CN109486856A - 毛竹原生质体环状rna过表达体系构建方法及应用 - Google Patents

毛竹原生质体环状rna过表达体系构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明名公开了一种毛竹原生质体环状RNA过表达体系构建方法及应用，属于基因工程技术领域。该体系构建环状RNA过表达载体并将其转化到毛竹的原生质体中。其构建方法为：高保真Taq酶扩增环状RNA宿主基因、以pUC19‑35s‑sGFP为终载体，使用Gateway方法构建环状RNA过表达重组质粒；大量提取重组质粒并在PEG介导下转化到毛竹原生质体中，研究环状RNA过表达对其宿主基因在转录和转录后水平的影响。

Description

毛竹原生质体环状RNA过表达体系构建方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及毛竹原生质体环状RNA过表达体系构建方法及应用。
背景技术
环状RNA是一类广泛存在于生物体内的特殊的RNA分子，它通过基因转录形成，3′端和 5′端共价闭合，长度不均一，通常两侧内含子区域具有可以进行反向互补匹配的序列。 环状RNA不具有典型poly(A)结构，而常规转录组文库构建一般均经过poly(A) 筛选这一步骤，导致无法检测到环状RNA的存在，所以早期这种环状非编码RNA一直被忽略。近年来随着高通量测序技术的发展，通过非poly(A) 转录组测序，人们发现环状RNA不仅在生物体内广泛存在，而且对其生长发育也起着非常重要的作用。环状RNA在细胞内非常稳定，并对核酸外切酶不敏感，可结合miRNA分子 ，也可被miRNA切割降解。除了调控宿主基因的转录，由于环状RNA来自宿主转录本，它的产生与对应的线性转录本之间也存在竞争关系。近期有研究表明部分环状RNA也可进入翻译途径。
产生环状RNA的宿主基因和环状RNA表达之间的相关性一直是人们关注的热点，而分子克隆技术对于研究这一问题具有重要意义，但是遗憾的是目前对于林木树种，尤其是毛竹来说，由于传统的遗传转化耗费时间太长，难度较大，很难看到环状RNA对其宿主基因在转录水平产生的影响。本研究通过分子克隆技术构建环状RNA过表达载体，在PEG介导下将其转化到毛竹原生质体中，在细胞内过表达环状RNA，可以在短时间内看到环状RNA过表达对其宿主基因的转录及转录后水平的影响，极大的节省了时间与经济成本。
发明内容
本发明的目的在于提供毛竹原生质体环状RNA过表达体系构建方法及应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种毛竹原生质体环状RNA过表达体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）毛竹核酸的提取；（2）环状RNA的验证；（3）环状RNA过表达重组质粒的构建；（4）环状RNA转化毛竹原生质体；（5）环状RNA过表达的检测。
上述步骤（2）环状RNA 的验证包括：基于转录组测序所得环状RNA基因序列，设计环状RNA “背靠背”引物；所述转录组测序所得环状RNA基因序列如SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:9所示；所述状RNA“背靠背”引物序列如SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:27所示。
上述步骤（3）环状RNA过表达重组质粒的构建包括：目的基因的扩增；利用Gateway方法先将目的基因连接到入门载体；然后将入门载体上的目的基因连接到终载体上获得环状RNA过表达重组质粒。
进一步的，目的基因扩增时的特异性引物5’端带有attB-位点接头；所述入门载体为pDONR207，终载体为pUC19-35s-sGFP（Chen et al, 2011; Lin et al, 2013; Lin etal, 2014)。
更进一步的，所述目的基因扩增时的特异性引物序列如SEQ ID NO:28：5’GGGGAC AAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGTAAGTGGACGAAACACAAGAAGAA-3’
和SEQ ID NO:29：5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTTTTACCCGTC
AATCAAACCTTA-3’所示，其中下划线加粗部分即attB识别位点。
上述步骤（4）环状RNA过表达重组质粒转化毛竹原生质体，包括以下步骤：
（1）分离原生质体
材料：取土里生长2周的毛竹幼苗，嫩芽部位。
酶解：使用刀片纵切嫩芽，将切下的碎条置于20 mL酶解液中，25℃，50rpm，避光酶解3h； 55℃水浴10min，逐渐冷却至室温；随后加入0.2 mL 1 M CaCl2，0.2 mL质量体积百分比浓度为10%的BSA，使用0.45μm滤膜过滤；
过滤：酶解后，使用等体积的W5 solution清洗3-5遍，之后使用40μm的尼龙网过滤到50ml离心管中，离心1500rpm，3min，冰上静置30min，得到原生质体沉淀，使用MMG solution将原生质体沉淀重悬，使用血球计数板在显微镜下观察，不断调整MMG solution的加量直到原生质体浓度在4.2×106 个/ml；
