CN102165920A - 一种水生鸢尾体细胞再生的组培方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水生鸢尾体细胞再生的组培方法，属于植物组织培养技术领域。方法包括：(1)培养基的配制；(2)水生鸢尾脱毒组培苗的培养：(3)组培苗的移栽与培养等步骤。本发明以无菌苗叶片作为胚状体诱导外植体所建立的组培快繁技术体系，具有繁殖系数大、速度快、结构完整、再生率高及生产成本低等特点，与一般器官组培方法相比较，在整个组培周期上缩短了75天，瓶苗增殖系数增加了2.4倍，组培苗生根率和移栽成活率达均100％，适合工厂化育苗，可商品化生产。本方法可在水生鸢尾种苗的企业化生产中推广应用。

Description

一种水生鸢尾体细胞再生的组培方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种利用水生鸢尾体细胞胚进行再生的组培方法。

背景技术

水生鸢尾系鸢尾科鸢尾属的多年生水生植物，原产美国路易斯安娜州。此类鸢尾在北美和欧洲一些国家早已被广泛应用，其花色丰富，花期长达4～5个月，不仅具有花大、色艳、叶花并观等优良观赏性状，而且还有较强的适应性，表现抗寒、耐旱、耐粗放，同时还能在我国长江以南周年保持常绿。目前该系列花卉植物的市场形势看好，但由于其主要以分株、种子进行繁殖，繁殖速度较慢，且费工费时，因此优质苗木供不应求，满足不了市场的需求。

以往水生鸢尾组培快繁都是通过器官发生途径，由外植体分化不定芽后再生植株，故存在外植体诱导愈伤组织周期较长，如从外植体消毒到获得愈伤组织至少需要一个半月，其他各阶段的培养时间也均在一个月左右，导致获得无菌苗速度较慢、繁殖系数不够高、且无菌苗长期连续增殖极易发生退化和变异等缺点。体细胞胚发生是由植物体细胞在离体条件下通过与合子胚类似的发育途径形成新个体的过程，相对于器官发生而言，体细胞胚发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高、后代遗传稳定性高等优点。

浙江省农业科学院从美国引进水生鸢尾新品种后，拟通过体细胞胚再生途径的组培技术大量繁殖无菌苗，以满足国内市场的需要。目前关于水生鸢尾组织培养方面的研究(贾明良，2010；刘慧春，2009；吴月燕，2009；王鹏，2009；杨俊梅，2009；张翼飞，2009；黄洁，2008；朱旭东，2007，2009；徐立军，2005；张金政，2004；黄苏珍，1999，2003；陈德芬，1997)，均是通过器官发生途径再生植株。而通过体细胞胚途径再生植株的研究在槐树(Plata，1990)、香雪兰(王丽，1991；1998)、福禄考(井忠平，1992)、仙客来(李会宁，2001；曲复宁，2003)、长寿花(马国华，2003；王桂兰，2003)、兰考泡桐(Ipekci，2003)、黄枝阔叶椴(Chalupa，2003)、黑种草(Elhag，2004)、月季(瞿素萍，2006)、地被菊(蒋细旺，2008)、多花蔷薇(田传卫，2008)等观赏植物上已有报道。但关于水生鸢尾体细胞胚再生途径的组培技术研究，在国内外均未见报道。

发明内容

本发明目的是，针对水生鸢尾常规组织快繁技术中所存在的外植体诱导愈伤组织周期长、获得无菌苗速度慢、繁殖系数低、无菌苗长期连续增殖极易发生退化和变异等缺陷，提供一种能大量快速繁殖结构完整、再生率高、无菌种苗后代遗传稳定的水生鸢尾组织培养的方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现。

一种水生鸢尾体细胞再生的组培方法，该方法按如下步骤进行：

(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分每升所含重量为：

1)基本培养基：水生鸢尾芽诱导采用MS培养基，叶片胚状体诱导和增殖、壮苗及生根均采用WPM培养基；其中，白糖15～60g/L，琼脂5～8g/L，pH5.6～5.8；

2)芽诱导培养基：MS+6-BA0.5～1.0mg/L和NAA0.2～0.5mg/L；

3)叶片胚状体诱导培养基：WPM+ZT 0.0～1.0mg/L、TDZ 0.25～0.3mg/L和2，4-D 0.0～0.1mg/L；

4)继代增殖培养基：WPM+ZT 0.5～1.0mg/L、TDZ 0.25～0.3mg/L和2，4-D0.05～0.1mg/L；

5)壮苗培养基：WPM+BA0.3～1.0mg/L和NAA0.1～0.3mg/L；

6)生根培养基：WPM+IBA0.5～1.5mg/L+NAA0.5～1.5mg/L；

(2)水生鸢尾脱毒组培苗的培养：

1)外植体的采取与灭菌：取健壮水生鸢尾植株剪除基部以上叶片及根系后的幼嫩芽，经10％洗洁精浸泡8～10min、流水冲洗3～4h后，于超净工作台上用无菌水冲洗干净；用70％酒精浸泡30～60s，再用0.1％升汞水溶液浸泡8～10min进行灭菌后用无菌水冲洗5～6次；将其茎尖组织块拨出、切成0.2～0.5cm³小块作为外植体，备用；

