CN111849858B

CN111849858B - 毛竹原生质体的制备及瞬时转化体系的建立

Info

Publication number: CN111849858B
Application number: CN202010696468.4A
Authority: CN
Inventors: 沈锦波; 张梦弟; 李岩
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2020-07-20
Filing date: 2020-07-20
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2040-07-20
Also published as: CN111849858A

Abstract

本发明公开毛竹原生质体的制备及瞬时转化体系的建立。本发明使用4.5～6％(wt/vol)纤维素酶R10、1～1.6％(wt/vol)离析酶R10将毛竹叶鞘解离出原生质体，所得到的原生质体经分离、纯化和预处理后，利用PEG‑Ca²⁺将外源基因高效转入毛竹原生质体进行瞬时表达的方法。

Description

毛竹原生质体的制备及瞬时转化体系的建立

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，是关于毛竹原生质体的制备方法，以及一种通过化学诱导将外源基因转入毛竹原生质体并进行瞬时表达的方法。

背景技术

植物原生质体是经过酶解得到的没有细胞壁的原生质团，但是具有活细胞的生物活性。可以作为分子生物学、细胞生物学等研究的理想材料。

瞬时转化以原生质体为受体，通过特定的方法将带有目的基因的瞬时表达载体导入植物原生质体内，不整合到植物基因组上，只利用载体自身原件进行表达。原生质体瞬时转化体系关键的步骤就是将外源基因导入原生质体中进行表达，目前已知的方法已经很多，主要有显微注射(Matsuoka et al.,2005)、农杆菌介导的转化(Ananthakrishnan etal.,2007)、粒子轰击(Romano et al.,2003)、电击转化(Schinkel et al.,2008)、PEG介导的转化(Sabovljevic et al.,2008)等方法，其中PEG法和电击转化法的应用最广泛。PEG(聚乙二醇)介导外源基因导入原生质体的方法，已成功构建了拟南芥(Yoo et al.,2007)、马铃薯(黄亚玲,2006)、玉米(Sheen,2001)、柑橘(张倩,2009)、软枣猕猴桃(米银法,2003)等原生质体转化体系，模式生物拟南芥外源基因的转化效率更是可达90％左右。因此该发明采用实验费用低、转化效率高、不需特定仪器的PEG法建立毛竹瞬时转化体系。原生质体瞬时转化体系为功能基因的研究提供了一种快速方便有效的工具，已被应用于各种生物学研究如在基因表达分析(Assmann et al.,1985)、转录调控分析(Jacobsen and Beach,1985；Li et al.,2012)、植物信号转导的研究(Worley et al.,2000；Yanagisawa et al.,2003；Wang et al.,2005；Paris et al.,2010)、RNA干扰(RNAi)(Li et al.,2013)、植物蛋白质亚细胞定位和共定位、(Miao et al.,2006；Wang et al.,2010；Wang and Jiang,2011；Qi et al.,2012；Shen et al.,2013；Zhuang et al.,2013)、植物细胞特定腔室中蛋白质分选信号的研究(Cai et al.,2011；Gao et al.,2012；Shen et al.,2013；Gao etal.,2015；Shen et al.,2018)、植物活细胞中蛋白质募集及其复合物形成的途径分析(Ding et al.,2013)等研究。原生质体瞬时转化体系在多种植物中成功构建。双子叶植物中原生质体瞬时转化体系构建成功的有拟南芥(Yoo et al.,2007)、烟草悬浮细胞(Shenet al.,2014)、毛果杨(Lin et al.,2014)、番木瓜(张建波，2011)、软枣猕猴桃(米银法，2003)和柑橘(张倩，2009)等。单子叶植物中原生质体瞬时转化体系构建成功的有水稻(Shen et al.,2014)、玉米(Sheen et al.,2001)、柳枝稷(Mitra et al.,2008)。但是关于单子叶林木植物的原生质体的制备及瞬时转化体系的构建却鲜有报道。

