CN112680473A - 甜瓜瞬时表达系统的建立和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种甜瓜瞬时表达系统的建立和应用。构建方法为：(1)黑暗环境中利用酶解液对甜瓜组织酶解；(2)利用第一终止液对酶解后溶液进行终止处理，过滤，对滤液离心去上清，获得原生质体；(3)将原生质体冰浴后离心去除上清，使用重悬液重悬，获得纯化的原生质体；(4)继续和质粒DNA混合，加入PEG4000‑Ca²⁺溶液，在黑暗环境下转染；(5)转染产物中加入第二终止液，终止产物进行离心，获得含质粒DNA的原生质体；(6)继续在黑暗环境下孵育，离心去上清，完成瞬时表达。该系统稳定，可用于多种功能分析，如基因表达分析、亚细胞定位、细胞内蛋白质转运分析、蛋白质相互作用等。

Description

甜瓜瞬时表达系统的建立和应用

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，具体涉及一种甜瓜瞬时表达系统的建立和应用。

背景技术

瞬时表达系统与稳定的遗传转化相比是一种快速有效的表达方法，其便捷的操作和高通量的转化可用于多种功能分析，例如基因表达分析、亚细胞定位、细胞内蛋白质转运分析、蛋白质相互作用以及启动子活性分析等。根癌农杆菌介导注射、生物弹轰击和PEG介导的原生质体转染是瞬时转化最常用的手段。与生物弹轰击和农杆菌侵染相比，PEG介导的原生质体转化更方便有效。原生质体是一种去除了细胞壁但保留完整的质膜和细胞器的细胞。原生质体为研究蛋白质功能提供了一个基于细胞的理想实验空间，DNA、RNA和蛋白质等大分子可以通过多种方式被传递到原生质体中。基于原生质体的瞬时转化已在许多植物中进行，例如拟南芥、水稻、玉米、草莓、黄瓜等。然而，有关甜瓜原生质体分离以及在甜瓜中建立瞬时转化系统的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的之一是在一定程度上解决上述问题。本发明针对现有技术存在的缺陷，提供了一种建立甜瓜瞬时表达系统的方法和应用。应用本发明所提供的甜瓜瞬时表达系统，可以用于多种功能分析，例如基因表达分析、亚细胞定位、细胞内蛋白质转运分析、蛋白质相互作用以及启动子活性分析等。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种甜瓜瞬时表达系统，所述甜瓜瞬时表达系统通过下述方法构建获得：

(1)在黑暗环境中，利用酶解液对甜瓜组织进行酶解处理，所述酶解液包括纤维素酶、离析酶、2-吗啉代乙烷磺酸和甘露醇，以便获得酶解后溶液；

(2)利用第一终止液对所述酶解后溶液进行终止处理，过滤，对滤液离心去上清，以便获得原生质体；

(3)将所述原生质体冰浴后离心去除上清，使用重悬液重悬，以便获得纯化的原生质体；

(4)将所述纯化的原生质体和质粒DNA混合，然后加入PEG4000-Ca²⁺溶液，在黑暗环境下进行转染，以便获得转染产物；

(5)在所述转染产物中加入第二终止液，对获得的终止产物进行离心，以便获得含有质粒DNA的原生质体；

(6)将所述含有质粒DNA的原生质体在黑暗环境下孵育，离心去上清，以便建立所述甜瓜瞬时表达系统。

根据本发明的实施例，以上所述甜瓜瞬时表达系统还可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述甜瓜组织为来自于甜瓜的第一片真叶和子叶。发明人在研究过程中创造性地发现，甜瓜来源不同的组织，所获得的原生质体的产量以及原生质体的活力不同。采用甜瓜的第一片真叶所获得的原生质的产量远远高于同等条件下子叶所获得的原生质体的产量，采用第一片真叶更适合作为原生质体分离的材料。

