CN114460183A - 一种新鲜植物样品中acc的测定方法 - Google Patents

一种新鲜植物样品中acc的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种新鲜植物样品中氨基环丙烷羧酸(ACC：l‑aminocyclopropane‑l‑carboxylicacid)的测定方法，包括如下步骤：(1)取研磨好的新鲜植物样品，加入一定量的ACC同位素内标，然后加入溶剂提取液超声混匀、旋涡振荡，得到ACC提取液，并冷冻离心浓缩至干；(2)对步骤(1)所得的ACC提取物复溶后，以有机溶剂作为萃取剂进行除杂，进而得到植物样品中ACC的待测溶液，从而实现植物样品中ACC的前处理；(3)将步骤(2)所得的ACC待测溶液冷冻离心浓缩至干，用溶剂复溶后过滤，通过超高效液相色谱‑三重四极杆质谱法进行检测。本发明方法简单、快速、准确、易操作。

Description

一种新鲜植物样品中ACC的测定方法
技术领域
本发明属于植物激素测定技术领域，具体涉及一种新鲜植物样品中ACC的测定方法。
背景技术
植物激素通常为小分子有机化合物，在植物生长发育中发挥重要作用。乙烯是传统的六大类植物激素之一，对植物的生命活动起着重要的调节作用，从种子萌发到果实成熟等一系列的生命过程，几乎都有乙烯的踪迹，如促进果实的成熟，加速叶、花及果实的脱落，诱导雌花的分化以及增加木本植物的乳液排泌等。但是乙烯是一种气体，要准确测定相当困难。而ACC是乙烯的前体物质，且是一种比较稳定的小分子有机化合物，如果能通过准确测定植物组织中ACC的含量，就可以推断出各植物组织中乙烯的准确含量。这样，即简化了乙烯测定的实验步骤，又能得到准确的实验结果。而文献报道的ACC的测定方法主要有：液相色谱-质谱法[Nancy Chauvaux，Walter Van Dongen，Eddy L.Esmans，Henri A.VanOnckelen.Quantitative analysis of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid byliquid chromatography coupled to electrospray tandem massspectrometry.Journal of Chromatography A.775(1997)143–150]气相色谱-质谱法[Rafael Smets，Veerle Claes，Henri A.Van Onckelen，Els Prinsen*.Extraction andquantitative analysis of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid in planttissue by gas chromatography coupled to mass spectrometry.Journal ofChromatography A,993(2003)79-87]等。
但是，这些方法的前处理方法比较复杂，并且需要做衍生化。
发明内容
为避免上述现有技术所存在的不足，本发明提供一种新鲜植物样品中ACC的测定方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种新鲜植物样品中ACC的测定方法，包括如下步骤：
(1)取研磨好的新鲜植物样品，加入ACC同位素内标，然后加入溶剂提取液超声混匀、旋涡振荡，得到ACC提取液，并冷冻离心浓缩至干；
(2)对步骤(1)所得的ACC提取液复溶后，以有机溶剂作为萃取剂进行除杂，进而得到植物样品中ACC的待测溶液，从而实现植物样品中ACC的前处理；
(3)将步骤(2)所得的ACC待测溶液冷冻离心浓缩至干，用溶剂复溶后过滤，通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱法进行检测。
进一步地，所述步骤(3)中，色谱检测条件为：色谱柱为Universil AQ-C18柱，150×1.8mm，2.2μm，流动相A为0.05％的乙酸水溶液，流动相B为甲醇；质谱检测条件为：电喷雾电离源，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应监测。
进一步地，所述步骤(1)中的新鲜植物样品重量为100mg，所述溶剂提取液为80～100％的乙腈，所述新鲜植物样品与所述溶剂提取液的质量比为10:1。