2)芽诱导培养：将上述茎尖外植体接种到步骤(1)2)芽诱导培养基上，在温度25±2℃，光强1500～2500Lx，光照时间12h/d条件下进行芽诱导培养10～20天至诱导形成丛生芽；

3)叶片胚状体诱导培养：将上述丛生芽上的叶片切下并接种到步骤(1)3)叶片胚状体诱导培养基上，在温度25±2℃，光强1500～2500Lx，光照时间12h/d条件下进行胚状体诱导培养15～30天至诱导形成胚状体或芽；

4)继代增殖培养：将上述胚状体或芽转接到步骤(1)4)继代增殖培养基上，在培养温度25±2℃，光强1500～2500Lx，光照时间12h/d条件下进行增殖培养10～15天至形成丛生芽；根据对丛生芽数量的需求，每隔10～20天按同样方法将所形成的丛生芽进行一次再增殖；

5)壮苗培养：将上述丛生芽转接到步骤(1)5)壮苗培养基上，在培养温度25±2℃，光强1500～2500Lx，光照时间12h/d条件下进行壮苗培养20～30天至苗高6～8cm；

6)生根培养：将上述6～8cm高的壮苗转接到步骤(1)6)生根培养基中，在培养温度25±2℃，光强1500～2500Lx，光照时间12h/d条件下进行生根培养15～30天，至基部长出1～5根根系即成水生鸢尾脱毒组培苗；

(3)组培苗的移栽与培养：将长高至10～15cm、长根≥5根的组培苗，移栽至由沙壤土∶泥炭∶黄壤土按体积6∶3∶1的混合基质中，在温度25～28℃，湿度70～85％，光照宜先弱后强并控制在10000lx以下条件下培养1～2个月后，即成水生鸢尾生产苗。

本发明的有益效果是：

1)以无菌苗的叶片作为胚状体诱导的外植体，这在大量节约外植体材料的同时也解决了体细胞再生过程中初代培养的污染问题，从而大大降低了组培成本，提高了效率；

2)建立的水生鸢尾体细胞再生途径的组培快繁技术体系，繁殖系数大、速度快、结构完整、再生率高，与一般的器官发生途径的组培方法比较，在整个组培周期上缩短了75天，瓶苗增殖系数增加了2.4倍，组培苗生根率和移栽成活率达均100％，适合工厂化育苗，可商品化生产。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

对实施例所涉材料的说明：

ZT：玉米素(6-Trans-zeatin Riboside)，Sigma进口国内分装，分析纯，纯度95％。

TDZ：噻苯隆(Thidiazuron)，Sigma进口国内分装，分析纯，纯度99.9％。

2，4-D：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-Dichloropohenoxyacetic acid)，Sigma进口国内分装，分析纯，纯度98％。

6-BA：6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)，Sigma进口国内分装，分析纯，纯度99.9％。

IBA：吲哚-3-丁酸(3-Indole butytic acid)，Sigma进口国内分装，分析纯，纯度99％。

NAA：a-萘乙酸(1-Naphthylacetic acid)，Sigma进口国内分装，分析纯，纯度99.5％。

洗洁精：立白普通洗洁精，广州立白企业集团有限公司生产。

实施例1：(一种水生鸢尾体细胞再生的组培方法1)

(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分在每升培养基中所含重量为：

1)基本培养基：水生鸢尾芽诱导采用MS培养基，叶片胚状体诱导和继代增殖、壮苗及生根培养的培养基均采用WPM基本培养基；其中，琼脂为5g/L，pH5.8；

2)芽诱导培养基：白糖30g/L的MS+6-BA 0.5mg/L和NAA 0.2mg/L；

3)叶片胚状体诱导培养基：白糖30g/L的WPM+ZT 0.5mg/L+TDZ 0.25mg/L和2，4-D 0.1mg/L；

4)继代增殖培养基：白糖为30g/L的WPM+ZT 0.5mg/L+TDZ0.25mg/L和2，4-D 0.1mg/L；

5)壮苗培养基：白糖为30g/L的WPM+BA1.0mg/L和NAA 0.3mg/L；

6)生根培养基：白糖为20g/L的WPM+IBA0.5mg/L+NAA 1.5mg/L；

(2)水生鸢尾脱毒组培苗的培养：

1)外植体的采取与灭菌：取健壮水生鸢尾植株剪除基部以上叶片及根系后的幼嫩芽，经10％立白洗洁精浸泡8min、流水冲洗3～4h后，于超净工作台上用无菌水冲洗干净；用70％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞水溶液浸泡8min进行灭菌后用无菌水冲洗5～6次；将其茎尖组织块拨出、切成0.2cm³小块作为外植体，备用；

