CN107299108A - 根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法，以茭白黑粉菌孢子为转化受体材料，将含有双元载体的根癌农杆菌与茭白黑粉菌孢子混合后共培养，用抗生素筛选，获得抗性转化子。该法操作简单、转化效率高且稳定性好，以此构建茭白黑粉菌突变体库，为筛选茭白黑粉菌二型态转换突变体提供了丰富的筛选菌源，同时为克隆茭白黑粉菌二型态转换基因以及茭白黑粉菌与茭白植株互作相关基因提供了手段，对阐明茭白的孕茭机制和推进茭白育种工作具有重要意义。

Description

根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法
技术领域
本发明属于微生物基因工程技术领域，尤其涉及一种根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法。
背景技术
茭白(Zizania latifolia)又称菰，为禾本科菰属多年生宿根草本植物，其肉质鲜嫩，富含丰富营养物质和多种药用成分。广泛栽培于长江流域及以南地区，广西柳州、桂林、贺州等地区素有种植。随着茭白产业不断发展，种植面积不断扩大，目前茭白已成为我国第二大水生蔬菜。
茭白黑粉菌(Ustilago esculenta)属于担子菌门黑粉菌科，研究发现，茭白黑粉菌为茭白植株的内生真菌，茭白能否孕茭与其成功侵染密切相关。当茭白植株受茭白黑粉菌侵染后，由于茭白抽穗开花受抑制，茎部组织受刺激膨大形成肉质茎，其中呈现白嫩可食用的肉质茎的称为正常茭白，而布满褐色孢子的肉质茎的茭白为灰茭，不可食用。据报道，误食茭白黑粉菌可引起肺炎。灰茭和正常茭白中的茭白黑粉菌在形态上存在较大的差异，茭白黑粉菌在灰茭中主要以冬孢子(T型)形式存在，致使茭肉呈褐色，而茭白黑粉菌在正常茭白中则多以菌丝型(MT型)存在，使茭肉呈白色。因此，深入研究茭白黑粉菌，对揭示茭白孕茭机理与茭白育种工作具有重要意义。
用分子生物学手段研究茭白黑粉菌为揭示茭白孕茭机理和加快茭白育种进程提供新的研究思路。分离和鉴定茭白黑粉菌致病与孕茭机理相关基因是关键所在，而建立真菌遗传转化技术创造缺陷突变体则是分离和鉴定该相关基因的一种有效途径。Yu jiajia等建立了PEG介导茭白黑粉菌原生质体的遗传转化体系，虽然通过该遗传转化体系获得了敲除突变体及EGFP绿色荧光蛋白过表达，但该转化体系存在一定缺陷，不仅需要制备繁琐的敏感原生质体，且还需要对转化载体进行线性化处理才能获得转化子。
目前，丝状真菌遗传转化技术已成为植物病原真菌分子遗传和基因功能研究的重要手段。由农杆菌介导的真菌遗传转化技术(ATMT)已经成功应用于U.maydis、Pseudozymaantarctica、U.hordei、S.scitamineum等黑粉菌及其它丝状真菌中。已有大量文献证明，农杆菌介导的真菌转化与PEG转化方法相比，具有转化效率高、转化子T-DNA为单拷贝、随机插入频率高等优点。此外，PEG转化时的受体只能为原生质体，而高浓度的PEG对原生质体有毒害作用。而由农杆菌转化获得的转化子比较稳定，由ATMT得到的转化子，在没有选择压力的培养基上培养几代后也不会丧失抗生素抗性。迄今，未见茭白黑粉菌农杆菌介导的遗传转化体系相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、转化效率高、稳定性好的根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法，以茭白黑粉菌孢子为转化受体材料，将含有双元载体的根癌农杆菌与茭白黑粉菌孢子混合后共培养，用抗生素筛选，获得抗性转化子。
上述根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法，包括以下步骤：
<1>茭白黑粉菌孢子的制备；
<2>含载体农杆菌的准备；
<3>转化。
步骤<1>按以下操作进行：在YePSA固体培养基上将茭白黑粉菌培养2天后，将茭白黑粉菌接种至YePS液体培养基，摇床200rpm，培养2天，然后5000rpm离心收集菌体，加入ddH2O2制成1×107个/mL孢子悬浮液，获得茭白黑粉菌孢子悬浮液，备用。