进一步地，所述步骤(1)中的ACC同位素内标为0.2μg l-Aminocyclopropane-2,2,3,3-d4-carboxylic Acid。
进一步地，所述步骤(1)中旋涡振荡时间为1小时。
进一步地，所述步骤(2)中使用的复溶剂为超纯水，体积为200μL；所述萃取剂为乙酸乙酯、正己烷或石油醚中的一种。
进一步地，所述步骤(3)中的复溶剂为80％乙腈，体积为100μL。
进一步地，所述步骤(3)中过滤使用的滤膜为0.22μm孔径的尼龙膜。
进一步地，所述步骤(3)中色谱检测条件为：进样体积为5μL；柱温为30℃；流速为0.2mL·min-1；流动相A为0.05％的乙酸水溶液，流动相B为甲醇，按照下表梯度洗脱：
Figure BDA0003411433570000021
Figure BDA0003411433570000031
进一步地，所述步骤(3)中质谱检测条件为：
DL温度为150℃，Heat Block温度为400℃，Nebulizing Gas流速为3L.min-1，Grying Gas流速为12L.min-1；毛细管电压为4.5kV；荷质比和MRM参数如下表：
Figure BDA0003411433570000032
所述新鲜植物样品可以是各种果实，且需要研磨成粉末状或匀浆。
步骤(2)优选地步骤为：首先除去步骤(1)所得ACC提取液中的溶剂，用超纯水复溶后加入乙酸乙酯萃取除杂，水相冷冻离心浓缩至干，然后用80％的乙腈复溶，即为ACC的待测溶液。
本发明在上述前处理方法的基础上还提供了一种新鲜植物样品中ACC的定量检测方法；将通过该前处理方法所得的植物样品中的ACC样品溶液，通过分析仪器采集信号，采用内标法定量，从而得到样品中的ACC含量。
按照上述方案，分析仪器可以是液相色谱仪、液相色谱-质谱联用仪等。优选地，采用超高效液相色谱-电喷雾离子源-三重四级杆质谱联用仪。
具体地，一种新鲜植物样品中氨基环丙烷羧酸(ACC)的超高效液相色谱-三重四极杆质谱测定方法，具体操作步骤如下：
1)精确称取ACC、D4-ACC(ACC的同位素内标)标准品用适量水溶解，均配制成浓度为1000μg·mL-1的标准母液，然后各取适量配制成15μg·mL-1和2μg·mL-1的单标溶液，溶剂为80％乙腈，放置于-20℃冰箱中密封保存备用；
2)从步骤1)取适量单标溶液混合，配制成含有ACC浓度分别为1500ng·mL-1、750ng·mL-1、300ng·mL-1、150ng·mL-1、75ng·mL-1、50ng·mL-1、30ng·mL-1、10ng·mL-1、5ng·mL-1、2ng·mL-1、0.5ng·mL-1，同时含有D4-ACC浓度均为2.0μg·mL-1的一系列混合标准溶液，溶剂为80％乙腈，放置于-20℃冰箱中密封保存备用；
3)取步骤1)中2μg·mL-1的ACC、D4-ACC单标溶液分别进质谱做全扫描，得到其母离子，再通过仪器方法优化确定子离子和质谱参数，然后建立ACC的MRM方法，并通过进样逐步优化离子源参数；
4)接上色谱柱，设定好色谱和质谱条件，待仪器稳定后，取步骤2)的不同浓度标准溶液通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)分析，得到色谱图，然后积分得到不同浓度标样的色谱峰面积，对不同浓度标准溶液的ACC、D4-ACC色谱峰面积比值作线性回归，制得标准曲线，其回归方程为Y＝0.00846963X-0.0419949，相关系数为0.9998；
5)在植物样品中加入0.2μg的D4-ACC，然后用80％的乙腈提取得到样品溶液；
6)将步骤5)所述的样品溶液浓缩至干，用水复溶后，用乙酸乙酯进行萃取除杂，水相冷冻离心浓缩至干，然后用80％的乙腈复溶，进而得到植物样品中ACC的待测溶液；
7)将步骤6)所述的待测溶液通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱检测分析采集色谱图，将对应的色谱峰进行积分，通过步骤4)所得标准曲线进行定量，从而得到样品中ACC的含量。
本发明的有益效果包括：
本发明只需要将研磨后的植物样品加提取液在常温下旋涡振荡1小时就可以充分提取，不需要低温、过夜；只需要用少量乙酸乙酯萃取除杂，不需要过纯化柱和衍生化、就能准确测定ACC含量；方法简单、快速、准确、易操作。
附图说明
图1为ACC的提取离子图；
图2为D4-ACC的提取离子图；
图3为标准曲线图；
图4为不同果实中ACC含量柱状图；
图5为嫩莲子样品提取离子图；
图6为提子样品提取离子图；
图7为圣女果样品提取离子图；
图8为李子样品提取离子图；
图9为桃子样品提取离子图；
图10为梨子样品提取离子图；
