CN102533864A - 获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，包括以下步骤：1)、植物抗性标记基因诱导剪切表达载体的构建；2)、外源基因序列DNA片段的制备；3)、DNA微弹载体悬液制备；4)、植物愈伤组织基因枪轰击转化；5)、抗性愈伤组织的筛选；6)、直接在抗性愈伤组织预分化或分化阶段进行重组酶诱导表达对标记基因相关序列进行剪切处理；7)、转基因植株的分子检测；8)、单拷贝目的基因表达框整合的转基因植株的获得和分子鉴定：对上述步骤挑选出的转基因植株，采用Southern杂交技术鉴定目的基因表达框整合的拷贝数，确定单拷贝整合的转基因植株。

Description

获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法

技术领域

发明涉及一种利用基因枪介导外源基因表达载体片段转化植物的方法，此方法获得的转基因植株除目的基因外不含多余垃圾DNA，而且外源目的基因为单拷贝整合，是一种植物转化技术。属于生物学领域，特别涉及到基因工程技术。

背景技术

自1983年第一例转基因植物诞生以来，植物基因导入技术日臻完善，形成了以基因枪和农杆菌两大转化技术为主体的植物基因转化系统。随着转基因农作物的商品化种植，转基因植物潜在的生态环境危害以及由之而来的遗传修饰食品对人类的食用安全性，已成为转基因农作物推广应用的重要障碍。

转基因植物中存在的抗性选择标记基因是导致转基因植物安全性问题的根源之一。转基因植物中的抗性选择标记基因在植物转化过程中用来区分转化和非转化细胞，赋予转化细胞对除草剂或抗生素抗性的抗性标记基因是植物转化中普遍使用也是最有效的筛选标记基因，对植物细胞转化处理后，通过在培养基中加入相应的除草剂或抗生素对细胞进行筛选来获得转化细胞。由于目前的基因导入技术只能将外源基因导入少数细胞中，所以在导入目的基因的同时必须引入抗性选择标记基因才能实现对植物细胞的有效转化。转基因植株再生后，这些抗性选择标记基因通常不再具有应用价值，但除草剂抗性基因可能通过基因漂移传递给近缘物种，产生恶性杂草，对生态环境造成危害；抗生素抗性基因可能通过基因漂移转移给土壤微生物或通过食物链转移至人类肠道微生物，使人对相应抗生素产生抗性，影响人类健康。因此如何在植物转化成功后田间释放前剔除抗性选择标记基因解决转基因植物安全性问题的必要程序。

目前通常将抗性标记基因与目的基因共转化，筛选获得转基因植株后再剔除标记基因是获得无选择标记基因的转基因植物的有效途径。已经建立的标记基因剔除系统主要包括四种：转座子介导目的基因再定位系统、共转化和遗传分离系统、重组酶介导标记基因剪切系统和依赖染色体内同源重组的标记基因切除系统(Sreekala C，Wu L，Gu Wang D，Tian DExcision of a selectable marker in transgenic rice(Oryza sativa L.)using a chemically regulated CRE/loxPsystem.Plant Cell Rep，2005，24：86-94)。其中基于P1噬菌体Cre/loxP系统发展的标记基因剪切系统应用最为广泛。1991年，Dale和Ow首次利用重组酶Cre可将位于两个同向排列的loxP位点之间的外源DNA序列选择性地切除这一特性，通过重组酶Cre基因二次转化获得完全剔除了筛选标记基因的转基因烟草植株(Dale EC，Ow DW(1991)Gene transfer with subsequentremoval ofthe selection gene from the host genome.Proc Natl Acad Sci USA 88：10558-10562)。近年来，利用Cre/loxP这一系统消除标记基因得到了快速发展。2000年，Zuo等建立了一种化学诱导植物基因表达系统XVE，雌激素诱导驱动Cre基因的表达，将雌激素诱导Cre基因表达系统和抗性标记基因同置于两个正向排列的LoxP位点之间，设计构建了雌激素诱导的标记基因诱导剪切系统，成功实现了转基因植物中抗性标记基因和为了切除抗性标记基因而引入的Cre基因表达序列(简称为抗性标记基因相关序列，resistant marker gene related sequences，缩写为RMGRS)的一次性可控删除(Zuo J，Niu QW，Chua NH.An estrogen receptor-basedtransactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants.Plant J，2000，24：265-273)。随后基于上述思路，研究者又发展了一些新型诱导表达型启动子如玉米乙酰苯胺类化合物瞬间诱导启动子(In5-2)(Yuan Y，Liu YJ，Wang T.ANew Cre/lox Systemfor Deletion of Selectable Marker Gene.Acta Botanica Sinica，2004，46(7)：862-866.)、热诱导启动子(Cuellar W，Gaudin A，Solorzano D，Casas A，Nopo L，Chudalayandi P，Medrano G，Kreuze J，Ghislain M.Self-excision of the antibiotic resistance gene nptII using a heat inducibleCre-loxP system from transgenic potato.Plant Mol Biol 2006，62：71-82)和地塞米松诱导启动子(李文旭，基于Cre/loxP系统诱导删除抗生素基因植物表达载体的构建，硕士学位论文，福建农林大学，2009，P16-17)等来诱导Cre基因表达以实现转基因植物中RMGRS的一次性可控删除。但上述研究技术存在的缺陷有两个：