（2）原生质体转化
PEG介导的原生质体转化：实验组将10 μg 重组质粒（体积调整至10ul）与 100 μL 原生质体混合，混匀后立即加入110μL新鲜配置的 PEG solution介导转化，黑暗条件下，室温孵育20min；空白对照组加入等量ddH2O代替重组质粒，阴性对照组加入等量未携带目的基因的质粒。
终止反应：孵育后，缓慢加入440 μL W5 solution 终止反应，轻柔颠倒混匀， 1,500 rpm离心3 min得到转化后的原生质体沉淀，使用1.5ml W5 solution缓慢重悬沉淀。
培养：最终将转化后的原生质体转移至90 mm圆形培养皿上，25℃光照孵育12-16h。 培养皿需提前用1ml 1% BSA 洗涤，只需洗涤即可，洗涤后将皿中的BSA溶液弃掉。
酶解液配方：1.5% (wt/vol) Cellulase R10，0.75%(wt/vol) Macerozyme R-10，10mM MES（PH 5.7），0.6 M mannitol。
W5 solution配方：154 mM NaCl，125 mM CaCl2，5 mM KCl ，2 mM MES （pH 5.7）。MMG solution 配方：0.6 M mannitol，15 mM MgCl2，4 mM MES（pH 5.7）。
MMG solution 配方：0.6 M mannitol，15 mM MgCl2，4 mM MES（pH 5.7）。
PEG solution 配方：40% (wt/vol)PEG 4000，0.2 M mannitol，水浴60℃，直至粉末溶解，逐渐降至40℃，随后加入0.1 M CaCl2。
上述步骤（5）环状RNA过表达的检测为：提取转化后毛竹原生质体的Total RNA，进行反转录，所得cDNA稀释5倍，取1uL作为模板，取环状RNA“背靠背”正反向引物各1 μl，Premix Taq (TaKaRa) 25 μl，加 ddH2O 至 50 μL，按照94 ℃ 30s, 58 ℃ 30s, 72 ℃30 s进行40个循环PCR反应，检测环状RNA的过表达，actin-1为内参基因。
一种毛竹原生质体环状RNA过表达体系的构建方法在过表达环状RNA对宿主基因影响中的应用。
进一步的，设计宿主基因的特异性引物已建立原生质体环状RNA过表达体系毛竹的宿主基因进行半定量PCR，以actin-1为内参基因，检测过表达环状RNA对宿主基因的影响。
更进一步的，以PH01000724G0700为宿主基因，设计宿主基因的特异性引物，正向引物序列为SEQ ID NO: 30； 反向引物序列为SEQ ID NO:31。反应体系为：环状RNA宿主基因特异性正反引物各1 μL， Premix Taq (TaKaRa) 25 μl，cDNA 1uL，加ddH2O 至50 μL；反应条件为：94 ℃ 30s, 58 ℃ 30s, 72 ℃ 30 s进行40个PCR循环；检测环状RNA过表达对其宿主基因的影响。
本发明的优点在于：
本发明的毛竹原生质体环状RNA过表达体系，通过构建环状RNA过表达重组质粒，重组质粒转化毛竹原生质体，实现了快速、稳定的瞬时转化，可以在短时间内看到环状RNA过表达对其宿主基因的转录及转录后调控的影响，极大的节约了时间与节省了经济成本。
附图说明
图1 RNase R消化后环状RNA富集，左边为未经RNase R消化的环状RNA条带，右边为经过RNase R消化的条带，NTB为线性内参。
图2 毛竹幼苗取材部位。
图3 毛竹嫩芽纵切后置于酶解液中。
图4 使用蓝光激发，荧光显微镜下观察整体转化情况并统计转化效率。
图5 Confocal下观察单个原生质体转化情况。“GFP fluorescence”：使用蓝光激发，视野下看到的表达GFP的原生质体；“Bright field”：可见光视野下的原生质体；“Merged”：前两个视野重叠下的原生质体。
图6 原生质体中环状RNA的过表达情况。图中上方为毛竹基因结构注释（粗线为外显子，细线为内含子），标箭头处为设计环状RNA背靠背引物的位置；下方为环状RNA过表达的凝胶电泳图，图中“circ-bHLH93”为目的环状RNA，“actin-1”为内参基因；“shoot、protoplast、vector、Ox-circRNA”分别代表竹笋组织、空白对照组、阴性对照组、转化组。
图7过表达环状RNA对宿主基因的影响。图中上方为毛竹基因结构注释（粗线为外显子，细线为内含子），标箭头处为设计宿主基因引物的位置；下方为宿主基因的半定量结果，图中“linear-bHLH93”为环状RNA的宿主基因，“actin-1”为内参基因；“Shoot、Protoplast、Vector、Ox-circRNA”分别代表竹笋组织、空白对照组、阴性对照组、转化组。
具体实施方式
实施例1 毛竹核酸的提取
（1）材料处理
选取毛竹地上部分为0.2cm的竹笋，用手术刀切取中间部位，用锡纸包好，迅速放于液氮中。使用高通量组织研磨仪（QIAGEN TissueLyser II）将材料研磨，-80℃保存。
（2）毛竹Genomic DNA 及Total RNA的提取
