CN101240290A - 一种含绿色荧光蛋白基因的植物转基因表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术中的基因工程领域，公开了一种含绿色荧光蛋白基因的植物转基因表达载体，以及其构建方法和应用。即利用pBIN19、pGFP和pCHS质粒，通过酶切和重组等方法，构建CaMV 35S启动子驱动的gfp基因的植物转基因表达载体pBIN－35S－GFP。该载体能实现gfp基因的高效表达，并且在CaMV 35S启动子的两端各有一个多克隆位点，可以方便地进行启动子替换，用于研究组织特异性启动子的功能；此外，该载体在gfp基因的5′端含有多克隆位点，在3′端含有EcoR I和Bsm I两个单一酶切位点，可以方便地在5′端连接上目标基因，表达含GFP的融合蛋白，用于研究目标基因编码蛋白的亚细胞定位；也可以方便地切除gfp基因，连上需要的目的基因用于遗传转化研究。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含绿色荧光蛋白基因的植物转基因表达载体，以及其构建方法和应用。
技术背景：
绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)是海洋动物水母(Aequoreavictoria)体内的一种发光蛋白。其编码基因gfp作为一种新颖的非酶性标记基因具有许多优点：检测方便，只需要荧光显微镜或激发光源；材料无需前处理，可以活体检测；无需任何底物或辅助因子；对细胞本身几乎无毒；植物本身不含有GFP，不会出现假阳性；对于一些使用抗生素或除草剂会降低转基因效率的物种，GFP可以作为替代的选择标记；此外，由于GFP分子量较小，不影响与其融合的蛋白的生物学活性，GFP在研究蛋白的亚细胞定位方面也是一个很好的工具(Stewart CN Jr.The utility of green fluorescent protein in transgenicplants.Plant Cell Rep，2001，20(5)：376-382.Zimmer M.Greenfluorescent protein(GFP)：Applications，structure，and relatedphotophysical behavior.Chem Rev，2002，102(3)：759-781.)。
Haseloff等、Richards等、Tzfira等、范文韬等和熊玲媛等分别报道构建了含有gfp基因的表达载体(Haseloff J，Siemering KR，Prasher DC，Hodge S.Removal of a cryptic intron and subcellular localization of greenfluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plantsbrightly.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(6)：2122-2127；Richards HA，Rudas VA，Sun H，McDaniel JK，Tomaszewski Z，Conger BV.Construction ofa GFP-BAR plasmid and its use for switchgrass transformation.Plant CellRep，2001，20(1)：48-54；Tzfira T，Tian GW，Lacroix B，Vyas S，Li J，Leitner-Dagan Y，Krichevsky A，Taylor T，Vainstein A，Citovsky V.pSATvectors：a modular series of plasmids for autofluorescent protein taggingand expression of multiple genes in plants.Plant Mol biol，2005，57(4)：503-516；范文韬，刘德立，孙晓洁，杨成丽。