JPS62501885A - ベクタ−による菌類の形質転換方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ベクターによる菌類の形質転換方法 この発明はチゴミセテスＨＡ　（ｃｌａｓｓ　ＺＹｇＯｍｙＣｅｔｅＳ）に属す る菌類を、組換えＤＮＡＶｉ術によって得られた粗換え発現ベクターで形質転換 する方法に関する。

（Ｊとんどの組換えＤＮＡの研究はエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ａ　ｃｏｌｉ）のような細菌について行われてきた。

それ故、この基′ｒＸ！研究によって得られた知識を産業上の利用分野に移そう とする努力はほとんどが、エシェリヒア・コリ、もしくはバチルス・ズブチリス （Ｅ３ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）のような伯の細菌、ある場合はサツ カロミセス・セレごシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）が代表的なものである酵母類に発現される遺伝子産物を工業的に生産しようと する試みに集中していた。しかしこれらの生物の使用にはいくつかの欠点がある 。というのは基本的に、これらの生物中に真核遺伝子を発現させたり細胞中にベ クタープラスミドを保持させることが困難なこと、および／または発現された遺 伝子産物を培養物から回収するのに問題があるからである。

ここにおいて、ある種の菌類、特にチゴミセテス綱に属すフィラメント状菌類が 前記問題点の一つ以上を解決するのに寄与するある種の価値ある性質を有するこ とが見出されたのである。

Ａ、チゴミセテス綱に属するいくつかの種、特にムコール（Ｍｕｃｏｒ）　ｒｆ Ａに属する種の菌類は、各種チーズの生産時に牛乳凝固剤として用いられる蛋白 分解酵素を主として生産するのに産業に永年利用されてきた。それ故これらの生 物を液内」８養法もしくは半固体培地上で培養する人聞生産法は、培養物を培養 する栄養培地の組成のようなＲ適培養条件についてよく知られている。

Ｂ、産業生産に用いられるチゴミセテス綱の菌類は非病原性であり、それ故に環 境災害を起こさない。

Ｃ１上記蛋白分解酵素類のような、少なくともいくつかの産物が、生物によって 培８％中に放出されるということはよく知られている。菌類がこれら蛋白類を放 出する機能を種々のしかたで利用することによって、挿入された遺伝子の遺伝子 産物を細胞外で生産させ、産物の回収を著しく容易にして最終製品のコストを下 げることができると考えられる。

Ｄ６ある種の遺伝子（これらの菌類もしくは他の菌類からの）は、ＤＮＡの塩基 配列中にイントロンが、または別の転写、メツセンジャーＲＮＡプロセッシング （例えばエキソン・スプライシング）または翻訳の各信号がおそらく存在するで あろうから、イー・コリのような細菌類もしくはサツカロミセス・セレビシアの ような酵母類に、発現されないということは知られている。前記の遺伝子は、ム コール種のごときチゴミセテス綱の菌類に挿入されると一層容易に発現されるか もしれないと考えられる。また前記理由もしくはその外の理由で細菌もしくは酵 母に発現できないかもしくは発現するのがむずかしいある種の真核遺伝子はチゴ ミセテス菌類に一層容易に発現できるかもしれないと予測される。

チゴミセテス種の菌類の形質転換、すなわち選択された遺伝子をプラスミドベク ターによって宿主生物に直接挿入することは、従来できなかったのである。チゴ ミセテス種の菌類はその性サイクルを利用するのが困難なので、組換えの研究に よって遺伝子を十分に分析することさえむずかしかったのである。

（＋）と（−）との菌株を交配しても必ずしも接合胞子を形成せず、いくつかの 種は、生産数が低く、他の種ではその発生が不完全のままである（Ｍ、　Ａ、Ａ 、　３ｃｈｉｐｐｅｒ、５ｔｕｄｉｅｓ　ｉｎＭＹＣｏｌｏｇｙ、１７，１９７ ８．１−５２参照）。その上、実験苗条件下での接合胞子の発芽に成功すること はまれであり、かなりの期間休眠状態が先行する（Ｗ、　Ｇａｕｇｅｒ、Ｍｙｃ ｏｌｏｏｉａ　５７，１９６５．ＤＤ　、６３４−６４１参照）。