2)芽诱导培养：将上述茎尖外植体块接种到步骤(1)2)芽诱导培养基上，在温度25±2℃，光强2000Lx，光照时间12h/d条件下进行芽诱导培养15天至诱导形成丛生芽；

3)叶片胚状体诱导培养：将上述丛生芽上的叶片切下并接种到步骤(1)3)叶片胚状体诱导培养基上，在温度25±2℃，光强2000Lx，光照时间12h/d条件下进行胚状体诱导培养22天至诱导形成胚状体或芽；

4)继代增殖培养：将上述胚状体或芽转接到步骤(1)4)继代增殖培养基上，在培养温度25±2℃，光强2000Lx，光照时间12h/d条件下进行增殖培养12天至形成丛生芽；根据对丛生芽数量的需求，每隔10～20天按同样方法将所形成的丛生芽进行一次再增殖；

5)壮苗培养：将上述丛生芽转接到步骤(1)5)壮苗培养基上，在培养温度25±2℃，光强2000Lx，光照时间12h/d条件下进行壮苗培养25天至苗高6～8cm；

6)生根培养：将上述6～8cm高的壮苗转接到步骤(1)6)生根培养基中，在培养温度25±2℃，光强2000Lx，光照时间12h/d条件下进行生根培养23天，至基部长出1～5根根系即成水生鸢尾脱毒组培苗；

(3)组培苗的移栽与培养：将长高至10～15cm、长根≥5根的组培苗，移栽至由沙壤土∶泥炭∶黄壤土按体积6∶3∶1的混合基质中，在温度28℃，湿度85％，光照宜先弱后强并控制在10000lx以下的条件下培养1～2个月后，即成水生鸢尾生产苗。

实施例2：(一种水生鸢尾体细胞再生的组培方法2)

本实施例，基本培养基中的琼脂为7g/L，pH为5.7；芽诱导培养基为：白糖20g/L的MS+6-BA 0.8mg/L和NAA 0.3mg/L；叶片胚状体诱导培养基为：白糖20g/L的WPM+ZT 1.0mg/L+TDZ 0.28mg/L；继代增殖培养基为：白糖20g/L的WPM+ZT 1.0mg/L+TDZ 0.28mg/L和2，4-D 0.05mg/L；壮苗培养基为：白糖15g/L的WPM+BA 0.5mg/L和NAA 0.1mg/L；生根培养基为：白糖15g/L的WPM+TBA1.0和NAA 0.5mg/L；幼嫩芽经70％酒精浸泡45秒，0.1％升汞水溶液浸泡9分钟后，拨出茎尖组织块并切成0.35cm³小块；芽诱导、叶片胚状体诱导、继代增殖、壮苗及生根培养各阶段的光强均为1500Lx，各阶段培养的时间分别为20天、15天、15天、30天及15天；组培苗移栽培养的温度为25℃，湿度为70％；其余步骤工艺同于实施例1。

实施例3：(一种水生鸢尾体细胞再生的组培方法3)

本实施例，基本培养基中的琼脂为8g/L，pH为5.6；芽诱导培养基为：白糖60g/L的MS+6-BA 1.0mg/L和NAA 0.5mg/L；叶片胚状体诱导培养基为：白糖60g/L的WPM+TDZ 0.3mg/L和2，4-D0.05mg/L；继代增殖培养基为：白糖60g/L的WPM+ZT0.75mg/L，TDZ 0.3mg/L和2，4-D0.075mg/L；壮苗培养基为：白糖30g/L的WPM+BA 0.3mg/L和NAA 0.2mg/L；生根培养基为：白糖30g/L的WPM+IBA1.5和NAA1.0mg/L；幼嫩芽经70％酒精浸泡60秒，0.1％升汞水溶液浸泡10分钟后，拨出茎尖组织块并切成0.5cm³小块；芽诱导、叶片胚状体诱导、继代增殖、壮苗及生根培养各阶段的光强均为2500Lx，各阶段培养的时间分别为10天、30天、10天、20天及30天；组培苗移栽培养的温度为26℃，湿度为75％；其余步骤工艺同于实施例1。

试验例：(水生鸢尾由器官与体细胞胚不同发生途径组培方法的效果对比试验)