带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物重组表达质粒pBI-GFP的构建。华中师范大学学报(自然科学版)，2000，34(2)：213-215；熊玲媛，陈亮，沈明山，黄胤怡，陈睦传。GFP-mut2植物表达载体的构建及在甜菊愈伤组织中的表达。厦门大学学报(自然科学版)，2002，41(5)：546-550。)。但构建的这些载体有的功能单一，有的单一的酶切位点少，有的构建的载体未见gfp基因表达效果的验证。因此，构建能高效稳定表达、单一的酶切位点多、用途广的含gfp植物转基因表达载体具有重要的应用价值。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种由质粒pBIN19、pGFP和pCHS构建的CaMV 35S启动子驱动的gfp基因的植物转基因表达载体pBIN-35S-GFP，以实现gfp基因的高效表达，以便于gfp基因在植物特异性启动子的功能研究、目标基因编码蛋白的亚细胞定位、目的基因的遗传转化等方面的应用，同时也提供一种构建所述载体pBIN-35S-GFP的方法。
本发明的目的通过如下的技术方案实现：一种含绿色荧光蛋白基因的植物转基因表达载体pBIN-35S-GFP，其特征在于该载体含有农杆菌LB边界序列，并且从此处开始顺时针方向依次连接有细菌操纵子LacZ序列、编码GFP蛋白的基因gfp、CaMV 35S启动子、新霉素-3′-磷酸转移酶Neomycinphosphotransferase-II(npt II)基因、农杆菌RB边界序列、卡那霉素抗性基因(KmR)、细菌起始复制子oriV和oriT序列。
所述表达载体pBIN-35S-GFP具有如下特点：在gfp基因5′端依次有Age I、Kpn I、Sma I、Xma I、BamH I和Xba I单一酶切位点，3′端有EcoR I和Bsm I单一酶切位点；在CaMV 35S启动子5′端依次有Pst I、Sph I和Hind III单一酶切位点，3′端有Age I、Kpn I、Sma I、Xma I、BamH I和Xba I单一酶切位点。
所述表达载体pBIN-35S-GFP的构建方法，包括如下步骤：
第一步，将质粒pGFP经EcoR I+BamH I酶切，然后回收含gfp基因的小片段。
第二步，将质粒pBIN19经EcoR I+BamH I酶切，然后回收大片段。
第三步，将第一步中回收的小片段与第二步中回收的大片段连接，得到新质粒pBIN19-GFP。质粒pBIN19-GFP经EcoR I+BamH I酶切鉴定得到约10Kb和750bp的两个片段，表明质粒pBIN19-GFP构建正确。
第四步，将质粒pCHS经Hind III+Xba I酶切，然后回收含CaMV 35S启动子的小片段。
第五步，将第三步中得到的质粒pBIN19-GFP经Hind III+Xba I酶切然后回收大片段。
第六步，将第四步中回收的小片段与第五步中回收的大片段连接，得到所述表达载体pBIN-35S-GFP。将质粒pBIN-35S-GFP，经Hind III+Xba I酶切鉴定得到约10.7Kb和900bp的两个片段，表明构建正确。
将本发明的表达载体pBIN-35S-GFP，由发根农杆菌K599介导转入矮牵牛叶片外植体。然后对侵染过的矮牵牛叶片进行培养，待经培养的矮牵牛叶片生出不定根，通过PRC扩增的方法对其不定进行鉴定。结果证明，本发明的表达载体pBIN-35S-GFP实现了gfp基因在植物基因组中的高效表达。
基于本发明的表达载体能实现gfp基因的高效表达，加之该表达载体自身结构所存在的“在CaMV 35S启动子的两端各有一个多克隆位点，可以方便地进行启动子替换；在gfp基因的5′端含有多克隆位点，在3′端含有EcoR I和BsmI两个单一酶切位点，可以方便地在5′端连接上目标基因，表达含GFP的融合蛋白，也可以方便地切除gfp基因，连上需要的目的基因。”等特点。可以说，本发明的表达载体pBIN-35S-GFP可以方便地应用于研究植物组织特异性启动子功能、研究目标基因编码蛋白质的亚细胞定位、实现目的基因的遗传转化等方面。在植物基因工程的理论和应用研究中具有重要的应用价值。
