CN103937813B - 甘蔗鞭黑粉菌b位点交配型基因及其表达载体和构建方法 - Google Patents
甘蔗鞭黑粉菌b位点交配型基因及其表达载体和构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了甘蔗鞭黑粉菌b位点交配型基因及其表达载体和构建方法，发明人以甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型单倍体菌株DNA为模板，利用同源克隆和hitail-PCR方法首次从甘蔗鞭黑粉菌中分离获得“+”和“-”交配型b位点基因DNA全长及“+”交配型b位点左右同源臂序列。基于此，发明人利用甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因及其左右同源臂的片段与载体pEX2连接，构建了“+”交配型基因b位点表达载体pEX2-b。应用该载体通过农杆菌介导用于甘蔗鞭黑粉菌“-”交配型单倍体菌株的遗传转化，可获得不依赖有性配合就能够长菌丝的突变体，为甘蔗鞭黑粉菌有性配合相关基因鉴定及机理的研究奠定了基础，具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及甘蔗鞭黑粉菌b位点交配型基因及其表达载体和构建方法。
背景技术
甘蔗鞭黑粉菌（UstilagoscitamineaSyd.）是引起甘蔗黑穗病的重要病原，该病原菌属担子菌亚门黑粉菌属，是两型真菌，在其生活史中，存在两种形式的菌株：单倍体的单细胞菌体和由相对性系不同的单细胞菌体有性配合所产生的双核菌丝体。文献（AlbertHHandSchenckS.PCRamplificationfromahomologofthebEmating-typegeneasasensitiveassayforthepresenceofU.scitamineaDNA.PlantDisease,1996,80:1189-1192.）将其中一种交配型定为“+”交配型，另一交配型则为“-”交配型。其中，不能配合的两个单倍体则为同一交配型（“+”“+”或“-”“-”），能配合的两个单倍体为异型交配型（“+”“-”或“-”“+”）。不同遗传交配型（“+”和“-”）的单倍体细胞有性配合形成双核菌丝体在活的寄主组织中才能侵入寄主植物体内发育，对植物产生致病。
甘蔗鞭黑粉菌和玉米瘤黑粉病的病原菌——玉米黑粉菌（Ustilagomaydis）同属于黑粉菌科（Ustilaginaceae）黑粉菌属，后者由于具显症快、生命周期需要时间短的特点，在过去的30年里被作为致病真菌的模式菌株进行研究。此菌生活周期里的有性配合是由交配型基因a位点和b位点控制的。单倍体细胞间的识别是由双等位基因a位点通过一个信息素和同源受体系统调控的。配合因子基因a1（mfa1）和a2（mfa2）编码信息素前体，而信息素受体由pra1和pra2基因编码。来自一个交配型的信息素被来自另一交配型的受体识别，即来自a1菌株mfa1编码的信息素被a2菌株pra2编码的受体所识别。U.maydisb交配型基因位点是一个多等位基因位点，包含两个偏离基因分别为bEast（bE）和bWest（bW），至少存在25个不同序列的b位点种类。bE和bW的易变区域允许其在单倍体细胞阶段辨别“自我”或“非自我”或者保持非侵染的状态。在诱发致病性阶段通过一个串联来调控bE/bW转录，这个串联包括很多关于调控细胞周期、有丝分裂和DNA复制的基因。既然bE/bW异质二聚体是致病性发展的首要调控因子，那么就可以控制b-locus构建一个能独立具有致病性的菌株。这样的菌株含有可亲和的b-locus等位基因，并且在不需要另一交配型的协作就可以单独侵染植物。独立具有致病性的菌株可用于鉴定某些基因包括致病性等很多方面，是一个非常有价值的菌株。这些信息为研究同属甘蔗鞭黑粉菌（U.scitamineum）的有性配合机制提供了很重要的参考。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供甘蔗鞭黑粉菌b位点交配型基因及其表达载体和构建方法，具体是甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型b位点基因及甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因表达载体及其构建方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：甘蔗鞭黑粉菌b位点交配型基因，具有序列表SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2的碱基序列。
具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列为甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因，具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列为甘蔗鞭黑粉菌“-”交配型b位点基因。
上述甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因的表达载体，以甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因及其b位点左右同源臂为目的片断；左右同源臂分别具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列。
