CN103352048A - 一种高效克隆及表达的微藻叶绿体载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效克隆及表达的微藻叶绿体载体及其应用。本发明的微藻叶绿体载体包括同源重组序列trnI、同源重组序列trnA、启动子PrbcL、终止子TrbcS、上游XcmI序列和下游XcmI序列，上游XcmI序列和下游XcmI序列引入启动子PrbcL和终止子TrbcS之间，形成了目的基因克隆位点，同源重组序列trnI在启动子PrbcL的上游，同源重组序列trnA在终止子TrbcS的下游。本发明采用微藻来源的启动子和终止子来调控目的基因的表达，使目的基因在微藻叶绿体中获得高效表达。

Description

一种高效克隆及表达的微藻叶绿体载体及其应用

技术领域：

本发明涉及微藻基因工程领域，具体涉及一种高效克隆及表达的微藻叶绿体载体及其应用。

背景技术：

对植物细胞的核基因遗传转化表达外源基因是植物基因工程研究的主要方向。然而，研究表明细胞核转化技术存在难以攻克的弊端，如核基因组大，背景复杂，导入的外源基因难以控制及表达量低下，在后代中表达不稳定，易出现基因失活、位置效应、基因沉默等现象（Zhang,et al.,2003;Sun,et al.,2003）。另外，核基因易随花粉扩散而威胁生态安全（Losey，et al.,1999）。

与传统的核基因转化相比，叶绿体基因转化有着诸多优点。叶绿体基因组的拷贝数非常大，整合到叶绿体基因组的外源基因在细胞中的拷贝数能达到100～10000个拷贝，显著提高了外源基因表达水平及产物的积累，最高可达叶片可溶性蛋白的46.1%(Staubet al.,2000)。叶绿体基因转化技术是外源基因通过同源整合到特定位点。因此，叶绿体转化体系具有表达原核性，可同时进行多基因转化、超量表达、后代遗传稳定、定点整合、不会产生基因沉默及母性遗传和环境安全性好等特点（Bock & Warzechr,2010;Cui etal.,2011;Daniell,et al.,2005;Verma & Daniell,2007;Wang,et al.,2009），有望解决核基因转化系统中因花粉扩散带来的生物安全性问题；在叶绿体中表达的蛋白质可以形成二硫键，人源蛋白表达后也可以被正确折叠。

近年来，叶绿体转化技术已广泛应用于多方面，包括作物形状的改良，作为生物反应器生产特殊的生物材料、酶制剂、疫苗、药物和工业产品等。目前已经成功进行叶绿体转化的真核藻类有莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、紫球藻（Porphyridium sp.）以及原生动物纤细裸藻（Euglena gracilis）。三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum），是一种代表性的海洋硅藻，生长快速，具有很高的生物固碳能力，是海洋初级生产力的重要贡献者之一。三角褐指藻富含多糖、蛋白质、多不饱和脂肪酸等多种高价值的活性物质，具有较高的营养价值，已被广泛地作为人工育苗的饵料。三角褐指藻细胞不含内毒素，个体小，光合效率高，生长快，单位面积产量高，生长成本低，作为生物反应器具有明显的优势。

目前国内有研究报道进行三角褐指藻的叶绿体转化（李宏业，等，2011），该转化体系中利用原核生物来源的启动子（CaMV35S）和终止子（NOS）来调控外源基因的表达，且采用传统的限制性内切酶来导入外源基因，获得了外源基因的表达。但该表达载体的外源基因的表达效率未见报道，采用的表达调控元件非来自微藻，且由于该转化体系采用酶切方法将外源基因导入载体，操作复杂、限制条件多、实验时间及成本较高。

发明内容：

本发明的第一个目的在于克服现有技术的不足和缺陷，提供一种高效克隆及表达的微藻叶绿体载体。

本发明的第二目的在于提供所述的微藻叶绿体载体在利用微藻表达外源基因上的应用。

本发明的高效克隆及表达的微藻叶绿体载体，包括同源重组序列trnI、同源重组序列trnA、启动子PrbcL、终止子TrbcS、上游XcmI序列和下游XcmI序列，上游XcmI序列和下游XcmI序列引入启动子PrbcL和终止子TrbcS之间，形成了目的基因克隆位点，同源重组序列trnI在启动子PrbcL的上游，同源重组序列trnA在终止子TrbcS的下游。