具体的说，一方面可以用组织特异性启动子替换所述表达载体pBIN-35S-GFP中的35S启动子形成新的质粒，将新的质粒转入相应植物外植体中，培养再生植株，通过观察再生植株的器官和组织中是否具有荧光，以确定组织特异性启动子的表达功能。
例如，将含有矮牵牛chsA基因启动子PchsA的pMT18-T克隆载体，经过Pst I和Xba I双酶切后，从中取小片段；将本发明的载体pBIN-35S-GFP经过Pst I和XbaI双酶切后，从中取大片段；将得到的大、小片段二者连接，并转化大肠杆菌。经筛选鉴定，获得阳性单克隆子。提取该阳性单克隆子的质粒，并将其通过农杆菌介导法或PEG介导法或基因枪等途径转入矮牵牛外植体，然后对矮牵牛外植体进行培养。结果表明，矮牵牛外植体再生植株中花发出绿色荧光，进而证明：chsA基因的启动子PchsA为花特异表达的启动子。
另一方面，还可以将目的基因插入到所述表达载体pBIN-35S-GFP中的gfp基因的5′端或3′端形成新的质粒，将新的质粒转入相应植物的原生质体中，观察原生质体亚细胞结构是否具有荧光，以确定目标基因编码蛋白的亚细胞定位。
例如，将含有水稻乙烯受体类蛋白基因OSPK1的pCRTM2.1克隆载体，经过Kpn I和Xba I双酶切后，从中取小片段；将本发明的载体pBIN-35S-GFP经过Kpn I和XbaI双酶切后，从中取大片段；将得到的大、小片段连接，并转化大肠杆菌，经筛选鉴定，获得阳性克隆子。提取该阳性克隆子的质粒，并将其通过PEG介导途径转入水稻原生质体。结果，转化后含有OSPK1基因的原生质体，其质膜上发出绿色荧光。这说明本发明的表达载体将OSPK1基因编码的蛋白OSPK1定位在细胞质膜上，即OSPK1蛋白在核糖体中合成后被运送到细胞质膜上，并在细胞质膜上发挥其信号传递作用。
第三方面，也可以将所述表达载体pBIN-35S-GFP中的gfp基因替换为目标基因形成新的质粒，将新的质粒转入相应植物的外植体，然后培养再生植株，以实现目标基因的遗传转化。
例如，将含有矮牵牛F3′，5′H基因的pMT18-T克隆载体，首先经过Pst I酶切，用T4 DNA聚合酶补平粘性末端，再用EcoR I酶切后，从中取小片段；将本发明的载体pBIN-35S-GFP经过Sma I和EcoR I双酶切后，从中取大片段。将得到的大、小片段连接，并转化大肠杆菌，经筛选鉴定后获得阳性克隆子。提取该阳性克隆子的质粒，并将其通过农杆菌介导法或PEG介导法或基因枪等途径转入菊花外植体，然后对菊花外植体进行培养。经RT-PCR分析，结果证明，菊花外植体再生植株中，F3′，5′H基因得到高效表达。
在本发明的各实验过程中，质粒DNA小量提取、酶切、片段回收、连接、转化克隆、以及筛选鉴定等步骤，均按照常规方法进行。
本发明的表达载体pBIN-35S-GFP样本已保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2008年2月27日，保藏编号为2378。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1、载体pBIN19-GFP构建示意图。
图2、质粒pBIN19-GFP DNA用EcoR I和BamH I酶切结果。其中，M1：1KbDNA ladder标准分子量标记；1：pBIN19被EcoR I+BamH I酶切；2：pBIN19-GFP被EcoR I+BamH I酶切；3：pGFP被EcoR I+BamH I酶切；M2：100bp DNA ladder Plus标准分子量标记。
图3、载体pBIN-35S-GFP构建示意图。
图4、质粒pBIN-35S-GFP DNA用Hind III和Xba I酶切结果。其中，M1：1Kb DNA ladder标准分子量标记；1：pBIN19-GFP被Hind III+Xba I酶切；2：pBIN-35S-GFP被Hind III+Xba I酶切；3：pCHS被Hind III+Xba I酶切；M2：100bp DNA ladder Plus标准分子量标记。
图5、矮牵牛叶片被发根农杆菌K599侵染后15天形成的不定根。
图6、矮牵牛叶片被发根农杆菌K599侵染后20天不定根的大量繁殖。
