CN102181554A - 半滑舌鳎雌性特异的基因组dna片段及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA片段及其应用。半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA片段，其特征在于所述的DNA片段为：(a)具有序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的DNA片段；(b)分别与(a)中所述DNA片段经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的DNA片段，且为半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA序列。本发明获得的半滑舌鳎雌性特异性的DNA片段作为分子标记能够有效的辨别半滑舌鳎的雌性个体，并且本发明的方法可以一次性鉴定大量个体，鉴定时间不超过90分钟，适合大规模地进行半滑舌鳎的遗传性别鉴定，能够在半滑舌鳎工厂化养殖中进行大规模的推广。

Description

半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA片段及其应用
技术领域
本发明属于生物技术中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术领域，具体涉及一种半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA片段及其应用。
背景技术
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)，俗称鳎米、龙利等，为近海冷温性鱼类，其肉嫩味鲜，营养丰富，是我国重要的海水经济鱼类，为我国当前海水工厂化养殖的主要种类之一。不过，半滑舌鳎雌、雄个体差异非常大，雌性个体生长速度比雄性快2-3倍，成熟雌鱼全长可达雄鱼的两倍以上，体重可达雄鱼的10倍。由于雄性个体生长速度过慢，严重影响了苗种质量，降低了养殖产量，增加了养殖成本，从而限制了半滑舌鳎苗种推广及其养殖产业的发展。因此，建立一种快速准确且方便使用的半滑舌鳎雌雄鉴定技术已迫在眉睫。
关于鱼类性别鉴定方面的研究，大多是跟分子标记相关的报道。比如Iturra等(1994)在虹鳟鱼基因组中找到了雄性特异的RAPD标记；Kovacs等(2000)获得了非洲鲶鱼的两个雄性性别相关的RAPD标记；Rachael等(2003)在虹鳟中筛选到两个雄性性别连锁的微卫星标记，还在北极鲑鱼和棕鳟中找到了很多雄性性别连锁的微卫星标记；Alicia等(2005)用不同的引物组合和限制性内切酶扫描虹鳟的雌、雄基因池，获得了18个可以用于性别鉴定的AFLP标记。关于半滑舌鳎性别鉴定相关的研究已开展了一些工作，但还不适合大规模地进行半滑舌鳎的遗传性别鉴定，无法应用于半滑舌鳎工厂化养殖的推广。
发明内容
本发明的目的是提供半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA片段及其应用，即提供一种半滑舌鳎雌性特异性分子标记，同时建立快速准确地鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法。
本发明的两条半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA片段，其特征在于所述的DNA片段为：
(a)、具有序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的DNA片段；
(b)、分别与(a)中所述DNA片段经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的DNA片段，且为半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA标记。
由序列为SEQ ID NO：1的DNA片段设计引物，上下游引物序列分别为SEQID NO：3和SEQ ID NO：4，其扩增片段长度为315bp。
由序列为SEQ ID NO：2的DNA片段设计引物，上下游引物序列分别为SEQID NO：5和SEQ ID NO：6，其扩增片段长度为239bp。
上述的引物分别用于半滑舌鳎遗传性别的鉴定。
半滑舌鳎遗传性别的鉴定方法，包括基因组DNA提取、PCR扩增、扩增产物电泳检测步骤，其特征在于，所述的DNA提取步骤是抽取少量的半滑舌鳎血液，迅速将血液置于超纯水的管中，99℃处理5分钟，上清部分即为PCR扩增的模板，其中血液和超纯水的体积比为1∶1。
上述的PCR扩增步骤条件如下：PCR反应体系为20μL，包含1对雌性特异引物0.2μM，1对阳性对照引物0.2μM，dNTPs各200μM，模板10μL，10×PCR Buffer2μL，1.5mM的MgCl2和1单位的Taq酶；PCR反应程序为：94℃下预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，反应进行25个循环；其中阳性对照引物的序列分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
本发明获得的半滑舌鳎雌性特异性分子标记能够有效的辨别半滑舌鳎的雌性个体，并且本发明的方法可以一次性鉴定大量个体，鉴定时间不超过90分钟，适合大规模地进行半滑舌鳎的遗传性别鉴定，能够在半滑舌鳎工厂化养殖中进行推广。本发明的方法可应用于半滑舌鳎养殖过程中雌性个体的筛选，减少因养殖雄性个体造成过高的成本，提高半滑舌鳎的养殖效益；还可以在利用ZW伪雄鱼生产WW超雌鱼进而开展全雌育种的尝试中进行伪雄鱼的筛选，为半滑舌鳎全雌育种的研究提供可靠的性别鉴定工具。
附图说明
图1：本发明鉴定方法得到的PCR产物的琼脂糖电泳图。
其中：a为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4引物的扩增产物；
b为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6引物的扩增产物；两条带的为雌性个体，一条带的为雄性个体，其中雌雄都有的条带为阳性引物扩增出的条带，大小为494bp，M代表Marker。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
一、半滑舌鳎雌性特异性分子标记的筛选
本发明的雌性特异的基因组DNA片段是通过对半滑舌鳎的W性染色体进行激光显微切割分离，然后构建W染色体DNA文库并测序，设计引物在雌雄个体上检测，结果表明从SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2设计的引物只在半滑舌鳎雌性个体上扩增出目的大小的片段，从而证明序列为SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2的片段只存在于半滑舌鳎的W性染色体上。
本发明的半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA片段还包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的DNA片段，且为半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA标记。例如在用引物扩增的时候，由于链滑动造成的一个或几个碱基的插入；或是由于聚合酶造成的碱基错配。这样或通过其他人工方法形成的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的衍生片段同样是半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA片段，即只能在雌性个体中扩增出条带。
二、半滑舌鳎雌性特异性分子标记的应用
从SEQ ID NO：1上设计引物，用于在雌性个体上扩增出特异性引物，其中上下游引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，其扩增片段长度为315bp。用于扩增序列为SEQ ID NO：2的DNA片段的引物，上下游引物序列分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，其扩增片段长度为239bp。
将上述的引物分别用于半滑舌鳎遗传性别的鉴定，包括基因组DNA提取、PCR扩增、扩增产物电泳检测步骤，具体如下：。
(1)基因组DNA提取：将待测半滑舌鳎样品使用一次性无菌注射器抽血50μL，然后迅速将血液置于含50μL超纯水的PCR管中，在PCR仪上99℃处理5分钟，取上清10μL做为PCR反应的模板；
(2)PCR扩增：PCR反应体系为20PCR扩增，包含1对雌性特异引物0.2μM，1对阳性对照引物0.2μM，dNTPs各200μM，模板10μL，1×PCR Buffer，1.5mM的MgCl2和1单位的Taq酶。PCR反应程序为：94℃下预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，反应进行25个循环。
(3)扩增产物电泳检测步骤：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统拍照检测。结果为2条带的为雌性个体，1条带的为雄性个体，无条带的说明模板或PCR试剂有问题。
使用本发明的方法对已知性别的5条雌鱼和5条雄鱼进行了遗传性别的鉴定，对两对雌性特异引物分别进行了使用(图1)，其中雌雄都有的条带为阳性引物扩增出的条带，大小为494bp，M代表Marker，a为SEQ ID NO：3和SEQID NO：4引物的扩增产物，长度为315bp，b为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6引物的扩增产物，长度为239bp，两条带的为雌性个体，一条带的为雄性个体，PCR产物条带清晰，雌雄条带差异明显，且耗时仅75分钟，证明了该方法的有效性。对扩增出的雌性特异性条带切胶回收、测序，结果表明，扩增出的雌性特异性条带正是本发明所筛选出的两条半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA片段的一部分，从而证明本发明的特异性片段鉴定半滑舌鳎性别的有效性。
Figure IDA0000056610810000012
Figure IDA0000056610810000021
Figure IDA0000056610810000031
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Claims (7)

