KR20080063036A - Ｎｅｏｍａｒｉｃａ ｇｒａｃｉｌｉｓ로부터 유래한플라보노이드-풍부한 조직 및 그 배양방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 뿌리, 잎, 잎의 기저부(basal portion) 및/또는 근경(rhizome)과 같은 증식할 수 있는 Neomarica gracilis의 조직 배양 조제로부터 얻은 Neomarica gracilis의 인 비트로 플라보노이드-풍부한 근경 조직을 제공한다. 그 N. gracilis 의 인 비트로 플라보이드-풍부한 근경 조직은 텍토리제닌(tectorigenin)을 함유하고 있고, 그것은 텍토리제닌을 포함하지 않는 야생형 N. gracilis 근경과 명확하게 다르다. 본 발명은 인 비트로에서 플라보노이드-풍부한 근경을 배양하는 방법, 플라보노이드 풍부한 근경 조직으로부터 텍토리제닌을 추출하는 방법 및 인 비트로 플라보노이드-풍부한 근경 조직에서 텍토리제닌의 양을 결정하는 정량적인 방법을 제공한다.
Neomarica gracilis, 플라보노이드-풍부한 조직, 텍토리제닌, 근경

Description

Ｎｅｏｍａｒｉｃａ ｇｒａｃｉｌｉｓ로부터 유래한 플라보노이드-풍부한 조직 및 그 배양방법{FLAVONOIDS-RICH TISSUES FROM Neomarica gracilis AND METHODS FOR CULTURING THE SAME}
본 특허 출원은 여기에 레퍼런스로 삽입된 2006년 12월 29일에 출원한 대만 특허출원(출원 번호95149939) 및 2007년 5월1일에 출원한 미국특허출원 (출원번호 11/797, 145)의 우선권 주장 출원이다.
기술 분야
본 발명은 뿌리, 잎, 잎의 기저부(basal portion) 및/또는 근경(rhizome)과 같은 증식할 수 있는 Neomarica gracilis의 인 비트로 플라보노이드-풍부한 라이좀 조직, 그리고 그것은 N. gracilis 조직을 사용하여 조직배양 방법에 의하여 제공된다. N. gracilis 플라보이드-풍부한 근경 조직은 텍토리제닌(tectorigenin)을 함유하고 있고, 그것은 텍토리제닌을 포함하지 않는 야생형 N. gracilis 근경과 명확하게 다르다.
식물생리활성영양소(Phytochemical)는 세균, 바이러스, 진균류에 대하여 그들 자신을 보호하기 위하여 자연적으로 식물이 생성하는 물질이다. 최근에 그들 중 많은 수가 암, 심장병 및 다른 만성 건강 질환의 위험을 감소하고 노화 과정을 늦추는데 효과가 있다는 것이 알려지면서 식물생리활성영양소에 대한 관심이 증대되고 있다.
900 여종 이상의 식물생리활성영양소가 식물 음식에서 발견되고 여전히 다른 것들이 발견되고 있다. 과일, 야채, 전곡, 콩, 견과류는 이들 질병과 싸우는 물질의 모든 공급원이다. 식물생리활성영양소는 식물 색소에 종종 관련이 있어서 밝은 색(노란, 오렌지, 붉은, 푸른, 보라, 녹색)을 가진 과일과 야채류가 가장 많이 포함한다.
플라보노이드는 항-염증, 항산화제, 항앨러지제, 간보호, 항혈전, 항바이러스, 및 항암 활성을 가진 것으로 오랫동안 인식되어 온 일 군의 식물생리활성영양소이다. 그 플라보노이드는 전형적인 페놀 화합물이고 따라서 강력한 금속 킬레이터 및 자유 래디컬 제거제로 작용한다. 들은 강력한 사슬-분해(chain-breaking) 항산화제이다. 그 플라보노이드는 뛰어난 생화학적 및 약리학적 작용을 나타내고, 그들 중 일부는 일 군의 화합물들이 여러 포유류 세포 시스템의 기능에 중요한 역할을 한다 것을 예측한다. 최근 논문은 식물 플라보노이드가 질소의 조절에 관여하는 세균 (Rhizobium) 조절 유전자의 활성화를 야기한다는 것을 나타내고, 그것은 특정 플라보노이드와 포유류 유전자의 활성화 및 발현 사이의 중요한 관계를 제안 하다(예를 들어 Midddledton 외., Pharmacological Reviews, 2000, 52:673-751 참조).
텍토리제닌은 플라보노이드이다. 최근 몇 년 내, 항-세균, 항-염증 및 암 예방 효과를 나타내는 텍토리제닌의 잠재적 이용을 정복하는 개발이 만들어졌다. 또 텍토리제닌은 프로스타그란딘의 생성을 촉진하고 매크로파지의 증식을 유도하고 에스트로겐 수용체의 활성을 선택적으로 조절하고 근수축을 조절하는 것이 알려졌다.
텍트리제닌은 Iris germanica LIris pallida LamIris nigricansIris ensataIris sanguineaIris setosa 및 Belamacanda chinensis B. chinensis와 같은 식물의 근경으로부터 일반적으로 추출한다. 근경의 양은 온도 및 습도와 같은 성장 조건에 의하여 영향을 받는다. B. chinensis의 경우 추출을 위하여 근경을 수확하기 전에 2-3년 성장이 소요된다. 따라서 높은 텍트리제닌 양을 가지는 식물을 효과적으로 성장시킬 수 있는 방법에 대한 필요성이 여전하게 존재한다.Neomarica gracilis (N. gracilis)는 Iridaceae 계열에 속하는 가장 일반적인 원예작물이다. 그것은 저렴하게 대량으로 배양될 수 있다. 그러나 자연적으로 성장한 N. gracilis 의 근경은 텍트리제닌을 포함하지 않는다.
아래 부분에 기재된 본 발명에 있어서, 조직 배양 방법으로부터 얻은 인 비트로N. gracilis 근경이고, 그것은 약 1 또는 2개월에 수확할 수 있다. 플라보노이드가 풍부한 인 비트로 N. gracilis 근경이고, 고 용량의 텍트리제닌을 포함하고, 텍트리제닌에 대한 공급원으로 사용될 수 있다.
본 발명은 인 비트로에서 플라보노이드-풍부한 근경을 배양하는 방법, 플라보노이드 풍부한 근경 조직으로부터 텍토리제닌을 추출하는 방법 및 플라보노이드-풍부한 근경 조직에서 텍토리제닌의 양을 결정하는 정량적인 방법을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 야생형 N. gracilis 플라보노이드 양을 변경하는 조직 배양 환경에서 제조된 Neomarica gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드 풍부한 조직을 제공한다. 특히 본 발명의 플라보노이드-풍부한 조직은 실질적인 양의 텍트리제닌을 포함한다.
N. gracilis의 상기 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직은 증식할 수 있는 N. gracilis 조직으로부터 배양된 근경 조직인 것이 바람직하다. 증식할 수 있는 N. gracilis 조직의 예들은 뿌리, 근경, 잎 및 잎의 기저부를 포함한다.
배양 배지는 N. gracilis 플라보노이드 풍부한 조직을 제조하기 위한 조직 배양에 사용된다. 이 배양 배지는 (1) 식물 성장 조절자, (2) 염 배지 및 (3) 탄수화물을 포함한다. 식물 성장 조절자는 사이토키닌 또는 옥신을 포함한다. PGR의 예들은 인돌-3-아세트 산, 2-4-디클로로페녹시아세트 산, 알파-나프타렌아세트산, 6-벤질-아미노퓨린, 카네틴 및/또는 그것의 혼합을 포함하나 이에 한정되지 아니한 다. 식물 성장 조절자는 약 0.01에서 2.0 mg/L 농도인 것이 바람직하다. 그 바람직한 염 배지는 무라시게(Murashige) 및 스쿡(Skoog) 베이직 염 배지(즉 MS 배지)이고 그 MS 배지는 나트륨, 칼륨, 나이트레이트, 암모늄, 마그네슘, 설페이트, 칼슘, 철, 클로라이드, 인산, 망간, 요오드, 보레이트, 아연, 구리, 몰리브덴, 코발트, 또는 그것의 혼합물인 것을 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 탄수화물의 예들을 마이오-이노시톨 또는 수크로스 또는 그것의 혼합물을 포함한다. 선택적으로 상기 배양 배지는 티아민 HCl, 피리독신 HCl, 및 니코틴산 및 안시미돌과 같은 비타민을 포함할 수 있다. 그 배양 배지는 약 5에서 7의 pH를 가진다.
