CN101418279A - 来自巴西鸢尾的富含类黄酮的组织及其培养方法 - Google Patents

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CN101418279A CNA2007101673403A CN200710167340A CN101418279A CN 101418279 A CN101418279 A CN 101418279A CN A2007101673403 A CNA2007101673403 A CN A2007101673403A CN 200710167340 A CN200710167340 A CN 200710167340A CN 101418279 A CN101418279 A CN 101418279A
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Abstract

本发明提供了巴西鸢尾(Neomarica gracilis)的富含类黄酮的离体根茎组织，其由能够增殖的巴西鸢尾(N.gracilis)组织的组织培养法(preparation)获得，所述能够增殖的巴西鸢尾组织的例子如根、叶、叶的基部和/或根茎。巴西鸢尾富含类黄酮的离体根茎组织含有鸢尾黄素酮，其明显不同于天然生长的不合有鸢尾黄素酮的巴西鸢尾根茎。本发明还提供一种用于培养富含类黄酮的离体根茎组织的方法、一种由富含类黄酮的组织提取鸢尾黄素酮的方法以及用于确定富含类黄酮的离体根茎组织中鸢尾黄素酮数量的定量方法。

Description

来自巴西鸢尾的富含类黄酮的组织及其培养方法
相关申请
本专利申请要求2007年5月1日提交的、美国专利申请第11/797,145号的优先权，此处通过引用将其并入本文。
技术领域
本发明涉及巴西鸢尾(Neomarica gracilis)的富含类黄酮的离体根茎组织，其通过使用能够增殖的巴西鸢尾(N.gracilis)组织的组织培养法获得，所述能够增殖的巴西鸢尾组织的例子如根、叶、叶的基部和/或根茎。巴西鸢尾富含类黄酮的根茎组织含有鸢尾黄素酮，其明显不同于野生的不含有鸢尾黄素酮的巴西鸢尾根茎。本发明还提供一种用于培养富含类黄酮的离体根茎组织的方法、一种由富含类黄酮的根茎组织提取鸢尾黄素酮的方法以及用于确定富含类黄酮的根茎组织中鸢尾黄素酮数量的定量方法。
背景技术
植物化学成分是植物天然形成的用来保护自身对抗细菌、病毒和真菌的物质。由于多数的植物化学成分表现出延缓衰老过程并降低癌症、心脏病及其他慢性健康状况风险的作用，因此近年来植物化学成分受到较多的关注。
已经在植物食品中发现超过900种不同的植物化学成分，但其中仍然有其他的成分有待发现。水果、蔬菜、全谷食品(whole grains)、大豆和坚果是这些抗击疾病的物质的所有来源。植物化学成分通常涉及植物色素，因此具有鲜艳色彩(黄色、橙色、红色、蓝色、紫色、绿色)的水果和蔬菜含有的植物化学成分最多。
类黄酮是一类植物化学成分，很长时间以来已经被公认具有抗炎、抗氧化、抗变应性、肝脏保护、抗血栓、抗病毒和抗癌活性。类黄酮是典型的酚类化合物，因此可作为有效的金属螯合剂和自由基清除剂起作用。它们均为强效的断链抗氧化剂。类黄酮显示出强大的生物化学和药理学作用阵容，其中的某些作用表明此类化合物中的某些成员可以显著地影响各种哺乳动物细胞系统的功能。近年来的报道指出植物类黄酮引起参与控制固氮作用的细菌(根瘤菌(Rhizobium))调节基因的活化，其表明特定的类黄酮与哺乳动物基因的活化和表达之间存在重要的相关性(参见：如Midddledton等人，Pharmacological Reviews，2000，52：673-751)。
鸢尾黄素酮属于黄酮类化合物。近年来，对于鸢尾黄素酮潜在效应的开发取得了一定进展，鸢尾黄素酮已经表现出抗菌、抗炎和预防癌症的活性。此外，已经证明鸢尾黄素酮刺激前列腺素的生成、诱导巨噬细胞的增殖、选择性地调节雌激素受体的活性并且控制平滑肌的收缩。
鸢尾黄素酮通常由鸢尾科植物提取，鸢尾科植物的例子如德国鸢尾(Iris germanica L.)、香根鸢尾(Iris pallida Lam)、全唇鸢尾(Iris nigricans)、花菖蒲(Iris ensata)、溪荪(Iris sanguinea)、山鸢尾(Iris setosa)和射干(Belamacanda chinensis)(B.chinensis)。根茎中的鸢尾黄素酮含量受生长条件的影响，比如温度和湿度。至于射干，在能够收割其根茎用于提取鸢尾黄素酮之前，通常需要生长2-3年。因此，仍然存在对能够使得具有高鸢尾黄素酮含量的植物有效生长的方法的需求。
巴西鸢尾(Neomarica gracilis)(N.gracilis)是很常见的园艺植物，其属于鸢尾科。巴西鸢尾可以较低的成本大规模地进行栽培。然而，天然生长的巴西鸢尾的根茎不含有鸢尾黄素酮。
在本发明随后部分提出的，巴西鸢尾的离体根茎由组织培养法获得，可以在大约1或2个月后进行收割。巴西鸢尾的离体根茎富含类黄酮并且含有高浓度的鸢尾黄素酮，这种根茎可以作为鸢尾黄素酮的来源使用。
发明内容
本发明提供巴西鸢尾富含类黄酮的离体组织，其在组织培养环境下制备，所述组织培养环境可改变野生巴西鸢尾的类黄酮含量。特别地，本发明富含类黄酮的组织含有大量的鸢尾黄素酮。
