种或两种以上功能。同时本发明也提供了该石墨烯多功能载体的详细制备步骤。本发明的主要用途为基因转染、活性分子输送、蛋白纯化等蛋白质作用机制的研究，可用于疾病发病机理的研究、药物设计以及基因治疗等领域。
Description
技术领域：
本发明涉及一种高效、低毒的石墨烯多功能载体，集基因转染、生物活性分子输送和蛋白质纯化功能于一体，可一步完成蛋白质作用机制的研究工作，提高了蛋白质作用机制研究的效率和准确性。
背景技术：
石墨烯是由单层碳原子形成的二维平面型纳米材料，易于进行各种功能化，目前已经广泛应用于生物化学领域。已有的研究证实，石墨烯可分别成功应用于药物运载、基因转染、和蛋白质分离领域。
2008年，Hongjie Dai课题组报道了石墨烯用于小分子药物阿霉素(doxorubicin)的负载，体外细胞实验获得良好的抗肿瘤活性，他们利用超支化聚乙二醇(PEG)功能化的石墨烯细胞毒性非常小，说明石墨烯是一种良好的药物运载试剂。同年，陈永胜课题组报道了氧化石墨烯对阿霉素可实现超高的负载率(2.35mg mg-1)和可控释放。2009至2011年间，张智军和陈永胜课题组分别报道了对石墨烯进行多功能化，采用不同方法制备了多功能化石墨烯，用以负载药物并靶向肿瘤细胞，均取得良好效果。
2010年，刘遵峰在世界上首次提出将石墨烯应用于蛋白质纯化领域，可将蛋白质(或复合物)进行快速亲和性分离。由于石墨烯具有极好的电子透射性能，无需进行洗脱，可直接使用透射电镜进行单颗粒三维结构分析，从而使整个分离过程可快速完成。目前获得对人类细胞中的航海蛋白(Navigator)的分离纯度可达到90％。2011年刘庄报道了石墨烯可降低聚乙烯基亚胺(PEI)在基因转染过程中的毒性；张智军将石墨烯应用于DNA和siRNA中的转染，获得低毒性和良好的效率。
本专利发明人在多年从事石墨烯的性质和生物化学中的应用研究过程中，利用超小尺寸氧化石墨烯(<20nm)进行基因转染，获得高转染效率(90％)和相当低的毒性(<10％死亡率)，远远高于经典商业化试剂lipofectamin(～30％)，在生物组织(斑马鱼卵模型)中也显示出很好的性能。
通过上述背景资料可以看出，石墨烯在基因转染、生物活性分子输送、蛋白质纯化领域中均表现出优异的性能。所以发明人认为，通过对石墨烯进行合理多功能化，完全有可能将上述多种功能集石墨烯于一身。本发明即在以上技术背景之上，设计并制备发出集基因转染、 生物活性分子输送、和蛋白质纯化功能于一体的高效率、低毒性多功能载体，使蛋白质作用机制的研究可一步完成，提高了蛋白质作用机制研究的效率和准确性。
发明内容：
针对以上技术背景，提出本发明。
本发明的内容是提供一种研究蛋白质作用机制的高效率、低毒性的石墨烯多功能载体的构建和制备方式，克服现有蛋白质研究工作流程繁复、效率低下、准确性难以保证等不足，可同时完成基因转染、生物活性分子输送和蛋白质纯化的研究。
本发明涉及的石墨烯多功能载体示意图祥见说明书附图1。
本发明涉及的石墨烯多功能载体具有以下特性：
1.以超小尺寸氧化石墨烯(<20nm)为基本载体：超小尺寸氧化石墨烯(<20nm)尺寸小，利于在细胞内运动，并易于进行功能化，且毒性小；
2.聚乙烯基亚胺(PEI)提供基因负载和转染能力，并提供反应性大量官能团NH2；
3.多臂聚乙二醇增加载体的溶解性、生物相容性、延长载体活性成分在细胞内的酶降解半衰期、并减小毒性；
4.链酶亲和素可专一性识别生物素标记的目标蛋白质，提供纯化功能。使用功能性多肽(多肽1、2、3)利于载体跨越细胞内部屏障，提高转染效率；
5.牛血清蛋白可减少甚至消除非目标蛋白质的非专一性吸附，提高目标蛋白质纯度。
本发明涉及的多功能载体的构建、合成步骤如说明书附图2。详细说明如下：
1.首先使用鳞片石墨(纯度99.95％)，根据改进的Hummer’s法制备氧化石墨烯。然后超声分散于MilliQ水中，使用离心过滤膜(100Kd，Millipore)过滤，使用MilliQ水洗涤，得超小尺寸氧化石墨烯(尺寸小于20nm)。
2.将上述超小尺寸氧化石墨烯分散于MilliQ水中，加入超支化PEI(分子量：25KD)和6臂聚乙二醇(单臂分子量：2000KD)，加入N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐室温搅拌，使用离心过滤膜(100Kd，Millipore)过滤、MilliQ水洗涤，分散于MilliQ水中即完成PEI和6臂PEG的功能化，得载体1。
3.将上步骤得到的载体1加入生物素、N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，室温搅拌过夜，使用离心过滤膜过滤，再用MilliQ水洗涤三次，分散于MilliQ水 (中。即完成生物素的功能化，得载体2。