图11为苹果样品提取离子图；
图12为脐橙样品提取离子图；
图13为香蕉样品提取离子图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
结合图1-13，一种新鲜植物样品中氨基环丙烷羧酸(ACC)的超高效液相色谱-三重四极杆质谱测定方法，具体操作步骤如下：
1)精确称取ACC、D4-ACC(ACC的同位素内标)标准品用适量水溶解，均配制成浓度为1000μg·mL-1的标准母液，然后各取适量配制成15μg·mL-1和2μg·mL-1的单标溶液，溶剂为80％乙腈，放置于-20℃冰箱中密封保存备用；
2)从步骤1)取适量单标溶液混合，配制成含有ACC浓度分别为1500ng·mL-1、750ng·mL-1、300ng·mL-1、150ng·mL-1、75ng·mL-1、50ng·mL-1、30ng·mL-1、10ng·mL-1、5ng·mL-1、2ng·mL-1、0.5ng·mL-1，同时含有D4-ACC浓度均为2.0μg·mL-1的一系列混合标准溶液，溶剂为80％乙腈，放置于-20℃冰箱中密封保存备用；
3)取步骤1)中2μg·mL-1的ACC、D4-ACC单标溶液分别进质谱做全扫描，得到其母离子，再通过仪器方法优化确定子离子和质谱参数，然后建立ACC的MRM方法，并通过进样逐步优化离子源参数；
4)接上色谱柱，设定好色谱和质谱条件，待仪器稳定后，取步骤2)的不同浓度标准溶液通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)分析，得到色谱图，然后积分得到不同浓度标样的色谱峰面积，对不同浓度标准溶液的ACC、D4-ACC色谱峰面积比值作线性回归，制得标准曲线，其回归方程为Y＝0.00846963X-0.0419949，相关系数为0.9998；
5)在植物样品中加入0.2μg的D4-ACC，然后用80％的乙腈提取得到样品溶液；
6)将步骤5)所述的样品溶液浓缩至干，用水复溶后，用乙酸乙酯进行萃取除杂，水相离心浓缩至干，然后用80％的乙腈复溶，进而得到植物样品中ACC的待测溶液；
7)将步骤6)所述的待测溶液通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱检测分析采集色谱图，将对应的色谱峰进行积分，通过步骤4)所得标准曲线进行定量，从而得到样品中ACC的含量。
本实施例中选取嫩莲子、提子、圣女果、李子、桃子、梨子、苹果、脐橙、香蕉为实验材料，用本发明方法测定其中的ACC含量。
测定方法包括如下步骤：
(1)取100mg研磨好的新鲜植物样品，加入0.2μg的ACC同位素内标，即0.2μg l-Aminocyclopropane-2,2,3,3-d4-carboxylic Acid，然后本实例中加入80％的乙腈，其他实施例中还可以为90％、100％的乙腈；新鲜植物样品与80％乙腈的质量比为10:1，超声混匀、旋涡振荡1小时，得到ACC提取液，并冷冻离心浓缩至干；
(2)采用体积为200μL的超纯水对步骤(1)所得的ACC提取液复溶后，优选以乙酸乙酯作为萃取剂进行除杂，除杂后的样品溶液冷冻离心浓缩至干，然后用80％的乙腈复溶，进而得到植物样品中ACC的待测溶液，从而实现植物样品中ACC的前处理；萃取剂还可以为正己烷或石油醚；
(3)将步骤(2)所得的ACC待测溶液冷冻离心浓缩至干，用100μL 80％的乙腈复溶后过滤，过滤使用的滤膜为0.22μm孔径的尼龙膜，通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱法进行检测。
色谱检测条件为：色谱柱为美国UniversilAQ-C18柱，150×1.8mm，2.2μm，流动相A为0.05％的乙酸水溶液，流动相B为甲醇；进样体积为5μL；柱温为30℃；流速为0.2mL·min-1；洗脱条件如下表：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 90 10
3 90 10
3.01 0 100
4 0 100
4.01 90 10
8 90 10
质谱检测条件为：电喷雾电离源，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应监测；DL温度为150℃，Heat Block温度为400℃，Nebulizing Gas流速为3.0L·min-1，GryingGas流速为12L·min-1；毛细管电压为4.5kV；荷质比和MRM参数如下表：
Figure BDA0003411433570000071