所述的同源重组序列trnI的序列如SEQ ID NO.1所示，同源重组序列trnA的序列如SEQID NO.2所示，启动子PrbcL的序列如SEQ ID NO.3所示，终止子TrbcS的序列如SEQ ID NO.4所示，上游XcmI序列和下游XcmI序列均如SEQ ID NO.5所示。

所述的引入，优选通过不依赖于连接反应的高效克隆方法（LIC）来引入。

所述的微藻叶绿体载体，优选在下游XcmI序列后增加Myc标签多肽序列，用于目的基因表达的检测。

所述的Myc标签多肽序列如SEQ ID NO.6所示。

所述的微藻叶绿体载体，优选包括抗性筛选表达盒及目的基因。

所述的表达盒是指含有启动子、目的基因或目的基因克隆位点和终止子、且其中的基因能正常进行转录和翻译的序列。

所述的抗性筛选表达盒由启动子、终止子和抗性筛选标记基因组成。

所述抗性筛选标记基因优选为氯霉素抗性基因（CAT）。

所述的目的基因优选为报告基因，优选以TA克隆的方法插入上述的启动子PrbcL和终止子TrbcS之间。

所述的报告基因优选为绿色荧光蛋白基因eGFP基因。

所述的微藻，优选为三角褐指藻。

上述的不依赖于连接反应的高效克隆方法（LIC）属于现有技术。

本发明采用微藻叶绿体基因组中的启动子及终止子进行目的基因的表达，提高了目的基因的表达水平；同时采用高效的不依赖于连接反应的高效克隆方法（LIC）在启动子和终止子之间引入了两个自主特别设计的XcmI序列，其中，下游XcmI序列后增加了Myc标签序列，载体经过限制性内切酶XcmI处理后形成含有“T”的粘性末端，依据TA克隆的方法，PCR获得的目的基因可快速简便地被导入微藻叶绿体载体上，目的基因的表达可很简便地通过Myc标签多肽序列进行Western blot、ELISA等方法进行检测。

本发明的有益效果：

（1）、本发明采用微藻来源的启动子和终止子来调控目的基因的表达，使目的基因在微藻叶绿体中获得高效表达；

（2）、本发明采用类似TA克隆的方法导入目的基因，实现了快速简便地连接目的；

（3）、本发明的微藻叶绿体载体含有两个自主特别设计的XcmI序列，其中，下游的XcmI序列后增加了Myc标签序列，目的基因的表达可以很简便地通过Myc标签多肽序列进行Western blot、ELISA等方法的检测；

（4）、本发明能成功得到叶绿体转基因微藻，叶绿体转基因微藻作为生物反应器能够生产重组疫苗、哺乳动物抗体、营养价值高的复合物及工业原料如β-胡萝卜素、多不饱和脂肪酸、氢气或生物燃料等，这预示着本发明将为生产以上高附加值产品提供了有效保障。

附图说明：

图1为PrbcL-XcmI-XcmI-Myc-TrbcS的PCR扩增结果（A）及其TA克隆后的双酶切验证结果（B），其中，A的泳道1为PrbcL-XcmI-XcmI-Myc-TrbcS的PCR扩增产物，M为100bp的ladder marker；B的泳道1为重组质粒pMD19-PrbcL-XcmI-XcmI-Myc-TrbcS的SalI和XbaI双酶切验证结果，泳道M为100bp的ladder marker；

图2为eGFP基因的扩增结果（A）及重组质粒pPtc-eGFP的双酶切验证结果（B），其中，A的泳道1为eGFP基因，泳道M为100bp的ladder marker；B的泳道1为重组质粒pPtc-eGFP的双酶切结果，泳道2为重组质粒pPtc-eGFP，泳道M为1kb的ladder marker；

图3为抗生素筛选阳性三角褐指藻的培养结果照片，其中，A为200mg·L^-1氯霉素平板筛选阳性藻的照片，Wild type为未转化藻，Transgenic为转化藻；B为200mg·L^-1氯霉素浓度的f/2培养基培养转化藻和未转化藻，Wild type为未转化藻，Transgenic为转化藻；