4.将上步骤得到的载体2加入4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)，溶解在DMSO中，室温下反应2h。之后使用离心过滤膜过滤，再用MilliQ水／DMSO混合液洗涤三次，分散于PBS缓冲液中，得活化的载体2。活化的载体2加入三羧乙基膦(TCEP)，搅拌、反应24h。使用离心过滤膜(100Kd，Millipore)过滤，再用PBS缓冲液洗涤三次，分散于PBS缓冲液中，即完成功能性多肽的功能化，得载体3。
5.将上步骤得到的载体3在2h内使用蠕动泵缓慢滴加到上述链酶亲和素与PBS缓冲溶液中，然后过夜混合。使用离心过滤膜(100Kd，Millipore)过滤，再用PBS缓冲液洗涤三次，分散于PBS缓冲液中，即完成链酶亲和素的功能化，得载体4。
6.将上步骤得到的载体4加入牛血清蛋白溶解于PBS缓冲液中，孵育1h，即完成牛血清蛋白在该多功能载体上的物理吸附，得到最终多功能载体。
附图说明：
图1.集基因转染、生物活性分子运载和蛋白质纯化功能于一体的多功能石墨烯载体的设计示意图
图2.集基因转染、生物活性分子运载和蛋白质纯化功能于一体的多功能石墨烯载体合成步骤示意图 。
Claims (9)
1.一种用于研究蛋白质作用机制的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是可同时实现基因转染、生物活性分子输送、蛋白质纯化三种功能中的任意两种或两种以上功能。
2.根据权利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是：以超小尺寸氧化石墨烯为基本载体，超小尺寸的氧化石墨烯尺寸需小于500nm。
3.根据权利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是：使用高分子或阳离子高分子提供基因负载和转染能力，并提供反应性大量官能团NH2。
4.根据权利要求3所述的阳离子高分子包含聚乙烯基亚胺(PEI)、聚酰胺-胺树形高分子(dendrimer)、脱乙酰壳多糖(chitosan)、阳离子聚磷酸酯、聚乙烯基吡啶盐、聚(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯。
5.根据权利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是：使用多臂聚乙二醇增加载体的溶解性、生物相容性、延长载体活性成分在细胞内的酶降解半衰期、并减小毒性。
6.根据权利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是：使用亲和性分离基团可专一性识别其标记的目标蛋白质，提供纯化功能。
7.根据权利要求6所述的亲和性分离基团包含链酶亲和素、6倍组氨酸(6XHis)、谷胱甘肽S-转移酶与谷胱甘肽。
8.根据权利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是：可使用牛血清蛋白或鸡血清蛋白减少或消除非目标蛋白质的非专一性吸附，提高目标蛋白质纯度。
9.根据权利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能载体的制备，包含以下步骤：
(1)制备权利要求2所述的超小尺寸氧化石墨烯：选取纯度99.95％以上的鳞片石墨，根据改进的Hummer’s法制备氧化石墨烯；然后超声分散于MilliQ水中，使用离心过滤膜过滤，MilliQ水洗涤，得到权利要求2所述的超小尺寸氧化石墨烯(尺寸小于500nm)；
(2)进行阳离子高分子的功能化：将步骤(1)制得的超小尺寸氧化石墨烯分散于MilliQ水中，加入超支化PEI、6臂聚乙二醇、N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌后使用离心过滤膜过滤、MilliQ水洗涤，得到载体1；
(3)进行生物素的功能化：将步骤(2)制得的载体1加入生物素、N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌过夜，使用离心过滤膜过滤，MilliQ水洗涤，得到载体2；
(4)进行功能性多肽的功能化：将步骤(3)制得的载体2加入4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)，溶解在DMSO中，室温下反应2h；之后使用离心过滤膜过滤，MilliQ水／DMSO混合液洗涤，分散于PBS缓冲液中；加入三羧乙基膦，搅拌反应24h；使用离心过滤膜过滤，PBS缓冲液洗涤，得到载体3；
(5)进行链酶亲和素的功能化：将步骤(4)制得的载体3在2h内使用蠕动泵缓慢滴加到上述链酶亲和素与PBS缓冲溶液中，混合；使用离心过滤膜过滤，PBS缓冲液洗涤，分散于PBS缓冲液中，得到载体4；
(6)将步骤(5)制得的载体4加入血清蛋白，溶解于PBS缓冲液中，孵育1h，即完成血清蛋白在该多功能载体上的物理吸附，得到最终的高效、低毒的石墨烯多功能载体。
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