(1)对RMGRS的剪切处理大多在转基因植株水平上，由于Cre基因表达重组酶只能切除同置于两个正向排列的LoxP位点之间序列，而转基因过程中外源基因的整合通常比较复杂，可能存在多拷贝整合以及或外源基因片段的截断和重组等，因此诱导剪切前需要对转基因植株进行Southern杂交分析，挑选出外源基因单拷贝整合的株系进行标记基因诱导剪切处理，而且需要对候选植株整株喷施一定量的雌激素，持续诱导很多天才能得到RMGRS成功切除的转基因株系，这不仅成本高，时间长，程序复杂，而且还有可能产生标记基因不完全切除的嵌合体。而传统的标记基因诱导剪切处理均在转基因植株水平上，诱导剪切前需要对转基因植株进行Southern杂交分析，挑选出外源基因单拷贝整合的株系进行标记基因诱导剪切处理，成本高，时间长，程序复杂，而且可能产生标记基因不完全切除的嵌合体。

(2)上述植物RMGRS诱导剪切系统均采用农杆菌介导转化法，无法消除转化质粒载体框架DNA序列的污染。已有大量研究证据表明，在农杆菌介导转化的转基因植株中载体框架序列的整合现象普遍存在。

质粒载体框架序列不可避免地含有允许基因构建体在大肠杆菌中或农杆菌中克隆的抗生素抗性选择标记和复制起点，具有向外界环境中逃逸的潜在危险性(Fu Xiangdong，etal.Linear transgene constructs lacking vector backbone sequences generatelow-copy-number transgenic plants with simple integration patterns.TransgenicResearch，2000，9：11-19)，是目前公认的导致转基因植物安全性问题的根源之二。基因枪法可将去除质粒载体框架序列的外源基因表达框(仅包括启动子、基因开放阅读框、终止子)导入植物基因组，从根本上消除质粒载体框架序列的不利影响，实现洁净DNA转化(clean DNA transformation)，目前国内外已有少数研究者利用洁净DNA转化技术获得了水稻、马铃薯、葡萄藤、小麦、玉米等转基因植株(Altpeter F et al.Particlebombardment and the genetic enhancement of crops：myths and real ities.Mol.Breeding.2005，15：305-327)，并研究共转化和遗法分离策略获得无选择标记的转基因植株，这种方法是利用基因枪介导法将抗性标记基因表达框和目的基因表达框共转化受体植物，筛选获得转基因植株后利用抗性标记基因和目的基因表达框在基因组不同位点整合的特点，在T1代得以遗传分离后，借助PCR分子检测等手段从后代植株中选择得到无抗性标记基因而只有目的基因表达框整合的转基因植株(Zhao Y，et al.Co-transformationof gene expression cassettes via particle bombardment to generate safe transgenicplant without any unwanted DNA.In Vitro Cellular and Developmen tal Biology-Plant，2007，43(4)：328-334；Shiva Prakash N et al.Marker-free transgenic corn plantproduction trough co-bombardment.Plant Cell Reports，2009，28：1665-1668)。这种技术的缺陷是：(1)获得无抗性标记基因的转基因植株的频率很低。植株转化中使用抗性标记基因提供的筛选来获得目的基因成功导入，这是依据抗性标记基因和目的基因在受体基因组中的共整合来实现，但遗传分离策略得到无抗性标记基因而只有目标基因整合的转基因植株的前提是：抗性标记基因和目标基因必须整合在基因组的不同位点才能在后代发生遗传分离。由于这种技术上的矛盾，虽然能获得单纯目的基因表达框整合的安全转基因植株，但频率很低。(2)外源目的基因的多拷贝整合。基因枪介导的外源基因转化通常导致基因多拷贝整合，多拷贝整合遗传不稳定，容易发生转基因沉默(Altpeter F et al.Particle bombardment and the genetic enhancement of crops：myths and realities.Mol.Breeding.2005，15：305-327)，虽然洁净DNA转化能增加转基因低拷贝整合的频率但单拷贝转基因植株的获得较难。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基因枪介导洁净DNA转化联合标记基因相关序列(RMGRS)诱导剪切技术获得只含单拷贝目标基因表达框而不含其它多余DNA序列的安全转基因植株的方法。该方法的特点是：(1)采用基因枪法将不含载体主干序列的标记基因诱导剪切相关序列和目的基因表达框片段转化植物细胞，消除质粒载体主干序列在转基因植株基因组内的整合；(2)根据抗性标记基因筛选获得转化细胞后，在抗性愈伤组织水平上诱导重组酶基因表达从而将RMGRS删除，使得转基因植株中RMGRS的剪切删除简单、快速、低成本而且避免转基因嵌合体产生；(3)获得的转基因植株中目标基因表达框多数为单拷贝整合，遗传稳定性好。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，具体实施包括如下步骤：