上述甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因的表达载体（pEX2-b）的构建方法，以甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因及其b位点左右同源臂为目的片断与载体pEX2连接而成。
上述甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因的表达载体在转化甘蔗鞭黑粉菌“-”交配型单倍体菌株获得不依赖有性配合就能长菌丝的单倍突变体方面的应用。
发明人以甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型单倍体菌株DNA为模板，利用同源克隆和hitail-PCR方法首次从甘蔗鞭黑粉菌中分离获得甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型b位点基因DNA全长及甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点左右同源臂序列。基于此，发明人利用甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因及其左右同源臂的片段与载体pEX2连接，构建了鞭黑粉菌“+”交配型基因b位点表达载体pEX2-b。应用该载体通过农杆菌介导用于甘蔗鞭黑粉菌“-”交配型单倍体菌株的遗传转化，可把“+”交配型基因b位点转入“-”交配型菌株中，使其单倍突变体同时拥有“+”和“-”两个不同交配型b位点基因，诱发该单倍突变体无需有性配合而产生菌丝，改变单倍体表型，获得不依赖有性配合就能够长菌丝的突变体。同时，鉴于此结果发明人证明甘蔗鞭黑粉菌交配型基因b位点与有性配合相关。该突变体为甘蔗鞭黑粉菌有性配合相关基因鉴定及机理的研究奠定了基础，具有重要意义。
附图说明
图1是本发明甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点交配型基因表达载体pEX2-b的构建图。
图2是甘蔗鞭黑粉菌长菌丝单倍体突变体hph基因PCR扩增电泳图，图中：1为1Kbmarker，2-17是随机挑选的长菌丝单倍体突变体，18是WT18即原始菌株，19是阴性对照，20是阳性对照，可见，除了泳道10、17、泳道18原始菌株和19阴性对照外，其他PCR结果均表现阳性。
图3是甘蔗鞭黑粉菌长菌丝单倍体突变体Southern杂交验证（基因组DNA经HindⅢ消化，以抗性基因hph为探针进行Southern杂交）结果图，图中：1是1Kbmarker，2-5是长菌丝单倍体突变体，6是甘蔗鞭黑粉菌（“-”交配型）野生型菌株，7是阳性对照hph基因PCR扩增产物。
图4是甘蔗鞭黑粉菌长菌丝单倍体突变体的形态特征结果图，图中：A甘蔗鞭黑粉菌长菌丝单倍体突变体菌落；B甘蔗鞭黑粉菌（“-”交配型）野生型单倍体酵母状菌落；C甘蔗鞭黑粉菌长菌丝单倍体突变体菌体；D甘蔗鞭黑粉菌（“-”交配型）野生型单倍体菌体。
具体实施方式
以下各实施例的甘蔗鞭黑粉病标样采集于广东省湛江市甘蔗种植区甘蔗品种ROC22上。蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型菌株按以下操作分离：
将病标样“黑粉鞭”上的黑粉孢子经无菌水悬浮后涂板于YePSA培养基（yeastextraction1%,peptone2%,sugar2%,agar2%）中，于28℃培养2d。将分离得到菌丝体，经无菌水悬浮后，稀释成不同梯度，涂板于YePSA培养基中，于28℃培养2d得到酵母状的单倍体。随机挑取培养基中酵母状的单倍体用无菌水配成悬浮液，在YePSA平板上进行两两随机配合，参考前述文献将这些单倍体归为两类不同的交配型菌株“+”或“-”，其中一种交配型定为“+”交配型，另一交配型则为“-”交配型。不能配合的两个单倍体则为同一交配型（“+”“+”或“-”“-”），能配合的两个单倍体为异型交配型（“+”“-”或“-”“+”）。
实施例1甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型b位点基因DNA全长及甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因左右同源臂的分离
（1）甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型b位点基因中间片断的获得
以甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型单倍体菌株DNA为模板，利用引物bE4：5‘-CGCTCTGGTTCATCAACG-3’（序列表SEQ.ID.No.7）和bE8：5‘-TGCTGTCGATGGAAGGTGT-3’（序列表SEQ.ID.No.8）进行同源克隆获得中间片段。25μL反应体系中，加入2.5μL10×PCRbuffer、2μL2.5μmol/LdNTP、1μL5μmol/L正向引物bE4、1μL5μmol/L反向引物bE8，1.0UTaqDNA聚合酶和1μLDNA，用ddH2O补至25μL。PCR反应程序：94℃，2min；94℃，30s，57℃，30s，72℃，60s，反应30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，UVP凝胶成像系统观察和照相，根据分子量大小判断目的片段。PCR产物用凝胶回收试剂盒（上海生工）回收纯化，用T4DNA连接酶（TaKaRa）连接到pMD18-T载体（TaKaRa），转化大肠杆菌感受态细胞，进行序列测定。
