CN104133066A - 可进行蛋白质即时定位的多功能载体 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米生物技术领域。基于碳纳米材料构建一种多功能载体，此载体可进入细胞、可俘获蛋白质，可进行荧光追踪、可进行细胞内蛋白质定位，大大提高了蛋白质作用机制研究的效率和准确性。该多功能载体在生物技术方面的应用将强有力的推动蛋白质功能与相互作用的研究，既有学术理论价值，又可产生巨大的经济效益和重大的社会意义。本发明的主要用途为蛋白质功能与作用机制的研究，可用于疾病发病机理的研究、药物设计以及基因治疗等领域。

Description

可进行蛋白质即时定位的多功能载体
技术领域：
本发明涉及一种基于碳纳米材料的多功能载体，此载体可进入细胞、可俘获蛋白质，可进行荧光追踪、可进行细胞内蛋白质定位，提高了蛋白质作用机制研究的效率和准确性。本发明属于纳米生物技术领域。
背景技术：
纳米生物技术是国际生物技术领域的前沿和热点问题，在医药卫生领域有着广泛的应用和明确的产业化前景。
蛋白质分子必须定位于细胞内部的特定位置来实现其所需的功能，因此蛋白质的亚细胞分布可调节并控制其活性。例如，多种蛋白质被合成出来之后必须定位到细胞质以外的其他地方以实现其功能，如细胞核、细胞膜、甚至细胞外的环境。这个过程是通过蛋白质上的定位信号序列完成的。即使在定位于细胞质中的蛋白质也是不均匀分布的，例如在细胞迁移和神经突触的生长过程中，特定蛋白质会聚集在生长／迁移的前端，用以保持细胞的极性。
目前，为研究蛋白质的功能及蛋白质之间的相互作用，人们通常通过基因修饰或沉默来改变其表达的蛋白质，用以研究其功能。通过在蛋白质上融合一个荧光标记，用以观察目标蛋白质。在当前的研究方法中，研究人员只能看到蛋白质的亚细胞分布，并不能自主控制蛋白质在细胞内部的即时定位。而蛋白质的细胞内分布与其功能紧密相连，不能有效控制蛋白质的即时定位，使我们不能研究原始环境下天然蛋白质的具体功能，这导致对细胞内很多作用过程只是模糊的了解，并不能进行深入的研究，甚至导致错误的结论。
因此，设计并开发出能够自主控制蛋白质在细胞内部的定位的研究工具与方法，是蛋白质功能与作用机制研究中的迫切需要。
发明内容：
针对以上技术背景，提出本发明。
要自主控制细胞内蛋白质的定位，应开发出满足如下要求的多功能载体：
(1)可进入细胞；
(2)可捕捉目标生物大分子；
(3)可对其进行荧光追踪；
(4)可对其位置进行磁场控制。
发明人在前期工作中发现，碳纳米材料在实验中表现出了极好的多功能化修饰能力，而且已经设计并开发出可分别实现上述四种功能的载体。在此基础上，本发明通过下面四种合理修饰，设计了集上述四种功能于一身的多功能载体，可实现对细胞内蛋白质的即时自主定位。
(1)修饰PEI引入正电荷，使其有效进入细胞；
(2)修饰链霉亲和素引入生物识别功能，可实现对生物素标记的目标生物大分子进行大量、专一性捕获；
(3)使用生物素标记的荧光分子进行追踪；
(4)使用生物素标记的超顺磁纳米球进行磁场控制。
本发明涉及的实现对细胞内蛋白质的即时自主定位的研究方案示意图见说明书附图1，具体表述如下：
①多功能载体的构建；
②表征载体的性质，以获得物理、化学特征；表征载体的功能，包括进入细胞能力的表征、蛋白质追踪能力的表征、蛋白俘获能力的表征、以及蛋白质定位能力的表征等；
③根据表征结果进行反馈、修正，最终获得可进入细胞、并进行俘获、追踪、定位蛋白质的的多功能载体。
使用多功能碳纳米材料控制细胞内蛋白质的即时定位示意图见说明书附图2，具体表述如下：
①进入细胞能力和追踪能力：先将带有红色荧光的多功能载体加入预先表达了生物素标记的绿色荧光蛋白的细胞。进入细胞效率通过使用荧光显微镜进行定性观测，取少量细胞采用流式细胞仪进行定量，并使用台盼蓝染色法定量测定其毒性。
②目标蛋白俘获与控制能力：载体进入细胞后，使用磁场控制多功能载体在细胞内的运动，通过荧光显微镜观察红色荧光(多功能载体)与绿色荧光(蛋白质)的运动，表征其俘获与控制蛋白质的能力。
③目标蛋白质俘获能力解析：裂解细胞，低速离心除去细胞膜等，高速离心分离载体，得目标蛋白质，并测定纯度，使用SDS PAGE电泳分析蛋白质纯度。
本发明涉及的可进入细胞，并进行俘获、追踪、定位蛋白质的多功能载体具有以下特性：