在本发明的一些实施例中，所述甜瓜组织通过下述方法获得：

将甜瓜种子在黑暗中浸种处理，以便获得发芽的甜瓜种子；

将所述发芽的甜瓜种子在空气相对湿度为40％～80％、光周期为12～20小时光和6～12小时暗的环境中培养，以便获得甜瓜植株，所述甜瓜组织来自于所述甜瓜植株。

在本发明的一些实施例中，所述酶解液包括1％～5％w/v纤维素酶、0.1％～1％w/v离析酶、10～50mM的2-吗啉代乙烷磺酸和0.1M～2M的甘露醇。

在本发明的一些具体实施例中，所述酶解液包括1.5％w/v纤维素酶、0.4％w/v离析酶、20mM的2-吗啉代乙烷磺酸和0.4M甘露醇。

在本发明的一些实施例中，所述质粒DNA中含有编码荧光蛋白的基因。所述荧光蛋白可以为绿色荧光蛋白，由此可以快速实现蛋白功能的分析以及亚细胞定位等。

在本发明的一些实施例中，所述第一终止液包括2-吗啉代乙烷磺酸、钙盐、钠盐和钾盐；优选地，所述第一终止液包括1～5mM MES，100～200mM NaCl，100～100mM CaCl₂和3～10mM KCl；更优选地，所述第一终止液包括2mM MES，154mM NaCl，125mM CaCl₂和5mMKCl，所述第一终止液pH为5～6.5，例如为5.8。

在本发明的一些实施例中，所述第二终止液包括2-吗啉代乙烷磺酸、钙盐、钠盐和钾盐；优选地，所述第二终止液包括1～5mM MES，100～200mM NaCl，100～100mM CaCl₂和3～10mM KCl。在本发明的一些具体实施例中，所述第二终止液包括2mM MES，154mM NaCl，125mM CaCl₂和5mM KCl，所述第一终止液pH为5～6.5，例如为5.8。

所提供的第一终止液和第二终止液可以根据需要命名为W5溶液。

在本发明的一些实施例中，所述原生质体和所述质粒DNA的量为：6*10⁵个原生质体：5～30微克质粒DNA；由此可以提高转化效率。

在本发明的一些实施例中，步骤(4)中将1-9*10⁵个所述原生质体和5～30微克所述质粒DNA的混合。优选地，步骤(4)中将6*10⁵个所述原生质体和20微克所述质粒DNA混合。由此，可以提高转化效率。

在本发明的一些实施例中，所述PEG4000-Ca²⁺溶液中PEG4000的浓度为10％～50％；优选为20％～40％。由此可以获得高的转化效率。

在本发明的一些实施例中，所述转染时间为5～30分钟。转染时间对于转化效率影响不大，可以在5～30分钟的合适的时间内进行所述转染，由此可以快速获得含有质粒DNA的原生质体。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种利用甜瓜瞬时表达系统进行亚细胞定位的方法，包括：

将外源基因导入质粒DNA上，所述质粒DNA上含有编码荧光蛋白的基因，所述质粒DNA被转入到甜瓜瞬时表达系统中，所述甜瓜瞬时表达系统为本发明第一方面所述的甜瓜瞬时表达系统；对所述荧光蛋白进行检测，以便确定所述外源基因的亚细胞定位。

根据本发明的实施例，所述荧光蛋白可以为绿色荧光蛋白。根据本发明的实施例，所述检测为激光共聚焦显微检测。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种甜瓜瞬时表达系统在蛋白或者基因功能分析领域中的用途，所述甜瓜瞬时表达系统为本发明第一方面所述的甜瓜瞬时表达系统。