取上述研磨后的样品150mg，使用Plant Genomic DNA Kit（TIANGEN, no. DP305,China）提取竹笋的Genomic DNA；使用RNAprep Pure Plant Kit (Polysaccharides＆Polyphenolics-rich)（TIANGEN , no. DP441, China）提取竹笋的Total RNA。Total RNA用于环状RNA验证，DNA用于载体构建，扩增宿主基因。
（3）RNA反转录
使用PrimeScript ™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaKa, no.6210A）将1ug Total RNA用Random Primer进行反转录，所得cDNA稀释5倍，进行环状RNA的验证。
实施例2 环状RNA的验证
根据转录组数据得到9条环状RNA序列，其序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:9所示，使用PRAPI软件设计的“背靠背”引物，验证环状RNA，引物序列如表1。
将 20 μg Total RNA（体积调整为51 μL）均分到两管中，一管进行RNase R消化处理，另一管作为对照。处理管中加入3 μL 10×RNase R Reaction Buffer，1.5 μL RNase R(20U/uL)；对照管中加入3 μL 10×RNase R Reaction Buffer，1.5 μL RNase-freewater。将处理管与对照管在水浴锅中37 ℃孵育15min，接着在两管中分别加入30 μL苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）以终止反应，混匀， 4 ℃、13,000g离心5 min。将上层清液转移到新的1.5 mL RNase-free离心管中，依次加入6 μL 4 M LiCl、1 μL glycogen 及 90 μL预冷无水乙醇(-20 ℃)，混匀后置于-80 ℃过夜沉淀，沉淀后13,000g离心15min富集RNA。将RNA使用Random Primer进行反转录，所得cDNA，稀释5倍，取2 μL作为模板，加入15 μL PremixTaq (TaKaRa)、环状RNA“背靠背”正反向引物各0.5 μL，加ddH2O至30 μL的总体系，进行40个循环PCR扩增，使用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小，Rnase R消化过程中以内参基因NTB作为线性标记。“背靠背”引物序列如表1中SEQ ID NO:10 至SEQ ID NO:27所示；内参基因NTB的引物如表2 中SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示。图1结果表明：经RNase R消化后，环状RNA依然存在，而内参基因NTB经RNase R消化后条带明显减弱。
以RNase R处理后样本的cDNA为模板，加入5 μL 10×PCR Buffer，5 μL 2 mMdNTPs，3 μL 25 mM MgSO4，“背靠背”正反向引物（表1）各1.5 μL，KOD-Plus-Neo（TOYOBO,no. KOD-401）1 uL，加ddH2O至50 μL体系，按照98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 10 s进行35个循环PCR扩增，切胶回收目的条带，若通过测序得到该目的条带的序列与环状RNA序列保持一致，并且在back-splicing 处是连接的，则说明该环状RNA真实存在。
实施例3 环状RNA过表达重组质粒的构建
（1）目的基因的扩增
选择PH01000724G0700（PH01000724:425581-426013）宿主基因作为目的基因。设计目的基因5’端带有attB-位点接头的特异性引物。具体引物序列如下：
正向引物为：SEQ ID NO:28：
5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGTAAGTGGACGAAACACAAGAAG
AA-3’反向引物为：SEQ ID NO:29：
5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTTTTACCCGTCAATCAAACCTTA-3’
下划线加粗部分即attB识别位点。
以毛竹Genomic DNA为模板，上述带attB-位点接头的正反引物各2.5 μL，2×Unique HiQTM Pfu Master Mix (No Dye) (Novogene, no. NHP007L, China) 25 μL，加ddH2O至50 μL体系，以98 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min进行34个PCR循环，扩增环状RNA的宿主基因。切胶回收纯化，获得带attB-接头序列的目的基因。
（2）连接目的基因到入门载体