毛竹(Phyllostachys edulis)属于单子叶林木，具有完整基因组序列(Peng etal.,2013)。具有分布范围广、栽培面积大、生长周期短、繁殖速度快、蓄积量多等特点，是理想的单子叶林木模式植物。目前林木的研究无论是关于基因功能的验证还是基因表达调控等的研究都是迫在眉睫，迫于林木遗传转化体系受限，这些研究无法进展下去。毛竹瞬时基因表达体系的构建，将为单子叶林木基因功能的验证、基因表达调控、蛋白亚细胞定位、信号转导、RNA干扰(RNAi)等方面提供快速高效的技术手段。因此，毛竹瞬时基因表达体系的构建显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种毛竹原生质体的制备方法，使用6％(wt/vol)CellulaseR-10和1.6％(wt/vol)Macerozyme R-10将毛竹叶鞘酶解成原生质体。

本发明毛竹原生质体的制备方法具体包括以下步骤：

步骤(1)、获取毛竹幼苗的叶鞘

获取毛竹幼苗的叶鞘部位，切成1～2mm的碎片；

步骤(2)、酶解

将叶鞘碎片快速转移至活化后的酶解液中，放置真空泵中抽真空30min，然后置于室温黑暗条件下酶解3.5h～4h，得到原生质体悬浮液；

所述的酶解液包括40mM MES(pH 5.7)，4.5～6％(wt/vol)纤维素酶R10、1～1.6％(wt/vol)离析酶R10、0.4M甘露醇和40mM KCl；活化条件：酶解液置于55℃水浴锅中加热10分钟，增强酶的溶解度并使DNA酶和蛋白酶失活；然后冷却至室温，再加入10mM CaCl₂、0.1％(v/v)BSA。

步骤(3)、分离、纯化

将上述处理后的原生质体悬浮液吸出并丢弃酶解液，并用与酶解液等体积的W5溶液替换，继续在室温黑暗条件下40～50rpm摇动下孵育1小时；通过75微米的尼龙网过滤，滤液在室温下以150×g(升速9降速2)离心原生质体悬浮液2～3分钟，得到原生质体沉淀物。添加2～5倍体积原生质体沉淀物的W5溶液，重悬原生质体沉淀。在室温下以150×g(升速9降速2)离心原生质体悬浮液1～2分钟，得到原生质体沉淀物；以适当的体积重悬于MMg溶液中，以达到每毫升4～6.5×10⁵个细胞的浓度。

本发明的另一个目的是提供PEG-Ca²⁺介导的毛竹原生质体瞬时转化方法，是所得到的原生质体经分离、纯化和预处理后，利用PEG-Ca²⁺将外源基因高效转入毛竹原生质体进行瞬时表达的方法，具体包括以下步骤：

步骤(1)、制备浓度为40-60％的PEG溶液，50℃～60℃水浴直至PEG固体彻底溶解。

作为优选，PEG溶液浓度为40％。

步骤(2)、将待转化的外源基因DNA中，加入毛竹原生质体悬浮液，并轻轻混匀。外源基因DNA与毛竹原生质体的质量体积比为20-40μg：100ul，优选为30μg：100ul。

步骤(3)、将PEG溶液在1min内缓慢添加到步骤(2)混合物中，混匀，在室温黑暗条件下孵育转化混合物10～25分钟。PEG溶液与步骤(2)混合物的体积比为1:1。

步骤(4)、在孵育转化后混合物中加入W5溶液阻止转化进程，然后上下颠倒混合，在室温下以150×g离心1分钟(升速9降速2)，吸除上清，得到沉淀物，其中孵育转化后混合物与W5溶液的体积比为1:2；再加入W5溶液，置于黑暗中25℃孵育12～16小时。

作为优选，W5溶液是由154mM NaCl、125mM CaCl₂、5mM KCl、2mM MES(pH 5.7)配制得到；MMG溶液由0.4M甘露醇、15mM MgCl₂、4mM MES(pH5.7)配制得到；浓度为40％PEG是4gPEG4000、3ml H₂O、2.5ml 0.8M甘露醇、1ml 1M的CaCl₂组成。

本发明的有益效果：

本发明采用叶鞘作为毛竹原生质体的取样部位，毛竹叶鞘主要有纤维素、半纤维素和木质素组成，除此之外还有少量的果胶以及灰分等物质，叶鞘纤维素含量可高达40％，半纤维素含量高达28％，而木质素可高达29％，配合特定的酶解液使得毛竹原生质体的解离效率高。