1)、植物抗性标记基因诱导剪切表达载体的构建：按照基因构建的常规分子生物学方法构建植物抗性标记基因诱导剪切表达载体质粒，其中用做基因枪轰击的外源基因片段序列结构如下：

并且特别注意在该外源基因片段序列两侧各设置相应的限制性酶切位点A和B，以便把该片段从质粒载体上切割下来；

2)、外源基因序列DNA片段的制备：采用合适的限制性内切酶将上述步骤1)构建好的外源基因片段序列片段从质粒载体上切割下来，通过凝胶电泳分离割胶回收，作为基因枪轰击植物细胞的外源DNA；

一般而言：外源DNA浓度要求回收得到DNA片段溶解在无菌纯水中，浓度调整为150～250ng/μl(较佳为200ng/μl)。

3)、DNA微弹载体悬液制备：

DNA微弹制备所需的外源DNA用量，浓度和制备方法按按基因枪转化植物时的常规方法进行；

一般而言：

本发明使用Biolistic PDS 1000/He基因枪装置(BioRad)作为转化工具。DNA微弹载体制备方法：取600mg金粉(Φ1.0μm)/ml的金粉悬液30-50μl，加2.5mol/L的CaCl₂溶液50μL和0.1mol/L亚精胺20μL，轻微震荡混匀，加上述步骤2)制备的200ng/μLDNA溶液10μL，斡旋振荡3min，10000r/min离心10min，弃上清，让DNA沉淀到金粉颗粒表面得DNA微弹沉淀，加无水乙醇250μl洗涤沉淀，斡旋振荡震荡后10000r/min离心3min，弃上清，重复上述无水乙醇洗涤一次，加无水乙醇80μl，此为DNA微弹载体悬液。轰击植物愈伤组织细胞时，每枪需要DNA微弹载体悬液10μl，上述DNA微弹载体悬液可以轰击6枪，由于乙醇易挥发，故上述步骤定溶为80μl体积。

4)、植物愈伤组织轰击转化：

一般而言：按常规方法诱导培养的植株胚性愈伤组织轰击前在高渗培养基上放置暗培养4-5h，接着进行基因枪轰击，每培养皿的愈伤组织轰击2枪，BioRad PDS 1000/He基因枪轰击参数按文献资料。轰击后的愈伤组织静置暗培养16-20h以便使轰击细胞恢复。

5)、抗性愈伤组织的筛选：

一般而言：依据抗性标记基因的类型采用相应的筛选剂按常规方法对转化愈伤组织进行筛选，筛选两轮后获得抗性愈伤组织。

6)、直接在抗性愈伤组织预分化或分化阶段进行重组酶诱导表达对RMGRS进行剪切处理：比如根据诱导启动子表达所需在预分化或分化培养基中添加合适浓度的诱导剂，并且预分化或分化培养基中不再添加筛选剂，如此不需要额外增加细胞培养流程，就能将介于

和

之间的RMGRS切除。分化获得再生植株。

7)、转基因植株的分子检测：

按上述转化步骤获得的再生植株，利用常规的PCR技术对目标基因表达框、抗性标记基因、重组酶基因序列分别设计合适引物对，对转基因植株进行PCR分子检测，挑选出目标基因表达框PCR(+)、抗性标记基因PCR(-)、重组酶基因PCR(-)的转基因植株，这些为RMGRS被成功切除的单纯目的基因表达框整合的转基因植株。

8)、单拷贝目的基因表达框整合的转基因植株的获得和分子鉴定：对上述步骤7)挑选出目标基因表达框PCR(+)、抗性标记基因PCR(-)、重组酶基因PCR(-)的转基因植株，采用常规的Southern杂交技术鉴定目的基因表达框整合的拷贝数，确定单拷贝整合的转基因植株。

作为本发明的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法的改进：步骤1)载体构建时确保所需外源基因片段序列两侧各设置相应的限制性酶切位点A和B，以便把该片段从质粒载体上切割下来，限制性酶切位点A和B包括根据载体构建所需的所有合适可用的限制性酶切位点。

作为本发明的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法的进一步改进：步骤1)载体构建时将包括抗性标记基因及其重组酶诱导剪切系统在内的所有DNA元件置于

和

之间，并与目的基因表达框相邻接，确保转化时外源DNA片段组成的有效性和完整性，所述和包括所有构建时使用的所有重组酶的相应酶切位点。

作为本发明的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法的进一步改进：步骤4)中的基因枪为Biolistic PDS 1000/He基因枪。