그 조직 배양 제조는 바람직하게는 교반 조건 하인 플라스크 배양, 일시적 잠김 시스템(Temporary Immersion System) 또는 그 혼합인 것을 포함한다.
N. gracilis 유래한 플라보노이드-풍부한 조직은 건조 조직 kg 당 약 2.5에서 65 mg의 양의 텍트리제닌을 포함한다. MS0(즉 첨가된 식물 성장 조절제가 없는 MS 배지)에서 고체 조직 배양 8 주 후 플라보노이드 전체의 양은 플라보노이드 풍부한 건체 조직 그램 당 약 10.74mg(표준으로 Ψ-텍트리제닌을 사용한 측정에 기초) 양이다.
본 발명은 N. gracilis 로부터 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직을 얻는 방법을 더 제공한다. 그 방법은 (1) 조직 배양의 배양 배지에 N. gracilis를 접종하고;(2) 근경 조직이 형성되기에 충분한 시간 동안에 상기 조직 배양에서 N. gracilis 조직을 성장시키는 것을 포함한다. 그 N. gracilis 조직은 뿌리, 잎, 잎의 기저부 또는 근경과 같이 세포 복제할 수 있다.
그 배양 배지는 약 20℃에서 30℃에서 유지되는 것이 바람직하다.
그 조직 배양은 플라스크 배양, 일시적 잠김 시스템(Temporary Immersion System) 또는 그 혼합이다.
N. gracilis의 플라보노이드-풍부한 근경 조직을 형성하기에 충분한 시간은 약 4에서 8주이다.
그 TIS는 N. gracilis 조직을 약 매 2-4시간 마다 약 1-3분 동안 배양 배지에 잠기게 한다.
본 발명은 N. gracilis의 플라보노이드-풍부한 조직으로부터 텍토리제닌을 추출하는 방법을 제공한다. 그 방법은 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직을 건조하여 건조된 플라보노이드-풍부한 조직을 얻고; (2) 그 건조된 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직에 알코올을 첨가하여 현탁액을 제조하고;(3) 그 현탁액을 가열하여서 가열된 현탁액을 만들고; (4) 그 가열된 현탁액을 냉각한 후 그 가열된 현탁액을 여과하여 상기 텍트리제닌을 함유한 여과액(filtrate)을 수집하는 것을 포함한다. 상기 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직을 건조하는 바람직한 방법은 동결건조하는 것이다. 그 현탁액을 가열하는 바람직한 방법은 약 50-70℃에서 약 1시간 동안 그 현탁액을 가열하는 동안 초음파를 사용하는 것이다. 그 건조된 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직에 첨가될 수 있는 알코올의 예들은 에탄올 또는 메탄올이다. 선택적으로 건조된 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직은 알코올 첨가 전에 마쇄될 수 있다. 상기 여과액은 상기 가열 된 현탁액을 와트만®No. 1 필터를 통하여 투과하여 수집되는 것이 바람직하다.
N. gracilis의 플라보노이드-풍부한 조직에서 텍트리제닌의 전체 양은 고성능액체 크로마토그래피(HPLC) 에 의하여 결정된다. 그 HPLC에 대한 바람직한 컬럼이 코스모실(Cosmosil) 5 C18-AR-II 칼럼이다. 그 바람직한 용리 용액은 55: 45의 부피 비의 메탄올과 물(0.1% 초산을 가지는)을 포함한다. 그 텍트리제닌의 양은 표준으로 Ψ-텍트리제닌(Sigma®T-9165)을 사용하여 약 265nm 에서 측정된다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 일 부분은 뿌리, 잎, 잎의 기저부(basal portion) 및 근경(rhizome)과 같은 세포 복제 및 증식할 수 있는 Neomarica gracilis 의 조직 배양으로부터 얻을 수 있는 N. gracilis 의 플라보노이드-풍부한 조직에 관한 것이다. 그 플라보이드-풍부한 조직은 텍토리제닌(tectorigenin)을 함유하고 있는 것에 의하여 야생형N. gracilis 근경과 명확하게 다르다. 최근 연구는 텍트리제닌은 자유 래디컬 제거하고, 암의 진행을 중지하고, H. pylori 와 곰팡이 등과 같은 진균류 및 병원성 세균을 저해하는 등에 대한 의학적 효과를 가진다고 알려졌다.
텍트리제닌은 하기에서 나타난 것과 같은 화학 구조를 가진다:
Figure 112007058629191-PAT00001
텍트리제닌은 Iris spuria, Iris carthaliniae, 및 Iris germanica, 그리고Pueraria thunbergiana와 같은 많은 콩과식물 및 참붓꽃(Iris)의 뿌리 또는 근경에서 야생적으로 발견된다. 그러나 이들 식물에서의 텍트리제닌 양은 너무 작아서 텍트리제닌의 공급원으로 사용될 수 없다.
텍트리제닌의 주된 공급원은 Belamcanda chinensis 근경으로부터 자연적으로 성장한 것으로부터 온다. 그러나, B. chinensis는 약 2에서 3년의 느린 성장 속도(즉 파종으로부터 수확까지)를 가지고 이것은 텍트리제닌의 수집을 어렵게 한다.
B. chinensis와 대조적으로 N. gracilis 는 대중적인 준-옥외식물로 쉽게 자라고 증식한다. 그러나, N. gracilis 는 텍트리제닌을 포함하지 않는다. N. gracilis는Iridaceae 계 및 16종을 가지는 Neomarica , 속에 속한다: N. caerulea, N. capitellata, N. caulosa, N. fluminensis, N. gracilis, N. imbricata, N. longifolia, N. nitida, N. northiana, N. paradoxa, N. portosecurensis, N. rotundata, N. rupestris, N. sabini, N. silvestris, and N. variegata. N. gracilis 는 서아프리카의 적도 지방 및 중남미, 특히 브라질에 최고의 분포로 자생한다. N. gracilis 는 꽃이 한번 핀 줄기로부터 발생하는 새로운 묘목이고 두꺼운 근경에 의하여 증식하는 다년생 초본 식물이다.
본 발명의 또 다른 부분은 일반적으로 4에서 8주 사이의 비교적 짧은 기간 동안 조직 배양 기술에 의하여 높은 텍트리제닌을 가지는 N. gracilis 인 비트로 근경 조직을 성장시키는 방법에 관한 것이고 따라서 새로운 텍트리제닌의 공급원을 제공한다. 그 방법은 배양 배지에서 N. gracilis 조직을 접종하고 그 근경 조직이 발생될 때까지 충분한 시간 동안 N. gracilis 조직을 성장시키는 단계를 포함한다.
N. gracilis 조직은 증식할 수 있는 배양된 N. gracilis 또는 자연적으로 성장한 N. gracilis 로 얻을 수 있는 조직일 수 있다. 바람직하게는 N. gracilis 조직은 N. gracilis의 잎의 기저부, 잎, 근경 또는 뿌리로부터 얻어진 조직이다.
