CN105794632B

CN105794632B - 一种积雪草多倍体及其诱导育种方法

Info

Publication number: CN105794632B
Application number: CN201410848092.9A
Authority: CN
Inventors: 邹节明; 蒋水元; 钟小清
Original assignee: Guilin Sanjin Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Guilin Sanjin Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2034-12-31
Also published as: CN105794632A

Abstract

本发明涉及植物育种领域，具体讲，涉及一种积雪草多倍体及其诱导育种方法。包括以下步骤：将野生积雪草移栽到培养基；配制诱导剂溶液；所述的诱导剂溶液为浓度为30～50mg/L胺磺灵，并添加有1～3wt％二甲基亚砜；将脱脂棉包裹在积雪草丛生叶生长点，用诱导剂溶液浸润脱脂棉；在自然光照条件下处理2～4天；将经染色体显微镜检测为四倍体的样本，采用无性繁殖扩繁保存。本发明对积雪草进行活体诱导，不仅诱导转化率高，并且多倍体积雪草中的药用有效物质的含量得到大幅度提高。

Description

一种积雪草多倍体及其诱导育种方法

技术领域

本发明涉及植物育种领域，具体讲，涉及一种积雪草多倍体及其诱导育种方法。

背景技术

积雪草为伞形科积雪草属植物，全世界约有20种，我国仅产积雪草1种，是一味重要的中草药，我国医学上用积雪草外用及内服治病已有两千多年历史。广西各个县市广泛分布，为具有广西民族特色的壮药之一。

积雪草药材主要来源于野生资源采挖，质量可控性差，存在混淆伪品以及采挖产地和季节导致的有效成分的差异问题；伴随中药产业的发展，原料的需求量增加，过度的采挖势必造成积雪草生境破坏和野生居群的破坏。因此，实施中药材GAP(Good AgriculturalPractice)对保证药材质量具有十分重要的意义。建立积雪草GAP基地，需要优良种源，培育和应用中药材优良品种是提高药材质量和产量的关键。积雪草作为提取有效药用成分的药材类型，育种的目的就是选育有效成分含量高、产量高的品种(系)。多倍体药用植物一般具有根、茎、叶、花和果的巨型性、抗逆性强、药用成分含量高等特性，一定程度上可以满足这类需求，是积雪草新品种培育的有效途径之一。

目前，人工诱导二倍体染色体加倍通常采用的诱导剂是秋水仙素。但秋水仙素诱导多倍体存在无法克服的缺点：秋水仙素有剧毒，对环境造成污染；秋水仙素价格高，用于试验成本高，有必要寻求低污染、低成本、低毒诱导剂来实现诱导染色体加倍。

专利申请201310133181.0公开了两种多倍体积雪草品种及其培育方法，其步骤如下：1)选取二倍体积雪草成年植株顶芽，繁育组培苗或愈伤组织；2)取组培继代苗或愈伤组织，用氨磺灵进行染色体加倍诱导培养和分化培养；3)切取分化培养成的新芽进行丛生芽培养；4)将培养成根茎叶完整植株进行染色体倍性鉴定，筛选出四倍体植株，种植成活，获得四倍体品种；5)将四倍体植株和二倍体植株人工去雄和授粉杂交，得到杂交种子(♀4N×♂2N或♂4N×♀2N→F1为3x)；6)将杂交种子繁殖成完整植株种植，种植成活，进行染色体数目检测，筛选出三倍体积雪草品种。该申请共来了一种实验室诱导培养积雪草品种的方法，需要在培育室内完成，具有对实验人员操作要求高、步骤繁琐、人工成本高的缺点。并且该专利申请中并未对制备得到的多倍体品种中的有效物质的含量进行检测，其实验结果不确切。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提出了一种积雪草多倍体诱导育种方法。

本发明的第二发明目的在于提出了一个积雪草多倍体品种。

为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：

一种积雪草多倍体诱导育种方法，包括以下步骤：

(1)将野生积雪草移栽到培养基；

(2)配制诱导剂溶液；所述的诱导剂溶液为浓度为20～50mg/L胺磺灵，并添加有1～3wt％二甲基亚砜；

(3)将脱脂棉包裹在积雪草丛生叶生长点，用诱导溶液试剂浸润脱脂棉；在自然环境条件下处理2～4天；

(4)将经染色体显微镜检测为四倍体的样本，采用无性繁殖扩繁保存。

本发明的第一优选技术方案为：在步骤(1)中，野生积雪草移栽的温度为11～18℃，优选12～15℃。其中，对于野生积雪草的原始亲本，对野生积雪草进行筛选，以获得有效含量更高的后代。