瞬时基因表达技术速度快，效率高不仅解决了毛竹基因在其他植物中异源基因表达的问题，更重要的是推进单子叶林木转录和翻译的调控、基因表达的诱导、信号传导机制、RNA干扰(RNAi)和蛋白质相互作用等研究进展，该方法同时为单子叶林木运用PEG介导法转化原生质体技术领域提供又一模式植物。

附图说明

图1为瞬时表达载体GFP转化原生质体的荧光检测，其中A是明场下激光共聚焦拍摄的毛竹叶鞘原生质体；B是488nm激发光下观测的毛竹叶鞘原生质体中表达GFP的区域呈现绿色荧光；C是546nm激发光下观测的毛竹叶鞘原生质体中叶绿体呈现青色荧光；D是B与C图像叠加结果，标尺：50μm。

图2A为获取原生质体的毛竹苗的生长状态；标尺：1.5cm。

图2B为毛竹苗的解离部位；标尺：1.5cm。

图3为不同浓度PEG4000对毛竹原生质体瞬时转化率的影响。

图4为不同浓度转化的质粒总量对原生质体瞬时转化率的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的分析。

以下实施例采用的W5溶液是由154mM NaCl、125mM CaCl₂、5mM KCl、2mM MES(pH5.7)配制得到；MMG溶液由0.4M甘露醇、15mM MgCl₂、4mM MES(pH 5.7)配制得到；浓度为40％PEG是4g PEG4000、3ml H₂O、2.5ml 0.8M甘露醇、1ml 1M的CaCl₂组成。

实施例1：毛竹原生质体的制备方法

步骤(1).毛竹苗的培养：

首先将毛竹Phyllostachys edulis的种子用75％酒精灭菌5min，ddH₂O冲洗3次，尽可能的冲洗掉毛竹种子表面的酒精。用ddH₂O渗透的滤纸铺于培养皿中，把灭过菌的毛竹种子平铺于内，早晚用温水冲洗，保持毛竹种子湿润状态，置于25℃，黑暗条件下培养。一个星期左右，毛竹种子露白，然后把露白的毛竹种子转移至装满ddH₂O的水培盒中，放置于光照培养箱中培养，培养温度控制在25℃，首先采用光强为10000lx的光光照14h，再置于黑暗中10h，每2天浇一次水，25天左右得到制备原生质体的毛竹苗。

步骤(2).制备酶解液：

步骤(3).制备原生质体:

用洁净的剃须刀片在滤纸上将毛竹幼苗的叶鞘切成1～2mm的碎片，将叶鞘碎片快速转移至酶解液中，然后放置真空泵中抽真空30min。然后置于25℃，黑暗条件下酶解4h。使用细塑料巴斯德吸管吸出并丢弃酶解液，并用与酶解液等体积的W5溶液替换。在黑暗中于25℃在40～50rpm摇动下孵育1小时。孵育后，轻轻摇动混合物以便从叶鞘中释放原生质体。通过75微米的尼龙网过滤，将原生质体悬浮液收集到15～50ml的原底离心管中。在室温下以150×g(升速9降速2)离心原生质体悬浮液2～3分钟。使用塑料巴斯德吸管吸出并丢弃上清液。添加2～5倍体积原生质体沉淀的W5溶液，并用1ml移液器吸头轻轻上下移液，重悬原生质体沉淀。在室温下以150×g(升速9降速2)离心原生质体悬浮液1～2分钟。尽可能吸掉上清将原生质体沉淀物以适当的体积重悬于MMg溶液中，以达到每毫升4～6.5×10⁵个细胞的浓度(血细胞计数板计数)。

对比例1：将步骤(2)中的酶解液成分替换成表1，其他条件与实施例1相同，最终得出E3组的酶解效率最高。

表1

对比例2：

采用实施例1相同条件，将取样替换成等量的毛竹苗的根、叶鞘和叶片，重复三组，表2结果显示根的解离率约为0个/g，叶片解离率约近35个/g，解离效率最高为叶鞘，其解离率约为2×10⁶个/g。