使用BP Clonase (Invitrogen, no. 11789-020)将带attB-位点的目的片段连接到Gateway克隆通用入门载体pDONR207中，将连接产物转化到DH-5α感受态细胞，在含有终浓度为0.03 mg/mL的庆大霉素抗性的LB固体培养基上过夜培养，筛选得到带有抗性的菌落，将菌落测序，序列正确的进行下游载体构建。
（3）环状RNA过表达重组质粒的获得
使用 LR clonase (ThermoFisher SCIENTIFIC, no. 11791-020)将入门载体上的目的基因连接到终载体——pUC19-35s-sGFP（Chen et al, 2011; Lin et al, 2013; Linet al, 2014)，将连接产物转化到DH-5α感受态细胞，在含有终浓度为0.05 mg/mL羧苄青霉素抗性的LB固体培养基上过夜培养，筛选得到带有抗性的菌落，将菌落测序，序列正确即为最终构建成功的重组质粒。在250 mL含终浓度为0.05 mg/mL羧苄青霉素抗性的LB 液体培养基中培养重组质粒16h，使用EndoFree Maxi Plasmid Kit (TIANGEN, no. DP117,China)大量提取重组质粒，使重组质粒浓度在1 mg/mL以上。
实施例4 环状RNA原生质体转化
（1）分离原生质体
材料：取土里生长2周的毛竹幼苗，嫩芽部位，如图2所示。
酶解：使用刀片纵切嫩芽，将切下的碎条置于酶解液中酶解，如图3所示，25℃，50rpm，避光酶解3h。酶解液配方：1.5% (wt/vol) Cellulase R10，0.75%(wt/vol)Macerozyme R-10，10 mM MES（PH 5.7），0.6 M mannitol，55℃水浴10min，逐渐冷却至室温。随后加入10 mM CaCl2，0.1% (wt/vol) BSA，使用0.45μm滤膜过滤。
过滤：酶解后，使用等体积的W5 solution清洗5遍，之后使用40μm的尼龙网过滤，静置离心1500rpm，3min，冰上静置30min，得到原生质体沉淀，使用MMG solution 将原生质体重悬，使用血球计数板在显微镜下观察，加入MMG solution调解原生质体浓度在4.2×106 个/ml。W5 solution配方：154 mM NaCl，125 mM CaCl2，5 mM KCl ，2 mM MES （pH5.7）。MMG solution 配方：0.6 M mannitol，15 mM MgCl2，4 mM MES（pH 5.7）。
（2）原生质体转化
PEG介导的原生质体转化：实验组将10 μg 重组质粒（体积调整至10uL）与 100 μL 原生质体混合，混匀后立即加入110μL新鲜配置的 PEG solution介导转化，黑暗条件下，室温孵育20min；空白对照组加入等量ddH2O代替重组质粒，阴性对照组加入等量未携带目的基因的质粒。PEG solution 配方：40% (wt/vol) PEG 4000，0.6 M mannitol，水浴60℃，直至粉末溶解，逐渐降至40℃，随后加入0.1 M CaCl2。
终止反应：孵育后，缓慢加入440 μL W5 solution 终止反应，轻柔颠倒混匀， 1,500 rpm离心3 min得到转化后的原生质体沉淀，使用1.5mL W5 solution缓慢重悬沉淀。
培养：最终将转化后的原生质体转移至培养皿上，25℃光照孵育16h。 培养皿需提前用1mL 1wt% BSA 洗涤，洗涤后将皿中的BSA溶液弃掉。
（3）高效统计原生质体转化效率方法
吸取10 μL转化后的原生质体于载玻片上，使用Zeiss荧光显微镜10倍或者20倍镜进行观察，统计转化效率；转化效率=（视野中带GFP荧光的原生质体个数/总的原生质体个数）*100%如图4所示，至少统计三个视野，计算出平均转化效率。随后使用Confocal对单个原生质体转化情况进行观察，如图5所示。
实施例5 环状RNA过表达的检测
1) 转化后毛竹原生质体Total RNA提取：使用RNAprep Pure Plant Kit(Polysaccharides＆Polyphenolics-rich)（TIANGEN），提取Total RNA。
2) 反转录：使用PrimeScript ™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaKa）将步骤1) 所提取的RNA反转录成cDNA，稀释5倍备用。
3) 环状RNA过表达检测：取步骤2) 所得稀释5倍的cDNA 1uL为模板，“背靠背”正反向引物各1 μL，Premix Taq (TaKaRa) 25 μL，加 ddH2O 至 50 μL，按照94 ℃ 30s, 58℃ 30s, 72 ℃ 30 s进行40个循环PCR反应，检测环状RNA的过表达，如图6所示。actin-1基因为内参，内参基因actin-1的引物如表2 SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35所示。
实施例6检测过表达环状RNA对宿主基因的影响
