CN105145355A - 毛竹原生质体培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了毛竹Phyllostachys？edulis原生质体培养的方法，它是通过对胚性愈伤组织进行酶解，将酶解后获得的原生质体进行过滤、离心和纯化，然后将纯化后的原生质体在适当的培养基上培养，使得原生质体再生细胞壁、形成胚性愈伤组织、并萌发形成再生植株，最后再生植株经过壮苗、炼苗后移栽成活。本发明解决了毛竹原生质体培养的技术难题，为实现毛竹的细胞工程育种提供了技术平台，也为其他竹类植物的相关研究提供了参考。
Description
技术领域
本发明涉及林木生物技术和细胞工程育种领域，特别涉及到毛竹原生质体培养。
背景技术
作为植物细胞工程的重要组成部分，原生质体培养技术兴起于上世纪六七十年代，几十年来被广泛应用于植物的遗传和育种学研究领域。随着基因工程的发展，原生质体系统同时也成为基因表达及细胞内定位的重要工具，在生物技术领域发挥着重要的功能。
1960年，Cocking采用酶法分离原生质体获得成功，提供了一种大量制备有活力的原生质体的方法，开创了植物原生质体培养和细胞杂交的研究领域(参考文献1)。
1971年，Nagata和Takebe从培养的烟草叶肉原生质体获得完整的再生细胞，极大地推动了这方面的研究(参考文献2)；
1972年，Carlson用NaNO3做融合剂将两种烟草的原生质体融合，培养出世界上第一株体细胞杂种(参考文献3)；
原生质体培养技术的突破，促使人们期望通过体细胞杂交来转移目标性状进而实现植物的遗传改良，成为遗传育种学研究的新手段，随着培养技术的不断进步，原生质体培养技术相继在禾本科植物上取得成功，成为禾本科作物育种的重要途径。
1995年，Spangenberg等通过原生质体培养实现了多花黑麦草与高羊茅的体细胞杂交，将后者的CMS转移到前者(参考文献4)；
1998年，Kisakaetal.获得水稻与大麦的族间体细胞杂种的再生植株并结实(参考文献5)；
2003年，Xiaetal.利用小麦与高冰草获得可育杂种植株，并将高冰草的优质、耐盐等目标性状转入小麦(参考文献6)。这些研究工作极大地鼓舞了其他植物的原生质体培养热情，推动着这一繁琐而又复杂的培养体系不断地发展进步。
关于竹类植物原生质体培养的研究，报道甚少。1990年Huangetal.利用蓬莱竹Bambusamultiplex和绿竹Bambusaoldhamii的愈伤组织，在1％的纤维素酶(Cellulysin)、2％的崩溃酶(Driselase)和1％的果胶酶(Pectolysase)上，于12℃、80rmp酶解16h，获得原生质体；然后在附加BSA、arpinineHCl、MES以及0.6Mmannitol的培养基上，蓬莱竹原生质体成活率达60％，绿竹达40％，但未见植株再生(参考文献7)。
1994年阙国宁等以Dendrocalamusmembranceus茎段为材料诱导出愈伤组织，然后在添加4％纤维素酶(Cellulase)R-10、2％离析酶(Macerozyme)和0.25％果胶酶(Pectinase)的培养基上，在40-50rpm、28℃的黑暗条件下酶解6h，过滤、离心及纯化后获得了活力80％以上的原生质体，其产量达到了每克鲜重2.5×105个原生质体，但未见原生质体继代培养及植株再生(参考文献8)。
竹类植物原生质体培养的滞后，主要归咎于其再生体系的不够完善。竹是无形成层的特殊木本植物，其再生技术不同于普通的木本植物和草本植物，离体再生难度大，尽管国内外已有较多竹子愈伤组织再生的报道，但是多数研究存在重复性差、再生效率低等缺点，特别是制备再生原生质体的最佳材料-胚状体系统匮乏，阻碍了其原生质体培养的研究。虽然同为禾本科植物，但是竹子不如农业作物的经济价值高，因此相应的研究投入和重视度都不够，最终形成了竹类植物几无原生质体成功再生的现状。
鉴于竹类植物由于开花结实习性特殊导致的种质创新困难、育种技术匮乏等问题，本发明提供了毛竹原生质体培养的方法，从而为毛竹的细胞工程、基因工程以及分子生物学的研究提供技术平台，具有一定的理论研究价值，也能推动竹子的种质资源创新工作，具有重要的生产实践意义。
主要参考文献
1.CockingEC(1960)Amethodfortheisolationofplantprotoplastsandvacuoles.1960，Nature187，962-963；doi：10.1038/187962a0
2.NagataT，TakebeI(1970)Cellwallregenerationandcelldivisioninisolatedtobaccomesophyllprotoplasts.Planta，92(4)：301-308
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7.HuangLC，HuangBL，ChenWL.(1990)Tissuecultureinvestigationsofbamboo.V.Recoveryofcallusfromprotoplastsofsuspension-culturedBambusacells.BotBullAcadSin，31：29-34.