步骤<2>按以下操作进行：利用质粒pEX2-eGFP和pEX2-RFP为转化载体，pEX2-eGFP载体携带绿色荧光蛋白基因eGFP和潮霉素抗性筛选基因hph，pEX2-RFP载体携带红色荧光蛋白基因RFP和潮霉素抗性筛选基因hph，通过电击转化的方法将质粒pEX2-eGFP和pEX2-RFP载体分别转入农杆菌感受态细胞中；挑含有双元载体的根癌农杆菌菌体至5mL的MM液体培养基中，28℃，200rpm，培养过夜，用IM液体培养基将菌液稀释OD600至0.15，28℃下预诱导培养6h，使菌液OD600调至为0.5备用。
MM液体培养基为基本培养基，其配方为：1.45g KH2PO4，2.05g K2HPO4，0.5gNH4NO3，0.01g CaCl2，0.3g(NH4)SO4，2g Glucose，0.01g FeSO4，5ml Z-buffer，加双蒸水定容至1000mL，pH6.7-7.0；诱导培养基配方为：1g Glucose，7.808g MES，1.45g KH2PO4，0.5gNH4NO3，0.6g MgSO4·7H2O，0.01g CaCl2，0.3g NaCl，0.5g(NH4)SO4，HCl调pH值到5.6，双蒸水定容至1000mL。
Z-buffer中含有以下成分CuSO4*5H2O，ZnSO4*7H2O，MnSO4*H2O，H3BO3和NaMbO4*2H2O各0.01％。
步骤<3>按以下操作进行：分别取步骤<1>中茭白黑粉菌孢子悬浮液和步骤<2>中农杆菌培养液各100μL，混合后涂板于含AS的覆盖有纤维素滤膜的IM固体培养基上，24℃下共培养48h-72h；转移纤维素滤膜至含有潮霉素B和头孢噻肟钠的YePSA，28℃下培养5-8d；将长出的单菌落转化子用牙签挑到含有潮霉素B和头孢噻肟钠的YePSA上进行二次筛选；第二次筛选获得的抗潮霉素B的茭白黑粉菌即为转化子。
IM固体培养基由每升诱导培养基加25克琼脂构成。
为研究茭白黑粉菌的孕茭机制，发明人建立了一种根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法，以茭白黑粉菌孢子为转化受体材料，将含有双元载体的根癌农杆菌与茭白黑粉菌孢子混合后共培养，用抗生素筛选，获得抗性转化子。该法操作简单、转化效率高且稳定性好，以此构建茭白黑粉菌突变体库，为筛选茭白黑粉菌二型态转换突变体提供了丰富的筛选菌源，同时为克隆茭白黑粉菌二型态转换基因以及茭白黑粉菌与茭白植株互作相关基因提供了手段，对阐明茭白的孕茭机制和推进茭白育种工作具有重要意义。
附图说明
图1是茭白黑粉菌分生孢子和菌丝，图中：A：茭白黑粉菌分生孢子，B：茭白黑粉菌菌丝。
图2是双元载体结构示意图，图中：A：载体pEX2-eGFP，B：载体pEX2-RFP。
图3是茭白黑粉菌荧光鉴定结果图，图中：A：在明场下的茭白黑粉菌GFP转化子分生孢子，B：在绿色荧光滤镜下的茭白黑粉菌GFP转化子分生孢子C：在明场下的茭白黑粉菌RFP转化子分生孢子，D：在红色荧光滤镜下的茭白黑粉菌RFP转化子分生孢子。
图4是茭白黑粉菌转化子PCR鉴定结果图，图中：M：marker 2k，1-16：茭白黑粉菌GFP和RFP转化子，17：为茭白黑粉菌野生型，18：质粒pEX2-eGFP。
图5是茭白黑粉菌转化子southern blot结果图，图中：M：marker 1kb，1-5：茭白黑粉菌GFP转化子，6-9：茭白黑粉菌RFP转化子，11：为茭白黑粉菌野生型，10：阳性对照质粒pEX2-eGFP。
具体实施方式
实施例1茭白黑粉菌T-DNA插入转化子的获得
<1>茭白黑粉菌孢子的制备
在YePSA固体培养基(yeast extraction 1％，peptone 2％，sugar 2％，agar2％)上将茭白黑粉菌培养2天后，将茭白黑粉菌接种至YePS液体培养基(yeast extraction1％，peptone 2％，sugar 2％)，摇床200rpm，培养2天，然后5000rpm离心收集菌体，加入ddH2O2制成1×107个/mL孢子悬浮液(图1))，获得茭白黑粉菌孢子悬浮液，备用。上述一切操作在无菌的条件下进行。
<2>含载体农杆菌的准备