作为本发明的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法的进一步改进：步骤6)中的直接在抗性愈伤组织预分化或分化阶段进行重组酶诱导表达对标记基因相关序列进行剪切处理，其中包括根据诱导启动子表达所需在预分化或分化培养基中添加合适浓度的诱导剂，但不限于在培养基中添加诱导剂这一种处理，也适合于重组酶诱导表达所需的其他相应处理，并且预分化和/或分化培养基中不再添加筛选剂，获得再生植株。

作为本发明的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法的进一步改进：步骤8)的所获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植转基因植株的挑选为：将步骤7)所得的再生植株，直接在分子水平上验证。

作为本发明的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法的进一步改进：植物为水稻，但不限于水稻，也适用于采用该方法获得的其他转基因植物。

本发明的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法的发明点之一是：采用基因枪法介导洁净DNA转化法代替农杆菌介导转化法，而前人研究采用的标记基因诱导剪切技术均是以农杆菌介导法转化植物的，不能避免质粒载体主干序列的污染。本发明将不含载体主干序列的标记基因诱导剪切相关序列和目的基因表达框片段转化植物细胞，消除质粒载体主干序列在转基因植株基因组内的整合。

本发明的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法的发明点之二是：根据抗性标记基因筛选获得转化细胞后，在抗性愈伤组织水平的预分化和分化培养基中直接添加诱导剂诱导重组酶基因表达从而将RMGRS删除，不需要增加额外的培养步骤，使得转基因植株中RMGRS的剪切删除简单、快速、低成本而且避免转基因嵌合体产生。尽管有1例报道(Sreekala C，Wu L，Gu Wang D，Tian D.Excision of a selectable marker intransgenic rice(Oryza sativa L.)using a chemically regulated CRE/loxP system.Plant Cell Rep，2005，24：86-94.)在抗性愈伤水平上对转基因水稻中标记基因序列进行诱导剪切，但该研究的缺陷是：在筛选获得抗性愈伤组织后需要额外增加诱导剪切处理培养步骤，对愈伤组织培养周期增加了2周。本发明人前期研究证实不需要增加额外培养步骤在抗性细胞水平上成功切除水稻转化细胞中的标记基因序列(赵艳，张晓丽，郭龙彪，钱前。应用Cre/loxP系统在细胞水平上高效删除转基因水稻中的标记基因。中国水稻科学，2011，25(6)：580-586)。但上述研究缺陷是均采用了农杆菌转化法，无法消除质粒载体主干序列对转基因植物的污染。

本发明的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法的发明点之三是：获得的转基因植株中目标基因表达框为单拷贝整合，遗传稳定性好，而且获得单纯目的基因表达框整合之安全转基因植物的频率高。本发明对转化获得的抗性愈伤在细胞水平上进行RMGRS诱导剪切处理，并且在处理时期和剪切后的培养基中，均不再添加抗性筛选剂，在无筛选压力情况下，非常有利于转基因单拷贝/低拷贝整合的转化细胞获得良好的生长和分化。由于载体中重组酶基因如Cre的表达的重组酶只能将位于两个同向排列的loxP位点之间的DNA序列切除(Zuo J，Niu Q W，Chua N H.An estrogen receptor-basedtransactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants.Plant J，2000，24：265-273)，因此无筛选剂分化再生的T₀代转基因水稻植株中T-DNA单拷贝整合的频率显著增加，这非常有利于标记基因和RMGRS的有效切除。反之，T₀代转基因水稻植株中RMGRS被成功剪切的那部分植株中，目的基因表达框绝大多数为单拷贝整合，克服基因枪介导转化法获得转基因植株多数为目的基因多拷贝整合的缺陷。

本发明的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法的发明点之四是：由于本发明巧妙利用了剪切效率高的标记基因诱导剪切系统，将目的基因表达框和抗性标记基因及其诱导剪切元件构建在一起，基因枪介导转化时使二者共整合入受体细胞，不存在抗性标记基因和目标基因必须整合在基因组的不同位点以便在后代发生遗传分离的技术矛盾，因此筛选获得转基因细胞的频率增加，又因为在细胞水平上进行RMGRS诱导剪切处理，增加了转基因单拷贝/低拷贝整合的转化细胞获得良好的生长和分化的频率从而提高了总的转化频率，使获得无抗性标记基因的转基因植株的频率显著增加。

本发明的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法所获得的转基因植株除含有目的基因表达框外无其他多余垃圾DNA。利用本发明技术进行植物转基因，能够从根本上解决选择标记基因和质粒载体框架DNA序列等多余DNA序列对转基因植物及转基因食品的影响，获得除目的基因表达框无其他多余DNA的转基因植株，而且目的基因表达框整合多数为单拷贝。本发明对所转化的外源基因没有特殊限制和要求，适用于所有基因枪法可转化的植物受体材料。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是载体质粒pNCG中Fgus-cre-nptII片段结构示意图；