以PH01000724G0700为宿主基因，设计宿主基因的特异性引物，正向引物序列：SEQ IDNO:30：PH01000724G0700-F:5’-CGTCGTCAGCTGCTTCAAC-3’；反向引物序列SEQ ID NO:31：PH01000724G0700-R:5’-TCTACAAGCAGCCTCCTCCT-3’；进行宿主基因的半定量PCR。环状RNA宿主基因正反向引物各1 μL， Premix Taq (TaKaRa) 25 μL，加cDNA 1uL 及ddH2O 至50 μL，按照94 ℃ 30s, 58 ℃ 30s, 72 ℃ 30 s进行40个PCR循环，发现环状RNA过表达使宿主基因的表达量降低，如图7所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 毛竹原生质体环状RNA过表达体系构建方法及应用
<130> 35
<160> 35
<170> PatentIn version 3.3
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<400> 5
ggaagccgcc gctggactgg cacacgcgca agcggatcgc cgtcggcacg gcgcggggcc 60
tgctgtacct gcacgagcag tgcgacccca agatcatcca ccgcgacgtc aaggccgcca 120
acgtgctgct cgacgagtgc cacgaggccg tcgtcggaga cttcggcctc gccaagctgc 180
tcgaccacgg cgactcgcac gtcaccacgg cggtgcgcgg caccgtgggc cacatcgcgc 240
cggagtacct ctccacaggg cagtcgtcgg agaagaccga cgtgttcggg ttcgggatcc 300
tgctgctcga gctcgtcacg ggacagcgcg cgctcgaggt cggcaaggcc tcggggatca 360
gccagagcca gaagggggtc atgcttgatt gg 392
<210> 6
<211> 392
<212> DNA
<213> PH01000048G0850
<400> 6
ggaagccgcc gctggactgg cacacgcgca agcggatcgc cgtcggcacg gcgcggggcc 60
tgctgtacct gcacgagcag tgcgacccca agatcatcca ccgcgacgtc aaggccgcca 120
acgtgctgct cgacgagtgc cacgaggccg tcgtcggaga cttcggcctc gccaagctgc 180
tcgaccacgg cgactcgcac gtcaccacgg cggtgcgcgg caccgtgggc cacatcgcgc 240
cggagtacct ctccacaggg cagtcgtcgg agaagaccga cgtgttcggg ttcgggatcc 300
tgctgctcga gctcgtcacg ggacagcgcg cgctcgaggt cggcaaggcc tcggggatca 360
gccagagcca gaagggggtc atgcttgatt gg 392
<210> 7
<211> 863
<212> DNA
<213> PH01002058G0150
<400> 7
gcacatatta ccgcaggcaa gagaaggctt ctgagcccag cagcagtgta cttacacctg 60
gagttgcaac ttgttccggc tgccttgcac ttcctgttgc acttaggatt tgtggttgtg 120
gatacagcag tgctatcaag gactgggaaa cttttcgttt ctgcaagcaa acatcaaaaa 180
aggagagaac agttataata attcttgatt cagatgatga ggatggaaac actgcaggaa 240
gtaaacagtt gtcaactgtg aagaacgaac aactgacaac atctgaattg gctggagaca 300
aaaacactca aattgttcct tacggtcaaa gtgcggattc aacgaatcag cttcctttgc 360
aaaccagctt gcaaccatct attgagtttg agagaattat gttgcagaaa agacctgatg 420
aggagcgtat tcaagatcta gtggctgaga ggaaacgacg gaaatcagac cacagctccc 480
aggtgaatgg agacgctgca accgccccaa gacaaagaaa aagaaaaggc gagcagaatc 540
cagcagcagt tgatttcccc ttcggtttac aacaaactga tagcccctca gaaacctaca 600
agcctatgga gaaagaggag aaaccaggaa aaacaagtga tcatcttgag gatctttgga 660
atggttttac actggctatg gaaagctcaa agcttgacac atctgaagag gtagccaatg 720