배양 배지는 적어도 하나의 식물 성장 조절자(PGR), 하나의 염 및 하나의 탄수화물을 포함한다. PGR들은 배양 챔버에서 증식되는 외식된 조직의 탈분화 또는 분화를 야기하고 촉진한다. PGR들의 예들은 옥신 및 시토키닌을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
옥신은 대부분 뿌리 혼합물에 존재하는 활성 성분이다. 옥신은 식물의 영양계번식을 돕는다. 세포 수준에서 옥신은 부정(adventitious) 뿌리의 형성, 세포 분열 및 세포 증식에 영향을 준다. 일부 옥신은 매우 낮은 농도에서 활성을 가진다. 옥신은 0.0001-20 mg/L, 바람직하게는 0.01-10 mg/L, 더욱 바람직하게는 0.01-2.0 mg/L의 농도 범위에서 사용될 수 있다. 옥신의 예들은 4-바이페닐초산, 3-클로로-4-하이드록시페닐초산, 4-하이드록시페닐초산, 인돌-3-초산(IAA), 인돌-3-프로피온산, 인돌-3-부틸산, 인돌-3-아세틸-L-알라닌, 인돌-3-아세틸-DL-아스파르트산, 인돌-3-아세틸-DL-트립토판, 인돌-3-아세틸-L-발린, 2,4-다이클로로페녹시초산(2,4-D), 및 알파-나프팔렌초산(NAA)을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
시토키닌(Cytokinin)은 일반적으로 세포 분열을 촉진하고, 묘조(shoot) 증식을 촉진하고, 유전자 발현 및 대사 활성을 활성화한다. 동시에 시토키닌은 뿌리 형성을 저해한다. 이것은 뿌리 형성이 바람직하지 않은 강력한 성장이 있는 식물 세 포 조직을 배양하는데 유용하게 한다. 또 시토키닌은 식물의 노화를 늦춘다. 시토키닌은 0.0001-20 mg/L, 바람직하게는 0.01-10 mg/L, 더욱 바람직하게는 0.01-2.0 mg/L의 농도 범위에서 사용될 수 있다. 시토키닌의 예들은 N-(3-메틸부-2-에닐)-1H-퓨린-6-아민, 6-벤질-아미노퓨린 (BA), 키네틴 및 제아틴(zeatin)을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
염의 예들은 질산, 염산, 인산, 황산, 붕산, 요오드산과 같은 무기 산의 염; 초산, 말론산, 만델산, 옥살산, 젖산, 락토바이온산, 푸말산, 말레산, 주석산, 구연산, 아스코르브산과 같은 유기산들을 포함한다. 그 염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 철, 마그네슘, 망간, 아연, 구리 또는 코발트 염일 수 있다. 그 배양 배지는 염의 혼합물을 함유할 수 있다.
일 실시예에서 그 배양 배지는 예를 들어 이후에서 "MS 기초 배지"로 명명되는 무리시게와 스쿡 Physiol . Plant ., 15, 473-497 (1962)에 기재된 다량 영양소 및 소량 영양소와 같은 외식된 식물 조직의 성장을 촉진하는 영양분을 포함한다. MS 기초 배지에 포함된 그 염들은 "MS 염들"로 명명한다. 본 발명의 명세서에서 사용된 MS 염들은 적당한 농도의 질산 암모늄, 붕산, 염화칼슘, 염화코발트, 황산 구리, Na2-EDTA, 황산 철, 황산마그네슘, 황산망간, 몰리브덴산, 요오드 칼륨, 질산칼륨, 제1인산칼륨, 질산 나트륨, 제1인산나트륨 및 황산아연을 포함한다.
탄화수소는 식물 배양에 영양적 가치를 가지는 탄화수소일 수 있다. 바람직하게는 탄화수소는 사카라이드이다. 더욱 바람직하게는 상기 탄화수소는 미오-이노 시톨, 수크로스 또는 그 혼합물이다.
배양 배지는 아미노산, 비타민 또는 그 혼합물과 같은 다른 구성성분을 부가적으로 포함할 수 있다. 바람직한 비타민들은 비타민 B1 (티아민 HCl), 비타민 B6 (피리독신 HCl), 및 비타민 B3 (니코틴산)을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
배양 배지는 N. gracilis의 성장에 적합한 pH 범위로 조정된다. 그 pH 범위는 바람직하게는 4와 8 사이, 더욱 바람직하게는 5와 7 사이이다. 일 실시예에서 그 배양 배지는 원하는 수준에서 유지된 pH를 위한 적당한 버퍼제를 포함한다. 이들 물질들은 전형적으로 약 4.5에서 약 5.5 사이의 pKa를 가질 것이고 구연산, N-모르포리노-에탄설폰산, 수소화칼륨 프탈산, 및 벤조산을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
배양 온도는 일반적으로 약 30℃ 또는 그 이하에서 유지되고, 바람직하게는 약 20-30℃ 범위에서 유지된다.
바람직한 성장 기간은 2에서 16주, 바람직하게는 4-8주이다.
바람직한 실시예에서 그 배양 배지는 MS 염, 수크로스(30 g/L), 미오-인노시톨(100 mg/L), 6-벤질-아미노퓨린(BA) (0.5 mg/L), 2,4-디클로로페녹시초산(2,4-D) (0.1 mg/L), 및 알파-나프탈렌초산(NAA) (0.84 mg/L)을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 그 N. gracilis 조직은 계속 교반하면서 배양된다. 또 다른 실시예에서 N. gracilis 조직은 일시적 잠김 시스템(Temporary Immersion System;TIS)에서 배양된다. 도 1에 도시된 바와 같이, TIS는 배양 배지에 식물 조직을 간헐적으로 잠기게 하여서 식물 배양을 산소화하고 영양분을 공급한다. 간략 하게 챔버 10은 스크린 14 또는 바스켓 상에 배양 12를 유지한다. 낮은 압력 공기가 챔버 10에 펌프되고, 액체 배지 16을 상승시키고 배양 12를 잠기게 한다. 또 공기 흐름은 배지 16을 산소화시키고 교반한다. 그 흐름이 꺼지면 압력이 정지하고 배지는 챔버 10의 바닥으로 돌아간다. 전형적으로 TIS의 모든 구성요소는 오토크레이브되고 재사용가능하다. 그 시스템은 대량 식물 조직 배양 동안 용이하게 자동화될 수 있다. 바람직한 실시예에서 상기 N. gracilis 조직은 매 2-4 시간마다 1-3 분 동안 배양 배지에 의하여 잠긴다.
본 발명의 또 다른 부분은 고 수준의 텍트리제닌을 가지는 배양된 N. gracilis조직들을 제공한다. 일 실시예에서 그 배양된 N. gracilis 근경 조직들은 건조 근경 중량의 텍트리제닌 양을 가진다. 그 배양된 N. gracilis 근경 조직들은 첨가된 PGR이 없는 MS 배지를 포함하는 고체 배지내의 건조 근경 중량의 평균의 플라보노이드 양을 가지고, 그것은 표준으로 Ψ-텍토리제닌을 사용하여 측정된다.
본 발명의 또 다른 부분은 N. gracilis 조직으로부터 플라보노이드를 추출하는 방법에 관한 것이다. 그 방법은 조직을 건조하고, 그 건조된 조직을 마쇄하고, 그 마쇄한 조직을 알코올에 현탁하고 그 현탁액을 가열하고 플라보노이드 추출물을 얻기 위하여 그 현탁액을 여과하는 단계를 포함한다.
상기 식물 조직은 상기의 방법, 바람직하게는 냉동 진공 건조기를 사용한 동결 건조에 의하여 건조될 수 있다. 상기 알코올은 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올인 알코올을 사용할 수 있다. 상기 알코올은 바람직하게는 50℃에서 70℃ 온도 범위까지 더욱 바람직하게는 교반, 진동, 또는 음파와 함께 가열된다. 진동의 바람 직한 방법은 초음파 진동이다.