CaMV35S：花椰菜花叶病毒35S启动子(对应

)；GUS：β-半乳糖醛酸苷酶A基因编码区(对应)；NOS：胭脂碱合酶终止子(对应)；loxP：重组酶Cre的34bp loxP特异识别位点(图中的2个loxP分别对应

和

)；Lex-35S：lexA DNA结合位点融合到CaMV35S小启动子-46处(对应

)；Cre：大肠杆菌P1重组酶Cre基因(对应)；

XVE：包含雌二醇受体调节区的嵌合转录激活子基因，是雌激素作用于诱导表达启动子的媒介；npt II：新霉素磷酸转移酶II基因编码区(对应

)。AscI、PacI：限制性内切酶名称，箭头所指为酶切位点，分别对应限制性酶切位点A和限制性酶切位点B。

图2是水稻愈伤转化及植株再生示意图；

A：成熟胚诱导愈伤；B：继代培养中的愈伤；C：高渗培养中的愈伤；D：筛选培养中的愈伤；E：预分化中的愈伤；F：分化培养中得愈伤；G：生根培养中的愈伤；H：转基因苗移入温室培养。

图3是部分T₀代水稻再生植株PCR检测结果图；

M：DNA分子量Marker；P：质粒阳性对照；1-23为转基因再生植株，图中编号为6、7、10、11、22对应植株为标记基因诱导剪切成功的无标记转基因植株，其余部分为标记基因序列未被剪切或剪切不完全的转基因植株。

图4是洁净DNA转化获得的T₀代无标记转基因水稻植株的southern分析图；

基因组DNA用gusA基因表达框的单切酶BamHI酶切，分别与gusA、nptII、Cre基因探针杂交，1，8，11，14，22，23，122，140，152，156，179，200为诱导剪切成功植株的对应株系号；151，198为非转基因对照；P：pNCG载体酶切样品阳性对照；gusA杂交条带均为单拷贝，而nptII与Cre均无杂交条带显示。

上图为gusA，下左图为nptII，下右图为Cre。

图5是无标记转基因水稻植株gusA基因的表达和遗传分析图；

A代表叶片GUS染色结果显示GUS基因正常表达；B代表T₁代实生苗GUS染色结果，显示GUS基因的遗传分离情况。

具体实施方式

本发明用上述方法实现了β-半乳糖苷酶(β-glucuronidase，GUS)基因对水稻的转化，成功获得了转基因阳性植株。以下实施例中所使用的植物细胞培养方法、基因枪转化方法、质粒构建、DNA制备、基因鉴定等分子生物学方法均为已知的技术，在相关文献和工具书中均有详细的说明。所用试剂如限制性内切酶和质粒载体元件均可市购获得或自行制备。

实施例1、植物抗性标记基因诱导剪切表达载体的构建和洁净DNA转化的外源基因序列片段微弹的制备。

步骤1、以GUS基因为目的基因，该基因表达β-半乳糖苷酶，催化底物X-gluc(5-bromo-4-choro-3-indolyl gulcuronide)产生蓝色沉淀物质，通过GUS活性染色很方便检测，是植物中常用的报告基因。标记基因诱导剪切系统采用雌激素诱导表达重组酶系统Cre/loxP，将GUS基因构建雌激素诱导抗性标记基因剪切植物载体表达质粒pNCG中，pNCG构建策略和方法参照见公开的文献(李霞，翁海波，韩绍印，席宇，雍克兰.转基因植物高效删除标记基因的实用型双元转化载体，生物工程学报，2006，22(4)：550-554)。采用AscI和Pacl双酶切从植物表达载体质粒pNCG中切割包含有抗性标记基因新霉素磷酸转移酶II(neomycin phosphotransferase II，nptII)及其雌激素诱导表达型Cre/loxP重组酶诱导剪切元件、目的基因β-半乳糖醛酸苷酶A(β-glucuronidase A，gusA)表达框的DNA片段(该片段简称为Fgus-cre-nptII结构见图1所示)，Fgus-cre-nptII经基因枪法转化水稻细胞，抗性标记基因G418筛选获得抗性愈伤组织后，采用DNA凝胶回收试剂盒经琼脂糖凝胶电泳割胶回收获得该片段，如此获得的Fgus-cre-nptII洁净DNA片段用去离子无菌水溶解，使DNA浓度为200ng/μl，作为基因枪轰击植物细胞的外源DNA。