ataaacaagt ggacaatgaa aaagaggtgg acaatgactg caatcatgac attcgtgttc 780
acgaagacct gggccatgta tgtcgtgtct gtggtatgat tgtgagaagt gctgattcaa 840
taattgatta tcagtggaaa aag 863
<210> 8
<211> 540
<212> DNA
<213> PH01001683G0200
<400> 8
gaaggtgatc cccgcctgtc aagttttgga ctaatgaaga acagccgtga cggaaaaagt 60
tatagcacca acctggctta caccccacca gagtttctac gaaccggcag agtcatcccc 120
gagagtgtga tatatagcta cggaacagtt ctgttggatc ttttgagcgg gaagcacatt 180
cctcctagtc acgcacttga tttgataaga ggaaagaata tactgttgct gatggattcc 240
tccttagaag ggcaatatgc caatgaagac gcttcaaaat tagttgatct tgcatcgaaa 300
tgtttgcagt ttgaagctag ggacagaccc aatataaagt atctcttgtc ttccgttggg 360
cctcttcaga agcaaaagga ggtggcatca catgtgttaa tgggcattac aaaagccacg 420
tcagtgttgc caaccattct ttcgccactt gggaaggcct gtgccagtat ggaccttaca 480
gcggtacatg atatattgct taaaacgggt tacaaagatg atgaaggtgc cgaaaacgag 540
<210> 9
<211> 621
<212> DNA
<213> PH01000724G0700
<400> 9
gtccattggg atgaaccttc ttccatcttg cgtccagaga gagtatcacc atgggatttg 60
gaacctcttg ttgcaactac tccttcgaac tcccaaccta tgcagaggaa caagcggcca 120
cggccatctg tcttgccctc accaacagcc aatctttctg cacttggtat gtggaaacct 180
tcggttgagt cttcagcttt ctcatatggt gaatcacaac gtggacgaga cccttatcca 240
tcacccaatt tctctaccac tgcaaaggcc aactctctta gcttctgtgg caatagtcaa 300
gtgaccagtg tttcgccgaa ttcaatgtat cggcctaacc aagtggaaag tgtcacagat 360
tcttttgctc cagttgtaaa caaagatttg ggagaaagga gacagggtac tgggattggc 420
tacagacttt tcgggattca acttattgac aatttcaatg cagaaggaac ttcaccagtg 480
gttactgtgt ctggaacagt gggcaatgat cgcccggttg tgtctttaga ggctgagtct 540
gatcagcatt ctgagcctga gaaatcatgt ctgagatctc atcaggagtt gcaaagtagg 600
caaatcagga gctgcacaaa g 621
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01002436G0250 -F
<400> 10
caccatcccg ttcctcatga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01002436G0250 -R
<400> 11
cgaagatggc cacgtactcg 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> PH01002004G0190 -F
<400> 12
ccccgcctgg tgtacgtc 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> PH01002004G0190 -R
<400> 13
gtggtcgcgg gtgttgtt 18
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01000391G0210 -F
<400> 14
tgtccttacc cacgaacgag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01000391G0210 -R
<400> 15
cgaccaagga ccctcaacaa 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01003949G0150 -F