利用质粒pEX2-eGFP和pEX2-RFP为转化载体，pEX2-eGFP载体携带绿色荧光蛋白基因eGFP和潮霉素抗性筛选基因hph(图2A)，pEX2-RFP载体携带红色荧光蛋白基因RFP和潮霉素抗性筛选基因hph(图2B)，通过电击转化的方法将质粒pEX2-eGFP和pEX2-RFP载体分别转入农杆菌感受态细胞中；挑含有双元载体的根癌农杆菌菌体至5mL的MM液体培养基中(状观霉素100μg/mL和利福平50μg/mL)，28℃，200rpm，培养过夜，用IM液体培养基将菌液稀释OD600至0.15(左右)，28℃下预诱导培养6h(28℃，200rpm)，使菌液OD600调至为0.5(左右)备用。其中，
MM液体培养基为基本培养基(minimal media，MM)，其配方为：1.45g KH2PO4，2.05g K2HPO4，0.5g NH4NO3，0.01g CaCl2，0.3g(NH4)SO4，2g Glucose，0.01g FeSO4，5ml Z-buffer(含有以下成分CuSO4*5H2O，ZnSO4*7H2O，MnSO4*H2O，H3BO3和NaMbO4*2H2O各0.01％。)，加双蒸水定容至1000mL，pH6.7-7.0；诱导培养基(induce media，IM)配方为：1g Glucose，7.808g MES，1.45g KH2PO4，0.5g NH4NO3，0.6g MgSO4·7H2O，0.01g CaCl2，0.3g NaCl，0.5g(NH4)SO4，HCl调pH值到5.6，双蒸水定容至1000mL。
<3>转化
分别取步骤<1>中茭白黑粉菌孢子悬浮液和步骤<2>中农杆菌培养液各100μL，混合后涂板于含AS(200μ mol/L)的覆盖有纤维素滤膜的IM固体培养基(由每升诱导培养基(induce media，IM)加25克琼脂构成)上，24℃下共培养48h-72h(黑暗条件下)；转移纤维素滤膜至含有潮霉素B(100μg/mL，)和头孢噻肟钠(300μg/mL)的YePSA，28℃下培养5-8d。将长出的单菌落转化子用牙签挑到含有潮霉素B(100μg/mL，)和头孢噻肟钠(300μg/mL)的YePSA上进行二次筛选；第二次筛选获得的抗潮霉素B的茭白黑粉菌即为转化子。
实施例2茭白黑粉菌转化子的鉴定
1)荧光显微镜鉴定
将茭白黑粉菌转化子分生孢子置于荧光显微镜下观察荧光。茭白黑粉菌野生型没有检测到荧光信号，经农杆菌转化后的转化子在荧光显微镜激发光下发绿光或红光，证明农杆菌的绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白RFP已经成功转到茭白黑粉菌中并得以表达(图3)。
2)茭白黑粉菌转化子PCR验证
以双元载体pEX2-eGFP和pEX2-RFP上的潮霉素基因(hph(SEQ.ID.No.1))为模板设计引物hph-F：ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC(SEQ.ID.No.2)/hph-R：GCTGCTCCATACAAGCCAACCAC(SEQ.ID.No.3)对转化子进行PCR扩增(扩增产物长度约733bp)，以初步验证是否得到真正有插入的突变体。
PCR反应液组成(25μL体系)：25.0μL反应体系中，加入2.5μL 10×PCR Buffer、2.0μL 2.5μ mol/L dNTP、1.0μL 5μ mol/L正向引物hph-F、1.0μL 5μ mol/L反向引物hph-R，1.0U Taq DNA聚合酶和1.0μL DNA，用ddH20补至25.0μL。PCR扩增反应程序：95℃预变性2min，然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。
所有测试的茭白黑粉菌GFP和RFP转化子及质粒pEX2-eGFP均能扩增出预期的约733bp大小的片段，而未经转化的野生型菌株对照则扩增不到任何条带，说明转化子含有T-DNA插入片段(图4)
3)茭白黑粉菌转化子southern blot验证
为进一步验证茭白黑粉菌转化子T-DNA插入和拷贝数，对茭白黑粉菌转化子进行southern blot。对茭白黑粉菌转化子DNA采用HindIII内切酶进行酶切，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。将电泳凝胶转入尼龙膜(Roche，Cat.No.11 417 240 001)，以引物hph-F/hph-R扩增得潮霉素基因hph片段为探针，PCR反映体系同2)，随后的分子杂交采用PCRDIGProbe Synthesis Kit(Roche，Cat.No.11 636 090 910)，显色反应采用DIG Nucleic AcidDetection Kit(Roche，Cat.No.11 175 041 910)进行，具体步骤参考产品使用说明书。