表2

实施例2：PEG-Ca²⁺介导的毛竹原生质体瞬时转化

步骤(1).制备浓度为40％的PEG溶液(现配现用，可转化前1小时制备)，50℃～60℃水浴直至PEG固体彻底溶解。

步骤(2).将10μl的3μg/μl待转化的GFP DNA加入2 ml圆底离心管中，加入100μl原生质体悬浮液，并轻轻混匀。

步骤(3).将110ulPEG溶液缓慢添加到混合物中，每个样品加样时间控制在1min，轻轻混匀，在黑暗中于25℃孵育转化混合物10～25分钟。

步骤(4).将混合物加入440μl的W5溶液阻止转化进程，然后上下颠倒混合，在室温下以150×g离心1分钟(升速9降速2)。

步骤(5).移除上清，加入1mlW5溶液，置于黑暗中25℃孵育12～16小时。

图2A为获取原生质体的毛竹苗的生长状态；标尺：1.5cm。图2B为毛竹苗的解离部位；标尺：1.5cm。

图3为不同浓度PEG4000对毛竹原生质体瞬时转化率的影响。本发明探索了浓度7％,15％,30％,40％，50％和60％的PEG4000对毛竹原生质体瞬时转化率的影响，结果显示PEG4000浓度为40％的转化效率最佳。

图4为不同浓度转化的质粒总量对原生质体瞬时转化率的影响。本发明探索了在100μl原生质体悬浮液中加入5μg,10μg,20μg,30μg,40μg,50μg,60μg和70μg的转化的质粒总量对原生质体瞬时转化率的影响，结果表明加入30μg的粒量时毛竹原生质体瞬时转化效率最高。

Claims

1.毛竹原生质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤（1）、获取毛竹幼苗的叶鞘

获取毛竹幼苗的叶鞘部位，并进行破碎；

步骤（2）、酶解

将叶鞘碎片转移至活化后的酶解液中，放置真空泵中抽真空30min，然后置于室温黑暗条件下酶解3.5～4h，得到原生质体悬浮液；

所述的酶解液包括40 mM MES pH 5.7 ，6% wt/vol 纤维素酶 R10、1.6% wt/vol离析酶 R10、0.4 M甘露醇和40 mM KCl；活化条件：酶解液置于55℃水浴锅中加热10分钟，增强酶的溶解度并使DNA酶和蛋白酶失活；然后冷却至室温，再加入10 mM CaCl₂、0.1％BSA；

步骤（3）、分离、纯化

将上述处理后的原生质体悬浮液吸出并丢弃酶解液，并用与酶解液等体积的W5溶液替换，继续在室温黑暗条件下40～50 rpm摇动下孵育1小时；通过75微米的尼龙网过滤，滤液在室温下离心原生质体悬浮液2~3分钟，得到原生质体沉淀物；添加2～5 倍体积原生质体沉淀物的W5溶液，重悬原生质体沉淀；再次室温下离心原生质体悬浮液1～2分钟，得到原生质体沉淀物；最后重悬于MMG溶液中，以达到每毫升4～6.5×10⁵个细胞的浓度；

W5溶液是由154mM NaCl、125 mM CaCl₂、5mM KCl、2mM MES pH 5.7配制得到；

MMG溶液由0.4M甘露醇、15 mM MgCl₂、4mM MES pH 5.7 配制得到。

2.PEG-Ca²⁺介导的权利要求1所述毛竹原生质体瞬时转化方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤(1)、制备浓度为40-60%的PEG溶液，50℃～60℃水浴直至PEG固体彻底溶解；

步骤(2)、将待转化的外源基因DNA中，加入毛竹原生质体悬浮液，并轻轻混匀；外源基因DNA与毛竹原生质体的质量体积比为20-40µg：100ul；

步骤(3)、将PEG溶液在1min内缓慢添加到步骤（2）混合物中，混匀，在室温黑暗条件下孵育转化混合物10～25分钟；PEG溶液与步骤（2）混合物的体积比为1:1；

步骤(4)、在孵育转化后混合物中加入W5溶液阻止转化进程，然后上下颠倒混合，在室温下离心1分钟，吸除上清，得到沉淀物，其中孵育转化后混合物与W5溶液的体积比为1:2；再加入W5溶液，置于黑暗中25℃孵育12～16小时；

W5溶液是由154mM NaCl、125 mM CaCl₂、5mM KCl、2mM MES pH 5.7 配制得到。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于PEG溶液的浓度为40%。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于浓度为40%PEG是4g PEG4000、3ml H₂O、2.5ml0.8M甘露醇、1ml 1M的CaCl2组成。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于外源基因DNA与毛竹原生质体的质量体积比为30µg：100ul。