结果：分别获得459bp的特异序列（序列表SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6），两段序列只有一个碱基的差异。在NCBI上进行Blastn比对，发现该序列与玉米丝黑粉菌Sporisoriumreilianum同源结构域转录因子bE2基因的4470bp-4019bp序列有78%的同源性。在NCBI上进行Blastx搜索，发现该序列对应的氨基酸序列与玉米丝黑粉菌Sporisoriumreilianum同源结构域转录因子bE2的部分序列同源性高达71%。
（2）甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型b位点基因DNA全长及甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点左右同源臂的分离
分别根据两段中间片段序列上下游设计三条巢式引物，用来与随机简并引物组合，以期用hiTAIL-PCR的方法得到这两侧的基因序列，网上比对，拼接，引物如下：
上游三条巢式引物分别为：
WTRB1：GCCGCAACGAGATCGTAGACCCAGT，（序列表SEQ.ID.No.18）
WTRB2：ACGATGGACTCCAGAGTCCGGCCGATCCAGCTGATCATGCTGCTCCATTCT，（序列表SEQ.ID.No.19）
WTRB3：GCCCGGGTGCAAAGGAACGGACAA。（序列表SEQ.ID.No.20）
下游三条巢式引物分别为：
WTLB1：TCCTTTGCGACAACCTCAATCGACCTCTCA，（序列表SEQ.ID.No.21）
WTLB2：ACGATGGACTCCAGAGTCCGGCCCGAAGAAGAATGGAGCAGCATGATCAGCTG，（序列表SEQ.ID.No.22）
WTLB3：AGCAAGAAGCCGCGGAAAACTGGTC。（序列表SEQ.ID.No.23）
随机简并引物（LAD引物）为：
LAD1-1ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)N(G/C/A)NNNGGAA，（序列表SEQ.ID.No.9）
LAD1-2ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/T)N(G/C/T)NNNGGTT，（序列表SEQ.ID.No.10）
LAD1-3ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)(G/C/A)N(G/C/A)NNNCCAA，（序列表SEQ.ID.No.11）
LAD1-4ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/T)(G/A/T)N(G/C/T)NNNCGGT。（序列表SEQ.ID.No.12）
hiTIL-PCR准备预扩增反应体系（20μL）含2.0μL的PCRbuffer，200μM的各种dATP、dCTP、dGTP和dTTP(dNTPs)，1.0μM的任何一种LAD引物，0.3μMLB1或TLB1，0.5UExTaq，20-30ng甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型单倍体菌株的DNA。每25μL的第一轮TAIL-PCR体系含2.5μLPCRbuffer，200μM的各种dNTPs，0.3μMAC1（AC1ACGATGGACTCCAGAG，序列表SEQ.ID.No.13）和LB2，0.6UExTaq，1μL稀释40倍的预扩增产物。第二轮TAIL-PCR体系为25μL，含2.5μL的PCRbuffer，200μM的各种dNTPs，0.3μMAC1和LB3，0.5UExTaq，1μL稀释10倍的第一轮TAIL-PCR产物。必要时，第一轮或第二轮TAIL-PCR体系需扩大到50μL。PCR产物用凝胶回收试剂盒（上海生工）回收纯化，用T4DNA连接酶（TaKaRa）连接到pMD18-T载体（TaKaRa），转化大肠杆菌感受态细胞，进行序列测定，网上比对，拼接。根据新序列上下游再设计三条巢式引物，用来与随机简并引物组合，用hiTAIL-PCR的方法得到这两侧的基因序列，网上比对，拼接直到获得甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型b位点基因全长。引物如下：
上游三条巢式引物分别为：
WT182LB1：AGTCTCCTCGCAAGACCCTCACCAACG，（序列表SEQ.ID.No.24）
WT182LB2：ACGATGGACTCCAGAGTCCGGCCTGGCCCTGATCGTTGTTCGCGCTGA，（序列表SEQ.ID.No.25）
WT182LB3：ACATGCCTGCCGGTGCCTGAGGAT。（序列表SEQ.ID.No.26）
下游三条巢式引物分别为：
WT182RB1：CGAACACCAACTCCTGATCTAGAGAACACCT，（序列表SEQ.ID.No.27）
WT182RB2：ACGATGGACTCCAGAGTCCGGCCGCAAGGATTCCAGCCTATTGACGAGATCGGA，（序列表SEQ.ID.No.28）
WT182RB3：GCATGAGTGATGGTGGTGATGTGGCA。（序列表SEQ.ID.No.29）
随机简并引物（LAD引物）为：
LAD1-1ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)N(G/C/A)NNNGGAA，（序列表SEQ.ID.No.9）
LAD1-2ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/T)N(G/C/T)NNNGGTT，（序列表SEQ.ID.No.10）