本发明的第二优选技术方案为：在步骤(1)中，所述的培养基为药渣栽培基质，优选添加复合肥为基肥。

本发明的第三优选技术方案为：所述的添加有复合肥的药渣栽培基质中含有速效N1000～1200mg/kg、速效P 300～350mg/kg、速效K 6000～6500mg/kg、有机质300～350g/kg、交换性Ca 25～35cmol/kg、交换性Mg 1.5～3cmol/kg、有效Zn 40～50mg/kg有效Fe 300～320mg/kg、有效B 0.1～0.4mg/kg；pH为6.0～6.5。

本发明的第四优选技术方案为：在步骤(2)中，所述的诱导剂溶液中胺磺灵的浓度为25～40mg/L，优选25～35mg/L，更优选30mg/L。

本发明的第五优选技术方案为：在步骤(2)中，所述的诱导剂溶液中二甲基亚砜的添加量为1.5～2.5wt％，优选1.8～2.2wt％，更优选2wt％。

本发明的第六优选技术方案为：在步骤(3)中，所述的丛生叶生长点为丛生茎生长点或匍匐茎生长点。

本发明的第七优选技术方案为：在步骤(3)中，取脱脂棉制成0.5～1.5厘米的棉球，覆盖于丛生叶生长点上，或包裹于匍匐茎生长点，将诱导剂溶液滴加在脱脂棉球上，1～3次/天，保持脱脂棉湿润。

本发明的第八优选技术方案为：在步骤(4)中，所述的染色体显微镜检测的方法为：选取形态上有变异的材料，切取旺盛生长积雪草茎尖或根尖，置于0.002mol/L 8-羟基喹啉溶液后洗净，再用卡诺氏固定液中固定取出洗净，置于1N盐酸中，水浴8～20分钟，用吉姆萨溶液染色，置于显微镜下观测。

本发明还涉及一种由上述雪草多倍体诱导育种方法得到的雪草多倍体品种。

下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。

本发明提供的一套积雪草化学诱变多倍体育种方法。本发明的方法采用直接在积雪草的栽培过程中，利用自然光照和自然温度条件，对积雪草进行多倍体活体诱导，获得积雪草多倍体品系。采用植物多倍体活体诱导，经济方便、易于操作，很多农作物、观赏植物都通过活体诱导的方式获得了多倍体。化学诱导途径可以采用活体诱导和离体诱导两种方式。离体诱导的基础是建立植物完整的再生体系，采用的方式是离体诱导和组织培养相结合，通常在组培室内进行，对环境的要求较高，要保证无菌的环境，以利于外植体的生长以及减少污染。和活体诱导相比，离体培养的环境更容易控制，易于重复实验结果，工作效率高，由于植物再生体系的建立更使得获得的多倍体容易进行进一步的筛选和保存。但是，运用离体诱导技术，需要建立组培室，对相关技术人员进行培训，对实验条件及人员方面要求较高；由于一些物种尚未建立完善的组培快繁体系，因此，此方法并不能用于所有的植物上，具有局限性；由于室内与外界环境差异较大，室内条件单一易于控制，而田间、温室会受到诸多因素影响，影响了组培苗移栽的成活率，造成诱变成功的植株移栽后死亡的现象。本发明采用直接在积雪草丛生叶生长点直接用诱导剂进行诱导，避免了在离体诱导所带来的步骤繁琐，成活率低、诱导成功率低的缺点，是积雪草新品种培育的有效途径。但是，活体诱导是在整个植株的水平上对植物染色体进行加倍，需要处理的数量多，且诱导频率较低，容易受到外界环境的影响，且诱导产生的多倍体一般都是嵌合体，会发生回复突变。本发明在获得形态上有变异的植株后，将其移栽到苗床中生长与扩繁，逐步剔除回复突变个体，经过一年的栽培与筛选，再对样本进行显微鉴定。