この発明は、遺伝子物質をチゴミセテス網に屈する宿主生物に導入できる方法を 提供することによって、これらの困難を克服したのである。

かくして、この発明はチゴミセテス網の菌類の形質転換法に関するものであり、 この方法によって、チゴミセテス綱の菌類の胞子のう胞子（ｓｐｏｒａｎｇ　１ ｏｓｐｏｒｅ　）もしくはジャームリング（ｇｅｒｍｌｉｒ＋ｇ）が、菌類棟内 で複製される組換え発現ベクターで形質転換される。

この明ｉｔにおいて、「胞子のう胞子」という用詔は、チゴミセテス種の増殖型 無性胞子（ｖｅｏｅｔａｔｉｖｅ、ａｓｅｘｕａｌ　５ｐｏｒｅｓ　）胞子のう 胞子とジャームリングは意外にも以下に詳述するように適切に処理することによ って、外部からの遺伝子物質を受入れることができる状態になしうろことが見出 されたのである。

このことは、この発明の方法によれば、組換え発現ベクターの使用を含む、組換 えＤＮＡ技術に通常用いられる形質転換法によって、チゴミセテス綱の菌類内に 特定の遺伝子を直接導入してクローニングを行うことが可能になったことを意味 する。

形質転換に用いられる菌類としては、ムコール屈の菌類が従来産業用に広く用い られてきたので好ましいものである。それ故、これらの菌類を大口生産で培養す る際に適用すべき条件はよく知られている。形質転換用に選択されたムコール菌 株はムコール、シルシネロイデス（Ｍ、　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）　、 ムコール。

ラセモスス（Ｍ、　ｒａｃｅｍｏｓｕｓ　）もしくはムコール、ローキシイ（Ｍ 、　ｒｏｕｘｉｉ）のような中温好性ムコール種、またはムコール。

ミニヘイ（Ｍ、　ｍ１ｅｈｅｉ）もしくはムコール、ブシルス（Ｍ。

ｐｕｓＮｌｕｓ）のような好熱性ムコール種であってもよい。

菌類の原形質体を形成させて形質転換する際の基本的な難点の一つは、１以上の 溶解酵素で消化することによって細胞畢を除去する必要があるということである 。例えば、ムコールの増殖性胞子（胞子のう胞子）が、その細胞壁が溶解酵素に よる消化に対する抵抗性が著しく高いので、原形質体源としてあまり適切なもの ではないかもしれないということは知られていた。

メラニンは細胞壁溶解酵素の公知の阻害剤であるから、高含有ｍのメラニン（乾 燥物の１０１ω％）が前記抵抗性に関連している（Ａ、　Ｔ、　Ｂｕｌｌ、Ａｒ ｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、１３７，１９７０．第３４５〜３５ ６頁）。しかし、発芽中の胞子のう胞子を１以上の適切な溶解酵素を用いて特定 の発育段階で処理し、得られた原型置体を適当なベクターで形質転換し、次いで 細胞壁を再生さゼることによって、形質転換を行う方法が、この発明によって開 光されたのである。

この方法によって発芽中の胞子のう胞子を処理できるようになったのは、次のこ とが見出されたから゛である。すなわち、発芽中に、ｊｌｉ！殖性ｎｌ　（ｖｅ ｇｃｔａｔｉｖｅ　ｗａｌｌ　）が胞子のう胞子の壁の下に新しく（デノボに） 形成され、その後、生殖細胞のチューブｌ　（（ｌｅｒｒＡｔｕｂｅ　ｗａｌｌ ）になることが見出されたのである。胞子と増殖性壁との連続性が欠如している のは、後者にはメラニンが含有されていないことを含めて両者の組成が著しく異 なることが関係している。代りに、キチンとキトサンが主成分となっていたので ある。例えば、一つのムコール様のムコール、ローキシイについては、キチンと キトサンとがそれぞれ菌糸細胞壁（ｈｙｐｈａｌ　ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ）の９． ４％と３２．７％を構成している。さらにこの細胞壁を分解するのに、キトサナ ーゼ（ｃｈｉ℃ｏｓａｎａｓｅ　）のような溶解酵素を用いうろことが見出され た。キトサナーゼ類はまだ市販されていないが、種々の微生物によって細胞外酵 素として製造されている。いくつかのこれら微生物の培養液もしくはこれを精製 して得られたキトサナーゼは、例えばムコールの菌糸細胞壁を消化でき、ムコー ル属や関連のフィコミセス属（ｇｅｎｕｓ　ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ　）の菌類か ら原形質体を作製することができる。市販されているキチナーゼも使えるが、こ れはキトサンを加水分解できないかもしくはごく一部しか加水分解できないので 、溶解酵素として単独では使えない。