LAD1-3ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)(G/C/A)N(G/C/A)NNNCCAA，（序列表SEQ.ID.No.11）
LAD1-4ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/T)(G/A/T)N(G/C/T)NNNCGGT。（序列表SEQ.ID.No.12）。
结果：获得甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因全长DNA序列为3856bp（序列表SEQ.ID.No.1），“-”交配型b位点全长DNA序列为3886bp（序列表SEQ.ID.No.2）。经NCBI进行Blast比对发现甘蔗鞭黑粉菌的b位点基因与玉米黑粉菌U.maydisb位点同源性达70%-77%，与Sporisoriumreilianumb位点同源性分别为71-72%，该位点基因的功能是与黑粉菌的有性配合、菌丝的维持及致病力相关。甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型基因b位点均存在两个开放阅读框（ORF）分别编码两个基因，即bW和bE基因。
根据甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因DNA序列上下游分别设计三条巢式引物用来与随机简并引物组合，用hiTAIL-PCR的方法得到甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因两侧（左右同源臂）的序列，获得左同源臂序列约为1.6kb（序列表SEQ.ID.No.3），右同源臂序列约1.3kb（序列表SEQ.ID.No.4）。最后与“+”交配型b位点序列拼接形成一个长片段。
上游三条巢式引物分别为：
WT17bLB1：ACCGCAGACAGCACCTTATCCAATACG，（序列表SEQ.ID.No.30）
WT17bLB2：ACGATGGACTCCAGAGTCCGGCCCTCGAGCTCGCTGCGGCTCCAACAC，（序列表SEQ.ID.No.31）
WT17bLB3：ACTTGCCATGCTCCGATCTCGATCTCG。（序列表SEQ.ID.No.32）
下游三条巢式引物分别为：
WT17bRB1：TGCAACACCCTTGGTTCAGCCCTTGGC，（序列表SEQ.ID.No.33）
WT17bRB2：ACGATGGACTCCAGAGTCCGGCCATATTTTATTTTTGTCGTTGTTCCCGCAC，（序列表SEQ.ID.No.34）
WT17bRB3：TCACGCACGCAGGTCGAGAAGAGTCAG。（序列表SEQ.ID.No.35）
随机简并引物为：
LAD1-1ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)N(G/C/A)NNNGGAA，（序列表SEQ.ID.No.9）
LAD1-2ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/T)N(G/C/T)NNNGGTT，（序列表SEQ.ID.No.10）
LAD1-3ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)(G/C/A)N(G/C/A)NNNCCAA，（序列表SEQ.ID.No.11）
LAD1-4ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/T)(G/A/T)N(G/C/T)NNNCGGT。（序列表SEQ.ID.No.12）
实施例2甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因表达载体pEX2-b的构建（图1）
根据甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点左右同源臂序列设计引物17bF11:AAAACTAGTTGTGAGGAACTAACTGGTTTGCA（序列表SEQ.ID.No.14，含有SpeI酶切位点，）和17bR22:AAATTAATTAATCCACACCAGATCCATCAAAACA（序列表SEQ.ID.No.15，含有PacI酶切位点），以甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型单倍体基因组DNA为模板，进行PCR扩增。50μL反应体系中，加入10μL5×phusionHFbuffer、4μL2.5μmol/LdNTP、3μL5μmol/L正向引物17bF11、3μL5μmol/L反向引物17bR22，0.5μLphusionDNA聚合酶和1μLDNA，用ddH2O补至50μL。PCR反应程序：98℃，30s；98℃，10s，61℃，30s，72℃，3min，反应30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，UVP凝胶成像系统观察和照相，根据分子量大小判断目的片段，PCR产物用凝胶回收试剂盒（上海生工）回收纯化。扩增获得包含甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因及左右臂约6.6kb的片段。利用内切酶SpeI和PacI对片断和载体pEX2分别进行双酶切，回收，采用T4连接酶连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，然后在含壮观霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。