8.阙国宁，诸葛强(1994)黄竹细胞悬浮培养和原生质体分离.林业科学研究，7(1)：44-47
本发明的特点
纵观国内外对竹类植物原生质体培养的研究现状可知，当前仅有个别竹种被尝试应用于开展原生质体的培养，且研究局限于原生质体的分离阶段，尚未有实现植株再生的报道。作为我国和世界上最常见、最重要的竹种之一，目前尚未见关于毛竹原生质体培养的报道。对于开花结实习性特殊的竹类植物而言，原生质体培养体系的构建可以避开开花结实等常规育种途径的限制，通过细胞途径实现种质创新，显著推动其遗传学和育种学领域的深入研究，具有重要的理论和实践价值。经过开展大量研究和实验，并对同类研究进行了重要改进，发明人掌握了毛竹原生质体培养的关键技术，在国际上首次公开毛竹原生质体培养的方法。
发明内容
毛竹Phyllostachysedulis原生质体培养的方法，其特征包括：胚性愈伤组织的酶解，原生质体的分离与纯化，原生质体的培养，愈伤组织的分化，以及壮苗、炼苗和移栽过程，具体步骤如下：
(1)胚性愈伤组织的酶解：选择致密淡黄色的毛竹胚性愈伤组织若干，将其放置在愈伤组织增殖培养基上，26℃暗培养7-15d，边缘生长出白色较疏松的胚性愈伤组织，愈伤组织增殖培养基是以MS培养基为基础，添加1-3mg/L的2，4-D、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、30g/L的葡萄糖、8g/L的琼脂粉；然后将刚长出的白色较疏松的胚性愈伤组织分离，放入装有酶解液的培养皿中，并将培养皿置于70rpm的摇床上进行避光酶解3-5h，酶解液由2％的cellulase、1.5％的macerozyme、0.1％的MES、0.7M的manitol、0.1％的CaCl2·2H2O、1％的BSA组成，pH＝5.80；
(2)原生质体的分离与纯化：将酶解后的溶液用40μm的细胞筛进行过滤，收集过滤液体，在4℃条件下设100-200g离心10-15min，小心倒掉上清液，加入4℃预冷的改良MS培养液使原生质体重新悬浮，然后再离心，如此反复3-4次直至酶解液完全洗净，最后将洗净后的原生质体用4℃预冷的MS培养液悬浮保存；改良MS培养液是以MS培养基为基础，添加10g/L的甘露醇、5g/L的山梨醇、10g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖；
(3)原生质体的培养：将原生质体悬浮液小心地吸取混合到原生质体培养基上，调整密度为1-20×105个/ml，26℃黑暗培养10-20d，期间每隔24h观测原生质体的生长状况，直至原生质体再生细胞壁，继而形成愈伤组织；原生质体培养基是以MS培养基为基础，添加10g/L的甘露醇、5g/L的山梨醇、100mg/L的抗坏血酸、750mg/L的氯化镁、40mg/L的半胱氨酸，40mg/L的天门冬酰胺、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、10g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖；
(4)愈伤组织的分化：将原生质体再生的愈伤组织转接到分化培养基上，26℃光培养30-50d，光照时间12h/d，光照强度1000-1500lux，使愈伤组织分化成苗，形成再生植株；分化培养基是以MS培养基为基础，添加0.5-2.0mg/L的ZT、0.5-3.0mg/L的IBA、0.5-2.0mg/L的NAA、30g/L的麦芽糖、8g/L的琼脂；
(5)壮苗、炼苗和移栽：将再生的小植株接种到壮苗培养基上培养30-50d，开瓶炼苗5-10d，取出小苗清洗根部的培养基，再用0.1％的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质中，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活；壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加1-4mg/L的NAA、0.2-0.5mg/L的TDZ、8g/L的琼脂、30g/L的蔗糖。
具体实施方式
下面结合毛竹Phyllostachysedulis实例对本发明进行详细说明。
(1)选择致密淡黄色的毛竹胚性愈伤组织若干，放置在以MS培养基为基础，添加3mg/L的2，4-D、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、30g/L的葡萄糖、8g/L的琼脂粉的培养基上，26℃暗培养10d，愈伤组织边缘生长出白色较疏松的胚性愈伤组织；将白色较疏松的胚性愈伤组织分离下来，放入含2％的cellulase、1.5％的macerozyme、0.1％的MES、0.7M的manitol、0.1％的CaCl2.2H2O、1％的BSA，pH为5.80的酶解液的培养皿中，置于70rpm的摇床上进行避光酶解培养3h；
(2)用40μm的细胞筛过滤酶解后的溶液，收集过滤液体，4℃条件下200g离心10min，小心倒掉上清液，加入4℃预冷的以MS培养基为基础，添加10g/L的甘露醇、5g/L的山梨醇、10g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖的MS培养液，使原生质体重新悬浮，再次离心，如此反复3次，将洗净后的原生质体用4℃预冷的MS培养液悬浮，备用；