この発明に有用であることが見出された一つの培養液は、任意に濃縮されたもの であってもよいが、ストレプトミセス種６号（３ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ＳＤ 、　Ｎｏ、６　＞　（ストレプトデーム（ｓｔｒｅｐｔｏｚｙｍｅ　）とも呼称 される〕の培養液であり、これは未ｙｉｌのキトサナーゼを含有しているが他の 溶解酵素も含有しているかもしれない。またそれ自身溶解効果をほとんどもたな いか全くもたないがキトサナーゼの効力を増大する酵素を添加することができる 。ある種の市販のポリサッカラーゼ類をキトサナーゼもしくは未精製のストレプ トデームと併せて用いると、これらの市販酵素はいずれもそれ自体明らかな溶解 効力をもたない【ブれども、適切な溶解酵素を低濃度で併用しても原形質体の収 量が増大することが実験で見′Ｌされた。

細胞壁を消化するのに用いられる溶解酵素の濃度が増大すると、原形質体の形成 速度と得られる原形質体のＲ終収量が増大することが見出された。例えばストレ プトデームの異なるバッチを比較すると、各バッチのムコール様の原形質体を製 造する効力は、存在する全キトサナーゼ活性に比例する。したがって比キトサナ ーゼ活性が２．３のバッチｏ、ｓｍＯ／７！は、比キトサナーゼ活性１．２のバ ッチ１．０ｍＱ／Ｍｌと同じ結果を与える。

また、胞子のう胞子の菌糸が成長し長さが大きくなるにつれて、わずかであるが 、溶解酵素に対する抵抗性を再び獲得するようであり、そのため発芽中の胞子の う胞子からの原形質体の製造は、発芽の段階にある程度左右されることが実験で 見出さ〜５０ｆｉｙになった時に、得られる原形質体の収量が最高になる傾向が ある。この大きざより小さいと、培養中の菌糸の先端の細胞壁の消化が起こり、 放出される物質の足が減少し、その結果形成される原形質体の数が減少する。生 殖細胞チューブ長が約６０）ａを越えると、溶解酵素製剤に対し明らかに抵抗性 の菌糸構造物の聞が増加して、原形質体の収量は減少し、また得られた原形質体 の均一性が減少する〔大きさ、屈折性および見掛けの膜）完全性（ａｐｐａｒｅ ｎｔ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　）によって立夏される〕。それ 故、形態学的に均一な原形質体を高収和で得るために、溶解酵素で処理されるジ ↑−ムリングは、発芽の程度（すなわち生殖細胞チューブ長）について、比較的 均一であるのが好ましい。同調発芽（ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ　ｇｅｒｍｉｎａ ｔｉｏｎ　）は、熱シヨツク法のような種々の処理法でフィコミセス属（ｐ　ｈ ｙｃｏｍｙｃｅＳ　）のものに導入することができ、また伯のリゾプスｌ　（Ｒ ｈｉｚｏｐｕｓ　）のものに１よ、同調発芽を、プロリン含有のｐＨ６，５のリ ン酸塩綴衝液によって誘導することができる。しかし、ムコール局の菌類に対す る具体的な誘導法はまだ開発されていないけれども、例えば、凍結胞子もしくは 最小培地を用いる代わりに新たに収穫した胞子のう胞子を完全培地中に発芽させ 、次いで問題の種の最適成育温度近傍の温度で培養することによって（後者の効 果は特に好熱性の種について観察される）、ムコール属の菌類に一層同調的な発 芽をさせることができるということを示している。

原形質休作製時に浸透安定剤（Ｏ３ｍＯｔｉＣ５ｔａｂｉｌｉｚｅｒ）を用いる 必要のある場合がいくつかある。使用される浸透安定剤は、細胞壁の分解をまっ たく起こさず、溶解酵素製剤の活性を阻害しないことが重要である。ソルビトー ルやマンニトールのような糖アルコールの溶液は、最も有効な浸透安定剤であろ う。一方塩ノ溶液、例えばＫ（１、ＭＱＣＱｔ、（ＮＨ４）２　ＳＯ−もしくは ＭｐＳＯ４の溶液を使用すると、原形質体は全く生成しないようである。ソルビ トールを浸透安定剤として使って、ムコールのジャームリングから原形質体を作 ［Ｔる際、その最適濃度は０．３５〜０．５Ｍであることが分かった。０．６５ 　Ｍ以上の濃度では細胞壁の分解は全く認められず、また０、３Ｍ以下の濃度で は、溶解酵素の作用は、原形質体の生成よりもむしろ著しい細胞溶＠　（ｃｅｌ ｌ　１ｙｓｉｓ）を伴なう傾向がある。