图4为转化的三角褐指藻的PCR验证结果，其中，A为转化藻中CAT表达盒的PCR扩增结果，A的泳道1为未转化藻，泳道2为转化藻，泳道3为PCR阴性对照，泳道M为1kb的ladder marker；B为转化藻的同质化的PCR扩增结果，B的泳道1为未转化藻，泳道2为转化藻，泳道3为PCR阴性对照，泳道M为1kb的ladder marker；

图5为Southern blot分析CAT基因的探针设计示意图；

图6为转化藻的Southern blot验证分析图，其中1为未转化藻，2为转化藻；

图7为转化藻中CAT基因的qPCR分析图；

图8为转化藻中eGFP基因的qPCR分析图；

图9为转化藻的eGFP蛋白的Western blot分析图，其中，1为转化藻，2为未转化藻；

图10为转化藻中eGFP蛋白表达的Elisa分析结果图；

图11为转化藻和未转化藻中eGFP表达的激光扫描共聚焦显微镜检测图，其中a为转化藻，b为未转化藻，a1、b1为绿色通道下的eGFP的荧光图像，a2、b2为红色通道下藻细胞叶绿体自发荧光图像，a3、b3为微分干涉相衬（DIC）通道图像，a4、b4为1、2和3的叠加图像；

图12为重组质粒pPtc-CAT的质粒图谱；

图13为重组质粒pPtc-T的质粒图谱；

图14为重组质粒pPtc-eGFP的质粒图谱。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

如无特殊说明，所使用的技术手段均为现有技术手段。

纯化回收试剂盒为Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒，购自大连宝生物公司；基因序列测序工作委托华大基因公司进行；引物的合成委托上海生工生物工程公司进行。

实施例1：

一、设计引物

启动子PrbcL的上游引物和下游引物分别是Pt358和Pt347

Pt358：5’-gcTCTAGAGCGGCCGCAAACTTCTAAAACTTTCAATTAAAA

      GCTATTCT-3’（5’端酶切位点XbaI-NotI）

Pt347：5’-TGATTTCTCCTTGGAATAAAAAGGCAATAT-3’

PrbcL-XcmI-XcmI的上游引物是Pt358，下游引物是Pt360a和Pt360b

Pt360a：5’-TCCTGGCCACCACAGGTGTGGTGATTTCTCCTTGGAATA

      AAAAGG-3’（5’端酶切位点XcmI）

Pt360b：5’-GTTTTTGTTCACCACCACTCTCCTGGCCACCACAGGTG-3’

                       XcmI

终止子TrbcS的上游引物和下游引物分别是Pt344和Pt359

Pt344：5’-TTTTTAGTAACAAAATAAAATTAAAAAATGTTAAT-3’

Pt359：5’-gcGTCGACCATTTTTTGTCATTGTGATAAGCTAAAGT-3’

            SalI

Myc-TrbcS的上游引物和下游引物分别是Pt357Myc和Pt359

Pt357Myc：5’-GAACAAAAACTCAGTGAAGAAGATCTTTAATTTTTAGTAACAAA

          ATAAAATTAAA-3’

二、PCR扩增

以三角褐指藻基因组DNA为模板，其中三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）购自武汉水生所，三角褐指藻基因组DNA的提取过程按照大连宝生物公司的Universal GenomicDNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书进行操作。

以三角褐指藻基因组DNA为模板，用上游引物Pt358和下游引物Pt347扩增得到210-bp的特异性片段PrbcL，凝胶电泳分离，纯化回收目的片段。然后再以扩增得到的特异性片段PrbcL为模板，用上游引物Pt358和下游引物Pt360a扩增得到特异性片段，纯化回收目的片段。再以该回收的目的片段为模板，用上游引物Pt358和下游引物Pt360b扩增得到融合基因PrbcL-XcmI-XcmI，大小为240-bp，经过上述两次的扩增将两个XcmI酶切位点序列引入PrbcL的3’末端。

用上游引物Pt344和下游引物Pt359扩增得到242-bp的特异性片段TrbcS，回收目的片段。再以回收的特异性片段TrbcS为模板，用上游引物Pt357Myc和下游引物Pt359扩增得到目的基因。将Myc标签多肽序列（编码氨基酸EQKLISEEDL）和终止密码子（TAA）引入TrbcS的5’末端，得到融合基因Myc-TrbcS，大小为260-bp。