巴西鸢尾富含类黄酮的离体组织优选为根茎组织，其通过将能够增殖的巴西鸢尾组织进行培养获得。能够增殖的巴西鸢尾组织的例子包括巴西鸢尾的根、根茎、叶和叶的基部。
在制备富含类黄酮的巴西鸢尾组织的组织培养中使用了培养基。这种培养基包括(1)植物生长调节剂，(2)盐培养基和(3)碳水化合物。植物生长调节剂(PGR)包括细胞分裂素或生长素。PGR的例子包括但不限于吲哚-3-乙酸、2-4-二氯苯氧基乙酸、α-萘乙酸、6-苯甲基-氨基嘌呤、激动素和/或其混合物。植物生长调节剂优选浓度约0.01-2.0mg/L。优选的盐培养基为Murashige和Skoog基础盐培养基(即MS培养基)，其包括但不限于下述的盐：钠、钾、硝酸盐、铵、镁、硫酸盐、钙、铁、氯化物、磷酸盐、锰、碘、硼酸盐、锌、铜、钼、钴或其混合物。碳水化合物的例子包括肌醇、蔗糖或其混合物。任选地，培养基可以含有维生素，所述维生素的例子如盐酸硫胺素、吡哆醇盐酸盐和烟酸以及嘧啶醇。培养基具有约5-7的pH。
组织培养法包括优选在震摇条件下的瓶培养、间歇浸没系统(TIS)或其组合。
来自巴西鸢尾的富含类黄酮的组织含有鸢尾黄素酮的含量为每Kg重量干燥组织约2.5-65mg。8周后，MS0(即没有加入植物生长调节剂的MS培养基)中固体组织培养物的类黄酮总量为每g干重的富含类黄酮的组织约含10.74mg(基于使用ψ-鸢尾黄素酮作为标准物的测量值)。
本发明还提供一种由巴西鸢尾获得富含类黄酮的离体组织的方法。所述方法包括(1)将巴西鸢尾组织接种于组织培养物的培养基；和(2)使组织培养物中的巴西鸢尾组织生长足够长的时间以允许根茎组织形成。巴西鸢尾组织能够进行下述部位的细胞复制，如根、叶、叶的基部或根茎。
优选将培养基保持在约20℃-30℃。
组织培养为瓶培养、间歇浸没系统(TIS)或其组合。
用于形成巴西鸢尾富含类黄酮的根茎组织的足够长时间约为4-8周。
TIS允许巴西鸢尾组织有待每隔2-4小时浸入培养基中约1-3分钟。
本发明还提供一种由巴西鸢尾富含类黄酮的组织提取鸢尾黄素酮的方法。所述方法包括：(1)干燥来自巴西鸢尾的富含类黄酮的离体组织以便获得干燥的富含类黄酮的组织；(2)将醇加至干燥的富含类黄酮的组织以形成悬浮液；(3)加热所述悬浮液至形成热悬浮液；和(4)在所述热悬浮液冷却后过滤所述热悬浮液以便收集含有鸢尾黄素酮的滤液。干燥富含类黄酮的离体组织的优选方法为冷冻干燥法。加热悬浮液的优选方式是使用超声波振动，同时将该悬浮液在约50-70℃加热约1小时。可以加至干燥的、富含类黄酮的离体组织的醇的例子为甲醇或乙醇。任选地，在加入醇之前可以将干燥的富含类黄酮的离体组织磨细。优选通过使热悬浮液经过
Figure A200710167340D00091
 1号滤纸来收集滤液。
通过高效液相色谱(HPLC)测定由巴西鸢尾富含类黄酮的组织提取的鸢尾黄素酮总量。优选的用于HPLC的柱子为
Figure A200710167340D00092
 5 C18-AR-II柱。优选的洗脱液为含有体积比55:45的甲醇与水(含有0.1％的乙酸)的溶液。使用ψ-鸢尾黄素酮 T-9165)作为标准物在大约265nm处测量鸢尾黄素酮的含量。
附图说明
图1为显示间歇浸没系统的图，该间歇浸没系统是本发明中使用的两个组织培养系统中的一个(另一个组织培养系统是瓶培养系统)。
图2为显示瓶培养中巴西鸢尾富含类黄酮的离体根茎组织的接种重量比对生长速率的影响图。对MS培养基(Murashige和Skoog培养基)中培养的根茎组织进行为期3周的数据采集，其中所述MS培养基含有0.5mg/L的6-苯甲基-氨基嘌呤(BA)、0.1mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和0.84mg/L的α-萘乙酸(NAA)。每个数据点表示3次重复实验的平均值并且误差范围(error bars)代表平均值的标准误。
图3是显示吲哚-3-乙酸(IAA)和激动素对巴西鸢尾富含类黄酮的离体根茎组织中生物量增长的影响图，其中根茎组织由瓶培养获得。每个数据点表示3次重复实验的平均值并且误差范围代表平均值的标准误。增长的生物量＝目前的鲜重-2周以前的鲜重。
图4是显示在MS培养基中培养8周的巴西鸢尾的生长曲线图，所述MS培养基含有0.1mg/L(◆)的α-萘乙酸(NAA)。每个数据点(ata)表示3次重复实验的平均值并且误差范围代表平均值的标准误。
图5是显示在0.1mg/L(○)的MS+NAA或1mg/L的NAA以及0.1mg/L的2，4-D(■)中培养8周的富含类黄酮的根茎中鸢尾黄素酮的含量图。每个数据点表示3次重复实验的平均值并且误差范围代表平均值的标准误。
图6是显示在嘧啶醇存在的条件下，巴西鸢尾根茎组织的幼芽形成的合成图像。在培养三周后进行拍摄。标尺＝1cm。板(a)：于第7天加入0.5mg/L的嘧啶醇；板(b)：于第7天加入2.0mg/L的嘧啶醇；板(c)：于第14天加入2.0mg/L的嘧啶醇，以及板(d)无任何嘧啶醇的对照培养。
图7显示接种物重量和植物生长调节剂(PGR)对巴西鸢尾根茎组织生长速度的影响图。每个数据点表示3次重复实验的平均值并且误差范围代表平均值的标准误。生长速度＝(最后的F.W.-最初的F.W.)/最初的F.W.
发明详述
本发明一方面涉及巴西鸢尾富含类黄酮的组织，其由能够增殖和进行细胞复制的巴西鸢尾组织的组织培养获得，所述能够增殖和进行细胞复制的巴西鸢尾组织的例子如根、叶、叶的基部和根茎。所述富含类黄酮的组织为离体的根茎组织，其由于含有鸢尾黄素酮而明显不同于野生巴西鸢尾的根茎。近年来的研究已经证明鸢尾黄素酮具有消除自由基、拦截肿瘤进程以及抑制致病菌和真菌，如幽门螺杆菌(h.pylori)和霉菌等的药物疗效。
鸢尾黄素酮具有如下所示的化学结构式：
鸢尾黄素酮广泛地存在于多种鸢尾科和豆科植物的根茎或根中，所述鸢尾科和豆科植物的例子如盐沼鸢尾(Iris spuria)、Iris carthaliniae和德国鸢尾(Iris germanica)以及葛藤(pueraria thunbergiana)。然而，这些植物中的鸢尾黄素酮含量太低以致于不能作为鸢尾黄素酮的来源使用。
鸢尾黄素酮的主要来源来自于天然生长的射干的根茎。然而，射干具有约2-3年的缓慢的生长速度(即从播种到收获)，这使得鸢尾黄素酮的采集难以实现。
与射干相反，巴西鸢尾是一种容易生长和繁殖的受欢迎的半户外植物。但是，巴西鸢尾却不含鸢尾黄素酮。巴西鸢尾属于鸢尾科马蝶花属，马蝶花属包括16个种：蓝花睡莲(N.caerulea)、N.capitellata、N.caulosa、紫露草(N.fluminensis)、巴西鸢尾(N.gracilis)、N.imbricata、黄巴西鸢尾(N.longifolia)、N.nitida、马蝶花(N.northiana)、N.paradoxa、N.portosecurensis、N.rotundata、N.rupestris、N.sabini、N.silvestris和N.variegata。巴西鸢尾原产于非洲西部的热带区域和美洲的中部及南部，其中大部分产于巴西。巴西鸢尾是多年生草本植物，其经由粗根茎和幼芽繁殖，这些幼芽从曾经开过花的茎长出。
本发明的另一方面涉及一种方法，所述方法通过相对短的、通常在4-8周之间的时间周期的组织培养技术使具有高浓度鸢尾黄素酮的巴西鸢尾的离体根茎组织生长，从而提供了鸢尾黄素酮的新来源。所述方法包括下述步骤：将巴西鸢尾组织接种于培养基中，并使巴西鸢尾组织生长足够长的时间直到根茎组织发育。
巴西鸢尾组织可以是由天然生长的巴西鸢尾或培养的、能够增殖的巴西鸢尾获得的任何组织。优选地，巴西鸢尾组织是采自巴西鸢尾根、根茎、叶或叶的基部的组织。
所述培养基包括至少一种植物生长调节剂(PGR)、一种盐和一种碳水化合物。PGR造成或促进正在培养室中繁殖的外植组织的分化或脱分化。PGR的例子包括但不限于生长素和细胞分裂素。
生长素是大部分生根混合物(rooting mixtures)中的活性成分。生长素有助于植物的无性繁殖。生长素在细胞水平影响细胞延长、细胞分裂和不定根的形成。某些生长素在极低的浓度即具有活性。生长素可以在0.0001-20mg/L，优选在0.01-10mg/L，更优选在0.01-2.0mg/L的浓度范围使用。生长素的例子包括但不限于4-联苯乙酸、3-氯-4-羟苯乙酸、4-羟苯乙酸、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丙酸、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酰基-L-丙氨酸、吲哚-3-乙酰基-DL-门冬氨酸、吲哚-3-乙酰基-DL-色氨酸、吲哚-3-乙酰基-L-缬氨酸、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和α-萘乙酸(NAA)。
通常，细胞分裂素促进细胞分裂、刺激茎芽增殖、激活基因表达和代谢活性。同时，细胞分裂素抑制根部形成。这使得细胞分裂素有益于植物细胞组织的培养中期望植物细胞组织能够茁壮地生长却无根部形成的情况。此外，细胞分裂素延缓植物的衰老过程。细胞分裂素可以在0.0001-20mg/L，优选在0.01-10mg/L，更优选在0.01-2.0mg/L的浓度范围使用。细胞分裂素的例子包括但不限于N-(3-甲基-2-丁烯)-1H-嘌呤-6-胺、6-苯甲基-氨基嘌呤(BA)、激动素和玉米素。
盐的例子包括无机酸盐、有机酸盐，所述无机酸盐的例子如硝酸、盐酸、磷酸、硫酸、硼酸、碘酸(iodion acid)；所述有机酸盐的例子如乙酸、丙二酸、扁桃酸、草酸、乳酸、乳糖酸、富马酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸。所述盐可以是钠、钾、钙、铵、铁、镁、锰、锌、铜或钴盐。培养基可以含有多种盐的混合物。
在一个实施方案中，培养基包括促进外植的植物组织生长的营养素，所述营养素的例子如Murashige & Skoog，Physiol.Plant.，15，473-497(1962)中所提出的大量营养素和微量营养素，在下文中将这些营养素称为“MS基础培养基”。MS基础培养基中含有的盐称为“MS盐”。本发明上下文中使用的MS盐包括适当浓度的硝酸铵、硼酸、氯化钙、氯化钴、硫酸铜、Na2-EDTA、硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锰、钼酸、碘化钾、硝酸钾、磷酸二氢钾、硝酸钠、磷酸二氢钠和硫酸锌。
碳氢化合物可以是对植物培养具有营养价值的任何碳氢化合物。优选地，碳氢化合物为糖类。更优选地，碳氢化合物为肌醇、蔗糖或其混合物。
培养基可以另外包括其他的组分，如氨基酸、维生素或其混合物。优选的维生素包括但不限于维生素B1(盐酸硫胺素)、维生素B6(吡哆醇盐酸盐)和维生素B3(烟酸)。
将培养基调节至适于巴西鸢尾生长的pH范围。该pH范围优选在4和8之间，并且更优选在5和7之间。在一个实施方案中，培养基包括用于将pH保持在期望水平的适宜的缓冲剂。这些药剂通常具有约4.5和约5.5之间的pKa，并且包括但不限于柠檬酸、N-吗啉代-乙磺酸(ethansulfonicacid)、邻苯二甲酸氢钾和苯甲酸。
培养物的温度通常保持在约30℃或低于约30℃，优选在约20-30℃的范围内。
期望的生长周期为2-16周，优选4-8周。
在优选的实施方案中，培养基包括MS盐、蔗糖(30g/L)、肌醇(100mg/L)、6-苯甲基-氨基嘌呤(BA)(0.5mg/L)、2，4-二氯苯氧基乙酸(dichrophenoxyacetic acid)(2，4-D)(0.1mg/L)和α-萘乙酸(NAA)(0.84mg/L)。
在另一个实施方案中，在持续搅拌状态下进行巴西鸢尾组织的培养。在另外的实施方案中，将巴西鸢尾组织在间歇浸没系统(TIS)中培养。如图1所示，通过将植物组织间歇性地浸入培养基中来以TIS滋养和用氧饱和植物。简要地，室10将培养物12保持在筛网14上或保持在篮中。将低压空气泵入室10，迫使液体培养基16上升并浸泡培养物12。空气流还氧化并搅动培养基16。当空气流被中断时，压力停止，并且培养基16返回室10的底部。典型地，TIS的所有组分均可高压灭菌并且可以重复使用。该系统可以使大规模的植物组织培养自动化。在优选的实施方案中，巴西鸢尾组织每隔2-4个小时被培养基浸没1-3分钟。
本发明的另一方面提供具有高浓度鸢尾黄素酮的、培养的巴西鸢尾组织。在一个实施方案中，培养的巴西鸢尾根茎组织每kg重量的干燥根茎具有鸢尾黄素酮的含量为2.5-65mg/kg。使用ψ-鸢尾黄素酮作为标准物进行测量，在含有不加入PGR的MS培养基(MS0)的固体培养物中，培养的巴西鸢尾根茎组织每g重量的干燥根茎具有的类黄酮总含量为10.741±0.311(平均值±S.E.)mg。
本发明的另一方面涉及由巴西鸢尾组织提取类黄酮的方法。所述方法包括下述步骤：干燥组织，粉碎干燥的组织，将研细的组织悬浮于醇中，加热悬浮液并过滤所述悬浮液获得类黄酮的提取物。
可以通过任何方法来干燥植物组织，优选通过使用冷冻真空干燥器的冷冻干燥来干燥植物组织。醇可以是任何醇，优选甲醇或乙醇。优选将醇加热至50℃-70℃的温度范围，并且更优选带有摇动、振动或声处理的加热。优选的振动方法是超声波振动。
以下的实验设计和结果是示例性的，不限制本发明的范围。此处可以作出合理的变动而不脱离本发明的范围，所述合理的变动如由适宜的技术人员所想到的那些。此外，在本发明的描述中，为了清楚说明而采用了专业术语。然而，本发明不预期受限于所选择的专业术语。有待理解的是每种特异性的要素包括所有以相似方式操作来达到相似目的的技术改造(technical equivalents)。
实施例
实施例1：材料和方法
来自巴西鸢尾(Neomarica gracilis)的富含类黄酮的离体根茎组织
巴西鸢尾富含类黄酮的离体根茎组织由大同大学植物组织培养实验室(Tatung University Plant Tissue Culture Lab)培养。每月将根茎组织进行继代培养，其中MS基础盐培养基添加有30g/L蔗糖、100mg/L肌醇、0.5mg/LBA、0.1mg/L 2，4-D和0.84mg/L NAA。
培养基
液体培养基包括MS基础盐培养基(Murashige和Skoog，1962)(表1)，所述MS基础盐培养基添加有30g/L蔗糖、100mg/L肌醇和根据不同实验而不同的植物生长因子。通过将8g/L琼脂加至液体培养基来制备固体培养基。在8×1.5×1.5cm培养管(10ml培养基/管)或烧瓶(30ml培养基/烧瓶)中进行固体培养。在分别具有10ml、50ml或100ml培养基的50ml、100ml或250ml烧瓶中进行液体培养。使用铝箔遮盖培养管或烧瓶的开口。
TIS培养使用了由A-Tech Bioscientific Co.Ltd.获得的系统。向各个培养室中加入约200ml的培养基。如所教导的，将塑料导管和无菌滤膜放置在气体入口和气体出口处。使用棉花和铝箔覆盖滤膜，并且使用夹钳固定塑料导管以防止水蒸汽进入滤膜中。使用铝箔遮盖培养室。
所有的培养基均具有5.70±0.05的pH值，并且在1.1-1.2kg/cm2的压力下，于121℃高压灭菌15分钟。
表1.MS的基础盐组合物(Murashige和Skoog，1962)
Figure A200710167340D00152
烧瓶培养
(1)为了确定接种重量的作用(以接种体鲜重/100ml培养基的克百分数表示)，将液体培养的巴西鸢尾根茎组织以0.5、1、1.5、2、3、4、5、10或15％(g鲜重(F.W.)/100ml培养基)的接种重量比接种于继代培养基中，所述继代培养基含有MS基础盐、0.5mg/L BA、0.1mg/L 2，4-D和0.84mg/LNAA。在接种三周后将培养的组织进行称重。
(2)为了确定植物生长调节剂(PGR)的作用，使用手术刀将来自液体培养的巴西鸢尾根茎组织的幼芽切除。该根茎组织以3％(g F.W./50ml)的接种重量接种于含有MS基础培养基的培养基中，所述MS基础培养基添加有如表2所示的PGR。每隔两周更换一次培养基。在全部的八周中，于每次更换培养基时将培养的组织进行称重。
(3)为了测量巴西鸢尾根茎组织的生长曲线和鸢尾黄素酮的含量，使用手术刀将液体培养的巴西鸢尾根茎组织的幼芽切除。该根茎组织以(gF.W./50ml)接种重量接种于含有MS基础培养基的培养基中，所述MS基础培养基添加有0.1mg/L NAA或1mg/L NAA与1.0mg/L2，4-D的混合物。在连续的八周中，每隔一周将该组织进行称重并分析鸢尾黄素酮的含量。