<400> 16
tgcatttgcc tcctggtgat 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01003949G0150 -R
<400> 17
agctcaaccg gtcttgtctg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01000798G0710 -F
<400> 18
ggagaagacc gacgtgttcg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01000798G0710 -R
<400> 19
atgatcttgg ggtcgcactg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01000048G0850 -F
<400> 20
aataccaatt cacccgctgg 20
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> PH01000048G0850 -R
<400> 21
gtggaataca cctcgaggat ca 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01002058G0150 -F
<400> 22
agaggtggac aatgactgca 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01002058G0150 -R
<400> 23
gtgcaacagg aagtgcaagg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01001683G0200 -F
<400> 24
cctcctagtc acgcacttga 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01001683G0200 -R
<400> 25
aactctggtg gggtgtaagc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01000724G0700 -F
<400> 26
acccgggtgg agatctactg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> PH01000724G0700 -R
<400> 27
cgatgtcctg tccatctcgg 20
<210> 28
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgtaagtgga cgaaacacaa gaagaa 56
<210> 29
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc cttttacccg tcaatcaaac ctta 54
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cgtcgtcagc tgcttcaac 19
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tctacaagca gcctcctcct 20
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> NTB-F
<400> 32
aatagctgtc cctggaggag ttt 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> NTB-R
<400> 33
tcttgtttga caccgaagag gag 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> actin-1-F
<400> 34
atacgcttcc tcacgctatt ctt 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> actin-1-R
<400> 35
ccgagcttct cctttatgtc cct 23

Claims (10)

1.一种毛竹原生质体环状RNA过表达体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）毛竹核酸的提取；（2）环状RNA的验证；（3）环状RNA过表达重组质粒的构建；（4）环状RNA过表达重组质粒转化毛竹原生质体；（5）环状RNA过表达的检测。
2.根据权利要求1所述一种毛竹原生质体环状RNA过表达体系的构建方法，其特征在于：步骤（2）环状RNA 的验证包括：基于转录组测序所得环状RNA基因序列，设计环状RNA“背靠背”引物；所述转录组测序所得环状RNA基因序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:9所示；所述状RNA“背靠背”引物序列如SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:27所示。