하기 실험 고안 및 결과는 본 발명의 범위를 한정하지는 아니하게 기술된다. 합리적인 당업자들이 알 수 있는 것과 같은 합리적인 진동들이 본 발명의 범위를 벗어나지 아니하고 여기에 만들어질 수 있다. 또한 본 발명의 기재에서 특정한 용어정의가 명확하기 위하여 채택된다. 그러나 본 발명은 그렇게 선택된 특정 용어에 한정되지 아니한다. 각 특정 요소들은 유사한 목적을 달성하기 위하여 유사한 형태로 작성되는 모든 등가물을 포함한다고 이해되어 진다.
본 발명은 인 비트로에서 플라보노이드-풍부한 근경을 배양하는 방법, 플라보노이드 풍부한 근경 조직으로부터 텍토리제닌을 추출하는 방법 및 플라보노이드-풍부한 근경 조직에서 텍토리제닌의 양을 결정하는 정량적인 방법을 제공한다.
실시예 1: 물질과 방법들
N. gracilis ( Neomarica gracilis )로부터 인비트로 플라보노이드-풍부한 근경 조직
N. gracilis의 인 비트로 플라보노이드-풍부한 근경 조직은 타퉁 대학 식물 조직 배양 실험실에서 배양되었다. 그 근경 조직은 30 g/L 수크로스, 100 mg/L 미오-이노시톨, 0.5 mg/L BA, 0.1 mg/L 2, 4- D 와 0.84 mg/L NAA가 보충된 MS 기초 염 배지로 매달 서브배양되었다.
배양 배지
액체 배양 배지는 30 g/L 수크로스, 100 mg/L 미오-인노시톨과 여러 실험에 따라 다양한 식물 성장 인자들이 보충된 MS 기초 염 배지(무라시게 및 스쿡, 1962) (표 1)를 포함한다. 상기 고체 배양 배지는 액체 배지에 8 g/L 아가를 첨가하여 제조하였다. 그 고체 배양은 8 x 1.5 x 1.5 cm 배양 튜브(10 ml 배양 배지/튜브) 또는 플라스크(30 ml 배양 배지/플라스크)에서 수행되었다. 액체 배양은 각각 10 ml, 50 ml 또는 100 ml 배양 배지를 가지는 50 ml, 100 ml 또는 250 ml 플라스크에서 수행되었다. 배양 튜브 또는 플라스크의 입구는 알루미늄 호일로 막았다.
TIS 배양은 A-Tech Bioscientific 사로부터 구입한 Plantima® 시스템을 사용하였다. 약 200 ml 배지를 각 배양 챔버에 첨가하였다. 플라스틱 튜빙 및 멸균된 여과 막들을 지시된 가스 입구와 출구에 위치하였다. 여과막을 면과 알루미늄 호일로 쌓고, 플라스틱 튜빙은 수증기가 필터에 들어가는 것을 막기 위하여 크램프로 고정하였다.
모든 배양 배지는 5.70 ±0.05의 pH값을 가지고, 121℃, 1.1-1.2 kg/ cm2 압력 하에서 15분간 오토크래이브하여 살균하였다.
화합물 mg/l
다량 영양소
KNO3 1900
NH4NO3 1650
MgSO4·7H2O 370
CaCl2·2H2O 440
KH2PO4 170
소량 영양소
MnSO4·4H2O 22.3
KI 0.83
H3BO3 0.2
ZnSO4·7H2O 8.6
CuSO4·5H2O 0.025
Na2MoO4·2H2O 0.25
CoCl2·6H2O 0.025
FeSO4·7H2O 27.8
Na2EDTA 37.3
표 1은 MS(무라시게와 스쿡, 1962)의 기초 염 조성을 나타낸 표
플라스크 배양
(1)접종물 중량(접종물의 새로운 중량의 그램/ 100 ml의 배양 배지의 퍼센테이즈로 표현)의 효과를 결정하기 위하여, 액체 배양된 N. gracilis 근경 조직은 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 10 또는 15 % (새로운 중량(F.W.)의 그램 / 100 ml 배지)의 접종물 중량 비에서 MS 기초 염, 0.5 mg/L BA , 0.1 mg/L 2, 4-D와 0.84 mg/L NAA을 포함하는 서브배양 배지로 접종된다. 상기 배양된 조직은 접종 3주 후에 측정하였다.
(2)식물 성장 조절자(PGR)의 효과를 결정하기 위하여, 액체 배양된 N. gracilis 근경 조직에서 온 싹을 메스로 제거하였다. 그 근경 조직을 표 2에 나타낸 것과 같은 PGR들로 보충된 MS 기초 배지를 포함하는 배양 배지에서 3% (g F.W. / 50 ml)의 접종물 중량에서 접종하였다. 그 배양된 배지는 2주마다 교환하였다. 그 배양된 조직을 총 8주 동안 각 배지 교환시에 중량을 측정하였다.
(3) N. gracilis 근경 조직의 성장 곡선과 그 텍트리제닌 양을 결정하기 위하여, 액체 배양된 N. gracilis 근경 조직에서 온 싹을 메스로 제거하였다. 그 근경 조직을 0.1 mg/L NAA 또는 1 mg/L NAA와 1.0 mg/L 2,4-D의 혼합물이 보충된 MS 기초 배지를 포함하는 배양 배지에서 접종물 중량(g F.W. / 50 ml)에서 접종하였다. 8주 연속 동안 매주 그 조직들의 중량을 측정하고 텍트리제닌 양을 분석하였다.
(4) 싹 형성 및 텍트리제닌 양의 안시미돌 효과를 결정하기 위하여, 액체 배양된 N. gracilis 근경 조직을 MS, 0.5 mg/L BA , 0.1 mg/L 2,4-D와 0.84 mg/L NAA를 포함하는 서브배양 배지에 3% (g F.W./ 100 ml)의 접종물 중량에서 접종하였다. 배양의 7일과 14일째, 멸균 여과된(0.2 um) 안시미돌을 최종 농도0.5, 1.0, 또는 2.0 mg/L로 배양 배지에 첨가하였다. 그 조직의 성장은 모니터되고 그 텍트리제닌 양은 분석되었다.
샘플 광물 조성 유기 물질(mg/l) 식물 성장 조절자(mg/L) 설탕 (g/L) pH
VB1 VB6 NA Gly MI NAA 2,4-D 키네틴 IAA
MSO MS 1 0.5 0.5 2 100 0 0 0 0 30 5.7
A1 MS 1 0.5 0.5 2 100 0.1 0 30 5.7
A2 MS 1 0.5 0.5 2 100 1.0 0 30 5.7
B1 MS 1 0.5 0.5 2 100 0 0.1 30 5.7
B2 MS 1 0.5 0.5 2 100 0.1 0.1 30 5.7
B3 MS 1 0.5 0.5 2 100 1.0 0.1 30 5.7
C1 MS 1 0.5 0.5 2 100 0 0.5 30 5.7
C2 MS 1 0.5 0.5 2 100 0.1 0.5 30 5.7
C3 MS 1 0.5 0.5 2 100 1.0 0.5 30 5.7
D1 MS 1 0.5 0.5 2 100 0 1.0 30 5.7
D2 MS 1 0.5 0.5 2 100 0.1 1.0 30 5.7
D3 MS 1 0.5 0.5 2 100 1.0 1.0 30 5.7
E1 MS 1 0.5 0.5 2 100 0 2.0 30 5.7
E2 MS 1 0.5 0.5 2 100 0.1 2.0 30 5.7
E3 MS 1 0.5 0.5 2 100 1.0 2.0 30 5.7
F1 MS 1 0.5 0.5 2 100 0 0.1 30 5.7
F2 MS 1 0.5 0.5 2 100 0 1.0 30 5.7
G1 MS 1 0.5 0.5 2 100 0.1 0 30 5.7
G2 MS 1 0.5 0.5 2 100 0.1 0.1 30 5.7
G3 MS 1 0.5 0.5 2 100 0.1 1.0 30 5.7
H1 MS 1 0.5 0.5 2 100 0.5 0 30 5.7
H2 MS 1 0.5 0.5 2 100 0.5 0.1 30 5.7
H3 MS 1 0.5 0.5 2 100 0.5 1.0 30 5.7
I1 MS 1 0.5 0.5 2 100 1.0 0 30 5.7
I2 MS 1 0.5 0.5 2 100 1.0 0.1 30 5.7
I3 MS 1 0.5 0.5 2 100 1.0 1.0 30 5.7
J1 MS 1 0.5 0.5 2 100 2.0 0 30 5.7
J2 MS 1 0.5 0.5 2 100 2.0 0.1 30 5.7
J3 MS 1 0.5 0.5 2 100 2.0 1.0 30 5.7
표 2은 플라스크 배양에서 N. gracili 조직 성장에 대한 식물성장 조절자의 효과
TIS 배양
TIS Plantima® 배양 시스템은 A-Tect Bioscientific 사, 대만, 타이페이)로부터 구입하였다.