(3)用胶头滴管吸取原生质体悬浮液，小心地混合到以MS培养基为基础，添加10g/L的甘露醇、5g/L的山梨醇、100mg/L的抗坏血酸、750mg/L的氯化镁、40mg/L的半胱氨酸，40mg/L的天门冬酰胺、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、10g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖的原生质体培养基上，调整密度约为1×106个/ml，26℃黑暗培养，24h后在显微镜下可以看到原生质体再生出细胞壁，7d后肉眼可以看到小细胞团形成，14d后愈伤组织长成直径约0.5mm的团块；
(4)将原生质体再生的愈伤组织转接到以MS培养基为基础，添加0.5mg/L的ZT、1.0mg/L的IBA、0.5mg/L的NAA、30g/L的麦芽糖、8g/L的琼脂的分化培养基上，26℃光照培养30d，多数愈伤组织分化成苗，形成再生植株；光照时间12h/d，光照强度1000-1500lux；
(5)将再生的小植株接种到以MS培养基为基础，添加2mg/L的NAA、0.2mg/L的TDZ、8g/L的琼脂、30g/L的蔗糖的壮苗培养基上培养30d，开瓶炼苗7d，取出小苗清洗根部的培养基，再用0.1％的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质中(山地黄壤土∶蛭石∶泥炭土＝1∶1∶1)，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活。
Claims (1)
1.毛竹Phyllostachysedulis原生质体培养的方法，其特征包括：胚性愈伤组织的酶解，原生质体的分离与纯化，原生质体的培养，愈伤组织的分化，以及壮苗、炼苗和移栽过程，具体步骤如下：
(1)胚性愈伤组织的酶解：选择致密淡黄色的毛竹胚性愈伤组织若干，将其放置在愈伤组织增殖培养基上，26℃暗培养7-15d，边缘生长出白色较疏松的胚性愈伤组织，愈伤组织增殖培养基是以MS培养基为基础，添加1-3mg/L的2，4-D、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、30g/L的葡萄糖、8g/L的琼脂粉；然后将刚长出的白色较疏松的胚性愈伤组织分离，放入装有酶解液的培养皿中，并将培养皿置于70rpm的摇床上进行避光酶解3-5h，酶解液由2％的cellulase、1.5％的macerozyme、0.1％的MES、0.7M的manitol、0.1％的CaCl2·2H2O、1％的BSA组成，pH＝5.80
(2)原生质体的分离与纯化：将酶解后的溶液用40μm的细胞筛进行过滤，收集过滤液体，在4℃条件下设100-200g离心10-15min，小心倒掉上清液，加入4℃预冷的改良MS培养液使原生质体重新悬浮，然后再离心，如此反复3-4次直至酶解液完全洗净，最后将洗净后的原生质体用4℃预冷的MS培养液悬浮保存；改良MS培养液是以MS培养基为基础，添加10g/L的甘露醇、5g/L的山梨醇、10g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖；
(3)原生质体的培养：将原生质体悬浮液小心地吸取混合到原生质体培养基上，调整密度为1-20×105个/ml，26℃黑暗培养10-20d，期间每隔24h观测原生质体的生长状况，直至原生质体再生细胞壁，继而形成愈伤组织；原生质体培养基是以MS培养基为基础，添加10g/L的甘露醇、5g/L的山梨醇、100mg/L的抗坏血酸、750mg/L的氯化镁、40mg/L的半胱氨酸，40mg/L的天门冬酰胺、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、10g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖；
(4)愈伤组织的分化：将原生质体再生的愈伤组织转接到分化培养基上，26℃光培养30-50d，光照时间12h/d，光照强度1000-1500lux，使愈伤组织分化成苗，形成再生植株；分化培养基是以MS培养基为基础，添加0.5-2.0mg/L的ZT、0.5-3.0mg/L的IBA、0.5-2.0mg/L的NAA、30g/L的麦芽糖、8g/L的琼脂；
(5)壮苗、炼苗和移栽：将再生的小植株接种到壮苗培养基上培养30-50d，开瓶炼苗5-10d，取出小苗清洗根部的培养基，再用0.1％的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质中，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活；壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加1-4mg/L的NAA、0.2-0.5mg/L的TDZ、8g/L的琼脂、30g/L的蔗糖。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |