CN113189240A - 一种高效的棉花代谢组学样本制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及棉花代谢组学解析领域技术领域，且公开了一种高效的棉花代谢组学样本制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)、取棉花特定组织样品，迅速浸没于液氮中保存制成冷冻样本。本发明的样品制备和检测方法，通过真空冷冻干燥使样品的称量更加方便、准确，同时也保证了样品内代谢物的稳定性；在提取液中加入甲酸，通过降低提取液PH的方法，减弱提取反应过程中代谢产物发生的氧化反应，进一步保持样品提取过程的稳定性；通过多次试验，优化出一个相对合适的色谱梯度，这一个色谱方法可以旨在压缩较少代谢物出峰阶段的时间，减少分析时长，提升分离效率，与此同时，延长较多代谢物出峰的时间段，减少质谱分析中的离子抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及棉花代谢组学解析领域，具体为一种高效的棉花代谢组学样本制备及检测方法。
背景技术
代谢分析是揭示生物体内细胞活动的重要分析方法，通过对生物体内代谢物的定性和定量分析，有助于理解生物生长发育过程的动态，解析代谢的遗传基础，从而了解生命活动的本质，棉花是重要的纤维作物和油料作物，其丰富的次生代谢产物被广泛报道参与棉花纤维发育以及逆境响应过程2-4，利用代谢组学解析棉花次生代谢产物的合成和遗传基础对改良棉花纤维品质提高抗逆性具有广阔前景，目前基于UPLC-QTOF-MS分析平台棉花代谢组学相关的研究还比较少，其样品制备和检测也大多参考其他作物中的方法，现有的关于棉花叶片组织代谢组学样品制备大多与2020年发表的文章中的方法5类似。
上述方法虽然也能用于提取棉花叶片组织代谢产物，但存在一定的问题，主要表现在以下几个方面：1、第一步操作中直接对样品进行称量会造成较大的误差，植物组织鲜样一般储存在低温例如-80℃或液氮中，直接在室温下对鲜样进行称取容易导致空气中的水蒸气在低温样品表面迅速液化，导致样品性质被破坏或称量不准确；2、棉花中含有大量的多酚类物质，极易氧化，尽管低温环境或经过预冷处理的试剂能减弱氧化反应过程，但其作用仍然有限； 3、过长的超声处理步骤将产生一定热量，导致样品所在环境升温，不利于样品稳定。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效的棉花代谢组学样本制备及检测方法，具备数据精确、样品稳定等优点，解决了现有技术存在的问题。
(二)技术方案
为实现上述数据精确、样品稳定的目的，本发明提供如下技术方案：一种高效的棉花代谢组学样本制备方法，包括以下步骤：
1)、取棉花特定组织样品，迅速浸没于液氮中保存制成冷冻样本；
2)、将步骤1)中的冷冻样本放入真空冷冻干燥仪中，进行冷冻干燥，真空冷冻干燥仪的参数设置为零点零二五个标准大气压，零下五十摄氏度，冷冻干燥的时间为二十四小时，得出干燥样品；
3)、将步骤2)中得到的干燥样品准确称取一百毫克，将一百毫克干燥样品放入容积为二毫升的离心管中，然后加入钢珠，随后以六十赫兹的频率将其研磨九十秒；
4)将甲醇、纯水以及甲酸按照79.9：30：0.1v/v的比例混合震荡三分钟，并将其冷藏一小时，制成提取液，；
5)、向离心管中加入步骤4)制成的提取液，并在四摄氏度的环境下振荡十五分钟，制成混合样品；
6)、将步骤5)中得出的混合样品转移到超声仪中进行进一步破碎，超声仪的参数设置为频率六十赫兹，破碎时长为十分钟，制成半成品样品；
7)、将步骤6)制成的半成品样品放入离心机中，并在四摄氏度环境下，以12000rmp的频率离心十五分钟，得出沉淀和上清液；
8)、将步骤7)得出的样品中的上清液吸取300ul，利用0.22μm的有机相滤膜进行过滤，并将其收集到进样瓶中，得出最终的棉花代谢组学样本。
本发明还同时提供了对利用上述样品制备方法所获得的样品进行上机检测的方法，其具体设置如下：
1、色谱方法：选用C18色谱柱(2.1X100mm，1.7μm)，进样量1ul，柱温 45摄氏度，流动相组成为含0.1％甲酸的水相(SolventA)和含0.1％甲酸的乙腈的有机相(SolventB)，样品室温度10摄氏度，流动相梯度见图1：
2、质谱方法：扫描模式为灵敏度模式，毛细管电压1.0kV，源温度120 摄氏度，采集模式为MSE，质谱采集范围50-1200Da，扫面时间0.3s，低碰撞能量6V，高碰撞能量15～45V。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种高效的棉花代谢组学样本制备及检测方法，具备以下有益效果：
本发明的样品制备和检测方法，从结果来看，可以得到较好代谢物提取和分离效果，在样品制备方面兼顾了样品提取质量和效率，通过真空冷冻干燥使样品的称量更加方便、准确，同时也保证了样品内代谢物的稳定性；在提取液中加入甲酸，通过降低提取液PH的方法，减弱提取反应过程中代谢产物发生的氧化反应，进一步保持样品提取过程的稳定性；通过多次试验，优化出一个相对合适的色谱梯度，这一个色谱方法可以旨在压缩较少代谢物出峰阶段的时间，减少分析时长，提升分离效率，与此同时，延长较多代谢物出峰的时间段，减少质谱分析中的离子抑制作用，故此本发明提出了一种高效的棉花代谢组学样本制备及检测方法。
附图说明
图1为本发明流动相梯度示意图；
图2为本发明液相和质谱方法结果示意图；
图3为本发明中每隔五个任意样品就对特定样品进行一次进样分析的结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：随机选择一个大田中种植的棉花品种，在蕾铃期取植株倒二叶样品进行代谢组学分析，检验专利方法对样品前处理和检测效果，具体步骤如下
1)取棉花蕾铃期倒二叶样品，迅速浸没于液氮中保存备用；
2)、将步骤1)中的冷冻样本放入真空冷冻干燥仪中，进行冷冻干燥，真空冷冻干燥仪的参数设置为零点零二五个标准大气压，零下五十摄氏度，冷冻干燥的时间为二十四小时，得出干燥样品；
3)、将步骤2)中得到的干燥样品准确称取一百毫克，将一百毫克干燥样品放入容积为二毫升的离心管中，然后加入钢珠，随后以六十赫兹的频率将其研磨九十秒；
4)将甲醇、纯水以及甲酸按照79.9：30：0.1v/v的比例混合震荡三分钟，并将其冷藏一小时，制成提取液，；
5)、向离心管中加入步骤4)制成的提取液，并在四摄氏度的环境下振荡十五分钟，制成混合样品；
6)、将步骤5)中得出的混合样品转移到超声仪中进行进一步破碎，超声仪的参数设置为频率六十赫兹，破碎时长为十分钟，制成半成品样品；
7)、将步骤6)制成的半成品样品放入离心机中，并在四摄氏度环境下，以12000rmp的频率离心十五分钟，得出沉淀和上清液；
8)、将步骤7)得出的样品中的上清液吸取300ul，利用0.22μm的有机相滤膜进行过滤，并将其收集到进样瓶中，得出最终的棉花代谢组学样本。
本发明还同时提供了对利用上述样品制备方法所获得的样品进行上机检测的方法，其具体设置如下：
1、色谱方法：选用C18色谱柱(2.1X100mm，1.7μm)，进样量1ul，柱温 45摄氏度，流动相组成为含0.1％甲酸的水相(SolventA)和含0.1％甲酸的乙腈的有机相(SolventB)，样品室温度10摄氏度，流动相梯度见图1：
2、质谱方法：扫描模式为灵敏度模式，毛细管电压1.0kV，源温度120 摄氏度，采集模式为MSE，质谱采集范围50-1200Da，扫面时间0.3s，低碰撞能量6V，高碰撞能量15～45V。
液相和质谱方法如上文所述，结果见图2：
结果显示，本发明专利对极性不同的代谢成产物能有效提取，并能将其较好地分离，可见本方法能够有效运用于代谢组学的研究，为进一步考察本方法在代谢组学分析中的重复性。
我们在分析中每隔五个任意样品就对特定样品进行一次进样分析，结果见图3：
结果显示，同一个样品在不同时间进样分析TIC图相似性很高，保留时间漂移控制较好，说明本方法在分析的稳定性上表现良好。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (1)
1.一种高效的棉花代谢组学样本制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、取棉花特定组织样品，迅速浸没于液氮中保存制成冷冻样本；
2)、将步骤1)中的冷冻样本放入真空冷冻干燥仪中，进行冷冻干燥，真空冷冻干燥仪的参数设置为零点零二五个标准大气压，零下五十摄氏度，冷冻干燥的时间为二十四小时，得出干燥样品；
3)、将步骤2)中得到的干燥样品准确称取一百毫克，将一百毫克干燥样品放入容积为二毫升的离心管中，然后加入钢珠，随后以六十赫兹的频率将其研磨九十秒；
4)将甲醇、纯水以及甲酸按照79.9：30：0.1v/v的比例混合震荡三分钟，并将其冷藏一小时，制成提取液；
5)、向离心管中加入步骤4)制成的提取液，并在四摄氏度的环境下振荡十五分钟，制成混合样品；
6)、将步骤5)中得出的混合样品转移到超声仪中进行进一步破碎，超声仪的参数设置为频率六十赫兹，破碎时长为十分钟，制成半成品样品；
7)、将步骤6)制成的半成品样品放入离心机中，并在四摄氏度环境下，以12000rmp的频率离心十五分钟，得出沉淀和上清液；
8)、将步骤7)得出的样品中的上清液吸取300ul，利用0.22μm的有机相滤膜进行过滤，并将其收集到进样瓶中，得出最终的棉花代谢组学样本。
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