1.本发明所述的多功能载体，其特征为：以超小尺寸碳纳米材料为基本载体，该超小尺寸碳纳米材料包含但不仅限于碳纳米管、石墨烯；
2.本发明所述的超小尺寸碳纳米材料，其特征为：尺寸需小于500nm，小尺寸有利于载体在细胞内运动，并易于进行功能化；
3.本发明所述的多功能载体，其特征为：使用碳化二胺(EDC)偶联法修饰PEI引入阳离子，提供反应性大量官能团NH2，可使材料进入细胞；
4.本发明所述的多功能载体，其特征为：使用EDC偶联法修饰多臂聚乙二醇(PEG)；多臂聚乙二醇增加载体的溶解性、生物相容性、延长载体活性成分在细胞内的酶降解半衰期、并减小毒性；
5.本发明所述的多功能载体，其特征为：EDC偶连法修饰生物素，生物素识别连接链酶亲和素，链酶亲和素可专一性识别生物素标记的目标蛋白质，可俘获带有生物素的蛋白质分子；
6.本发明所述的多功能载体，其特征为：牛血清蛋白(BSA)吸附在载体表面，可减少甚至消除非目标蛋白质的非专一性吸附，避免其他蛋白质分子的非定向吸附；
7.本发明所述的多功能载体，其特征为：使用带有生物素标记的荧光分子进行追踪定位；
8.本发明所述的多功能载体，其特征为：使用带有生物素标记的超顺磁纳米球进行蛋白质定位。
本发明涉及的多功能载体的构建如说明书附图3。详细说明如下：
以碳纳米管为基本载体，进行合理修饰，引入如下功能：
①进入细胞功能：使用碳化二胺(EDC)偶联法修饰聚乙烯基亚胺(PEI)引入阳离子，可使材料进入细胞。
②溶解性和生物相容性：使用EDC偶联法修饰多臂聚乙二醇(PEG)。
③蛋白质俘获功能：EDC偶连法修饰生物素，生物素识别连接链酶亲和素，可俘获带有生物素的蛋白质分子。
④细胞内追踪功能：使用带有生物素标记的荧光分子进行追踪定位。
⑤蛋白质定位控制功能：使用带有生物素标记的超顺磁纳米球进行蛋白质定位。
⑥牛血清蛋白(BSA)吸附在载体表面，避免其他蛋白质分子的非定向吸附。
附图说明：
图1.可进行蛋白质即时定位的研究方案示意图。
图2.使用多功能碳纳米材料控制细胞内蛋白质的即时定位示意图。
图3.多功能载体合成步骤示意图。其中①为COOH-PEG-生物素，②为血清蛋白，③为链霉亲和素，④为生物素-超顺磁纳米材料，⑤为荧光分子-生物素
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，而本发明并不仅局限于该实施例。
1.首先使用鳞片石墨(纯度99.95％)，根据改进的Hummer’s法制备石墨烯。然后超声分散于MilliQ水中，使用离心过滤膜(100Kd，Millipore)过滤，使用MilliQ水洗涤，得超小尺寸石墨烯(尺寸小于100nm)。
2.将上述超小尺寸石墨烯分散于MilliQ水中，加入超支化PEI(分子量：25KD)和6臂聚乙二醇(单臂分子量：2000KD)，加入N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐室温搅拌，使用离心过滤膜(100Kd，Millipore)过滤、MilliQ水洗涤，分散于MilliQ水中即完成PEI和6臂PEG的功能化，得载体1。
3.将上步骤得到的载体1加入生物素标记的荧光分子、N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，室温搅拌过夜，使用离心过滤膜过滤，再用MilliQ水洗涤三次，分散于MilliQ水中。即完成生物素标记的荧光分子的功能化，得载体2。
4.将上步骤得到的载体3在2h内使用蠕动泵缓慢滴加到上述链酶亲和素与PBS缓冲溶液中，然后过夜混合。使用离心过滤膜(100Kd，Millipore)过滤，再用PBS缓冲液洗涤三次，分散于PBS缓冲液中，即完成链酶亲和素的功能化，得载体4。
5.将上步骤得到的载体4加入牛血清蛋白溶解于PBS缓冲液中，孵育1h，即完成牛血清蛋白在该多功能载体上的物理吸附，得到多功能化载体。
6.取表达了生物素标记的绿色荧光蛋白细胞，将细胞裂解得裂解液，低速离心除去细胞膜等，加入多功能载体，高速离心分离载体，得目标蛋白质，由此确定多功能载体具有从细胞裂解液中俘获蛋白质的能力。
7.使用生物素标记的超顺磁纳米球进行磁场控制：载体进入细胞后，使用磁场控制多功能载体在细胞内的运动，通过荧光显微镜观察红色荧光(多功能载体)与绿色荧光(蛋白质)的运动，表征其俘获与控制蛋白质的能力。

Claims (7)