步骤2、Fgus-cre-nptII DNA片段微弹载体悬液制备：

在轰击前制备，取600mg/ml的金粉(Φ1.0μm)悬液30-50μl，加2.5mol/L的CaCl₂溶液50μL和0.1mol/L亚精胺20μL，轻微震荡混匀，加10μl的上述步骤1)制备的200ng/μl DNA片段Fgus-cre-nptII DNA溶液，使DNA总量为2μg。斡旋振荡3min，10000r/min离心10min，弃上清，让DNA沉淀到金粉颗粒表面得DNA微弹沉淀，加无水乙醇250μl洗涤沉淀，斡旋振荡震荡后10000r/min离心3min，弃上清，重复上述无水乙醇洗涤一次，再加无水乙醇80μl，此为DNA微弹载体悬液。轰击植物愈伤组织细胞时，每枪需要DNA微弹载体悬液10μl，上述DNA微弹载体悬液可以轰击6枪，由于乙醇易挥发，故上述步骤定溶为80μl体积。制备好的DNA微弹立即进行轰击。

实施例2、Fgus-cre-nptII DNA片段微弹对水稻愈伤组织轰击转化：

步骤1、水稻愈伤组织的诱导和培养：挑选饱满的粳稻品种日本晴成熟胚种子于灭菌锥形瓶中，用70％(体积浓度)的酒精浸没。表面清洗1分钟，倒掉滤液。再用30％(质量浓度)的次氯酸钠溶液浸洗15分钟，重复一次，然后用无菌水清洗3-5遍后，将成熟胚放在无菌滤纸上在超净台下吹干，接种在NB诱导培养基(NB基本培养基+2，4-D 2mg/L)上于28℃暗培养下诱导14天左右，摘芽(图2A和B)，将愈伤接入新鲜的NB诱导培养基继代培养10-12，待愈伤长至直径4-5mm，将愈伤分割成2-3毫米大小，置于新的NB诱导培养基继续培养5天作为轰击愈伤组织。轰击前接入高渗培养基(NB基本培养基+2，4-D2mg/L+山梨醇47g/L+甘露醇47g/L)，愈伤组织的接入数量和摆放位置按常规基因枪转化要求(图2C)，28℃暗培养6小时后进行轰击。

步骤2、轰击转化愈伤：本发明基因枪转化采用的载体膜、可裂膜和阻挡网均为BioRAD公司产品，其中可裂膜压力规格是1100PSI，射程25cm，每皿轰击2枪，每枪需要DNA微弹载体悬液10μl。轰击后的愈伤组织28℃静置暗培养16-20h以便使轰击细胞恢复。

步骤3、抗性愈伤的获得：轰击后经过恢复培养的愈伤组织细胞转入筛选培养基，筛选剂的添加浓度和方法按植物基因转化常规方法进行。如，本实施例中筛选标记基因为nptII，对应的抗生素筛选剂为G418，添加浓度具体为3mg/L，添加方式具体为在培养基灭菌后倒培养皿平板前，将配制好的G418母液按所需终浓度3mg/L换算体积直接添加到培养基中混匀。本实施例中采用的筛选培养基为(NB基本培养基+2，4-D 2mg/L+3mg/LG418)，培养条件为28℃静置暗培养。第一轮筛选培养15天，去除褐化死亡的非转化愈伤细胞，将生长有活力的抗性愈伤再转入新鲜的筛选培养基，进行第二轮筛选培养15天。

上述筛选培养的过程中，在筛选培养的过程中，转化细胞因为获得了标记基因编码的抗性，所以在筛选剂(本实验标记基因为nptII，赋予转化细胞G418抗性)存在情况下能存活并生长分裂，而非转化细胞因为不具有抗性而被筛选剂杀死(图2D)。两论筛选结束后，挑选出黄白色生长活力旺盛的抗性愈伤进行植株再生和RMGRS的诱导剪切处理。

实施例3、Fgus-cre-nptII片段转化水稻愈伤组织细胞中的标记基因相关多余序列(RMGRS)的诱导剪切处理和无标记转基因植株的获得。

步骤1、转化水稻愈伤组织细胞中RMGRS的诱导剪切：根据所用基因构建物，诱导剂雌激素(具体为β-雌二醇)溶于二甲基亚砜(DMSO)中，存储液浓度10mmol/L，冻存于-20℃的冰箱中。培养基中雌激素的添加方法为，灭菌好的培养基待冷却到50℃以下时在无菌超净台上添加雌激素到所需终浓度。为了比较在愈伤组织培养和分化的不同阶段添加雌激素诱导处理对RMGRS的切除效果，本实施里例进行了如下对比实验：预分化阶段(Pre-differentiation stage，P)、分化阶段(Differentiation stage，D)、预分化和分化阶段(P+D)3个不同阶段实施标记基因诱导剪切处理，处理方式是在相应培养基中添加终浓度25μmol/L的雌激素，同时去掉筛选剂G418。其中预分化培养基(NB基本培养基+2mg/L6-BA+1mg/L NAA+5mg/L ABA)，培养条件28℃暗培养9天(图2E)。分化培养基(NB基本培养基+2mg/L 6-BA+1mg/L NAA)，28℃日光照周期16小时进行分化，分化约15-20天，获得再生植株(T₀代)，移栽到温室(图2F、G和H)。