图7、利用rolB和gfp基因引物对转基因获得的不定根进行PCR扩增的结果。其中，1～8是rolB基因引物扩增的结果，9～16是gfp基因引物扩增的结果。M：100bp DNA ladder Plus标准分子量标记；1：野生型发根农杆菌K599Ri质粒；2～7：矮牵牛转基因根；8：矮牵牛非转基因根；9：质粒pBIN-35S-GFP；10～15：矮牵牛转基因根；16：矮牵牛非转基因根。
图8、利用virG基因引物对转基因不定根进行PCR扩增的结果。其中，M：100bp DNA ladder Plus标准分子量标记；1：野生型发根农杆菌K599 Ri质粒；2：质粒pBIN-35S-GFP；3～8：矮牵牛转基因根。
图9、外植体上获得的一段转基因根在蓝色激发光下发出绿色荧光。
图10、外植体上获得的另一段转基因根在蓝色激发光下发出绿色荧光。
具体实施方式：
一、准备生物材料。
将含有质粒pGFP的大肠杆菌在LB+Amp(氨苄青霉素)50mg/L固体培养基上在37℃条件下培养12小时。从培养基中挑取含有质粒pGFP的大肠杆菌单菌落，并将其转入LB+Amp 50mg/L液体培养基中，在转速为250r/min的摇床上在37℃条件下，悬浮培养12小时。最后用Sangon公司质粒小量提取试剂盒提取质粒pGFP，并将获得的质粒保存在-20℃条件下备用。
再用同样的方法，分别用含有pBIN19质粒和含有pCHS粒的大肠杆菌，依次使用LB+Km 25mg/L的固体培养基和LB+Km 25mg/L的液体培养基，获得质粒pBIN19和pCHS，也保存在-20℃条件下。
二、构建表达载体pBIN-35S-GFP，参照图1、图3。
第一步，将质粒pGFP经EcoR I+BamH I在37℃酶切3小时，然后用Sangon公司DNA胶回收试剂盒，回收含gfp基因的小片段；
第二步，将质粒pBIN19经EcoR I+BamH I在37℃酶切3小时，然后用Sangon公司DNA胶回收试剂盒，回收大片段；
第三步，将第一步中回收的小片段与第二步中回收的大片段在16℃条件下连接反应12小时。将连接反应产物转化到感受态大肠杆菌XL1-Blue MRF′，在LB+Km 25mg/L的固体培养基上培养12小时。然后从中挑取单菌落转入LB+Km 25mg/L的液体培养基，在转速为250r/min的摇床上，在37℃条件下悬浮培养12小时。然后用Sangon公司质粒小量提取试剂盒提取构建的新质粒pBIN19-GFP。质粒pBIN19-GFP经EcoR I+BamH I在37℃酶切3小时，电泳鉴定得到约10Kb和750bp的两个片段，如图2所示，表明质粒pBIN19-GFP构建正确。
第四步，将质粒pCHS经Hind III+Xba I在37℃酶切3小时，然后用Sangon公司DNA胶回收试剂盒，回收含CaMV 35S启动子的小片段；
第五步，将第三步中得到的质粒pBIN19-GFP经Hind III+Xba I在37℃酶切3小时，然后用Sangon公司DNA胶回收试剂盒回收大片段；
第六步，将第四步中回收的小片段与第五步中回收的大片段在16℃条件下连接反应12小时，将连接反应产物转化到感受态大肠杆菌XL1-Blue MRF′，在LB+Km 25mg/L的固体培养基上培养12小时，从固体培养基上挑取单菌落转入LB+Km 25mg/L的液体培养基，在转速为250r/min的摇床上，37℃悬浮培养12小时，用Sangon公司质粒小量提取试剂盒提取构建的新质粒pBIN-35S-GFP，经Hind III+Xba I在37℃酶切3小时，电泳鉴定得到约10.7Kb和900bp的两个片段，如图4所示，表明质粒pBIN-35S-GFP构建正确。
三、将表达载体pBIN-35S-GFP导入发根农杆菌K599。
发根农杆菌K599感受态的制备和质粒的提取均参照向太和等的方法(向太和，杨剑波，Somers DA。野生型发根农杆菌K599的解毒。遗传，2001，23(4)：336-340。)进行。用冻融法将pBIN-35S-GFP导入发根农杆菌K599，即：在100μL K599感受态细胞中加入约0.1μg纯化质粒DNA，混匀，在0℃冰上放置10min，再置于液氮速冻5min，然后立即用28℃水浴热激5min，最后转入500μLLB液体培养基中，在28℃缓慢振荡培养2h。取100μL菌液涂布于LB+Km(卡那霉素)50mg/L+Str(链霉素)50mg/L固体培养基上，在28℃条件下培养48h，筛选得到抗性单克隆菌落。