1.一种可实现对细胞内蛋白质即时、自主定位的研究方案，其研究方法包含：一种可进入细胞，并进行俘获、追踪、定位蛋白质的多功能载体的构建；多功能载体的物理、化学性质表征；载体的功能表征，包括进入细胞能力的表征、蛋白质追踪能力的表征、蛋白俘获能力的表征、以及蛋白质定位能力的表征的表征；表征结果进行反馈、修正，最终获得可进入细胞、并进行俘获、追踪、定位蛋白质的的多功能载体。
2.基于权利项1所述的可进入细胞，并进行俘获、追踪、定位蛋白质的多功能载体，其特征是：可同时实现进入细胞、俘获目标蛋白质、追踪目标蛋白质、定位目标蛋白质四种功能中的任意两种或两种以上功能。
3.根据权利项2所述的多功能载体，其特征是：以超小尺寸碳纳米材料为基本载体，例如石墨烯、氧化石墨烯、碳纳米管；基本载体的尺寸需小于500nm；提供反应性官能团NH2；牛血清蛋白吸附在载体表面；修饰多臂聚乙二醇、生物素、链酶亲和素；实现目标蛋白质俘获的功能。
4.根据权利项2所述的多功能载体，其特征是：将荧光分子与生物素标记，将带有生物素标记的荧光分子连接到多功能载体上；使用带有生物素标记的荧光分子进行追踪。
5.根据权利项2所述的多功能载体，其特征是：将超顺磁纳米球与生物素标记，超顺磁纳米粒子(SPN)在磁场存在下产生磁性，无磁场是不产生磁性；将SPN连接到多功能纳米材料上，可提供磁场控制能力；使用带有生物素标记的超顺磁纳米球进行蛋白质定位。
6.根据权利项5所述的超顺磁纳米粒子，其特征是：在磁场存在下产生磁性，无磁场是不产生磁性的纳米粒子，尺寸小于50nm；包含但不仅限于纳米金、纳米铁、纳米四氧化三铁、纳米氧化铁。
7.根据权利要求2所述的多功能载体的制备，至少包含以下步骤：
(1)进入细胞功能：使用碳化二胺(EDC)偶联法修饰聚乙烯基亚胺(PEI)引入阳离子，可使材料进入细胞；
(2)溶解性和生物相容性：使用EDC偶联法修饰多臂聚乙二醇(PEG)；
(3)蛋白质俘获功能：EDC偶连法修饰生物素，生物素识别连接链酶亲和素，可俘获带有生物素的蛋白质分子；
(4)细胞内追踪功能：使用带有生物素标记的荧光分子进行追踪定位；
(5)蛋白质定位控制功能：使用带有生物素标记的超顺磁纳米球进行蛋白质定位；
(6)血清蛋白吸附在载体表面，减轻甚至消除其他蛋白质分子的非定向吸附。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112326955A (zh) * 2020-11-09 2021-02-05 华中农业大学 基于一水蓝铜矾的固定和偶联蛋白复合材料及其制备方法和应用
CN113960089A (zh) * 2020-07-20 2022-01-21 清华大学 一种多功能化石墨烯载网及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060008924A1 (en) * 2002-04-18 2006-01-12 The Regents Of The University Of Michigan Modulated physical and chemical sensors
WO2008081938A1 (ja) * 2006-12-28 2008-07-10 Japan Tobacco Inc. 耐熱性ビオチン結合性タンパク質の利用法、および当該タンパク質が結合した固体担体
CN103131728A (zh) * 2011-11-22 2013-06-05 刘遵峰 一种多功能化的石墨烯基因载体和基于该基因载体的基因转染试剂及其制备方法
CN104122399A (zh) * 2013-06-07 2014-10-29 常州碳宇纳米科技有限公司 一种同步、简化的蛋白质研究方法及所需多功能载体的构建
CN104140981A (zh) * 2013-12-20 2014-11-12 常州碳宇纳米科技有限公司 一种高效、低毒的石墨烯多功能载体的构建及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060008924A1 (en) * 2002-04-18 2006-01-12 The Regents Of The University Of Michigan Modulated physical and chemical sensors
WO2008081938A1 (ja) * 2006-12-28 2008-07-10 Japan Tobacco Inc. 耐熱性ビオチン結合性タンパク質の利用法、および当該タンパク質が結合した固体担体
CN103131728A (zh) * 2011-11-22 2013-06-05 刘遵峰 一种多功能化的石墨烯基因载体和基于该基因载体的基因转染试剂及其制备方法
CN104122399A (zh) * 2013-06-07 2014-10-29 常州碳宇纳米科技有限公司 一种同步、简化的蛋白质研究方法及所需多功能载体的构建
CN104140981A (zh) * 2013-12-20 2014-11-12 常州碳宇纳米科技有限公司 一种高效、低毒的石墨烯多功能载体的构建及其制备方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113960089A (zh) * 2020-07-20 2022-01-21 清华大学 一种多功能化石墨烯载网及其制备方法
CN112326955A (zh) * 2020-11-09 2021-02-05 华中农业大学 基于一水蓝铜矾的固定和偶联蛋白复合材料及其制备方法和应用
CN112326955B (zh) * 2020-11-09 2021-09-14 华中农业大学 基于一水蓝铜矾的固定和偶联蛋白复合材料及其制备方法和应用

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