步骤2、无标记转基因植株的获得：上述步骤1获得的水稻再生植株(T₀代)，在苗期取叶片提取DNA进行针对标记基因nptII、重组酶基因Cre和目的基因gusA PCR检测标记基因的切除效率，其中gusA、nptII、重组酶基因(Cre)的PCR引物设计位置、引物序列、PCR扩增分析、产物检测的方法和具体操作见已发表文献(赵艳，张晓丽，郭龙彪，钱前。应用Cre/loxP系统在细胞水平上高效删除转基因水稻中的标记基因。中国水稻科学，2011，25(6)：580-586)。部分植株PCR分析结果示于图3，其中PCR结果为gusA(+)/nptII(-)/Cre(-)的植株为标记基因剪切成功的转基因植株，在细胞分化不同阶段添加25μmol/L雌激素诱导处理获得无标记转基因植株的效率的结果总结于表1。

表1愈伤组织分化不同阶段添加雌激素诱导处理对水稻T₀代植株中标记基因切除效率的比较

注：PS：预分化固体培养基诱导；DS：分化固体培养基诱导；

转基因阳性植株率＝[gusA PCR阳性植株数/绿苗数]×100％；

标记基因剪切成功率＝[gusA(+)/nptII(-)/Cre(-)植株数/绿苗数]×100％。

表1结果说明：根据标记基因抗性(本实施例为G418)筛选获得抗性愈伤组织后，在细胞分化的不同阶段直接在培养基中添加雌激素诱导重组酶Cre基因的表达，能方便快捷地直接在细胞水平上成功切除转化细胞中的标记基因，而且效率高。其中在预分化阶段诱导处理后T₀代再生植株中RMGRS诱导剪切效率最高，达32％，在分化培养阶段诱导处理后T₀代再生植株中RMGRS诱导剪切效率次之，为17.83％，而预分化和分化阶段共处理的效果最差，但也有4.97％的T₀代再生植株中RMGRS被成功切除。这说明，按本发明的方法采用洁净DNA转化技术和标记基因诱导剪切处理相结合，确实能在细胞水平上成功实现转化细胞中标记基因序列的快速有效切除。

实施例4、洁净DNA转化Fgus-cre-nptII片段获得的T₀代无标记转基因水稻植株中gusA整合的拷贝数和表达特征。

按照常规检测转基因植株中外源基因整合拷贝数的Southern杂交技术分析gusA基因表达框在无标记基因转基因T₀代水稻植株中的整合情况。转基因水稻植株基因组DNA提取、基因组DNA的酶切、电泳和转膜：参照前期文献(ZhaoY，Qian Q，Wang HZ and Huang DN.Co-transformation of gene expression cassettes via particle bombardment to generate safe transgenic plantwithout any unwanted DNA.In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant.，2007，43(4)：328-334b.)，5μg基因组DNA采用限制性内切酶BamH I酶切，总反应体积70μl，30℃水浴酶切14h。电泳：0.8％琼脂糖凝胶，先用50V电泳至样品出点样孔(大约45min)，然后转变成20V过夜电泳(17-18h)。按Southern毛细管虹吸转膜方法转膜16-20h，杂交膜采用尼龙膜，80℃烤膜干燥180min，直接用于杂交或用塑料袋密封保存于4℃冰箱备用。gusA、nptII和Cre基因探针按分别利用各自的引物从质粒载体中PCR扩增出相应基因片段，以此为模板依据DIG DNA Labelling Kit  (Roche)说明书进行DIG-dUTP标记合成探针DNA。基因的杂交和检测采用DIG DNA Hybridization and Detection Kit(Roche)说明书进行。

对标记基因诱导剪切成功的植株进行Southern杂交分析结果(图4)，证明无标记基因转基因T₀代水稻植株中gusA为单拷贝整合。这是因为一方面，洁净DNA转化的外源基因表达框倾向于低拷贝简单整合，另一方面本发明在抗性愈伤细胞水平上进行RMGRS诱导剪切处理时期和剪切后的培养基中，均不再添加抗性筛选剂，在无筛选压力情况下，转基因单拷贝/低拷贝整合的转化细胞获得良好的生长和分化，因此T₀代转基因水稻植株中Fgus-cre-nptII单拷贝整合的频率显著增加，这非常有利于标记基因和RMGRS的有效切除。由于载体中用于切除标记基因的重组酶具有很严格的切割位点专一性，如Cre基因表达的重组酶只能将位于两个同向排列的loxP位点之间的DNA序列切除，因此在细胞水平上诱导处理不仅快速切除了RMGRS，同时简便快捷地将单拷贝转基因植株挑选出来。这是本发明在细胞水平上实现标记基因剪切的另一显著优点。