上述PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃15s，72℃1min，35个循环；72℃5min。

三、PrbcL-XcmI-XcmI-Myc-TrbcS的连接反应

通过不依赖于连接反应的高效克隆方法（LIC）将片段PrbcL-XcmI-XcmI和Myc-TrbcS连接起来，得到PrbcL-XcmI-XcmI-Myc-TrbcS片段。

上述LIC方法具体步骤如下：

1、采用T4DNA聚合酶（购自NEB公司）分别处理片段PrbcL-XcmI-XcmI和片段Myc-TrbcS。

片段PrbcL-XcmI-XcmI的T4DNA聚合酶反应体系如下：

片段Myc-TrbcS的T4DNA聚合酶反应体系如下：

反应条件为：23℃1.5h，75℃20min。

2、采用PCR纯化回收试剂盒（购自Takara公司）纯化回收上述两种反应液，分别得到末端含有碱基“T”的片段PrbcL-XcmI-XcmI和末端含有碱基“A”的片段Myc-TrbcS；

3、采用T4DNA连接酶（购自NEB公司）进行上述2个片段的连接反应，反应体系如下：

连接反应的条件为：16℃连接过夜。

4、以步骤3的连接反应液作为PCR反应的模板，用上游引物Pt358和下游引物Pt359进行扩增，PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃15s，72℃1min，35个循环；72℃5min。

5、进行凝胶电泳分离，切胶纯化回收，得到508bp的PrbcL-XcmI-XcmI-Myc-TrbcS片段。

通过Pfu DNA polymerase扩增得到的片段是平末端，因此用DNA聚合酶（Ex DNA Taq，购自Takara公司）进行PrbcL-XcmI-XcmI-Myc-TrbcS片段的3’末端加“A”，反应体系如下：

反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，5个循环；72℃5min。

纯化回收后将PrbcL-XcmI-XcmI-Myc-TrbcS片段连入质粒pMD19-T中，连接方法和体系根据pMD19-T载体（购自Takara公司）的使用说明书进行，得到重组质粒pMD19-PrbcL-XcmI-XcmI-Myc-TrbcS。然后用限制性内切酶SalI（购自NEB公司）和XbaI（购自NEB公司）双酶切PrbcL-XcmI-XcmI-Myc-TrbcS片段和质粒pPtc-CAT（该质粒的构建参考ZL201010285197.X中质粒ptrnI-trnA-CAT的构建方法），分别得到PrbcL-XcmI-XcmI-PrbcS片段和pPtc-CAT空载体。用T4连接酶（购自NEB公司）进行16℃过夜连接，连接体系参照T4连接酶说明书进行，得到重组质粒pPtc-T，大小为6800-bp。将上述含有重组质粒pPtc-T的连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自广州鼎国生物有限公司），采用200μg·ml^-1浓度的氯霉素平板进行筛选，37℃培养16h。挑取转化子进行扩大培养，提取转化子的质粒DNA。用SalI和XbaI双酶切进行验证，验证结果如图1所示，并测序验证。

四、三角褐指藻叶绿体表达体系pPtc-eGFP的构建

以质粒EGFP-N1（购自上海工硕生物技术有限公司）为模板，用引物

Pt201（5’-ACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3’）和

Pt202（5’-AACTCGAGCTTGTACAGCTCGTC-3’）扩增得到744-bp的eGFP基因片段（如图2A所示），其中Pt201引物在5’末端添加了一个“A”，“ACCATG”是一个强的起始转录信号。用Taq进行eGFP基因片段的3’末端加“A”。同时，用XcmI限制性内切酶（购自NEB公司）对上述质粒pPtc-T进行单酶切，37℃下反应6h，酶切体系参照XcmI限制性内切酶的说明书。酶切结束后，通过凝胶电泳进行分离，得到含有“T”末端的开环质粒pPtc-T，切胶回收并测定DNA浓度为80ng·ul^-1。根据eGFP基因片段（浓度为100ng·ul^-1）和开环质粒pPtc-T的浓度，以物质的量比值为6进行后续的连接反应。以T₄连接酶（购自NEB公司）进行16℃过夜连接，连接体系参照T4连接酶的说明书。将连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用氯霉素平板进行筛选，37℃培养16h。挑取多个转化子进行扩大培养，提取转化子的质粒DNA。用SalI和XbaI双酶切验证重组质粒，得到一条1.3-kb的目的条带。测序结果表明eGFP随机地正向或反向插入载体，得到重组质粒pPtc-eGFP（如图2B所示）。质粒pPtc-eGFP能够利用叶绿体基因组序列trnA-trnI区域通过同源重组将外源基因定位整合到叶绿体基因组中。