本发明运用化学试剂活体诱导方法，采用胺磺灵(Oryzalin)作为诱导试剂，获得积雪草多倍体。Oryzalin是一种二硝基苯胺类除草剂，可与细胞微管蛋白结合，抑制小管生长端的微管聚合，从而导致微管的丧失，抑制细胞的有丝分裂。其在四倍体诱变机理方面与传统的四倍体诱变剂秋水仙素相似，但是Oryzalin的用量与毒性均比秋水仙素要低很多，对植物微管蛋白有更高的亲和性，在低浓度条件下具有更高的微管蛋白解聚能力，比秋水仙素更有效，诱导的死亡率低，对人体毒性小且价格低廉，因此可作为秋水仙素的替代品。

本发明对胺磺灵的所使用的浓度进行了深入的研究，从而进一步优选了30～50mg/L的浓度。由于本发明是在完整的植物外部进行贴壁诱导，因此选用了比较高的诱导剂浓度，从而保证了诱导剂通过植物的细胞壁，从而影响植物的细胞核内的有丝分裂过程。由于植物的细胞壁较为致密，因此，本发明通过对诱导剂浓度的调整，从而保证了诱导的成功率。

二甲基亚砜是一种优良的有机溶剂，在化学诱变中其常常作为渗透剂和增效剂而受到亲睐，主要通过提高分生组织的穿透力促进化学诱变剂加倍,对化学诱变剂加倍起到了辅助作用。

本发明利用自然光照，不需要对光照进行特殊的控制，因此更加节约能源，从而可将诱导处理从实验室移到农业生产的田间。并且本发明的方法简单，仅通过简单的操作，不需要专业训练的农业生产者就可以直接操作，更加适合于实际成产中的广泛应用。本发明完成了从实验室到农业田间的转换，具有重要的实践意义。

本发明通过对多倍体中有效物质含量的精确测定发现，本发明制备得到的多倍体中重要的有效物质：羟基积雪草苷和积雪草苷的含量得到极大的提高，其中羟基积雪草苷的含量提高了近5倍，积雪草苷的含量提高了近4倍。大大超出了一般多倍体中有效物质含量升高的水平，证实本发明得到的积雪草多倍体具有极高的应用价值。

本发明还具有极高的诱导成功率，丛生茎生长点可达到20％，匍匐茎生长点可达到10％。诱导成功率与具体的植物品种相关，不同植物品种对诱导剂的敏感度不同，不同部位对诱导剂的反应也有所不同。而现有技术报道中，积雪草活体诱导的诱导率均低于5％。因此，本发明通过对诱导条件的深入研究和探索，大大提高了其诱导成功率。并且本发明的诱导方法具有很高的稳定性与重现性，从而更加适用于大规模推广应用。

同时，在栽培过程总发现，积雪草多倍体的适应性显著增强。多倍体积雪草的植株更加粗壮，相比其亲本具有了较强的耐热、耐寒、耐旱性能。

附图说明：

图1野生二倍体积雪草(2n＝18)与本发明经过化学诱导剂处理获得的形态上有变异样本(2n＝36)，两者染色体数目对比。

本发明的具体实施方式仅限于进一步解释和说明本发明，并不对本发明的内容构成限制。

具体实施方式

实施例1

一种积雪草多倍体诱导育种方法，包括以下步骤：

1.将野生积雪草移栽到培养基；野生积雪草移栽的温度为12～15℃；湿度为80％,培养基为药渣栽培基质，并添加复合肥为基肥。添加有复合肥的药渣栽培基质中含有速效N1000～1200mg/kg、速效P 300～350mg/kg、速效K 6000～6500mg/kg、有机质300～350g/kg、交换性Ca 25～35cmol/kg、交换性Mg 1.5～3cmol/kg、有效Zn 40～50mg/kg有效Fe 300～320mg/kg、有效B0.1～0.4mg/kg；pH为6.0～6.5。

2.配制诱导剂溶液；所述的诱导剂溶液为浓度为30mg/L胺磺灵，并添加有2wt％二甲基亚砜；

3.将脱脂棉包裹在积雪草丛生叶生长点，用诱导剂溶液浸润脱脂棉；在自然光照条件下处理2～4天；所述的丛生叶生长点为丛生茎生长点或匍匐茎生长点；取脱脂棉制成1厘米左右的棉球，覆盖于丛生叶生长点上，或包裹于匍匐茎生长点，将诱导剂溶液滴加在脱脂棉球上，2次/天，保持脱脂棉湿润。