使用される溶解酵素の活性を阻害しないように、培養に用いられる培地のｐＨは ４．５〜７．５の範囲が好ましい。

形質転換後の細胞壁の再生は、適切な緩衝剤、もしくはツルどトールのような適 切な浸透安定剤含有の増殖培地中で原形質体を２度洗浄し、次いで浸透安定剤含 有の固形寒天培地上に原形質体をプレイドすることによって行うことができる。

原形黄体懸濁液のプレイティング（ｐｌａｔｉｎｇ）は、原形質体を直接、固形 寒天培地の表面に塗布するか、または好ましくは、溶融状態の、浸透安定剤含有 の寒天上塗層に、原形質体を混合しておいて、これを固形寒天培地上ｔこそそぐ ことによって行うことができる。原形質体を寒天に埋封すると、高い再現性と頻 度で細胞壁が再生される。

この発明の形質転換法には、形質転換される細胞の選択法も株としては、適切な 栄養要求変異株（すなわち、野生型菌株には不要の１以上の成長因子を必要とす る菌株）またはある種の抗生物質に感受性の変異株であって、形質転換される際 、逆選択性（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｂｌｅ）原栄養株の遺伝子もしく は抗生物質耐性の遺伝子を有する発現ベクターで相補される変異株が好都合であ る。

栄養要求変異株が、この発明の方法に特に有用であることが分かった。かような 変異株は、紫外線照射法、電離性放躬線照割汰もしくは化学的突然変成誘発物質 での処理のような通常の突然変異法で作ることができる。次いで所望の栄養要求 変異株が、突然変異誘発培養物に住き残っている原栄養菌株を選択的に除去する ことによって単Ｍされる。かような単離法のほとんどのものは、代謝的【こ活性 な細胞が、発芽していない胞子のような不活性な細胞よりも抗生物質や天然の試 薬に対し一層感受性であるという事実に基づいている。それ故、原栄養菌株が優 先的に殺されるのは、最小培地、すなわち栄養要求変異株の成育に必要な成長因 子を含有しない培地で培養される突然変異誘発培養物が逆選択性試薬にさらされ るからである。伯の方法としては、発芽していない胞子に対して発芽している胞 子の分離凍結殺減法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｒｒｅｅＺｅ　−ｋｉｌｌｉ ｎｇ　ｏｆ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｖｅｒｓｕｓ　ｎｏｎ　−ｇｅｒｍｉｎａ ｔｉｎｇ　５ｐｏｒｅｓ）または発芽していない栄養要求変異株の胞子に対し発 芽している原栄養菌株の胞子の分離熱感受性法（ｄｅｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｈ ｅａｔ　５ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　）が挙げられる。単離法のなかで餞も有利な のは、代謝的に活性な細胞の細胞壁中のステロール類との相互作用によって透過 性に相当の変化を起こさせる抗生物質を使用する方法であることが分かった。

特に有利な抗生物質はＮ−グリコシルーポリファンジン（Ｎ−ｇｆｃｏｓｙｌ　 −ｐｏｌｉｆｕｎｇｉｎ、　ＮＧＰ）のようなポリエン抗生物質でありこのＮＧ Ｐはさらに、ナイスタチンのような他のほとんどのポリエン抗生物質と異なり水 溶性であるという利点を有する。

上記の濃縮法を利用すれば、続いて抗生物質で処理すると、得られる変異株の頻 度がざらに増大することになると考えられる。逆選択のザイクルをかように付は 加えることは、変異株の、特別にまれな表現型が必要な際に得策である。ざらに 栄養要求変異株は、抗生物質処理に生残ったコロニイを培養し、特定の成長因子 を含有しない培地上では成育しないがこれらの成長因子を含有する培地では成長 するそれらのコロニイを選択することによって、選択することができる。