本发明在上述前处理方法的基础上还提供了一种新鲜植物样品中ACC的定量检测方法；将通过该前处理方法所得的植物样品中的ACC样品溶液，通过分析仪器采集信号，采用内标法定量，从而得到样品中的ACC含量。
按照上述方案，分析仪器可以是液相色谱仪、液相色谱-质谱联用仪等。优选地，采用超高效液相色谱-电喷雾离子源-三重四级杆质谱联用仪。
由图中结果可知，测量的准确度较好。

Claims (10)

1.一种新鲜植物样品中ACC的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取研磨好的新鲜植物样品，加入ACC同位素内标，然后加入溶剂提取液超声混匀、旋涡振荡，得到ACC提取液，并冷冻离心浓缩至干；
(2)对步骤(1)所得的ACC提取液复溶后，以有机溶剂作为萃取剂进行除杂，进而得到植物样品中ACC的待测溶液，从而实现植物样品中ACC的前处理；
(3)将步骤(2)所得的ACC待测溶液冷冻离心浓缩至干，用溶剂复溶后过滤，通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱法进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种新鲜植物样品中ACC的测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中，色谱检测条件为：色谱柱为Universil AQ-C18柱，150×1.8mm，2.2μm，流动相A为0.05％的乙酸水溶液，流动相B为甲醇；质谱检测条件为：电喷雾电离源，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应监测。
3.根据权利要求1或2所述的一种新鲜植物样品中ACC的测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中的新鲜植物样品重量为100mg，所述溶剂提取液为80～100％的乙腈，所述新鲜植物样品与所述溶剂提取液的质量比为10:1。
4.根据权利要求3所述的一种新鲜植物样品中ACC的测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中的ACC同位素内标为0.2μg l-Aminocyclopropane-2,2,3,3-d4-carboxylic Acid。
5.根据权利要求1或2所述的一种新鲜植物样品中ACC的测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中旋涡振荡时间为1小时。
6.据权利要求1或2所述的一种新鲜植物样品中ACC的测定方法，其特征在于，所述步骤(2)中使用的复溶剂为超纯水，体积为200μL；所述萃取剂为乙酸乙酯、正己烷或石油醚中的一种。
7.据权利要求1或2所述的一种新鲜植物样品中ACC的测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中的复溶剂为80％乙腈。
8.据权利要求7所述的一种新鲜植物样品中ACC的测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中过滤使用的滤膜为0.22μm孔径的尼龙膜。
9.据权利要求1或2所述的一种新鲜植物样品中ACC的测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中色谱检测条件为：进样体积为5μL；柱温为30℃；流速为0.2mL·min-1；流动相A为0.05％的乙酸水溶液，流动相B为甲醇，按照下表梯度洗脱：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 90 10 3 90 10 3.01 0 100 4 0 100 4.01 90 10 8 90 10
。
10.据权利要求1或2所述的一种新鲜植物样品中ACC的测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中质谱检测条件为：
DL温度为150℃，Heat Block温度为400℃，Nebulizing Gas流速为3L.min-1，GryingGas流速为12L.min-1；毛细管电压为4.5kV；荷质比和MRM参数如下表：
Figure FDA0003411433560000021
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