四、发根农杆菌K599介导的遗传转化和不定根的繁殖。
发根农杆菌K599/pBIN-35S-GFP单克隆在LB+Km 50mg/L+Str 50mg/L液体培养基中，在28℃下，在200r/min转速的摇床上，过夜培养。再取5mL菌液移入50mL MS+Km 50mg/L+Str 50mg/L液体培养基中，在28℃下，在200r/min转速的摇床上，培养至OD600为0.5，取反应物在5000r/min转速下，在4℃条件下，离心10min，收集菌体，用MS培养基清洗3次后，用MS+乙酰丁香酮20mg/L培养基将菌液稀释10倍后作为侵染液待用。
取矮牵牛无菌苗叶片，剪成5mm2的小块，放入侵染液中10min，用无菌滤纸吸干菌液，置于MS培养基上共培养3天后，转入MS+Cef(头孢霉素)500mg/L+Km 50mg/L培养基上培养；同时将未经侵染的矮牵牛叶片外植体培养在相同的培养基上作为阴性对照。
矮牵牛无菌苗离体叶片在发根农杆菌K599/pBIN-35S-GFP侵染后10天，切口边缘长出白色小突起；15天，切口边缘长出明显可见的白色不定根，如图5所示。不定根的诱导频率达45％(18/40)；而未经发根农杆菌K599/pBIN-35S-GFP侵染的外植体未见根的生成。待不定根长到5-7cm，切成两段，培养在无任何植物激素的MS+Cef 500mg/L+Km 50mg/L上。在该培养基上不定根生长旺盛，15-20天即可形成大量毛状分枝的不定根，如图6所示。
五、不定根的PCR鉴定
不定根基因组DNA的提取参照向太和等的方法(向太和，王利琳，庞基良，陈敏，许超。发根农杆菌K599对大豆、黄瓜和风仙花活体感染生根的研究。遗传，2005，27(5)：783-786。)。参照施和平等的报道(施和平，齐莹，张悦，梁山。黄瓜毛状根的诱导及细胞分裂素6-BA对其生长和形态的影响。生物工程学报，2006，22(3)：514-520。)设计扩增rolB基因的引物rolB-P1和rolB-P1，rolB-P1：GCTCTTGCAGTGCTAGATTT，rolB-P2：GAAGGTGCAAGCTACCTCTC；参照Lee等的报道(Lee MH，Yoon ES，Jeong JH，Choi YE.Agrobacterium rhizogenes-mediated transformatiOn of Taraxacum platycarpum and changes ofmorphological characters.Plant Cell Rep，2004，22(11)：822-827.)设计扩增virG基因的引物virG-P1和virG-P2，virG-P1：TTATCTGAGTGAAGTCGTCTCAGG，virG-P2：CGTCGCCTGAGCTTAAGTGTC；根据gfp基因(GenBank登记号U17997)序列设计引物GFP-P1和GFP-P2，GFP-P1：GTCAGTGGAGAGGGTGAAGG，GFP-P2：AAAGGGCAGATTGTGTGGAC。PCR扩增反应体积为35μL，其中包括0.2μL10mmol/L dNTP混合物，2μL 10pmol/L PCR引物，2u Taq Plus DNA聚合酶和约0.2μg DNA。用美国ABI公司PE9700型DNA扩增仪进行扩增反应。PCR反应程序为：94℃ 5min变性后，按94℃ 45sec、55℃ 45sec、72℃ 90sec的设置进行30个循环，反应结束后在72℃下延伸10min，随后于4℃保存备用。扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5V/cm)，溴化乙锭(EtBr)染色，用美国Bio/Rad凝胶成像系统观察并拍照记录。
根据rolB基因序列设计的引物rolB-P1和rolB-P2对获得的6个转基因不定根和野生型发根农杆菌K599自身携带的Ri质粒均扩增出约450bp大小的条带。同时，根据gfp基因序列设计的引物GFP-P1和GFP-P2对获得的6个转基因不定根和质粒pBIN-35S-GFP均扩增出538bp的条带；而非转基因的矮牵牛根基因组DNA均未扩增出任何条带，如图7所示。