采用常规的GUS活性染色法分析了本发明方法获得的无标记安全转基因水稻植株中目的基因gusA的表达和遗传情况。GUS染色方法参照Jefferson(Jefferson RA.Assaying chimericgenes in plants：the GUS gene fusion system.Plant Mol.Biol.Rep.，1987，5：387-405.)略作修改。取T0代无标记转基因水稻植株叶片为组织和T₁代实生幼苗为材料，浸泡于X-Gluc染色液(100mmol/L磷酸钠缓冲液，10mmol/L EDTA，lmmol/L X-Gluc，0.1％Triton)中，37℃暗处理过夜，镜检观察染色情况。组织出现蓝色为GUS阳性，染色结果在解剖显微镜下拍照或直接拍照。结果如图5所示，说明利用本发明获得无标记的转基因植中目标基因gusA表达框不仅均为单拷贝整合，而且在T₀代和T₁代能正常表达和遗传，遗传表达稳定性好。

A：T₀代无标记转基因水稻植株叶片GUS染色；B：T₁无标记转基因水稻种子苗GUS染色，上排为阳性，下排为阴性。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，其特征是依次包括以下步骤：

1)、植物抗性标记基因诱导剪切表达载体的构建：按照基因构建的分子生物学方法构建植物抗性标记基因诱导剪切表达载体质粒，其中用做基因枪轰击的外源基因片段序列结构如下：

在该外源基因片段序列两侧各设置相应的限制性酶切位点A和限制性酶切位点B，以便把该片段从质粒载体上切割下来；

2)、外源基因序列DNA片段的制备：采用限制性内切酶将上述步骤1)构建好的外源基因片段序列从质粒载体上切割下来，通过凝胶电泳分离割胶回收，作为基因枪轰击植物细胞的外源DNA；

3)、DNA微弹载体悬液制备；

4)、植物愈伤组织基因枪轰击转化；

5)、抗性愈伤组织的筛选：

依据抗性标记基因的类型采用相应的筛选剂，按植物基因转化的方法对转化愈伤组织进行筛选，获得抗性愈伤组织；

6)、直接在抗性愈伤组织预分化或分化阶段进行重组酶诱导表达对标记基因相关序列进行剪切处理；

根据诱导启动子表达所需进行重组酶的诱导表达处理，就能将介于和

之间的抗性标记基因相关序列切除；从而分化获得再生植株；

7)、转基因植株的分子检测：

按上述转化步骤获得的再生植株，利用PCR技术对目标基因表达框、抗性标记基因、重组酶基因序列分别设计合适引物对，对转基因植株进行PCR分子检测，挑选出目标基因表达框PCR(+)、抗性标记基因PCR(-)、重组酶基因PCR(-)的转基因植株，所述转基因植株为单纯目的基因表达框整合的转基因植株；

8)、单拷贝目的基因表达框整合的转基因植株的获得和分子鉴定：

对上述步骤7)挑选出目标基因表达框PCR(+)、抗性标记基因PCR(-)、重组酶基因PCR(-)的转基因植株，采用Southern杂交技术鉴定目的基因表达框整合的拷贝数，确定单拷贝整合的转基因植株。

2.根据权利要求1所述的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，其特征是：所述步骤1)载体构建时确保所需外源基因片段序列两侧各设置相应的限制性酶切位点A和B，以便把该片段从质粒载体上切割下来，所述限制性酶切位点A和B包括根据载体构建所需的所有合适可用的限制性酶切位点。

3.根据权利要求1或2所述的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，其特征是：所述步骤1)载体构建时将包括抗性标记基因及其重组酶诱导剪切系统在内的所有DNA元件置于

和之间，并与目的基因表达框相邻接，确保转化时外源DNA片段组成的有效性和完整性，所述

和

包括所有构建时使用的所有重组酶的相应酶切位点。

4.根据权利要求3所述的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，其特征是：所述步骤4)中的基因枪为Biolistic PDS 1000/He基因枪。

5.根据权利要求4所述的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，其特征是：所述步骤6)中的直接在抗性愈伤组织预分化或分化阶段进行重组酶诱导表达对标记基因相关序列进行剪切处理，其中包括根据诱导启动子表达所需在预分化或分化培养基中添加合适浓度的诱导剂，但不限于在培养基中添加诱导剂这一种处理，也适合于重组酶诱导表达所需的其他相应处理，并且预分化和/或分化培养基中不再添加筛选剂，获得再生植株。

6.根据权利要求2、3、4或5所述的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，其特征是：所述步骤8)的所获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植转基因植株的挑选为：将步骤7)所得的再生植株，直接在分子水平上验证。

7.根据权利要求6所述的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，其特征是：所述植物为水稻，但不限于水稻，也适用于采用该方法获得的其他转基因植物。

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