所有测试的9个茭白黑粉菌转化子(其中5个为GFP转化子，4个为RFP转化子)均能检测到杂交信号，且杂交信号表现丰富带型；除了2个转化子(图5泳道5和7)为双拷贝外，其他转化子均为单拷贝，说明T-DNA在转化子中为随机插入，且77.8％以上为单拷贝(图5)。

Claims (8)

1.一种根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法，其特征在于：以茭白黑粉菌孢子为转化受体材料，将含有双元载体的根癌农杆菌与茭白黑粉菌孢子混合后共培养，用抗生素筛选，获得抗性转化子。
2.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法，其特征在于包括以下步骤：
<1>茭白黑粉菌孢子的制备；
<2>含载体农杆菌的准备；
<3>转化。
3.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法，其特征在于步骤<1>按以下操作进行：在YePSA固体培养基上将茭白黑粉菌培养2天后，将茭白黑粉菌接种至YePS液体培养基，摇床200rpm，培养2天，然后5000rpm离心收集菌体，加入ddH2O2制成1×107个/mL孢子悬浮液，获得茭白黑粉菌孢子悬浮液，备用。
4.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法，其特征在于步骤<2>按以下操作进行：利用质粒pEX2-eGFP和pEX2-RFP为转化载体，pEX2-eGFP载体携带绿色荧光蛋白基因eGFP和潮霉素抗性筛选基因hph，pEX2-RFP载体携带红色荧光蛋白基因RFP和潮霉素抗性筛选基因hph，通过电击转化的方法将质粒pEX2-eGFP和pEX2-RFP载体分别转入农杆菌感受态细胞中；挑含有双元载体的根癌农杆菌菌体至5mL的MM液体培养基中，28℃，200rpm，培养过夜，用IM液体培养基将菌液稀释OD600至0.15，28℃下预诱导培养6h，使菌液OD600调至为0.5备用。
5.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法，其特征在于：所述MM液体培养基为基本培养基，其配方为：1.45g KH2PO4，2.05g K2HPO4，0.5gNH4NO3，0.01g CaCl2，0.3g(NH4)SO4，2g Glucose，0.01g FeSO4，5ml Z-buffer，加双蒸水定容至1000mL，pH6.7-7.0；所述诱导培养基配方为：1g Glucose，7.808gMES，1.45g KH2PO4，0.5gNH4NO3，0.6g MgSO4·7H2O，0.01g CaCl2，0.3g NaCl，0.5g(NH4)SO4，HCl调pH值到5.6，双蒸水定容至1000mL。
6.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法，其特征在于：所述Z-buffer中含有以下成分CuSO4*5H2O，ZnSO4*7H2O，MnSO4*H2O，H3BO3和NaMbO4*2H2O各0.01％。
7.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法，其特征在于步骤<3>按以下操作进行：分别取步骤<1>中茭白黑粉菌孢子悬浮液和步骤<2>中农杆菌培养液各100μL，混合后涂板于含AS的覆盖有纤维素滤膜的IM固体培养基上，24℃下共培养48h-72h；转移纤维素滤膜至含有潮霉素B和头孢噻肟钠的YePSA，28℃下培养5-8d；将长出的单菌落转化子用牙签挑到含有潮霉素B和头孢噻肟钠的YePSA上进行二次筛选；第二次筛选获得的抗潮霉素B的茭白黑粉菌即为转化子。
8.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的茭白黑粉菌的遗传转化方法，其特征在于：所述IM固体培养基由每升诱导培养基加25克琼脂构成。
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