五、三角褐指藻的电穿孔转化及抗生素筛选阳性藻株

采用电穿孔法（所用电穿孔仪为Bio-Rad GenePulser Xcell）将上述重组质粒pPtc-eGFP导入三角褐指藻细胞中。具体参照（朱聪聪，等，2011）。

将重组质粒pPtc-eGFP导入三角褐指藻细胞12天后观察转化细胞的生长状况，并查看得到分离的藻落。对照组为未转化重组质粒pPtc-eGFP的三角褐指藻，对照组平板由褐色变成白色，这是因为未转化的三角褐指藻细胞对氯霉素敏感。实验组的平板的褐色越来越深，并看得到分离的藻落（如图3A所示）。挑取阳性藻落，接种于新鲜的不加si的f/2培养基中培养，培养基含有200mg·L^-1的氯霉素，同时相同条件下培养未转化的三角褐指藻，CAT基因在转化载体pPtc-eGFP的藻细胞中成功表达，转化藻对氯霉素具有抗性，而未转化的三角褐指藻由于对氯霉素敏感而凋亡（如图3B所示）。培养生长4周后，查看得到的藻落，计算出转化效率为1/1000，是三角褐指藻核转化的100倍（Miyagawa,et al.,2009;Li,et al.,2006），表明叶绿体同源重组具有高效性。

六、转化的三角褐指藻的PCR验证分析

转化藻在添加200mg·L^-1的氯霉素的液体培养基中培养5个生长周期，尽可能获得更多的发生同源重组的藻细胞，5个周期后的转化藻用于后续的分析实验。为了提取转化藻和未转化藻的叶绿体DNA，首先采用蔗糖密度梯度离心法获得叶绿体，具体步骤如下：1）离心收集50ml的处于平台期的三角褐指藻藻液，4°C下5,000g离心10min；2）用液氮研磨藻细胞，将藻粉转移到1个装有1.5ml研磨缓冲液（0.3M sucrose,40mM Tris–HCl(pH7.8),5mMMgCl₂,1mM PMSF）的离心管中，混匀，冰浴5min；3）4°C下350g离心10min；4）轻轻移出上清液转移到1个新的离心管中，弃掉沉淀；5）4°C下12,000g离心20min；6）弃掉上清液，得到富含叶绿体的碎片沉淀；7）取出适量的碎片物置于荧光显微镜下观察叶绿体富含物。验证后，采用植物DNA提取试剂盒Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（购自Takara公司）提取叶绿体DNA，最后凝胶电泳检测。

首先，检验CAT只存在于转化藻的叶绿体中，以转化藻的叶绿体DNA为模板，用引物Pt368（5’-CGGGATCCCGGGATCCAGCATCACCCGACGCACT-3’）

和Pt369（5’-GCTCTAGAGCTCTAGATAACGACCCTGCCCTGAAC-3’）进行扩增，得到1.1-kb的目的条带（如图4A所示），而以对照组的藻细胞叶绿体DNA为模板，没有扩增出任何条带。同时，为了检验表达载体pPtc-eGFP与三角褐指藻叶绿体基因组序列的trnA和trnI发生了同质化，以转化藻的叶绿体DNA为模板，用引物Pt361（5’-ATCGGCTAACTCCGTGCCAG-3’）和Pt362（5’-AGCAACTGACTGAAATGCCTC-3’）进行扩增反应，得到1.49-kb的目的片段（如图4B所示），而以对照组藻细胞叶绿体DNA为模板，则没有扩增出目的条带。其中，引物Pt361位于叶绿体基因组的trnI的5’端上游，且保证载体上克隆的trnI元件不出现此引物或同源性高的序列；而引物Pt362位于CAT编码区的上游。PCR反应体系为25ul，反应成分具体如下：叶绿体DNA模板250ng，引物各5pmol，LA Taq DNA聚合酶0.75U（购自Takara公司），10x PCR反应缓冲液2.5μl，25mM MgCl₂1.5μl，10mM dNTP0.25μl。PCR反应程序为：（1）95℃，3min，（2）95℃，30sec，（3）58℃，1min，（4）72℃，1min，（5）72℃，3min，（2）-（4）循环35次。PCR反应结束后，凝胶电泳检测。