(1) 조직 성장에 대한 접종물 중량의 효과를 결정하기 위하여 TIS 배양 챔버를 4 면적으로 나누었다. 액체 배양된 N. gracilis 근경 조직을 각 면적당 1.5, 3, 6 및 9g으로 접종하였다. 그 배양 배지는 표 3의 샘플 T12, T17과 T18에 기재된 것과 같은 PGR로 보충된 MS 배지였다. 상기 조직은 Plantima® 사용자 설명서에 상세하게 기재된 조건하에서 배양되고 매 3시간마다 2분씩 담갔다. 그 배양된 조직의 중량은 10일마다 측정하였고, 배지를 교환하였다.
(2) N. gracilis 의 성장 및 텍트리제닌 양 영향에 대한 PLR의 효과를 결정하기 위하여, 10 조각의 액체 배양된 N. gracilis 근경 조직을 표 3의 샘플 MS0, TI3, TI4, TI5와 TI6에 기재된 MS와 PGR을 함유하는 배양 배지에서 접종하였다.
그 배양 배지는 2주에 교체되고 그 조직들은 4주에 수확되고 텍트리제닌 양을 분석하였다.
테스트 샘플 광물 조성 유기 물질 (mg/L) 식물 성장 조절자 (mg/L) 설탕 (g/L) pH
VB1 VB6 NA Gly MI BA NAA 2,4-D 키네틴
MSO MS 1 0.5 0.5 2 100 0 0 0 0 30 5.7
TI2 MS 1 0.5 0.5 2 100 0 0 0 1.0 30 5.7
TI3 MS 1 0.5 0.5 2 100 0 0.1 0 0 30 5.7
TI4 MS 1 0.5 0.5 2 100 0 0.5 0 0 30 5.7
TI5 MS 1 0.5 0.5 2 100 0.5 0.84 0.1 0 30 5.7
TI6 MS 1 0.5 0.5 2 100 0 1.0 0.1 0 30 5.7
TI7 MS 1 0.5 0.5 2 100 0 1.0 1.0 0 30 5.7
TI8 MS 1 0.5 0.5 2 100 0 2.0 1.0 0 30 5.7
표 3은 TIS배양에서 N. gracili 조직 성장에 대한 식물성장 조절자의 효과
텍트리제닌 및 전체 플라보노이드의 추출
N. gracilis 근경 조직을 -80℃에서 10시간 냉동하고, 냉동 진공 건조기(VirTis Freezemobile 12XL)에서 오보나잇한 후 마쇄하였다. 0.5 g의 건조되고 마쇄된 조직을 10ml 플라스크내의 적당한 양의 메탄올에 부유시켜 60℃에서 1시간 동안 초음파 진동하면서 배양하고 냉각하였다. 메탄올을 그 후에 현탁액에 최종 부피 10 ml로 첨가하였다. 그 현탁액을 와트만 No. 1 여과지로 여과하였다. 그 여과된 용액을 갈색 샘플 바이알에 밀봉하고 이후 실험을 위하여 냉장실에 놓았다.
텍트리제닌 양을 결정하기 전에, 텍트리제닌 표준(Sigama T-9165, Ψ-텍트리제닌) 용액과 샘플을 0.45 um 필터를 통하여 여과하였다. 그 여과된 샘플들을 차후에 분석을 위하여 2 ml 갈색HPLC 바이알에 밀봉하였다.
플라보노이드의 측정
전체 플라보노이드는 Lee et al., J. Agric . Food Chem . (2003) 51: 7292-7295에 따라서 측정되었다. 요약하면, 샘플 혼합물을 만들기 위하여 4 ml의 탈이온수와 0.3 ml의 5% NaNO2 를 약 0.5 ml의 N . Gracilis 추출물에 첨가하고 그 반응을 약 5분 동안 진행하였다. 그 후 약 0.3 ml의 10% AlCl3를 반응된 샘플 혼합물에 첨가하고 충분한 교반 하에서 추가로 5분간 반응하였다. 이것은 더 반응된 샘플 혼합물에 2 ml의 1 N NaOH와 2.9 ml의 탈이온수를 첨가하여 수반된다. 반응샘플 결과물 내의 총 플라보노이드는 그 후 UV 분광기(Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech)로 510nm파장에서 흡광도를 측정하고 표준으로 Ψ-텍트리제닌을 사용한 표준 곡선과 데이터를 비교하여 결정하였다.
HPLC 에 의한 텍트리제닌 측정
조직 추출물의 텍트리제닌 양은 Cosmosil 5 C18-AR-II 컬럼(5㎛, 4.6x 250 mm), a Lichrospher®100 RP-18e 가드 컬럼(45x 4.6mm, 5㎛, Merck), Degasser ( ERC-3415α 펌프, Waters 600E 오토샘플러와 인젝터(Schambeck SGD GmbH S5200), Waters TM 486 UV/VIS 디텍터 및 인터크레이터(SISC Xunhua Ltd.)을 사용한 HPLC 분석에 의하여 결정된다. 그 분석은 55 : 45 비율의 메탄올: H2O (0.1 % 초산), 0.8 ml/분의 흐름속도, 및 265 nm의 검출파장을 사용하여 수행된다. 표준의 텍트리제닌 피크는 약 13 분에서 나타난다.
통계 분석
모든 측정은 3회 반복 실시하였다. 각 실험 데이터는 5% 유의 수준을 가지는 던칸의 다중 범위 테스트(Duncan D. B. 1955, Biometrics, 11:1-42)를 사용하여 분석되었다.
형태 분석과 사진
형태 분석은 해부 현미경(Olympus SZ-ET) 하에서 분석되었다. 사진 기록은 디지털 카메라(Nikon coolpix 8700)을 사용하여 만들었다.
실시예 2: 플라스크 배양에서 조직 성장에 대한 접종물 중량의 효과
액체 배양된 N. gracilis 근경 조직은 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 10 또는 15 % (새로운 중량(F.W.)의 그램 / 100 ml 배지)의 접종물 중량에서 MS, 0.5 mg/L BA, 0.1 mg/L 2, 4-D와 0.84 mg/L NAA을 포함하는 서브배양 배지로 접종된다. 도 2에 도시된 바와 3% (g 새로운 중량(F.W.)/100 ml 배지)의 접종물 중량은 최고 성장 속도, 즉 약 4배의 새로운 중량 증가((새로운 증량의증가 배수 = 최종 새로운 중량- 시작 새로운 중량) /시작 새로운 중량)을 야기한다. 그 얻은 중량은 접종물 중량이 4% 보다 큰 경우에는 아마 플라스크 내의 영양분 공급 및 제한된 공간에 기인하여 감소된다.