根据本发明的实施例，所述蛋白或者基因功能分析包括但不限于基因表达分析、亚细胞定位、细胞内蛋白质转运分析、蛋白质相互作用或者启动子活性分析等。

在本发明的第四方面，本发明提供了一种甜瓜瞬时表达系统的建立方法，包括：

(1)在黑暗环境中，利用酶解液对甜瓜组织进行酶解处理，所述酶解液包括纤维素酶、离析酶、2-吗啉代乙烷磺酸和甘露醇，以便获得酶解后溶液；

(2)利用第一终止液对所述酶解后溶液进行终止处理，过滤，对滤液离心去上清，以便获得原生质体；

(3)将所述原生质体冰浴后离心去除上清，使用重悬液重悬，以便获得纯化的原生质体；

(4)将所述原生质体和质粒DNA混合，然后加入PEG4000-Ca²⁺溶液，在黑暗环境下进行转染，以便获得转染产物；

(5)在所述转染产物中加入第二终止液，对获得的终止产物进行离心，以便获得含有质粒DNA的原生质体；

(6)将所述含有质粒DNA的原生质体在黑暗环境下孵育，离心去上清，以便建立所述甜瓜瞬时表达系统。

在本发明的第五方面，本发明提供了一种获得甜瓜原生质体的方法，包括：在黑暗环境中，利用酶解液对甜瓜组织进行酶解处理，所述酶解液包括1％～5％w/v纤维素酶、0.1％～1％w/v离析酶、10～50mM的2-吗啉代乙烷磺酸和0.1M～2M的甘露醇，以便获得酶解后溶液；利用第一终止液对所述酶解后溶液进行终止处理，过滤，对滤液离心去上清，以便获得原生质体；其中，所述甜瓜组织为甜瓜的第一片真叶和子叶。由此可以快速大量地获得来自于甜瓜原生质体。

附图说明

图1为根据本发明的实施例提供的采用甜瓜新鲜子叶和第一片真叶作为材料进行原生质体分离的结果图。

其中图1A左面和右面分别示出了甜瓜M7的子叶和第一个真叶；1B示出了真空渗透后的酶解液；1C示出了酶解6小时后的酶解液；1D示出了酶解6小时后，子叶(上面)和第一片真叶(下面)所分离出的原生质体的显微镜结果图。

图2为根据本发明的实施例提供的甜瓜新鲜子叶和第一片真叶的原生质体产量和活力比较结果图。

其中图2A为酶解时间对子叶原生质体产量和活力的影响结果图；图2B为酶解时间对第一片真叶原生质体产量和活力的影响结果图；图2C为酶解6小时后，来自真叶的原生质体的FDA染色结果图；图2D为在酶解6小时(左图)和酶解8小时(右图)后，从第一片真叶分离出的原生质体的结果图。

图3为根据本发明的实施例提供的PEG浓度、质粒DNA量和转化时间对瞬时转化效率的影响结果图。

其中3A为不同PEG浓度下的转化效率结果图；3B示出了不同质粒量的转化效率结果图；3C示出了不同孵育时间的转化效率结果图；3D示出了pAN580质粒的定位。

图4为根据本发明的实施例提供的CmAPRR2蛋白的亚细胞定位结果图。

具体实施方式

下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提供了一种甜瓜瞬时表达系统的建立方法，包括：

(1)在黑暗环境中，利用酶解液对甜瓜组织进行酶解处理，所述酶解液包括纤维素酶、离析酶、2-吗啉代乙烷磺酸和甘露醇，以便获得酶解后溶液；

(2)利用第一终止液对所述酶解后溶液进行终止处理，过滤，对滤液离心去上清，以便获得原生质体；

(3)将所述原生质体冰浴后离心去除上清，使用重悬液重悬，以便获得纯化的原生质体；

(4)将所述原生质体和质粒DNA混合，然后加入PEG4000-Ca²⁺溶液，在黑暗环境下进行转染，以便获得转染产物；

(5)在所述转染产物中加入第二终止液，对获得的终止产物进行离心，以便获得含有质粒DNA的原生质体；

(6)将所述含有质粒DNA的原生质体在黑暗环境下孵育，离心去上清，以便建立所述甜瓜瞬时表达系统。

在本发明的至少一些实施例中，所述甜瓜组织为来自于甜瓜的第一片真叶和子叶。发明人在研究过程中创造性的发现，甜瓜组织的不同来源，所获得的原生质体的产量以及原生质体的活力不同。采用甜瓜的第一片真叶所获得的原生质的产量远远高于同等条件下子叶所获得的原生质体的产量，采用第一片真叶更适合作为原生质体分离的材料。