七、Southern blot鉴定分析CAT基因

采用植物DNA提取试剂盒Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（购自Takara公司）提取转化藻和未转化藻的总DNA，并纯化回收。为了鉴定CAT基因存在于转化藻的叶绿体基因组中，在CAT编码基因上面EcoRI和XbaI的酶切位点上（如图5所示），根据Southernblot分析的探针引物设计原理，采用Primer Premier5.0设计CAT探针的上游引物和下游引物，进行探针模板的扩增。扩增产物预期片段大小为576bp，引物序列如下：

上游引物为Pt377F：5’-AATTCCGTATGGCAATGAAAGACGG-3’

下游引物为Pt378R：5’-TAACGACCCTGCCCTGAACC-3’

根据DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II（购自Roche公司）的说明书操作步骤进行探针的制备和后续的实验。用EcoRI（购自Takara公司）对转化藻和未转化藻的基因组DNA进行酶切，37℃酶切过夜，酶切反应体系参照EcoRI的说明书。总DNA酶切反应结束后进行凝胶电泳，电泳结束后根据DIG High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit II说明书的操作步骤进行胶变性、胶中和、转膜、杂交、显影和定影。

CAT探针的Southern blot分析结果（如图6所示）表明转化藻泳道有特异性条带，大小为2.9kb，而未转化藻没有特异性条带。结果表明CAT存在于转化后的三角褐指藻细胞，而未转化三角褐指藻则为阴性结果。

八、转化藻的荧光定量PCR分析

为了检测目的基因在转化藻中的转录水平，本发明进行了荧光定量PCR实验。采用PrimerPremier5.0设计荧光定量PCR引物，分别对CAT编码基因、eGFP基因及β-actin基因进行荧光定量PCR分析，其中以β-actin基因分析数据作为内参。用引物Pt379（5’-GCGTGTTACGGTGAAAACCT-3’）和Pt380（5’-GGGCGAAGAAGTTGTCCATA-3’）分析CAT编码基因，用引物Pt381（5’-ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’）和Pt382（5’-AAGTCGTGCTGCTTCATGTG-3’）分析eGFP基因，用引物Act1f（5’-AGGCAAAGCGTGGTGTTCTTA-3’）和Act1r（5’-TCTGGGGAGCCTCAGTCAATA-3’）分析β-actin基因。首先，采用植物RNA提取试剂盒（购自Takara）提取转化藻和未转化藻的总RNA，然后通过采用PrimeScript II1st Strand cDNA Synthesis Kit（购自Takara公司）进行mRNA反转录合成cDNA。进行RT-PCR反应，反应体系25ul如下：10×PCR Buffer，2.5ul；25mM Mg²⁺，1.5ul；dNTP Mixture，0.5μl；Sense primer，1μl；Anti-sense primer，1μl；Taq，0.2μl；cDNA，1.5μl；dH2O，16.8μl。PCR反应参数：

Cycle1：（1×）94℃，    3-4min

Cycle2：（30×）94℃，   30s，

               60℃，    30s，

               72℃，    30s；

Cycle3：（1×）72℃，    10min，

               16℃，    ∞

进行荧光定量PCR反应，反应体系的配制及反应参数等均按TaKaRa 

Premix ExTaq^TMII（Perfect Real Time）试剂盒说明书进行，荧光定量PCR的扩增曲线和融解曲线应用Bio-Rad CFX96Real-Time PCR System的操作方法进行。最后运用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪配套的Bio-Rad CFX Manager Software1.6数据分析软件进行分析，且采用2^-ΔΔCt法来计算。

CAT编码基因的qPCR分析结果（如图7所示）表明CAT基因在转化藻中成功进行转录。eGFP基因的qPCR分析结果（如图8所示）表明eGFP基因在转化藻中的转录水平很高，是CAT转录水平的33.34倍，且未转化藻是完全的阴性，说明eGFP基因在三角褐指藻叶绿体高效启动子PrbcL的驱动下，能高效启动外源基因的转录。