실시예 3: 플라스크 배양에서 조직 성장 및 텍트리제닌 양에 대한 PGR 의 효과
액체 배양된 N. gracilis 근경 조직에서 온 싹을 메스로 제거하였다. 그 근경 조직을 표 2에 나타낸 것과 같은 다양한 양의 PGR들로 보충된 MS를 포함하는 배양 배지에서 3% (g F.W. / 50 ml)의 접종물 중량에서 접종하였다. 그 배양된 배지는 2주마다 교환하고 조직의 새로운 중량은 매 2주마다 측정되었다. 새로운 중량에서 현저한 증가는 배양 6-8주 동안 관찰되었다(도 3).
표 2에 기재된 15 키네틴/IAA 조합 중에서, 단지 4 조합들(즉, B1, C1, C2, 와 D1)이 텍트리제닌 양의 현저한 증가를 야기하였다. 증가된 텍트리제닌 양을 야기하는 4 조합 가운데, 0.5 mg/L IAA/ 0 mg/L 키네틴의 조합이 37.6 ∂ 4.9 mg/ kg D.W.의 가장 높은 텍트리제닌 양을 제공하였다 (표 4). 배양 배지에 키네틴을 첨가하는 것은 텍트리제닌 양에서 증가를 야기하지 않았다.
식물성장 조절자(mg/L)
IAA 키네틴 건조 중량(g)1 텍트리제닌(mg/kg D.W.)1
0 0 1.08±0.16bc 2 3.0±0.24d2
0.5 0.1 0.93±0.06c 37.0±1.2a
0.1 0 1.26±0.22b 11.8±8.4b
0.5 0 1.02±0.11bc 37.6±4.9a
1 0 1.70±0.08a 29.0±0.29c
표 4는 N. gracilis 근경 조직의 텍트리제닌 양 및 건조 중량에 대한 IAA와 키네틴의 효과
표에서 1. 데이터는 배양 8주 후에 수집, 값들은 3회 반복의 평균±S.E
2. 동일한 문자(a에서 d)에 의하여 수반된 컬럼 내의 평균들은 던칸 복수 범위 테스트와 크게 다르지 아니하다(P〉0.05)
증가된 텍트리제닌 양은 또한 NAA 만으로 배양된 일부 조직뿐 아니라 2,4-D와 NAA의 존재 하에서 배양된 모든 조직에서 발견된다(표 5). 가장 높은 텍트리제닌 양은 1.0 mg/L NAA와 0.1.mg/L 2,4-D (60.9±0.67 mg/kg D.W.), 단지 0.5 mg/L NAA (58.9 ± 0.23 mg/kg D.W.), 및 단지 0.1 mg/L NAA(55.5±0.67 mg/kg D.W.)의 존재 하에서 배양된 조직에서 발견된다. NAA가 단독으로 사용될 때, NAA 농도 증가는 건조 중량의 감소를 이끈다. 가장 높은 건조 중량은 0.1 mg/L의 NAA농도에서 얻어졌다 (표 5).
식물성장 조절자(mg/l)
2,4-D NAA 건조 중량(g)1 텍트리제닌(mg/kg D.W.)1
0 0 1.17±0.02ab2 8.2±0.42e2
0 0.1 1.39±0.32a 55.5±0.67ab
0 0.5 1.03±0.31bc 58.9±0.23ab
0 1.0 1.05±0.20bc 49.0±0.81bc
0 2.0 0.75±0.02cd 9.4±0.22e
0.1 0 0.92±0.15bc 38.9±1.17cd
0.1 0.1 1.06±0.03bc 49.5±1.21bc
0.1 0.5 0.92±0.13bc 40.1±0.55cd
0.1 1.0 0.95±0.01bc 60.9±0.67a
0.1 2.0 0.93±0.02bc 14.5±0.67e
1.0 0 1.17±0.21ab 36.7±0.33cd
1.0 0.1 1.39±0.54a 35.3±0.23d
1.0 0.5 1.03±0.12bc 33.4±0.16d
1.0 1.0 1.05±0.10bc 16.5±0.80e
1.0 2.0 0.75±0.03cd 38.0±1.13cd
표 5는 N. gracilis 근경 조직의 텍트리제닌 양 및 건조 중량에 대한 NAA와 2,4-D의 효과
표에서 1. 데이터는 배양 8주 후에 수집, 값들은 3회 반복의 평균±S.E
2. 동일한 문자(a에서 e)에 의하여 수반된 컬럼 내의 평균들은 던칸 복수 범위 테스트와 크게 다르지 아니하다(P〉0.05)
실시예 4: N. gracilis 성장속도와 성장 동안 텍트리제닌 양
근경 조직을 0.1 mg/L NAA 또는 1 mg/L NAA와 1.0 mg/L 2,4-D의 혼합물이 보충된 MS 기초 배지를 포함하는 배양 배지에서 접종물 중량(g F.W. /50 ml)에서 접종하였다. 8주 연속 동안 매주 그 조직들의 중량을 측정하고 텍트리제닌 양을 분석하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, 0.1 mg/L NAA가 보충된 MS 기초 배지에서 배양된 근경 조직은 3-4 주 및 6-7 주의 기간 동안 신속하게 성장하였다. 5주 및 8 주 동안에는 성장이 거의 없다. 1 mg/l NAA and 1.0 mg/l 2,4-D가 보충된 MS 기초 배지에서 배양된 근경 조직은 유사한 성장 곡선을 보였다.
성장 동안 텍트리제닌 양에 관련하여, 가장 높은 양이 양 배양 조건들(0.1 mg/L NAA와 1 mg/L NAA/1.0 mg/L 2,4-D에 대하여 각각 56±2.82 mg/kg D.W.와 43±2.15 mg/kg D.W.) 하에서 1주 동안 검출되었다. 그 텍트리제닌 양은 2주 차에서 점차적으로 감소하여서 가장 낮은 위치인 7±0.42 mg/kg D.W.에 도달하고 3-4주차에는 점차적으로 증가하였다. 그 후 그 텍트리제닌 양은 5주차에서 또 다른 현저한 감소를 보이고 6-8 주차 동안에 다시 증가하였다(도 5).
고체 배양의 MS0 (즉 PGR이 없는 MS 배지)에서 배양된 조직의 총 플라보노이드 양은 동량의 시간 동안 배양에서 TIS 및 액체 배양 배지에서 MS에서보다 일반적으로 더 높다. MS0을 포함하는 고체 조직 배양에서 약 8주간 동안 총 플라보노이드의 양은 약 10.74±0.31의 Ψ-텍트리제닌 mg/g 건조 중량과 동일하고 그것은 높은 양의 플라보노이드로 공지된 허브 Belamcanda chinensis로부터 추출한 총 플라보노이드 양과 유사하다. B. chinensis에서 총 플라보노이드는 여기에 사용된 것과 동일한 측정 방법에 기초하여 약 11.50±0.1의 Ψ-텍트리제닌 mg/g 건조중량이었다.
실시예 5: 싹 형성 및 배양된 N. gracilis 근경 조직의 텍트리제닌 양에 대한 안시미돌의 효과
액체 배양된 N. gracilis 근경 조직을 MS, 0.5 mg/L BA , 0.1 mg/L 2, 4-D와 0.84 mg/L NAA를 포함하는 서브배양 배지에 3% (g F.W./ 100 ml)의 접종물 중량에서 접종하였다. 배양의 7일과 14일째, 멸균 여과된(0.2 um) 안시미돌을 최종 농도 0.5, 1.0, 또는 2.0 mg/L로 배양 배지에 첨가하였다. 그 조직의 성장은 모니터되고 그 텍트리제닌 양은 분석되었다.
표 6에 도시된 바와 같이, 14일째 조직 배양에 0.5 또는 2.0 mg/L 안시미돌의 첨가는 감소된 텍트리제닌 양을 야기하였다. 7일째 조직 배양에 안시미돌의 첨가는 텍트리제닌 양에 영향이 없었다. 그러나 형태학적으로 7일째 조직 배양에 안시미돌 첨가는 싹 형성을 크게 감소하였다(도 6).