ムコールは、他の生物から耐性を付与する遺伝子が得られる抗生物質の大ていの ものに低い固有の感受性を示すから、特にムコール種に関する限り、栄養要求変 異株の使用が好ましいけれども、抗生物質感受性の変異株を用いることもできる 。両方の場合について、菌類細胞を形質転換するのに用いられる発現ベクターは 、その宿主生物のこの性質を相？ｌＩＩする遺伝子、すなわちその菌株が感受性 を有する抗生物質に対する耐性を伝達する遺伝子か、または前記栄養要求変異株 に、これが野生型の栄ｆｆ要求性にもどるよう、原栄養性を伝達する遺伝子を有 するべきである。

この発明において、宿主細胞を形質転換するのに用いられる発現ベクターは、自 己複製性（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　）であってもよく、すなわち染 色体外物として存在して複製は染色体の複製に対し独立していてもよく（すなわ ちプラスミド）、またはこのベクターは、挿入によって、例えば相同組換え法（ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）　（ベクターの少なくと も一部が（相同的に）染色体の一部に対応して形成されて、ベクターの一部が染 色体に゛結合する（ｊｏｉｎｉｒ＋ｇ　）　”　）によって、一つ以上の宿主染 色体に安定に組みこまれ、これら染色体と同時に複製されてもよい。このベクタ ーが自律的に複製するプラスミドの場合、このプラスミドは、それがｍ’ｍ中に 保持されるしかたで複製されるように宿主細胞中で機能できる複製源を有してい る。

ある場合には、このベクターとしては、チゴミセテス綱の菌類の種、イー・コリ および／またはサツカロミセス・セレどシアのようなり！ｆ母中で複製されうる シャトルベクターが好ましい。

シャトルベクターは、イー・コリもしくは酵母のベクターにすでにクローンされ た遺伝子の転移、新遺伝子もしくは付加遺伝子を含むベクターの組立て、増殖お よび分析を容易にするので有利である。かようなベクターの具体例は、この発明 によって製造されるρＭＣＬ１３０２であり、下記実施例８においてムコール・ シルシネロイデス、ロイシン栄養要求株Ｒ７Ｂに導入された。ｐＭｃＬ１３０２ を有するこの菌株はＣｅｎｔｒａａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅ ｌｋｕｌｔｗｒｅｎに寄託番号第ＣＢＳ　７５４．８４号で奇託されている。も う一つのベクターは、類似の方法で作られるが、同じムコール菌株に導入された ｐＭｃＬ１６４７である。ｐＭＣＬ１６４７を有するムコール・シルシネロイデ スＲ７Ｂ菌株も寄託番号第ＣＢＳ　７５５．８４号でＣｅｎｔｒａａｌ　Ｂｕｒ ｅａｕ　ｖｏｏｒＳ　ｃｈｉｍｍｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎに奇託されている。

伯の態様としてこの発明は、チゴミセテス綱の複数の菌類を形質転換するための 表現ベクターに関し、このベクターは、チゴミセテスのＤＮＡのＤＮＡ塩基配列 、所望の遺伝子産物をコードする（所望の遺伝子産物を合成する遺伝情報を指定 する）ＤＮＡ塩基配列、およびこのベクターで形質転換される細胞を同定および ／または選択するためのマーカーを有し、チゴミセテス綱の菌類中で複製される 。ここで゛’ＤＮＡ塩基配列塩基配列相詔は、一つ以上の構造遺伝子と、適当な 転写および翻訳の出発および停止の信号と、プロモーターと、通常の制限部位な どを含む塩基対核酸の配列を意味する。上記のように、選択マーカーは、抗生物 質に感受性の菌類の菌株に抗生物質処理を伝達する遺伝子、または栄養要求変異 株に原栄養性を伝達する遺伝子であってもよい。後者の場合、その遺伝子は次の ものであってもよい。すなわち、その遺伝子が存在しない場合もしくは改変され た形態の場合に、その生物の増殖培地に、単一の特定のアミノ酸もしくはいくつ かのアミノ酸、一つ以上のヌクレオチドまたはビタミン類を必要とさせる遺伝子 であり、この遺伝子が宿主生物にベクターを導入することによって相補されると き、問題の単一もしくは複数の複合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ　）はもはや増殖する 必要はない。