九、转化藻的蛋白提取和Western blot分析

由于重组质粒pPtc-T中含有Myc标签多肽序列，可以通过对Myc标签多肽序列的检测来检验目的基因eGFP的表达。为了检测eGFP基因的表达，采用植物蛋白提取试剂盒（购自凯基公司）提取转化藻和未转化藻的全蛋白，实验操作步骤完全按照试剂盒的说明书。然后采用BCA蛋白定量试剂盒（购自凯基公司）对提取的蛋白进行浓度测定（蛋白浓度为33ug·ml^-1）。根据蛋白浓度确定SDS-PAGE的上样体积，最终上样量均为20μg。同时配置两块聚丙烯氨酰胺胶，进行SDS-PAGE实验，上样量及实验条件相同，实验条件为：胶浓度12﹪，电压100V，电泳时间100min。电泳结束后，取出一块胶进行考马斯亮蓝G-250染色分析，另一块胶进行电转移，蛋白转移到PVDF膜上。转移结束后，小心取出PVDF膜，将膜置于5﹪的脱脂奶粉封闭液中，4℃过夜。封闭结束后，往封闭液中加入1:5000的抗-Myc的小鼠抗体（购自Invitrogen公司），室温孵育2h。然后用PBST溶液（137mM NaCl，2.7mMKCl，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，0.5%Tween20，pH7.6）洗涤3次，每次10min。回收一抗溶液，将膜置于1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗（购自康为公司），室温孵育2h。回收二抗溶液，用PBST溶液洗涤3次，每次10min，采用TMB试剂（购自碧云天公司）进行显色。显色结束后，用抗体清除液（购自碧云天公司）清除结合在PVDF膜上的抗体，清除后换抗-GFP的小鼠抗体（购自Invitrogen公司）重新进行印记免疫反应，具体的实验步骤同上。同时采用GAPDH和β-actin作为内参。

印记免疫实验结果（如图9所示）表明eGFP基因在转化藻中成功表达，抗-Myc的抗体探针特异结合目的蛋白，分子大小约28Kda。而未转化的藻未出现任何条带，表明Western blot实验未出现抗体的交叉反应。与内参蛋白GAPDH和β-actine的表达量相比较，转化藻成功表达了eGFP蛋白，且表达量较高，表明叶绿体载体pPtc-eGFP是一个高效表达的载体。用抗Myc和抗GFP的印记结果相似，表明用抗Myc便可以快速有效地检测插入载体表达盒中任意目的基因的表达，经济实惠。

十、转化藻的ELISA分析

采用植物绿色荧光蛋白ELISA试剂盒（购自TSZ公司）分析转化藻细胞中eGFP蛋白的表达水平。实验操作步骤完全按照试剂盒的说明书。根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度为35ug·ml^-1。

通过植物绿色荧光蛋白ELISA检测试剂盒检测转化藻细胞中eGFP蛋白的表达水平。检测结果（如图10所示）表明eGFP蛋白占转化藻的全蛋白质量的0.121％，比海琏藻中表达GFP的0.05％增加了0.071个百分点。再一次证明了外源基因eGFP在三角褐指藻叶绿体高效启动子PrbcL的驱动下，能高效启动外源基因的表达。

十一、激光扫描共聚焦荧光显微镜分析转化藻的eGFP表达

分别取20μl的处于平台期的转化藻和未转化藻培养液，制备样品玻片，置于激光扫描共聚焦荧光显微镜（购自Zeiss,Jena公司）下观察，Ex=488和543，分别通过BP500-530滤镜和LP600的滤镜收集绿色荧光和红色荧光。图片采用LSM510软件（Zeiss,Jena公司）处理。