结果：通过克隆、酶切、连接，将包含甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因及左右臂约6.6kb的片段整合到载体pEX2中，构建一个新载体命名为pEX2-b。该载体含有潮霉素抗性基因hph和启动子umgpda，以及壮观霉素和链霉素抗性基因sp/strR（图1）。
实施例3甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因在甘蔗黑粉菌“-”交配型交配型单倍体菌株中的表达
1.农杆菌转化甘蔗鞭黑粉菌
甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因表达载体pEX2-b转化农杆菌，挑含有甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因表达载体的根癌农杆菌菌体至加入状观霉素（100μg/mL）和利福平（50μg/mL）5mL的MM液体培养液中，28℃，200rpm，培养过夜，用IM液体培养液稀释OD600至0.15左右，28℃下预诱导培养6h，测OD600约为0.5左右时，即可用于共培养。挑取甘蔗鞭黑粉菌“-”交配型单倍体菌体于2mLYePS液体培养基中，28℃下培养过夜，200rpm，用YePS液体培养基稀释OD600至0.15左右，28℃下，200rpm培养6h，测OD600约为0.5左右时，即可用于共培养。分别取上述农杆菌培养液和甘蔗鞭黑粉菌（“-”交配型）1×106个/mL孢子悬浮液，各100μL混合涂在加入AS（200μmol/L）的覆盖了混合纤维素滤膜的IM固体培养基上，24℃下共培养48h。转移纤维素滤膜到含有潮霉素B（HygB，100μg/mL，）和头孢噻肟钠（300μg/mL）的YePSA，28℃下培养8-12d，以获得转化子。将长出的单菌落用牙签挑到含有潮霉素B（HygB，100μg/mL，）的YePSA上进行二次筛选。待长出菌落后再挑入YePS培养液28℃下，200rpm培养2d后，对突变体进行形态特征观察。
2.PCR、southernblotting鉴定及形态观察。
通过农杆菌转化甘蔗鞭黑粉病菌后获得的突变体提取DNA进行PCR鉴定（图2），引物为hph-F:5-GCAAGACCTGCCTGAAACCG-3’（序列表SEQ.ID.No.16）和hph-R:5’-GGTCAAGACCAATGCGGAGC-3’（序列表SEQ.ID.No.17）,反应体系同实施例1。此外，利用引物hph-F/hph-RPCR扩增产物合成探针，采用罗氏southernblotting试剂盒进一步验证插入片段的拷贝数（图3）。对突变体菌落形态进行肉眼观察记录和利用电子显微镜对突变体孢子、菌丝等进行观察、拍照记录（图4）。
结果：在潮霉素抗性培养基上获得产生菌丝的转化子。将具有明显抗性生长的长菌丝转化子进行单孢分离，获得纯菌株后提取基因组DNA，进行PCR和southernblotting试验。经PCR试验证实除两个突变体显示阴性外，其他15个长菌丝突变体均显示阳性（图2）；选取其中4个阳性长菌丝突变体进行southernblotting试验，结果显示利用hph基因做探针，4个长菌丝突变体均能杂出阳性条带且为单一条带，证实外援基因以单拷贝的形式插入甘蔗鞭黑粉菌（“-”交配型）基因组中（图3），并经过数代培养获得稳定表达长菌丝的突变体。在YePSA固体培养基中该突变体菌落形态为长白色菌丝的菌落，而甘蔗鞭黑粉菌（“-”交配型）野生型菌株菌落形态为酵母状；在电子显微镜下观察及测量，发现长菌丝突变体其产生的小孢子大小比野生型单倍体孢子大，突变体小孢子大小为3.30-4.48μm×15.92-39.10μm，野生型单倍体孢子大小为1.48-2.57μm×7.32-15.42μm。
Claims (5)
1.甘蔗鞭黑粉菌b位点交配型基因，其特征在于该基因是序列表SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的甘蔗鞭黑粉菌b位点交配型基因，其特征在于序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列为甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因，序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列为甘蔗鞭黑粉菌“-”交配型b位点基因。
3.权利要求2中所述甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因的表达载体，其特征在于以甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因及b位点左右同源臂为目的片断，将目的片断与载体连接而成；所述左右同源臂分别为序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列。
4.权利要求3所述甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因的表达载体的构建方法，其特征在于：以甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因及b位点左右同源臂为目的片断与载体pEX2连接而成。
5.权利要求3所述甘蔗鞭黑粉菌“+”交配型b位点基因的表达载体在转化甘蔗鞭黑粉菌“-”交配型单倍体菌株获得不依赖有性配合就能长菌丝的单倍突变体方面的应用。
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