안시미돌(mg/L) 첨가 시간(일) 텍트리제닌(mg/kg D.W.)1
대조군 --- 32.81 ±0.72 ab2
0.5 7 28.31 ±0.11 b
1.0 7 27.74 ±0.08 b
2.0 7 35.65±0.18 a
0.5 14 18.59 ±0.07 c
1.0 14 30.81 ±0.35 a
2.0 14 13.36 ±0.13 d
표 6은 N. gracilis 근경 조직의 텍트리제닌 양에 대한 안시미돌의 효과
표에서 1. 데이터는 배양 3주 후에 수집, 값들은 3회 반복의 평균±S.E
2. 동일한 문자(a에서 d)에 의하여 수반된 컬럼 내의 평균들은 던칸 복수 범위 테스트와 크게 다르지 아니하다(P〉0.05)
실시예 6: N. gracilis 바이오메스 증가에 접종물의 효과
TIS 배양 챔버를 4 면적으로 나누고 액체 배양된 N. gracilis 근경 조직을 각 면적당 1.5, 3, 6 및 9g으로 접종하였다. 그 배양 배지는 표 3의 샘플 T12, T17과 T18에 기재된 것과 같은 PGR로 보충된 MS 배지였다. 배양된 조직 중량을 매 10일마다 측정하였다. 도 7에 도시한 바와 같이, 1 mg/L 키네틴으로 보충된 MS 배지에서 1.5g의 접종물 중량은 최고의 조직 성장을 제공하고 -- 30일에서 접종물 중량의 4.5배인 새로운 중량(6.76±0.33 g)에 도달함. 모든 다른 접종물 중량/PGR 조합은 느린 성장을 야기한다(도 7).
텍트리제닌 양에 대한 PGR의 효과를 결정하기 위하여, 10 조각의 액체 배양된 N. gracilis 근경 조직(각 1.5g)을 표 3의 샘플 MS0, TI3, TI4, TI5와 TI6에 기재된 MS와 PGR을 함유하는 배양 배지에서 접종하였다. 그 조직을 4주차에 수확하여서 텍트리제닌 양을 분석하였다. 도 7에 도시한 바와 같이, 가장 높은 텍트리제닌 양(48±0.22 mg/kg D.W.)은 0.1 mg/L 2,4-D와 1.0 mg/L NAA로 보충된 MS 배지에서 얻어졌다.
PGR(mg/l) F.W.(g) 성장 속도1 텍트리제닌(mg/kg D.W.)
대조군 42.63±3.51 1.84±0.23 22±0.11
키네틴 1.0 46.12±2.18 2.07±0.15 10±0.15
NAA 0.1 40.65±2.09 1.71±0.14 38±0.57
NAA 0.5 31.47±3.12 1.10±0.21 33±0.38
NAA 1.0+2,4-D 0.1 30.48±1.13 1.06±0.08 48±0.22
0.5BA+0.1 2,4-D+0.84NAA 33.50±1.03 1.23±0.07 40±0.52
표 7은 TIS 배양에서 N. gracilis 근경 조직의 성장 및 텍트리제닌 양에 대한 PGR의 효과
표에서 값들은 3회 반복의 평균±S.E
1. 성장 속도=(최종 F.W.-시작 F.W.)/시작 F.W.
실시예 7: 플라스크와 TIS 에서 배양된 N. gracilis 근경 조직에서 텍트리제닌 양의 비교
실시예 2의 결과에 기초하여서 2,4-D와 NAA가 IAA와 키네틴의 조합보다 더 높은 텍트리제닌 양을 제공한다. 가장 높은 텍트리제닌 양은 0.1 mg/L NAA (텍트리제닌 55.5±0.67 mg/ kg D.W.) 0.5 mg/L NAA (텍트리제닌 59.9±0.23 mg/ kg D.W.) 또는 0.1 mg/L NAA 와 1 mg/L 2,4-D (텍트리제닌 60.9±0.67 mg/ kg D.W.)로 보충된 MS 배지에 의하여 얻어졌다. 총 플라보노이드 양은 또한 이들 배양 조건에서 결정되었다.
실시예 8: 배양된 및 야생형 N. gracilis 근경 조직에서 텍트리제닌 양 비교
표 8은 배양된 및 야생형 N. gracilis 근경 조직에서 텍트리제닌 양을 보여준다. 그 결과들은 야생형 N. gracilis 근경 조직은 텍트리제닌이 없지만 배양된 N.gracilis 근경 조직은 55.5±0.67 mg/kg D.W의 텍트리제닌 양을 가진다.
텍트리제닌(mg/kg D.W.)2
플라스크 배양된 근경1 55.5±0.67
야생형 근경 ND3
표 8은 배양 및 야생형 N. gracilis 근경 조직의 텍트리제닌 양
표에서 1.근경 배양 배지는 O.1mg/l NAA를 가지는 MS.
2. 값들은 3회 반복의 평균±S.E
3. ND=검출 안됨
실시예 9: 배양된 N. gracilis 근경 조직에서 유래한 추출물은 종양 세포 성장을 저해
본 발명의 실시예에서 기재된 과정을 사용하여 얻어진 배양된 N. gracilis 근경 조직에서 유래한 추출물을 배양된 종양세포들에서 인 비트로 실험하였다. 그 추출물은 0.1%에서 20% 농도 범위에서 인간 정상 장 세포에 독성을 나타내지 않았다. 그러나 그 추출물은 3.13%, 25% 그리고 50%의 농도에서 마우스 흑색종 세포(B16-F0)의 성장을 저해한다. 그 추출물은 또한 퍼옥사이드의 형성을 모니터하는 루시제닌 분석을 사용하여 급성 골수 백혈병 세포주 PLB985와 인간 유방암 세포주 MCF7에 대한 실험을 하였고, 항-산화제 분석기에 의한 자유-래디컬의 분석을 수반하였다. 그 결과는 그 추출물이 두 종양 세포주의 성장을 저해하는 것을 나타내었다.
본 명세서에서 기재되고 논한 실시예들은 단지 본 발명을 만들고 사용하기 위하여 본 발명자들에게 가장 잘 알려진 방법을 당업자에게 설명하는 것의 목적이다. 본 명세서에는 본 발명의 범위를 제한되는 것으로 인정되어야 하는 것은 없다. 상기 기재된 본 발명의 실시예들은 상기 기재로부터 당업자에 의하여 알 수 있는 바와 같이 본 발명으로부터 벗어나지 아니하고 변형 또는 변화되어 질 수 있고 구성요소들도 첨가되거나 생략될 수 있다. 따라서 청구범위와 그들의 균등 범위 내에서 본 발명은 특정하게 기재된 것과는 다르게 실행될 수 있다고 이해되어 지는 것이다.
도 1은 일시적인 잠김 시스템을 나타내는 그림이고, 그것은 본 발명에서 사용된 두 조직 배양 시스템(다른 조직배양 시스템은 플라스크 배양 시스템) 중 하나.
도 2는 플라스크 배양에서 N. gracilus인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직의 성장 속도에 대한 접종물 중량 당 효과를 나타낸 그림데이터는 0.5 mg/L의 6-벤질-아미노퓨린(BA), 0.1 mg/L의 2,4-디클로로페녹시초산(2,4-D), 및 0.84 mg/L의 알파-나프탈렌초산 (NAA)을 포함하는 무라시게(Murashige) 및 스쿡(Skoog) 베이직 염 배지(즉 MS 배지)에서 3주간 배양된 근경 조직으로부터 수집하였다. 각 데이터 포인트는 평균 3회 반복하였고, 그 에러 바는 평균들의 표준편차를 나타낸다.
도 3은 그 근경 조직을 플라스크 배양으로부터 얻은 Neomarica gracili의 인 비트로 플라보노이드-풍부한 근경 조직에서 바이오매스의 증가에 대한 인돌-3-초산(IAA) 및 키네틴의 효과를 보여주는 그림. 각 데이터 포인트는 평균 3회 반복하였고, 그 에러 바는 평균들의 표준편차를 나타낸다. 바이오매스 증가 = 현재 새로운 중량-2 주전의 새로운 중량.