(4)为了确定嘧啶醇对幼芽形成和鸢尾黄素酮含量的影响，将液体培养的巴西鸢尾根茎组织以3％(g F.W./100ml)的接种重量接种于继代培养基中，所述继代培养基含有MS、0.5mg/L BA、0.1mg/L2，4-D和0.84mg/LNAA。在培养的第7天和第14天，将无菌过滤的(0.2um)嘧啶醇加至培养基中直至达到0.5、1.0或2.0mg/L的终浓度。监控组织的生长并分析鸢尾黄素酮的含量。
表2.烧瓶培养中植物生长调节剂对巴西鸢尾组织生长的影响
TIS培养
TIS 
Figure A200710167340D00172
培养系统从台湾台北的A-Tect Bioscientific Co.，Ltd.购买。
(1)为了确定接种重量对组织生长的影响，将TIS培养室分成四个区域。在每个区域中分别接种1.5、3、6和9g的液体培养的巴西鸢尾根茎组织。培养基为MS培养基，所述MS培养基添加有如表3的样品T12、T17和T18中所描述的PGR。在用户手册详细描述的条件下培养组织并且每三个小时将组织浸没2分钟。每隔十天将培养的组织称重并更换培养基。
(2)为了确定PLR对巴西鸢尾生长的作用和对鸢尾黄素酮含量的影响，将十段液体培养的巴西鸢尾根茎组织接种于培养基中，所述培养基含有表3样品MS0、TI3、TI4、TI5和TI6中所描述的MS和PGR。在第2周更换培养基以及在第4周收割组织并用于分析鸢尾黄素酮的含量。
表3.TIS培养中植物生长调节剂对巴西鸢尾组织生长的影响
鸢尾黄素酮和全部类黄酮的提取
巴西鸢尾的根茎组织在冷冻真空干燥器(VirTis Freezemobile 12XL)中于-80℃冷冻10小时，干燥过夜并研细。将0.5g干燥并研细的组织悬浮于10ml烧瓶中的足量甲醇，将孵育过的研细的组织悬浮于10ml烧瓶中的足量甲醇，使用超声振动在60℃孵育1小时并冷却。然后将甲醇加至该悬浮液中至10ml的终体积。使用Whatman 1号滤纸过滤悬浮液。过滤的溶液密封于棕色的样品瓶并放置在冷冻室中以便用于以后的实验。
在测量鸢尾黄素酮的含量之前，将鸢尾黄素酮标准物(Sigama T-9165，ψ-鸢尾黄素酮)溶液和样品溶液通过0.45um的滤器过滤。过滤的样品密封于2ml棕色的HPLC瓶用于作进一步的分析。
类黄酮总量的测量
根据Lee等人，J.Agric.Food Chem.(2003)51：7292-7295测量类黄酮的总量。简要地，将4ml去离子水和0.3ml 5％的NaNO2加至大约0.5ml的巴西鸢尾提取物以形成样品混合物并允许反应约5分钟。随后向反应的样品混合物中加入约0.3ml的10％ AlCl3并允许在充分振摇的条件下进一步反应另外5分钟。继之加入2ml 1N NaOH和2.9ml去离子水以使样品混合物进一步反应。然后通过使用UV分光光度计(Ultrospec 2000，Pharmacia Biotech)测量510nm波长处的吸光度来确定所得的反应样品混合物中类黄酮的总量，并且将数据与使用ψ-鸢尾黄素酮作为标准物的标准曲线进行比较。
通过HPLC测量鸢尾黄素酮
通过HPLC分析测定组织提取物的鸢尾黄素酮含量，所述HPLC分析使用了Cosmosil 5 C18-AR-II柱(5μm，4.6×250mm)、
Figure A200710167340D00191
 100RP-18e保护柱(45×4.6mm，5μm，Merck)、脱气(ERC-3415α)泵、Waters 600E自动采样和注射器(Schambeck SGD GmbH S5200)、Waters TM 486 UV/VIS检测器和积分仪(SISC Xunhua Ltd.)。使用55:45比例的甲醇:H2O(0.1％的乙酸)、0.8ml/min的流速和265nm的检测波长施行实验。标准物的鸢尾黄素酮峰在大约13min出现。
统计分析
所有的测量均重复三次。使用具有5％显著性水平的Duncan多范围检验(Duncan′s multiple range test)分析实验数据(Duncan D.B.1955，Biometrics，11：1-42)。
形态学观察和照相
在立体显微镜(Olympus SZ-ET)下进行形态学观察。使用数码照相机(Nikon coolpix 8700)进行摄像记录。
实施例2：烧瓶培养中接种重量对组织生长的影响
将液体培养的巴西鸢尾根茎组织以0.5、1、1.5、2、3、4、5、10或15％(g鲜重(F.W.)/100ml培养基)的接种重量接种于继代培养基中，所述继代培养基含有MS、0.5mg/L BA、0.1mg/l 2，4-D和0.84mg/L NAA。如图2所示，3％(g鲜重(F.W.)/100ml培养基)的接种重量产生了最高的生长速度，即大约四倍的鲜重增长((鲜重的增长倍数＝最终的鲜重-最初的鲜重)/最初的鲜重)。当接种重量大于4％时重量增益减少，可能是由于受到了烧瓶中空间和供应营养的限制。
实施例3：烧瓶培养中PGR对组织生长和鸢尾黄素酮含量的影响
将巴西鸢尾根茎组织以3％(g F.W./100ml)的接种重量接种于培养基中，所述培养基含有添加不同数量PGR(表2)的MS。每两周更换一次培养基并测量组织的鲜重。在培养的6-8周期间观察到鲜重显著增加(图3)。
在表2中所列出的15种激动素/IAA组合中，仅有4种组合(即B1、C1、C2和D1)使得鸢尾黄素酮含量显著增加。在导致鸢尾黄素酮含量增加的4种组合中，0.5mg/L IAA/0mg/L激动素的组合获得了最高的鸢尾黄素酮含量37.6±4.9mg/kg D.W.(表4)。似乎将激动素加入培养基中并没有引起鸢尾黄素酮含量的任何增加。
表4.IAA和激动素对巴西鸢尾根茎的干重和鸢尾黄素酮含量的影响