在本发明的一些实施例中，所述甜瓜组织通过下述方法获得：

将甜瓜种子在黑暗中浸种处理，以便获得发芽的甜瓜种子；

将所述发芽的甜瓜种子在空气相对湿度为40％～80％、光周期为12～20小时光和6～12小时暗的环境中培养，以便获得甜瓜植株，所述甜瓜组织来自于所述甜瓜植株。

在本发明的至少一些实施方式中，将将所述发芽的甜瓜种子在空气相对湿度为60％、光周期为16小时光和8小时暗的环境中培养，以便获得甜瓜植株。

在本发明的一些实施方式中，所述酶解液包括1％～5％w/v纤维素酶、0.1％～1％w/v离析酶、10～50mM的2-吗啉代乙烷磺酸和0.1M～2M的甘露醇。

在本发明的一些具体实施方式中，所述酶解液包括1.5％w/v纤维素酶、0.4％w/v离析酶、20mM的2-吗啉代乙烷磺酸和0.4M甘露醇。

在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述酶解时间为4～12小时，优选为4～8小时，更优选为6小时。

在本发明的一些实施方式中，所述质粒DNA中含有编码荧光蛋白的基因。所述荧光蛋白可以为绿色荧光蛋白，由此可以快速实现蛋白功能的分析以及亚细胞定位等。例如所述质粒DNA可以为含有GFP的pAN580质粒(pAN580-GFP)，当然其他质粒等也均可以用于本发明甜瓜瞬时表达系统中。

在本发明的一些实施例中，所述第一终止液包括2-吗啉代乙烷磺酸、钙盐、钠盐和钾盐；优选地，所述第一终止液包括1～5mM MES，100～200mM NaCl，100～100mM CaCl₂和3～10mM KCl；更优选地，所述第一终止液包括2mM MES，154mM NaCl，125mM CaCl₂和5mMKCl，所述第一终止液pH为5～6.5，例如为5.8。

在本发明的一些实施方式中，所述第二终止液包括2-吗啉代乙烷磺酸、钙盐、钠盐和钾盐；优选地，所述第二终止液包括1～5mM MES，100～200mM NaCl，100～100mM CaCl₂和3～10mM KCl；更优选地，所述第二终止液包括2mM MES，154mM NaCl，125mM CaCl₂和5mMKCl，所述第一终止液pH为5～6.5，例如为5.8。

根据本发明的实施例，所述第一终止液和所述第二终止液均为可以根据需要命名的W5溶液。在本发明的一些实施例中，步骤(3)中对所述原生质体冰浴时间为20～50分钟，例如为30分钟、40分钟。

在本发明的一些实施例中，步骤(4)中将1-9*10⁵个所述原生质体和5～30微克所述质粒DNA的混合。优选地，步骤(4)中将6*10⁵个所述原生质体和20微克质粒DNA混合。由此，可以提高转化效率。

在本发明的一些实施方式中，将所述原生质体和所述质粒DNA的混合物，与所述PEG4000-Ca²⁺溶液等体积混合，所述PEG4000-Ca²⁺溶液中PEG4000的浓度为10％～50％；优选为20％～40％；例如可以为25％，28％，30％或者40％。由此可以获得高的转化效率。所提到的PEG4000-Ca2+溶液中，PEG4000的浓度为质量体积浓度。

在本发明的一些实施方式中，所述转染时间为5～30分钟。转染时间对于转化效率影响不大，可以在5～30分钟的合适的时间内进行所述转染，由此可以快速获得含有质粒DNA的原生质体。

在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中将所述含有质粒DNA的原生质体在黑暗环境下孵育，离心去上清后，重悬于含有MES、甘露醇和KCl的重悬液中，以便获得所述甜瓜瞬时表达系统。

在本发明的一些实施方式中，所述重悬液含有2～10mM MES、0.2～1M甘露醇和10～40mM KCl，所述重悬液的pH值为5～6.5。在本发明的一些具体实施方式中，所述重悬液含有4mM MES、0.5M甘露醇和20mM KCl，所述重悬液的pH值为5.8。所用到的重悬液可以命名为WI溶液。