此外，根据发根农杆菌virG基因设计的引物virG-P1和virG-P2对K599自身携带的Ri质粒、质粒pBIN-35S-GFP和矮牵牛转基因不定根基因组DNA进行扩增，结果只有K599自身携带的Ri质粒扩增出了长度约1Kb条带，如图8所示。因此，排除了不定根中存在残留农杆菌污染的可能。
六、转基因不定根的GFP蛋白荧光检测
用ZEISS显微镜(型号：Axio imager)，在蓝色激发光下(滤光片FITC)对诱导出的不定根进行荧光检测，并用ZEISS显微镜配套的数码成像系统拍照记录。利用荧光显微镜观察，转基因不定根在蓝色光激发下，发出强烈的绿色荧光，如图9和图10所示。
七、应用实例
例一，将含有矮牵牛chsA基因启动子PchsA的pMT18-T克隆载体，经过Pst I和Xba I在37℃酶切3小时，用Sangon公司DNA胶回收试剂盒回收小片段；将本发明的载体pBIN-35S-GFP经过Pst I和Xba I在37℃酶切3小时，用Sangon公司DNA胶回收试剂盒回收大片段。小片段和大片段二者在16℃连接反应12小时，转化感受态大肠杆菌XL1-Blue MRF′，在LB+Km 25mg/L的固体培养基上筛选单菌落，挑单菌落于LB+Km 25mg/L的液体培养基上，在转速为250r/min的摇床上，在37℃条件下悬浮培养12小时，用Sangon公司质粒小量提取试剂盒提取构建的新质粒，Pst I和Xba I在37℃酶切3小时，电泳出现约11Kb和0.5Kb的大小两个片段，即构建的新质粒鉴定正确。
利用构建的新质粒，通过农杆菌介导法或PEG介导法或基因枪等途径将矮牵牛chsA基因启动子介导的gfp基因，转入矮牵牛叶片外植体中，外植体在MS+6-BA2mg/L培养基上再生植株。用ZEISS显微镜(型号：Axio imager)，在蓝色激发光下(滤光片FITC)分别对再生植株的不同器官进行观察，花器官发出绿色荧光，即表明chsA基因的启动子PchsA为花特异表达的启动子。
例二，将含有水稻乙烯受体类蛋白基因OSPK1的pCRTM2.1克隆载体，经过Kpn I和Xba I在37℃酶切3小时，用Sangon公司DNA胶回收试剂盒回收小片段；将本发明的载体pBIN-35S-GFP经过Kpn I和Xba I在37℃酶切3小时，用Sangon公司DNA胶回收试剂盒回收大片段。小片段和大片段二者在16℃连接反应12小时，转化感受态大肠杆菌XL1-Blue MRF′，在LB+Km 25mg/L的固体培养基上筛选单菌落，挑单菌落于LB+Km 25mg/L的液体培养基上，在转速为250r/min的摇床上，37℃悬浮培养12小时，用Sangon公司质粒小量提取试剂盒提取构建的新质粒，在37℃酶切3小时，电泳出现约11Kb和1Kb的大小两个片段，即构建的新质粒鉴定正确。
利用构建的新质粒，通过PEG介导法将OSPK1基因转入水稻原生质体，转化后含有OSPK1基因的原生质体，用ZEISS显微镜(型号：Axio imager)，在蓝色激发光下(滤光片FITC)对转化后的原生质体进行观察，其质膜上发出绿色荧光。即用本发明的表达载体将OSPK1基因编码的蛋白OSPK1定位在细胞质膜上，表明OSPK1蛋白在核糖体中合成后被运送到细胞质膜上，并在细胞质膜上发挥其信号传递作用。
例三，含有矮牵牛F3′，5′H基因的pMT18-T克隆载体，首先用Pst I在37℃酶切3小时，再用T4 DNA聚合酶在在37℃聚合反应30分钟，补平粘性末端。随后用EcoRI在37℃酶切3小时，用Sangon公司质粒小量提取试剂盒提取小片段；本发明的载体pBIN-35S-GFP经过Sma I和EcoR I在37℃酶切3小时，用Sangon公司质粒小量提取试剂盒提取大片段。大小片段二者在16℃连接反应12小时，转化感受态大肠杆菌XL1-Blue MRF′，在LB+Km 25mg/L的固体培养基上筛选单菌落，挑单菌落于LB+Km 25mg/L的液体培养基上，在转速为250r/min的摇床上，37℃悬浮培养12小时，用Sangon公司质粒小量提取试剂盒提取构建的新质粒，用EcoR I在37℃酶切3小时，电泳出现1条约12.5Kb的片段，即构建的新质粒鉴定正确。