Figure A200710167340D00201
1.在培养8周后采集数据，并且数值为3次重复实验的平均值±S.E。
2.通过Duncan多范围检验，在每栏中继之以相同字母(a-d)的平均值无显著性差异(P>0.05)。
在2，4-D和NAA存在条件下培养的所有组织中和在某些仅仅使用NAA培养的组织中也发现了鸢尾黄素酮含量的增加(表5)。在1.0mg/LNAA与0.1mg/L 2，4-D(60.9±0.67mg/kg D.W.)存在的条件下、在仅0.5mg/LNAA(58.9±0.23mg/kg D.W.)和仅0.1mg/L NAA(55.5±0.67mg/kg D.W.)存在的条件下培养的组织中发现了最高的鸢尾黄素酮含量。当NAA单独使用时，NAA浓度的增加导致干重的减少。使用0.1mg/L浓度的NAA获得了最大的干重(表5)。
表5.NAA和2，4-D对巴西鸢尾根茎组织的干重和鸢尾黄素酮含量的影响
1.在培养8周后采集数据，并且数值为3次重复实验的平均值±S.E。
2.通过Duncan多范围检验，在每栏中继之以相同字母(a-e)的平均值无显著性差异(P>0.05)。
实施例4：在生长期间巴西鸢尾的生长速度和鸢尾黄素酮的含量
将根茎组织以3％(g F.W./50ml)的接种重量接种于含有MS基础培养基的培养基中，所述MS基础培养基添加有0.1mg/L NAA或1mg/L NAA与1.0mg/l 2，4-D的混合物。在连续的八周中，每周将组织称重并分析鸢尾黄素酮的含量。
如图4所示，在添加有0.1mg/L NAA的MS基础培养基中培养的根茎组织在第3-4周和第6-7周的时间周期中快速地生长。在第5周和第8周存在很少的生长。在添加有1mg/l NAA和1.0mg/l 2，4-D的MS基础培养基中培养的根茎组织显示出相似的生长曲线。
至于生长期间的鸢尾黄素酮含量，在两种培养条件下检测到了最高的含量(对于0.1mg/L NAA与1mg/L NAA/1.0mg/L 2，4-D分别为56±2.82mg/kg D.W.与43±2.15mg/kg D.W.)。鸢尾黄素酮的含量在第2周明显降低，达到最低点7±0.42mg/kg D.W.，并在3-4周以后逐渐地增加。鸢尾黄素酮的含量在第5周显示出另一次明显减少并且在第6-8周期间再次增加(图5)。
在培养的相同时间，于MS0(即无PGR的MS培养基)中进行固体培养的组织里类黄酮的总含量通常高于在液体培养基和TIS中培养的组织里类黄酮的总含量。在包括MS0的、培养约8周的固体组织中类黄酮的总含量相当于每g干重约10.74±0.31mg的ψ-鸢尾黄素酮，其与由射干全草提取的类黄酮总含量相似，其中射干以其高的类黄酮浓度而著称。基于此处所用的相同测量方法，射干中的类黄酮总含量约为每g干重11.50±0.1mgψ-鸢尾黄素酮。
实施例5：嘧啶醇对培养的巴西鸢尾根茎组织的幼芽形成和鸢尾黄素酮含量的影响
将液体培养的巴西鸢尾根茎组织以3％(g F.W./100ml)的接种重量接种于继代培养基中，所述继代培养基含有MS、0.5mg/L BA、0.1mg/L 2，4-D和0.84mg/L NAA。在培养的第7天和第14天，将无菌过滤的(0.2um)嘧啶醇加至培养基中直至达到0.5、1.0或2.0mg/L的终浓度。监控组织的生长并分析鸢尾黄素酮的含量。如表6所示，于第14天将0.5或2.0mg/L的嘧啶醇加至组织培养物中导致鸢尾黄素酮含量的降低。于第7天将嘧啶醇加至组织培养物中并没有影响鸢尾黄素酮的含量。但是，在形态学上，于第7天将嘧啶醇加至组织培养物中导致幼芽形成的显著减少(图6)。
表6.嘧啶醇对巴西鸢尾根茎组织的鸢尾黄素酮含量的影响
Figure A200710167340D00221
1.在培养3周后采集数据，并且数值为3次重复实验的平均值±S.E。
2.通过Duncan多范围检验，在每栏中继之以相同字母(a-d)的平均值无显著性差异(P>0.05)。
实施例6：接种对巴西鸢尾生物量增长的影响
将TIS培养室分成四个区域并将液体培养的巴西鸢尾根茎组织以1.5、3、6和9g的接种重量接种到每个区域中。培养基为添加有PGR的MS培养基，所述PGR如表3样品TI2、TI7和TI8所描述。每隔十天将培养的组织称重一次。如图7所示，在添加有1mg/L激动素的MS培养基中的1.5g接种量提供了最佳的组织生长—在30天后达到4.5倍于接种重量的鲜重(6.76±0.33g)。其他的所有接种重量/PGR组合使得生长较缓慢(图7)。
为了测定PGR对鸢尾黄素酮含量的影响，将十段液体培养的巴西鸢尾根茎组织(每段1.5g)接种于含有MS和PGR的培养基中，所述MS和PGR在表3的样品MS0、TI3、TI4、TI5和TI6中描述。在第4周收获该组织并分析鸢尾黄素酮含量。如表7所示，使用添加有0.1mg/L 2，4-D和1.0mg/LNAA的MS培养基获得了最高的鸢尾黄素酮含量(48±0.22mg/kg D.W.)。
表7.TIS培养中PRG对巴西鸢尾根茎组织的生长和鸢尾黄素酮含量的影响
 
PGR(mg/l) F.W.(g) 生长速度1 鸢尾黄素酮(mg/kg D.W.)
对照 42.63±3.51 1.84±0.23 22±0.11
激动素1.0 46.12±2.18 2.07±0.15 10±0.15
NAA 0.1 40.65±2.09 1.71±0.14 38±0.57
NAA 0.5 31.47±3.12 1.10±0.21 33±0.38
NAA 1.0+2，4-D 0.1 30.84±1.13 1.06±0.08 48±0.22
0.5 BA+0.12，4-D+0.84 NAA 33.50±1.03 1.23±0.07 40±0.52
数值为3次重复实验的平均值±S.E