为了在甜瓜上建立起一种有效的瞬时表达系统，本发明首先对比了子叶和第一片真叶的原生质体产量和活力，确定了原生质体分离最佳的取样部位和酶解时间，其次通过优化PEG介导转化中的关键参数(PEG浓度、质粒总量和转染时间)，获得了最有效的转化操作步骤。同时，利用该瞬时转化系统对目标蛋白CmAPRR2进行了亚细胞分析，确保了该系统的有效性。

下面将通过不同的实施例，对于本发明所提供的技术方案进行解释和说明，以方便理解。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

实施例1提供了一种制备甜瓜瞬时表达系统的方法，包括：

(1)材料培育：将甜瓜M7品种种子置于30℃培养箱中黑暗浸种24h。挑选发芽良好的种子，在空气相对湿度为60％,光周期为16h光/8h暗的培养室中培养2周左右。

(2)取样：在生长良好情况下，剪取完全伸展的子叶或者第一片真叶用于制备原生质体。用刀片将叶片沿垂直于中脉方向切成约1mm宽的细条，并立即放入酶解液[包含：1.5％(w/v)纤维素酶R-10、0.4％(w/v)离析酶R-10、20mM 2-吗啉代乙烷磺酸(MES)和0.4M甘露醇]中(每10mL酶解液加入0.5g真叶或者子叶)。

(3)黑暗酶解：在黑暗条件下对酶解液抽真空30min。后移至28℃、40r·min^-1的摇床中黑暗酶解6小时以获得最大原生质体产量。

(4)原生质体分离：用等体积(10mL)的W5溶液(2mM MES，154mM NaCl，125mMCaCl₂、5mM KCl，pH 5.8)稀释酶解液并轻轻混合，然后过200目滤网。将滤液以1000r/min离心5min，弃去上清液，并用W5将原生质体再洗涤一次。离心后除去上清液，将原生质体用1mLW5溶液重悬获得原生质体。

(5)镜检计数和活力测定：适当稀释原生质体，并在显微镜下用血球计数板计数以进行原生质体产量统计。活力测定是使用FDA储备液以50μg/mL的终浓度添加到稀释的原生质体中(约50μL)，然后在黑暗中孵育5分钟，再用W5溶液洗涤两次，最后重悬于200μL WI溶液(4mM MES，0.5M甘露醇，20mM KCl，pH 5.8)。荧光显微镜下观察确定原生质体活力。

(6)静置重悬：将分离的原生质体置于冰上30分钟后去除上清液，并用1mL的MMG溶液(4mM MES，0.4M甘露醇，15mM MgCl₂，pH 5.8)重悬，使终浓度达到6×10⁶原生质体/ml。

(7)PEG-Ca²⁺转染：将100μL原生质体(6×10⁵原生质体)缓慢加入到20μL质粒(1000ng/μL)中并轻轻混合。加入等体积的新鲜制备的PEG4000-Ca²⁺(120μL，其中PEG4000浓度为40％)溶液，轻轻颠倒混合后在28℃黑暗中转染20分钟。

(8)离心重悬：加入600μL W5溶液稀释混合物来终止转染。将混合物以1000r/min离心2min，然后将原生质体轻轻重悬于750μLWI溶液中。

(9)避光孵育：将转染的原生质体在28℃下黑暗下孵育20小时，再次以1000r/min离心2分钟，然后重悬于50-100μL WI溶液(4mM MES，0.5M甘露醇，20mM KCl，pH 5.8)中以用于镜检。

(10)镜检测定转化效率：在荧光显微镜下用蓝光观察荧光结果，并且使用绿色荧光原生质体的数量来计算转化效率：转化效率(％)＝(视角的荧光原生质体数目/视角的总原生质体数目)×100％。