4.选取形态上叶面积增大，叶柄加粗及伸长的植株，切取旺盛生长积雪草茎尖或根尖，置于0.002mol/L 8-羟基喹啉溶液后洗净，再用卡诺氏固定液(无水乙醇：冰醋酸＝3:1)中固定取出洗净，置于1N盐酸中，水浴8～20分钟，用吉姆萨溶液染色，置于显微镜下观测。将经染色体显微镜检测为四倍体的样本，采用无性繁殖扩繁保存。诱导得到的多倍体的染色体显微镜检测结果如图1所示。

实施例2

一种积雪草多倍体诱导育种方法，包括以下步骤：

1.将野生积雪草移栽到培养基；野生积雪草移栽的温度为12～16℃；湿度为70-75％。培养基为药渣栽培基质，并添加复合肥为基肥。添加有复合肥的药渣栽培基质中含有速效N1000～1200mg/kg、速效P 300～350mg/kg、速效K 6000～6500mg/kg、有机质300～350g/kg、交换性Ca 25～35cmol/kg、交换性Mg 1.5～3cmol/kg、有效Zn 40～50mg/kg有效Fe 300～320mg/kg、有效B 0.1～0.4mg/kg；pH为6.0～6.5。

2.配制诱导剂溶液；所述的诱导剂溶液为浓度为40mg/L胺磺灵，并添加有2wt％二甲基亚砜。

3.将脱脂棉包裹在积雪草丛生叶生长点，用诱导剂溶液浸润脱脂棉；在自然光照条件下处理4天；所述的丛生叶生长点为丛生茎生长点或匍匐茎生长点。取脱脂棉制成1厘米左右的棉球，覆盖于丛生叶生长点上，或包裹于匍匐茎生长点，将诱导剂溶液滴加在脱脂棉球上，2次/天，保持脱脂棉湿润。

4.选取形态上叶面积增大，叶柄加粗及伸长的植株，切取旺盛生长积雪草茎尖或根尖，置于0.002mol/L 8-羟基喹啉溶液后洗净，再用卡诺氏固定液(无水乙醇：冰醋酸＝3:1)中固定取出洗净，置于1N盐酸中，水浴8～20分钟，用吉姆萨溶液染色，置于显微镜下观测。将经染色体显微镜检测为四倍体的样本，采用无性繁殖扩繁保存。诱导得到的多倍体的染色体显微镜检测结果与图1相似。

实施例3

一种积雪草多倍体诱导育种方法，包括以下步骤：

1.将野生积雪草移栽到培养基；野生积雪草移栽的温度为12～18℃；湿度为75％,培养基为药渣栽培基质，优选添加复合肥为基肥。所述的添加有复合肥的药渣栽培基质中含有速效N1000～1200mg/kg、速效P 300～350mg/kg、速效K 6000～6500mg/kg、有机质300～350g/kg、交换性Ca 25～35cmol/kg、交换性Mg 1.5～3cmol/kg、有效Zn 40～50mg/kg有效Fe 300～320mg/kg、有效B 0.1～0.4mg/kg；pH为6.0～6.5。

2.配制诱导剂溶液；所述的诱导剂溶液为浓度为50mg/L胺磺灵，并添加有3wt％二甲基亚砜。

3.将脱脂棉包裹在积雪草丛生叶生长点，用诱导剂溶液浸润脱脂棉；在自然光照条件下处理3天；所述的丛生叶生长点为丛生茎生长点或匍匐茎生长点；取脱脂棉制1厘米左右的棉球，覆盖于丛生叶生长点上，或包裹于匍匐茎生长点，将诱导剂溶液滴加在脱脂棉球上，2次/天，保持脱脂棉湿润。