利用构建的新质粒，通过农杆菌介导法或PEG介导法或基因枪等途径将F3′，5′H基因转入菊花叶片外植体，外植体在MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.5mg/L上培养基再生植株。设计RT-PCR引物：F3′，5′H-P1：AAATAAAATGAGCATTCTA ACCCTAA和F3′，5′H-P2：TCAAACAGATTCATCTTACAAACAGA。用Promega公司RT-PCR试剂盒，对叶片、根和茎分别进行RT-PCR扩增分析，结果再生植株叶片、根和茎中均扩增出大小约1500bp的条带，即F3′，5′H基因得到高效表达。
应该理解到的是：上述实施例只是对本发明的说明，而不是对本发明的限制，任何不超出本发明实质精神范围内的发明创造，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1、一种含绿色荧光蛋白基因的植物转基因表达载体，名称为pBIN-35S-GFP，其特征在于含有农杆菌LB边界序列，并且从此处开始顺时针方向依次连接有细菌操纵子LacZ序列、编码GFP蛋白的基因gfp、CaMV 35S启动子、新霉素-3′-磷酸转移酶Neomycin phosphotransferase-II(npt II)基因、农杆菌RB边界序列、卡那霉素抗性基因(KmR)、细菌起始复制子oriV和oriT序列。
2、根据权利要求1所述的一种含绿色荧光蛋白基因的植物转基因表达载体，其特征在于，在gfp基因5′端依次有Age I、Kpn I、Sma I、Xma I、BamH I和Xba I单一酶切位点，3′端有EcoR I和Bsm I单一酶切位点；在CaMV 35S启动子5′端依次有Pst I、Sph I和Hind III单一酶切位点，3′端有Age I、Kpn I、Sma I、Xma I、BamH I和Xba I单一酶切位点。
3、权利要求1所述表达载体pBIN-35S-GFP的构建方法，包括如下步骤：第一步，将质粒pGFP经EcoR I+BamH I酶切，然后回收含gfp基因的小片段；
第二步，将质粒pBIN19经EcoR I+BamH I酶切，然后回收大片段；
第三步，将第一步中回收的小片段与第二步中回收的大片段连接，得到新质粒pBIN19-GFP；
第四步，将质粒pCHS经Hind III+Xba I酶切，然后回收含CaMV 35S启动子的小片段；
第五步，将第三步中得到的质粒pBIN19-GFP经Hind III+Xba I酶切然后回收大片段；
第六步，将第四步中回收的小片段与第五步中回收的大片段连接，得到所述表达载体pBIN-35S-GFP。
4、权利要求1所述表达载体pBIN-35S-GFP在研究植物组织特异性启动子的功能方面的应用。
5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用组织特异性启动子替换所述表达载体pBIN-35S-GFP中的35S启动子形成新的质粒，将新的质粒转入相应植物外植体中，培养再生植株，通过观察再生植株的器官和组织中是否具有荧光，以确定组织特异性启动子的表达功能。
6、权利要求1所述表达载体pBIN-35S-GFP在研究目标基因编码蛋白的亚细胞定位方面的应用。
7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将目的基因插入到所述表达载体pBIN-35S-GFP中的gfp基因的5′端或3′端形成新的质粒，将新的质粒转入相应植物的原生质体中，观察原生质体亚细胞结构是否具有荧光，以确定目标基因编码蛋白的亚细胞定位。
8、权利要求1所述表达载体pBIN-35S-GFP在实现目的基因的遗传转化方面的应用。
9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述表达载体pBIN-35S-GFP中的gfp基因替换为目标基因形成新的质粒，将新的质粒转入相应植物的外植体，培养再生植株，以实现目标基因的遗传转化。
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