도 4는 0.1 mg/L (◆)의 알파-나프탈렌초산(NAA)을 포함하는 MS 배지에서 8주간 배양한 N. gracilis의 배양 곡선을 보여주는 그림. 각 데이터 포인트는 평균 3회 반복하였고, 그 에러 바는 평균들의 표준편차를 나타낸다.
도 5는 0.1 mg/L (○)의 MS + NAA, 또는 1mg/L의 NAA 및 0.1 mg/L의 2,4-D (■)에서 8 주간 배양된 플라보노이드-풍부한 근경의 텍트리제닌 양을 보여주는 그림. 각 데이터 포인트는 평균 3회 반복하였고, 그 에러 바는 평균들의 표준편차를 나타낸다.
도 6은 안시미돌의 존재 하에서 N. gracilis 근경 조직의 발아 형성을 보여주는 그림. 사진은 배양 3 주후에 촬영. 바 = 1 cm. 패널 (a): 0.5 mg/L 안시미돌은 7일째에 첨가; 패널(b): 2.0 mg/L 안시미돌을 7일째 첨가; 패널 (c): 2.0 mg/L 안시미돌을 14일째 첨가, 및 패널(d)는 안시미돌이 없는 대조 배양.
도 7은 N. gracilis 근경 조직의 성장 속도에 대한 식물 성장 조절자(PGR)들 및 접종물 중량의 효과를 보여주는 그림. 각 데이터 포인트는 평균 3회 반복하였고, 그 에러 바는 평균들의 표준편차를 나타낸다. 성장 속도 = (최종F.W.- 처음 F.W.)/처음 F.W.

Claims (44)

  1. Neomarica gracilis의 플라보노이드 양을 변경하는 조직 배양 조제로부터 얻은 Neomarica gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드 풍부한 조직, 여기서 상기 플라보노이드-풍부한 조직은 텍트리제닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직은 증식할 수 있는 N. gracilis 조직으로부터 배양된 근경 조직인 것을 특징으로 하는 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 N. gracilis 조직은 뿌리, 근경, 잎 및 잎의 기저부를 포함하는 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 조직 조제는 식물 성장 조절자를 함유하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍 부한 조직.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 식물 성장 조절자는 사이토키닌 또는 옥신을 포함하는 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 식물 성장 조절자는 인돌-3-아세트 산, 2-4-디클로로페녹시아세트 산, 알파-나프타렌아세트산, 6-벤질-아미노퓨린 및 카네틴으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  7. 제4항에 있어서, 상기 식물 성장 조절자는 약 0.01에서 2.0 mg/L 농도인 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  8. 제4항에 있어서, 상기 배양 배지는 무라시게(Murashige) 및 스쿡(Skoog) 베이직 염 배지(MS 배지)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  9. 제8항에 있어서, 상기 MS 배지는 나트륨, 칼륨, 나이트레이트, 암모늄, 마그네슘, 설페이트, 칼슘, 철, 클로라이드, 인산, 망간, 요오드, 보레이트, 아연, 구리, 몰리브덴, 코발트, 또는 그것의 혼합물인 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  10. 제 4항에 있어서, 상기 배양 배지는 탄수화물을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 탄수화물은 마이오-이노시톨 또는 수크로스 또는 그것의 혼합물인 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  12. 제 4항에 있어서, 상기 배양 배지는 비타민을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 비타민은 티아민 HCl, 피리독신 HCl, 및 니코틴산으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  14. 제 4항에 있어서, 상기 배양 배지는 안시미돌(ancymidol)을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  15. 제 4항에 있어서, 상기 배양 배지는 약 5에서 7의 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 조직 배양 제조는 플라스크 배양, 일시적 잠김 시스템(Temporary Immersion System) 또는 그 혼합인 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 텍트리제닌은 kg 건조 조직 중량 당 약 2.5에서 65 mg의 양인 것을 특징으로 하는 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  18. 조직 배양 조제의 배양 배지에 증식할 수 있는 N. gracilis를 접종하고;
    근경 조직이 형성되기에 충분한 시간 동안에 상기 조직 배양 조제에서 N. gracilis 조직을 성장시키는 제1항에 따른 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직을 얻는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 배쟝 배지는 약 20℃에서 30℃에서 유지되는 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 상기 N. gracilis 조직은 뿌리, 잎, 잎의 기저부 또는 근경인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18항에 있어서, 상기 조직 배양 조제는 플라스크 배양, 일시적 잠김 시스템(Temporary Immersion System) 또는 그 혼합인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 18항에 있어서, 상기 충분한 시간은 약 4에서 8주인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 TIS는 약 매 2-4시간 마다 약 1-3분 동안 N. gracilis 조직을 상기 배양 배지에 담가 놓게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 18항에 있어서, 상기 배양 배지는 식물 성장 조절자, 염 배지 및 탄수화물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 식물 성장 조절자는 사이토키닌 또는 옥신을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 식물 성장 조절자는 인돌-3-아세트 산, 2-4-디클로로페녹시아세트 산, 알파-나프타렌아세트산, 6-벤질-아미노퓨린 및 키네틴으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 24항에 있어서, 상기 식물 성장 조절자는 약 0.01에서 2.0 mg/L 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 염 배지는 나트륨, 칼륨, 나이트레이트, 암모늄, 마그네슘, 설페이트, 칼슘, 철, 클로라이드, 인산, 망간, 요오드, 보레이트, 아연, 구리, 몰리브덴, 코발트, 또는 그것의 혼합물인 것을 포함하는 무라시게 및 스쿡 베이직 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 24항에 있어서, 상기 탄수화물은 마이오-이노시톨 또는 수크로스 또는 그것의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 24항에 있어서, 상기 배양 배지는 비타민을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서 상기 비타민은 티아민 HCl, 피리독신 HCl, 및 니코틴산으 로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 N. gracilis 유래한 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직.
  32. 제 24항에 있어서, 상기 배양 배지는 약 5에서 7의 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. N. gracilis의 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직을 건조하여 건조된 플라보노이드-풍부한 조직을 얻고;
    그 건조된 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직에 알코올을 첨가하여 현탁액을 제조하고;
    그 현탁액을 가열하여서 가열된 현탁액을 만들고;
    그 가열된 현탁액을 냉각한 후 그 가열된 현탁액을 여과하여 상기 텍트리제닌을 함유한 여과액(filtrate)을 수집하는 것을 포함하는 제 1항의 N. gracilis의 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직으로부터 유래한 텍트리제닌을 추출하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 건조된 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직은 상기 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직을 동결건조하여서 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 33항에 있어서, 상기 현탁액은 약 50-70℃에서 가열되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 33항에 있어서, 상기 현탁액은 진동과 함께 가열되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 진동은 초음파에 의하여 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 33항에 있어서, 상기 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 33항에 있어서, 상기 여과액은 상기 가열된 현탁액을 와트만® No. 1 필터를 통하여 투과하여 수집되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 33항에 있어서, 고성능액체 크로마토그래피(HPLC) 에 의하여 상기 텍트리젠닌의 양을 결정하는 것을 포함하는 N. gracilis의 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직에서 텍트리제닌의 양을 결정하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 HPLC는 코스모실(Cosmosil)® 5 C18-AR-II 컬럼을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 40항에 있어서, 상기 텍트리제닌은 55: 45의 부피 비의 메탄올과 물(0.1% 초산을 가지는)을 포함하는 용리(eluting) 용액으로 용출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 40항에 있어서, 상기 텍트리제닌의 양은 표준으로 Ψ-텍트리제닌을 사용 하여 약 265 nm에서 측정되는 것을 특징으로 방법.
  44. 제 33항의 항-종양 활성을 가지는 N. gracilis의 인 비트로 플라보노이드-풍부한 조직의 추출물.
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