实验例1

本发明按照实施例1的方法，通过对胺磺灵浓度和处理天数，得到的诱导结果如表1所示。

表1 积雪草多倍体诱导实验处理和结果统计

实验例2：多倍体积雪草含量测定

对实施例1经显微镜鉴定诱导成功的积雪草多倍体的茎叶进行含量测定，平时10株，取平均值如表2所示。同时对其亲本的茎叶进行对比作为参照。

【含量测定】照高效液相色谱法(附录ⅥD)测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-2mmol/L倍他环糊精溶液(24：76)为流动相；检测波长为205nm。理论板数按积雪草苷峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备取积雪草苷对照品、羟基积雪草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品粉末(过二号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理((功率180W，频率42kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液10～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计算，含积雪草苷(C₄₈H₇₈O₁₉)和羟基积雪草苷(C₄₈H₇₈O₂₀)的总量不得少于0.80％。

多倍体积雪草检测羟基积雪草苷、积雪草苷结果

表2：

根据含量检测可发现，本发明诱导得到的多倍体中有效物质的含量远远高于其亲本，证明其药用成分的含量得到了极大的提高。

Claims

1.一种积雪草多倍体诱导育种方法，包括以下步骤：

（1）将野生积雪草移栽到培养基质；

（2）配制诱导剂溶液；所述的诱导剂溶液为浓度为20～50mg/L胺磺灵，并添加有1～3wt%二甲基亚砜；

（3）将脱脂棉包裹在积雪草丛生叶生长点，用诱导剂溶液浸润脱脂棉；在自然光照条件下处理2～4天；所述的丛生叶生长点为丛生茎生长点或匍匐茎生长点；

（4）将经染色体显微镜检测为四倍体的样本，采用无性繁殖扩繁保存。

2.根据权利要求1所述的积雪草多倍体诱导育种方法，其特征在于，在步骤（1）中，野生积雪草移栽的温度为11～18℃；湿度为70-80%。

3.根据权利要求2所述的积雪草多倍体诱导育种方法，其特征在于，在步骤（1）中，野生积雪草移栽的温度为12～15℃。

4.根据权利要求1所述的积雪草多倍体诱导育种方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述的培养基质为药渣栽培基质。

5.根据权利要求4所述的积雪草多倍体诱导育种方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述的培养基质为添加有复合肥的药渣栽培基质。

6.根据权利要求5所述的积雪草多倍体诱导育种方法，其特征在于，所述的添加有复合肥的药渣栽培基质中含有速效N 1000～1200 mg/kg、速效P 300～350mg/kg、速效K 6000～6500mg/kg、有机质 300～350g/kg、交换性Ca 25～35 cmol/kg、交换性Mg 1.5～3cmol/kg、有效Zn 40～50mg/kg有效Fe 300～320 mg/kg、有效B 0.1～0.4mg/kg；pH为6.0～6.5。

7.根据权利要求1所述的积雪草多倍体诱导育种方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的诱导剂溶液中胺磺灵的浓度为25～40mg/L。

8.根据权利要求7所述的积雪草多倍体诱导育种方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的诱导剂溶液中胺磺灵的浓度为25～35mg/L。

9.根据权利要求8所述的积雪草多倍体诱导育种方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的诱导剂溶液中胺磺灵的浓度为30 mg/L。

10.根据权利要求1所述的积雪草多倍体诱导育种方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的诱导剂溶液中二甲基亚砜的添加量为1.5～2.5wt%。

11.根据权利要求10所述的积雪草多倍体诱导育种方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的诱导剂溶液中二甲基亚砜的添加量为1.8～2.2 wt%。

12.根据权利要求11所述的积雪草多倍体诱导育种方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的诱导剂溶液中二甲基亚砜的添加量为2 wt%。

13.根据权利要求1所述的积雪草多倍体诱导育种方法，其特征在于，在步骤（3）中，取脱脂棉制成0.5～1.5厘米的棉球，覆盖于丛生茎生长点上，或包裹于匍匐茎生长点，将诱导剂溶液滴加在脱脂棉球上，1～3次/天，保持脱脂棉湿润。

14.根据权利要求1所述的积雪草多倍体诱导育种方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述的染色体显微镜检测的方法为：选取形态上有变异的材料，切取旺盛生长积雪草茎尖或根尖，置于0.002 mol/L 8-羟基喹啉溶液后洗净，再用卡诺氏固定液固定取出洗净，置于1N盐酸中，水浴8～20分钟，用吉姆萨溶液染色，置于显微镜下观测。