1.半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA片段，其特征在于所述的DNA片段为：
(a)、具有序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的DNA片段；
(b)、分别与(a)中所述DNA片段经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的DNA片段，且为半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA标记。
2.权利要求1所述的DNA片段用于半滑舌鳎遗传性别的鉴定。
3.权利要求1所述的序列为SEQ ID NO：1的DNA片段设计引物，上下游引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
4.权利要求1所述的序列为SEQ ID NO：2的DNA片段设计引物，上下游引物序列分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
5.权利要求3或4所述的引物用于半滑舌鳎遗传性别的鉴定。
6.如权利要求5所述的半滑舌鳎遗传性别的鉴定，其方法包括基因组DNA提取、PCR扩增、扩增产物电泳检测步骤，其特征在于，所述的基因组DNA提取步骤是抽取少量的半滑舌鳎血液，迅速将血液置于超纯水的管中，99℃处理5分钟，上清部分即为PCR扩增的模板，其中血液和超纯水的体积比为1∶1。
7.如权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于上述的PCR扩增步骤的条件如下：PCR反应体系为20μL，包含有权利要求3或权利要求4所述的引物0.2μM，一对阳性对照引物0.2μM，dNTPs各200μM，模板10μL，10×PCR Buffer2μL，1.5mM的MgCl2和1单位的Taq酶；PCR反应程序为：94℃下预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，反应进行25个循环；其中阳性对照引物的序列分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
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