由此可以获得稳定的甜瓜瞬时表达系统，实施例5采用构建的该甜瓜瞬时表达系统进行了蛋白质的定位。

实施例2

通常采用幼嫩的植物组织用于分离原生质体。参照上述实施例1示出的步骤，变换了取样部位，实施例2比较了不同的取样部位对于所获得的甜瓜原生质体的影响，其研究内容如下：

本实施例利用1周左右的子叶和2周左右的第一片真叶来对比取样部位对原生质体的影响。

如图1所示，图1A位于左面和右面的分别为甜瓜M7的子叶和第一个真叶。使用相同的刀片切丝法获取子叶和第一片真叶，并立即放于酶溶液中消化。首先经过30min的黑暗下抽真空，后经低速恒温酶解(28℃、40r·min^-1)。其中图1B和图1C中分别示出了真空渗透后的酶解液，以及消化6小时后的酶解液；结果发现溶液的颜色从开始的灰黄色变为黄绿色，表明了原生质体已经解离。图1D中示出了酶解6小时后，子叶(图1D中上面的图)和第一片真叶(图1D中下面的图)所分离出的原生质体的显微镜结果图。显微镜观察结果证实了原生质体已经解离。而且，从图1D示出的结果不难看出，在相同的酶解时间后发现的第一片真叶的原生质体产量远远高于子叶的原生质体产量。该结果表明，对于甜瓜材料来说，第一片真叶比子叶更适合于作为原生质体分离的材料。

实施例3

参照上述实施例1示出的步骤和条件，变换了酶解时间，实施例3比较了酶解时间不同，对于原生质体所带来的影响。

为了优化酶解时间，分别在2小时、4小时、6小时和8小时分析了子叶和第一片真叶的原生质体产量和活力。

结果如图2所示，其中2A为酶解时间对子叶原生质体产量和活力的影响结果图，2B为酶解时间对第一片真叶原生质体产量和活力的影响结果图，图2A和图2B中横坐标均为小时，图2A和图2B中柱状图代表原生质体产量的结果图，折线图代表原生质体的活力的结果图。结果表明，子叶和真叶的原生质体产量均随酶解时间的增加而增加。但是，每克子叶的原生质体数为14×10⁵个，而每克真叶的原生质体数为15×10⁶个，几乎是子叶的10倍。这进一步证实了真叶是适合原生质体分离的组织。

另外，通过FDA染色评估原生质体状态和活力。图2C为酶解6小时后，来自真叶的原生质体的FDA染色结果。结合图2B给出的结果不难看出，对于真叶来说，虽然6小时的酶解中原生质体产量少于8小时，但其拥有最高的原生质体活力。图2D示出了在酶解6小时(左图)和酶解8小时(后图)后，从第一片真叶分离出的原生质体的结果图。从图2D示出的结果不难看出，8小时的异常原生质体的比例高于6小时，这可能导致原生质体破裂并降低存活率。该现象在子叶酶解中也存在(图2A)。结合上述结果，酶解时间为6小时时，可以获得高产又高质量的原生质体。

实施例4

为了研究PEG介导的转染参数，包括PEG浓度、质粒DNA总量和转染时间对转化效率的影响，实施例4参照实施例1示出的步骤和条件，通过改变PEG浓度、质粒DNA总量和转染时间等，来研究条件改变对于转化效率的影响。具体进行了如下实验：

为了优化PEG浓度和质粒DNA量，使用瞬时表达载体pAN580-GFP评估转染效率。由于片段小(5kb)和含有的GFP标签，pAN580通常用作瞬时表达的对照载体。结果表明，将从第一片真叶中分离出的100μL原生质体和20μg质粒混合，加入等体积的不同浓度的PEG4000-Ca²⁺溶液(PEG4000的浓度分别为10％，20％，30％，40％和50％)，孵育20分钟后，计算转化效率。结果表明，转化效率随PEG4000浓度(10％，20％，30％和40％)的增加而增加。此外，使用20％-40％PEG4000的转化效率接近40％，最大转化效率出现在40％PEG4000(约47％)时(图3A)。但是，当PEG4000浓度达到50％时，转化效率降低到39％。总之，40％PEG4000是最合适的转化浓度。