1.生长速度＝(最终的F.W.-最初的F.W.)/最初的F.W.
实施例7：烧瓶培养和TIS培养的巴西鸢尾根茎组织中鸢尾黄素酮含量的比较
基于实施例2的结果，2，4-D和NAA的组合提供了高于IAA和激动素组合的鸢尾黄素酮含量。通过MS培养基获得了最高的鸢尾黄素酮含量，所述MS培养基添加有0.1mg/L NAA(鸢尾黄素酮55.5±0.67mg/kgD.W.)、0.5mg/L NAA(鸢尾黄素酮59.9±0.23mg/kg D.W.)或0.1mg/LNAA和1mg/L 2，4-D(鸢尾黄素酮60.9±0.67mg/kg D.W.)。还测定了这些培养条件下的类黄酮总含量。
实施例8：培养的和野生的巴西鸢尾根茎组织中鸢尾黄素酮含量的比较
表8显示培养的和野生的巴西鸢尾根茎组织中鸢尾黄素酮的含量。结果表明野生的巴西鸢尾根茎组织不含有鸢尾黄素酮而培养的巴西鸢尾根茎组织具有的鸢尾黄素酮含量为55.5±0.67mg/kg D.W.。
表8.培养的和野生的巴西鸢尾根茎组织的鸢尾黄素酮含量
Figure A200710167340D00241
1.根茎培养基为具有0.1mg/l NAA的MS。
2.数值为3次重复实验的平均值±S.E
3.ND＝不可检测
实施例9：由培养的巴西鸢尾根茎组织获得的提取物抑制肿瘤细胞的生长
在培养的肿瘤细胞中对培养的巴西鸢尾根茎组织的提取物进行了体外测试，所述提取物通过材料和方法中描述的步骤获得。提取物在0.1％-20％的浓度范围显示对人类正常的肠细胞无毒性。然而，提取物在3.13％、25％和50％的浓度抑制小鼠黑色素瘤细胞(B16-F0)的生长。还在急性髓细胞样白血病细胞系PLB985和人类乳腺癌细胞系MCF7上使用光泽精分析对提取物进行了检测，以便监控过氧化物的形成，随后通过抗氧化剂分析仪分析自由基。结果表明提取物抑制两种肿瘤细胞系的生长。
在本说明书中阐述和讨论的实施方案仅预期将发明人已知的最佳方式教导给本领域的技术人员，以便制备并使用本发明。不应认为本说明书限制本发明的范围。如同本领域技术人员按照以上教导所理解的，本发明上述实施方案可以进行修改或变动，并且可添加或省略各种要素而不脱离本发明的范围。因此有待理解的是除了具体描述的之外，可以在权利要求及其等价的范围内以其他的方式实施本发明。

Claims (44)

1.一种来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其由改变所述巴西鸢尾类黄酮含量的组织培养法获得，其中所述富含类黄酮的组织包括鸢尾黄素酮。
2.根据权利要求1所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述离体的富含类黄酮的组织是由能够增殖的巴西鸢尾组织培养的根茎组织。
3.根据权利要求2所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述巴西鸢尾组织包括根、根茎、叶和叶的基部。
4.根据权利要求1所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述组织培养法包括含有植物生长调节剂的培养基。
5.根据权利要求4所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述植物生长调节剂包括细胞分裂素或生长素。
6.根据权利要求5所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述植物生长调节剂为选自下述组的至少一种：吲哚-3-乙酸、2-4-二氯苯氧基乙酸、α-萘乙酸、6-苯甲基-氨基嘌呤和激动素。
7.根据权利要求4所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述植物生长调节剂的浓度为约0.01-2.0mg/L。
8.根据权利要求4所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述培养基还包括Murashige和Skoog基础盐培养基(MS培养基)。
9.根据权利要求8所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述MS培养基包括钠、钾、硝酸盐、铵、镁、硫酸盐、钙、铁、氯化物、磷酸盐、锰、碘、硼酸盐、锌、铜、钼、钴、或其混合物。
10.根据权利要求4所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述培养基还包括碳水化合物。
11.根据权利要求10所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述碳水化合物为肌醇或蔗糖或其混合物。
12.根据权利要求4所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述培养基还包括维生素。
13.根据权利要求12所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述维生素为选自下述组的至少一种：盐酸硫胺素、吡哆醇盐酸盐和烟酸。
14.根据权利要求4所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述培养基还包括嘧啶醇。
15.根据权利要求4所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述培养基具有约5-7的pH。
16.根据权利要求1所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述组织培养法为烧瓶培养、间歇浸没系统(TIS)或其组合。