3.根据权利要求1所述一种毛竹原生质体环状RNA过表达体系的构建方法，其特征在于：环状RNA过表达重组质粒的构建包括：目的基因的扩增；利用Gateway方法先将目的基因连接到入门载体；然后将入门载体上的目的基因连接到终载体上获得环状RNA过表达重组质粒。
4.根据权利要求3所述一种毛竹原生质体环状RNA过表达体系的构建方法，其特征在于：目的基因扩增时的特异性引物5’端带有attB-位点接头；所述入门载体为pDONR207；所述终载体为pUC19-35s-sGFP。
5.根据权利要求1所述一种毛竹原生质体环状RNA过表达体系的构建方法，其特征在于：所述目的基因扩增时的特异性引物序列如SEQ ID NO:28：5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCGTAAGTGGACGAAACACAAGAAGAA-3’和SEQ ID NO:29：5’GGGGAC
CACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTTTTACCCGTCAATCAAACCTTA-3’所示，其中下划线加粗部分即attB识别位点。
6.根据权利要求1所述一种毛竹原生质体环状RNA过表达体系的构建方法，其特征在于，
环状RNA过表达重组质粒转化毛竹原生质体，包括以下步骤：
（1）分离原生质体
材料：取土里生长2周的毛竹幼苗，嫩芽部位；
酶解：使用刀片纵切嫩芽，将切下的碎条置于20mL酶解液中，25℃，50rpm，避光酶解3h；55℃水浴10min，逐渐冷却至室温；随后加入0.2 mL 1 M CaCl2，0.2 mL质量体积百分比浓度为10%的BSA，使用0.45μm滤膜过滤；
过滤：酶解后，使用等体积的W5 solution清洗3-5遍，之后使用40μm的尼龙网过滤到50ml 离心管中，离心1500rpm，3min，冰上静置30min，用移液器吸去上清，得到原生质体沉淀，使用MMG solution 将原生质体沉淀重悬，使用血球计数板在显微镜下观察，不断调整MMG solution的加量直到原生质体浓度在4.2×106个/ml；
（2）原生质体转化
PEG介导的原生质体转化：实验组将10 μg 重组质粒与 100 μL 原生质体混合，混匀后立即加入110μL新鲜配置的 PEG solution介导转化，黑暗条件下，室温孵育20min；空白对照组加入等量ddH2O代替重组质粒，阴性对照组加入等量未携带目的基因的质粒；
终止反应：孵育后，缓慢加入440 μL W5 solution 终止反应，轻柔颠倒混匀， 1500rpm离心3 min得到转化后的原生质体沉淀，使用1.5ml W5 solution缓慢重悬沉淀；
培养：最终将转化后的原生质体转移至培养皿上，25℃光照孵育12-16h；
培养皿需提前用1mL 1wt% BSA溶液 洗涤，洗涤后将皿中的BSA溶液弃掉；
酶解液配方：质量体积百分比浓度为1.5% Cellulase R10，质量体积百分比浓度为0.75% Macerozyme R-10，10 mM MES，0.6 M mannitol ，PH 5.7；
W5 solution配方：154 mM NaCl，125 mM CaCl2，5 mM KCl ，2 mM MES，pH 5.7；
MMG solution 配方：0.6 M mannitol，15 mM MgCl2，4 mM MES，pH 5.7；
PEG solution 配方：质量体积百分比浓度为40% PEG 4000，0.2 M mannitol，水浴60℃，直至粉末溶解，逐渐降至40℃，随后加入0.1 M CaCl2。
7.根据权利要求1所述一种毛竹原生质体环状RNA过表达体系的构建方法，其特征在于，
所述步骤（5）环状RNA过表达的检测为：提取转化后毛竹原生质体的Total RNA，并将其反转录成cDNA，稀释5倍，取1uL为模板，取环状RNA“背靠背”正反向引物各1 μL，Premix Taq25 μL，加 ddH2O 至 50 μL，按照94 ℃ 30s, 58 ℃ 30s, 72 ℃ 30 s进行40个循环PCR反应，检测环状RNA的过表达，以actin-1基因为内参。
8.如权利要求1所述一种毛竹原生质体环状RNA过表达体系的构建方法在过表达环状RNA对宿主基因影响中的应用。
9.根据权利要求8所的述应用，其特征在于：设计环状RNA宿主基因的特异性引物，对已建立原生质体环状RNA过表达体系毛竹的宿主基因进行半定量PCR，以actin-1为内参基因，检测过表达环状RNA对宿主基因的影响。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述宿主基因为PH01000724G0700 基因，环状RNA宿主基因的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID NO: 30；反向引物序列如SEQ IDNO:31。
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