为了探索质粒DNA对转化频率的影响，将质粒DNA的总量(5μg，10μg，20μg和30μg)以相同的1μg/μL质粒浓度，40％PEG4000和20分钟的孵育时间转染到原生质体中。结果表明，当质粒量为20μg时，转化效率达到峰值，约为53％(图3B)。实验结果表明：5μg质粒的转化效率高于10μg质粒，当质粒量达到30μg时，转化效率降至35％。总之，40％PEG4000和20μg质粒DNA是瞬时转化的最佳参数。

为了观察孵育时间对转化效率的影响，从第一片真叶中分离出的100μL原生质体和20μg质粒在40％浓度的PEG4000-Ca²⁺溶液的介导下计算转化效率。保持40％PEG4000和20μg质粒DNA一致，孵育时间设置为5、10、20和30分钟。结果表明，5-30分钟的转化效率基本都在50％左右，这表明孵育时间对转化效率的影响很小(图3C)。

pAN580载体用于评估具有几个关键参数的转化效率。按照实施例1所示步骤，在步骤(9)将转染的原生质体在在黑暗环境中培养20小时后，荧光观察显示pAN580位于细胞核和细胞质中(图3D)，这与之前的研究是一致的，表明了所构建的瞬时表达系统是有效的。

实施例5

实施例5采用CmAPRR2转录因子对上述实施例1所构建的瞬时表达系统的稳定性以及CmAPRR2的转录因子功能进行了验证。

根据注释，CmAPRR2(MELO3C003375)是属于GLK2样转录因子家族的转录因子。在甜瓜中，据报道CmAPRR2(MELO3C003375)负责果皮颜色并与色素积聚有关。我们曾在“MR-1”甜瓜中克隆了CmAPRR2的全长CDS。为了进一步确认该系统的有效性，将CDS融合到了pAN580载体中GFP标签的5'端。结果表明，CmAPRR2位于细胞核中，证实其为转录因子(图4)。总之，瞬时表达系统是研究蛋白质定位的有效系统。

本文中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种甜瓜瞬时表达系统，其特征在于，所述甜瓜瞬时表达系统通过下述方法构建获得：

(1)在黑暗环境中，利用酶解液对甜瓜组织进行酶解处理，所述酶解液包括纤维素酶、离析酶、2-吗啉代乙烷磺酸和甘露醇，以此获得酶解后溶液；

(2)利用第一终止液对所述酶解后溶液进行终止处理，过滤，对滤液离心去上清，以便获得原生质体；

(3)将所述原生质体冰浴后离心去除上清，使用重悬液重悬，以便获得纯化的原生质体；

(4)将所述纯化的原生质体和质粒DNA混合，然后加入PEG4000-Ca²⁺溶液，在黑暗环境下进行转染，以便获得转染产物；

(5)在所述转染产物中加入第二终止液，对获得的终止产物进行离心，以便获得含有质粒DNA的原生质体；

(6)将所述含有质粒DNA的原生质体在黑暗环境下孵育，离心去上清，以便建成所述甜瓜瞬时表达系统。

2.根据权利要求1所述的甜瓜瞬时表达系统，其特征在于，所述甜瓜组织为来自于甜瓜的第一片真叶和子叶；

任选地，所述甜瓜组织通过下述方法获得：

将甜瓜种子在黑暗中浸种处理，以便获得发芽的甜瓜种子；

将所述发芽的甜瓜种子在空气相对湿度为40％～80％、光周期为12～20小时光和6～12小时暗的交替环境中培养，以便获得甜瓜植株，所述甜瓜组织来自于所述甜瓜植株。

3.根据权利要求1所述的甜瓜瞬时表达系统，其特征在于，所述酶解液包括1％～5％w/v纤维素酶、0.1％～1％w/v离析酶、10～50mM的2-吗啉代乙烷磺酸和0.1M～2M的甘露醇；