17.根据权利要求1所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述鸢尾黄素酮的含量为每Kg干重组织约2.5-65mg。
18.一种获得根据权利要求1所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织的方法，包括下述步骤：
将巴西鸢尾组织接种于组织培养法的培养基中；其中所述巴西鸢尾组织能够增殖；和
使所述巴西鸢尾组织在所述组织培养法中生长足够长的时间以允许根茎组织形成。
19.根据权利要求18所述的方法，其中将所述培养基保持在约20℃-30℃。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述巴西鸢尾组织包括根、叶、叶的基部或根茎。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述组织培养法为烧瓶培养、间歇浸没系统(TIS)或其组合。
22.根据权利要求18所述的方法，其中足够长的时间为约4-8周。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述TIS允许所述巴西鸢尾组织每隔约2-4小时浸没在所述培养基中约1-3分钟。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述培养基包括植物生长调节剂、盐培养基和碳水化合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述植物生长调节剂包括细胞分裂素或生长素。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述植物生长调节剂为选自下述组的至少一种：吲哚-3-乙酸、2-4-二氯苯氧基乙酸、α-萘乙酸、6-苯甲基-氨基嘌呤和激动素。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述植物生长调节剂的浓度约为0.01-2.0mg/L。
28.根据权利要求24所述的方法，其中所述盐培养基为Murashige和Skoog基础盐培养基(MS培养基)，其包括钠、钾、硝酸盐、铵、镁、硫酸盐、钙、铁、氯化物、磷酸盐、锰、碘、硼酸盐、锌、铜、钼、钴、或其混合物。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述碳水化合物为肌醇或蔗糖或其混合物。
30.根据权利要求24所述的方法，其中所述培养基还包括维生素。
31.根据权利要求30所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织，其中所述维生素为选自下述组的至少一种：盐酸硫胺素、吡哆醇盐酸盐和烟酸。
32.根据权利要求24所述的方法，其中所述培养基具有约5-7的pH。
33.一种由如权利要求1所述的来自巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织提取鸢尾黄素酮的方法，其包括下述步骤：
干燥所述巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织以获得干燥的富含类黄酮的组织；
将醇加至所述干燥的离体的富含类黄酮的组织以形成悬浮液；
加热所述悬浮液以形成热的悬浮液；和
在所述热的悬浮液已经冷却后过滤所述热的悬浮液以收集含有所述鸢尾黄素酮的滤液。
34.根据权利要求33所述的方法，其中通过使所述离体的富含类黄酮的组织经受冷冻干燥而获得所述干燥的离体的富含类黄酮的组织。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述悬浮液在约50-70℃下加热。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述悬浮液在振动下加热。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述振动通过超声波产生。
38.根据权利要求33所述的方法，其中所述醇为甲醇或乙醇。
39.根据权利要求33所述的方法，其中所述滤液通过将所述热的悬浮液经过
Figure A200710167340C0005154636QIETU
 1号滤纸收集。
40.一种用于测定根据权利要求33所述的巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织中所述鸢尾黄素酮含量的方法，其包括下述步骤：
通过高效液相色谱(HPLC)测定所述鸢尾黄素酮的含量。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述HPLC包括Cosmosi1
Figure A200710167340C0005161618QIETU
 5C18-AR-II柱。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述鸢尾黄素酮使用含有55:45体积比的甲醇和水(具有0.1％的乙酸)的洗脱溶液进行洗脱。
43.根据权利要求40所述的方法，其中所述鸢尾黄素酮的含量使用ψ-鸢尾黄素酮作为标准物在约265nm波长处进行测定。
44.一种如权利要求33所述的巴西鸢尾的离体的富含类黄酮的组织提取物，其中所述提取物具有抗肿瘤活性。
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