采用激光扫描共聚焦荧光显微镜对处于稳定期的转化藻细胞和未转化的藻细胞进行观察，结果如图11a和图11b所示，在图11b中，绿色通道内几乎观察不到绿色荧光（如图11b1所示）；在相同层面上的红色通道内，因叶绿体具有自发的红色荧光，可观察到藻细胞内的叶绿体为红色（如图11b2所示）。在绿色通道内，转化藻细胞内发出较强的绿色荧光（如图11a1所示）；在相同层面上的红色通道内，可观察到藻细胞内的叶绿体为红色（如图11a2所示）。在绿色荧光和红色荧光叠加的通道里，均可观察到各自绿色和红色荧光叠加的亚细胞区域均为黄色（如图11a4和图11b4所示），表明叶绿体的红色荧光和eGFP的绿色荧光具有很高的重合度。激光扫描共聚焦荧光显微镜结果再一次证明eGFP基因在三角褐指藻叶绿体中成功获得了表达。且转化后的藻细胞形态也发生了改变，和对照组的长梭形相比，细胞长度变短了，但宽度变大细胞变得更大了。

为了检测转化藻的eGFP基因表达水平，采用流式细胞仪（FACS-Aria，Becton Dickinson,NJ,USA）进行荧光扫描分析。采用1×10⁴的处于平台期的转化藻的藻细胞进行上机分析，测定eGFP的荧光强度。通过向前散射参数和侧散射参数消除死细胞，检测参数为Ex=488，530/15nm宅波通滤光片，FL1检测通道。每个实验均设置三个相同培养条件的平行实验，最后结果采取算术平均数。与对照组荧光强度进行比对，转化藻的荧光强度为135，而朱聪聪等设计的pPtc-GFP的荧光相对强度仅为80.04（转基因藻细胞的值为100.41，没有转GFP的三角褐指藻的值仅为20.37），表明本发明的微藻叶绿体载体驱动目的基因表达的效率要远远高于现有技术中的载体pPtc-GFP，本发明的微藻叶绿体载体的高效启动子PrbcL能够强启动目的基因eGFP的表达，最终实现外源基因的原核表达。而本发明的微藻叶绿体载体可用于三角褐指藻叶绿体高效表达任意外源基因。与现有技术的载体pPtc-GFP相比，本发明的微藻叶绿体载体表达效率更高，导入外源基因更加快速简便，实用性更强。

Claims (10)

1.一种高效克隆及表达的微藻叶绿体载体，其特征在于，包括同源重组序列trnI、同源重组序列trnA、启动子PrbcL、终止子TrbcS、上游XcmI序列和下游XcmI序列，上游XcmI序列和下游XcmI序列引入启动子PrbcL和终止子TrbcS之间，形成了目的基因克隆位点，同源重组序列trnI在启动子PrbcL的上游，同源重组序列trnA在终止子TrbcS的下游；所述的同源重组序列trnI的序列如SEQ ID NO.1所示，同源重组序列trnA的序列如SEQ IDNO.2所示，启动子PrbcL的序列如SEQ ID NO.3所示，终止子TrbcS的序列如SEQ ID NO.4所示，上游XcmI序列和下游XcmI序列均如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的高效克隆及表达的微藻叶绿体载体，其特征在于，在下游XcmI序列后增加Myc标签多肽序列，所述的Myc标签多肽序列如SEQ ID NO.6所示。

3.根据权利要求1或2所述的高效克隆及表达的微藻叶绿体载体，其特征在于，所述的引入是通过不依赖于连接反应的高效克隆方法来引入的。

4.根据权利要求1或2所述的高效克隆及表达的微藻叶绿体载体，其特征在于，还包括抗性筛选表达盒及目的基因。

5.根据权利要求4所述的高效克隆及表达的微藻叶绿体载体，其特征在于，所述的抗性筛选表达盒由启动子、终止子及抗性筛选标记基因组成。

6.根据权利要求5所述的高效克隆及表达的微藻叶绿体载体，其特征在于，所述的抗性筛选标记基因为氯霉素抗性基因。

7.根据权利要求4所述的高效克隆及表达的微藻叶绿体载体，其特征在于，所述目的基因为绿色荧光蛋白基因eGFP基因，以TA克隆的方法插入上述的启动子PrbcL和终止子TrbcS之间。

8.根据权利要求1或2所述的高效克隆及表达的微藻叶绿体载体，其特征在于，所述的微藻，优选为三角褐指藻。

9.权利要求1或2所述的高效克隆及表达的微藻叶绿体载体在利用微藻表达外源基因上的应用。

10.权利要求4所述的高效克隆及表达的微藻叶绿体载体在利用微藻表达外源基因上的应用。

Images