任选地，所述酶解液包括1.5％w/v纤维素酶、0.4％w/v离析酶、20mM的2-吗啉代乙烷磺酸和0.4M甘露醇，所述酶解液的pH为5.8；

任选地，步骤(1)中所述酶解时间为4～12小时，优选为4～8小时，更优选为6小时；

任选地，所述质粒DNA中含有编码荧光蛋白的基因，优选地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白。

4.根据权利要求1所述的甜瓜瞬时表达系统，其特征在于，所述第一终止液和所述第二终止液各自独立地包括2-吗啉代乙烷磺酸、钙盐、钠盐和钾盐；

优选地，所述第一终止液和所述第二终止液各自独立地包括1～5mM MES，100～200mMNaCl，100～100mM CaCl₂和3～10mM KCl；

任选地，所述第一终止液和所述第二终止液各自独立地包括2mM MES，154mM NaCl，125mM CaCl₂和5mM KCl，所述第一终止液和所述第二终止液的pH各自为5～6.5；

任选地，步骤(3)中对所述原生质体冰浴时间为20～50分钟，优选为30分钟。

5.根据权利要求1所述的甜瓜瞬时表达系统，其特征在于，步骤(4)中将(1-9)*10⁵个所述纯化的原生质体和5～30微克所述质粒DNA混合；

优选地，步骤(4)中将6*10⁵个所述纯化的原生质体和20微克所述质粒DNA混合。

6.根据权利要求1所述的甜瓜瞬时表达系统，其特征在于，所述PEG4000-Ca²⁺溶液中PEG4000的质量体积浓度为10％～50％；优选为20％～40％；

任选地，所述转染时间为5～30分钟。

7.一种利用甜瓜瞬时表达系统进行亚细胞定位的方法，其特征在于，包括：

将外源基因导入到质粒DNA上，所述质粒DNA上含有编码荧光蛋白的基因，所述质粒DNA被转入到甜瓜瞬时表达系统中，所述甜瓜瞬时表达系统为权利要求1～6中任一项所述的甜瓜瞬时表达系统；

对所述荧光蛋白进行检测，以便确定所述外源基因的亚细胞定位；

任选地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白；

任选地，所述检测为激光共聚焦显微检测。

8.权利要求1～6中任一项所述的甜瓜瞬时表达系统在蛋白或者基因功能分析领域中的用途；

任选地，所述蛋白或者基因功能分析选自基因表达分析、亚细胞定位、细胞内蛋白质转运分析、蛋白质相互作用或者启动子活性分析中的至少一种。

9.一种甜瓜瞬时表达系统的建立方法，其特征在于，包括：

(1)在黑暗环境中，利用酶解液对甜瓜组织进行酶解处理，所述酶解液包括纤维素酶、离析酶、2-吗啉代乙烷磺酸和甘露醇，以便获得酶解后溶液；

(2)利用第一终止液对所述酶解后溶液进行终止处理，过滤，对滤液离心去上清，以便获得原生质体；

(3)将所述原生质体冰浴后离心去除上清，使用重悬液重悬，以便获得纯化的原生质体；

(4)将所述纯化的原生质体和质粒DNA混合，然后加入PEG4000-Ca²⁺溶液，在黑暗环境下进行转染，以便获得转染产物；

(5)在所述转染产物中加入第二终止液，对获得的终止产物进行离心，以便获得含有质粒DNA的原生质体；

(6)将所述含有质粒DNA的原生质体在黑暗环境下孵育，离心去上清，以便建立所述甜瓜瞬时表达系统。

10.一种获得甜瓜原生质体的方法，其特征在于，包括：

在黑暗环境中，利用酶解液对甜瓜组织进行酶解处理，所述酶解液包括1％～5％w/v纤维素酶、0.1％～1％w/v离析酶、10～50mM的2-吗啉代乙烷磺酸和0.1M～2M的甘露醇，以便获得酶解后溶液；

利用第一终止液对所述酶解后溶液进行终止处理，过滤，对滤液离心去上清，以便获得原生质体；

其中，所述甜瓜组织为甜瓜的第一片真叶和子叶。

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