1)器官发生途径的组培：本试验例基本培养基均采用MS培养基，培养基中的琼脂为5g/L，pH为5.8；愈伤诱导培养基为：白糖30g/L的MS+6-BA 2.0mg/L和NAA 0.3mg/L；芽分化培养基为：白糖20g/L的MS+6-BA 1.0mg/L和NAA 0.3mg/L；芽增殖培养基为：白糖20g/L的MS+6-BA 1.0mg/L和NAA 0.3mg/L；壮苗培养基为：白糖20g/L的MS+BA 0.2mg/L和NAA 0.1mg/L；生根培养基为：白糖20g/L的MS+NAA0.5mg/L；幼嫩叶片经70％酒精浸泡30秒，0.1％升汞水溶液浸泡6分钟后，将叶片切成0.3cm²小块；愈伤诱导、芽分化、芽增殖、壮苗、生根各阶段的培养温度为25+2℃，光强均为1500Lx，各阶段培养的时间分别为45天、40天、27天、30天及30天；组培苗移栽培养的温度为28℃，湿度为80％；

2)体细胞胚发生途径的组培：本试验的步骤、工艺均同于实施例1。

通过对比试验可以看出，水生鸢尾由本发明体细胞胚作为发生途径的组培方法比对照，在整个组培周期上缩短了75天，瓶苗的增殖系数增加了2.4倍、苗子质量如生根率和移栽成活率均达100％，因此育苗成本有了显著下降。具体结果见表1：

表1不同发生途径组培方法对比

Claims (1)

1.一种水生鸢尾体细胞再生的组培方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分每升所含重量为：

1)基本培养基：水生鸢尾芽诱导采用MS培养基，叶片胚状体诱导和增殖、壮苗及生根均采用WPM培养基；其中，白糖15～60g/L，琼脂5～8g/L，pH5.6～5.8；

2)芽诱导培养基：MS+6-BA0.5～1.0mg/L和NAA0.2～0.5mg/L；

3)叶片胚状体诱导培养基：WPM+ZT 0.0～1.0mg/L、TDZ 0.25～0.3mg/L和2，4-D 0.0～0.1mg/L；

4)继代增殖培养基：WPM+ZT 0.5～1.0mg/L、TDZ 0.25～0.3mg/L和2，4-D0.05～0.1mg/L；

5)壮苗培养基：WPM+BA0.3～1.0mg/L和NAA0.1～0.3mg/L；

6)生根培养基：WPM+IBA0.5～1.5mg/L+NAA0.5～1.5mg/L；

(2)水生鸢尾脱毒组培苗的培养：

1)外植体的采取与灭菌：取健壮水生鸢尾植株剪除基部以上叶片及根系后的幼嫩芽，经10％洗洁精浸泡8～10min、流水冲洗3～4h后，于超净工作台上用无菌水冲洗干净；用70％酒精浸泡30～60s，再用0.1％升汞水溶液浸泡8～10min进行灭菌后用无菌水冲洗5～6次；将其茎尖组织块拨出、切成0.2～0.5cm³小块作为外植体，备用；

2)芽诱导培养：将上述茎尖外植体接种到步骤(1)2)芽诱导培养基上，在温度25±2℃，光强1500～2500Lx，光照时间12h/d条件下进行芽诱导培养10～20天至诱导形成丛生芽；

3)叶片胚状体诱导培养：将上述丛生芽上的叶片切下并接种到步骤(1)3)叶片胚状体诱导培养基上，在温度25±2℃，光强1500～2500Lx，光照时间12h/d条件下进行胚状体诱导培养15～30天至诱导形成胚状体或芽；

4)继代增殖培养：将上述胚状体或芽转接到步骤(1)4)继代增殖培养基上，在培养温度25±2℃，光强1500～2500Lx，光照时间12h/d条件下进行增殖培养10～15天至形成丛生芽；根据对丛生芽数量的需求，每隔10～20天按同样方法将所形成的丛生芽进行一次再增殖；

5)壮苗培养：将上述丛生芽转接到步骤(1)5)壮苗培养基上，在培养温度25±2℃，光强1500～2500Lx，光照时间12h/d条件下进行壮苗培养20～30天至苗高6～8cm；

6)生根培养：将上述6～8cm高的壮苗转接到步骤(1)6)生根培养基中，在培养温度25±2℃，光强1500～2500Lx，光照时间12h/d条件下进行生根培养15～30天，至基部长出1～5根根系即成水生鸢尾脱毒组培苗；

(3)组培苗的移栽与培养：将长高至10～15cm、长根≥5根的组培苗，移栽至由沙壤土∶泥炭∶黄壤土按体积6∶3∶1的混合基质中，在温度25～28℃，湿度70～85％，光照宜先弱后强并控制在10000lx以下条件下培养1～2个月后，即成水生鸢尾生产苗。