さらにこの発明は、チゴミセテス綱の単一の菌類を形質転換するための発現ベク ターに関する。このベクターは、チゴミセテスのＤＮＡの塩基配列、このベクタ ーで形質転換されるｌ１ｌｌｌｌａを同定および／または選択するためのマーカ ー、および所望の遺伝子産物をコードするＤＮＡ塩基配列を挿入するための制限 座位の少なくともひとつからなる。このベクターはチゴミセテス綱の菌類中で複 製される。その制限座位は、所望の遺伝子産物をコードするＤＮＡ塩基配列を挿 入しても、ベクターの再生みよび／またはベクターが転移されるべき宿主生物の 選択を閉害しない部位に置かれるのが好ましく、すなわちその制限座位は複製源 と選択マーカーをコードするＤＮＡ塩基配列の外側に置かれるべぎである。これ らの要件を満足するベクターの例は、ｐＭｃＬ１３０２とＩ）　Ｍ　ＣＬ　１６ ４７Ｔ−アリ、ｉ記の実ｍ例に記載され第２図に示されている。

またこの発明は、ヂゴミセテス綱のの菌類中で複製されるプラスミドに、そのベ クターで形質転換される細胞を同定および／または選択するためのマーカーとし てのＤＮＡ塩基配列を挿入し、所望の遺伝子産物をコードするＤＮＡ塩Ｍ配列を 、それが複製および／または選択を１１１１１害しない位置に挿入するための少 なくとも一つの制限座位を与え、次いでこの座位に所望の遺伝子産物のためのＤ ＮＡ遺伝子配列を挿入することからなる、前記発現ベクターの製造法に関する。

簡便な制限座位が得られない場合は、１ｌｉｌｌ　ＩＵ座位は適切な座位に挿入 されたリンカ−の形態で与えることができる。この発明の発現ベクターを作るの に用いられる手順は、組換えＤＮＡ技杯ｉの分野でこれを目的として通常採用さ れる手順であってもよい。

加うるにこの発明は、生物中に複製される絹換え発現ベクターを有するヂゴミセ テス綱の菌類に関プる。遺伝的形質転換法、すなわち、単頭された遺伝子を単離 されたＤＮＡの形態で組入れる方法は、従来、アスコミセテス（Δｓｃｏｍｙｃ ｅｔｅｓ）　ｗＪに属するフィラメント状の菌類だＩプに達成されているにすぎ ない。すなわちニューロスポーラ・クラッサ（ＮｅＷｒＯ３ｐＯｒａ　ｃｒａｓ ｓａ）（Ｃａｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃｏｄ、ｓｃｉ、 　ＵＳＡ７６．１９７９．ｐ。

５２５９）　、ボドスポーラ・アンセリナ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ　ａｎｓｅｒｉ ｎａ　）（Ｓｔａｈｌ　ｅｔ　ａｔ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、３ｃｉ 、７０，１９８２．ｐ、３６４１　）およびアスペルギルス・ニデユランス（Ａ 　ｓｐｅｒｇ　ｉ＋　１ｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ　）　（３ａｌｌａｎｃｅ　ｅｔ 　ａｌ。３　ｉｏｃｈｅｍ、　３１ｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、Ｈ２，１９８３，ｐ、２８４）である。

Ｒ後にこの発明は、チゴミセテス綱の菌類の胞子のう胞子もしくはヂャームリン グがその菌類の種中で複製されかつ所望の遺伝子産物をコードするＤＮＡ塩基配 列を有する組換えＲ，坦ベクターで形質転換され、形質転換された胞子のう胞子 もしくはヂャームリングが適切な培養基中で培養されて前記ＤＮＡ塩基配列を発 現し、次いで得られた産物を収穫する、ヂゴミセテス綱の菌類で遺伝子産物を製 造する方法に関する。

その形質転換された胞子のう胞子もしくはヂャームリングは適切な培養基で培養 されそのＤＮＡ塩基配列を発現する。この培養は、ヂゴミセテス種、特にムコー ル種の菌類を大１生産するための公知の方法、例えばに、　Ａｕｎ５ｔｒｕｐ、 　”ｐｒｏｔｅｒｎａｓｅｓ”　。

ｉｎ　Ａ、　Ｉ−ｔ、　Ｒｏｓｅ、ｅｄ、、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｎｚｙｍｅ ｓ　ａｎｄ３１ｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｓ　：　Ｅ　ｃｏｎｏｍｉｃ　ｌｙｌ　 ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏ１５Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　 ”１’ｏｒｋ、１９８０．ｐｐ、５０−１１４に記載のような技術で、問題の菌 類の種にとって最適なことが知られている通常の栄養培地を用いて、適切に行う ことができる。例えば、ムコール種の菌類は、液内培養法もしくは半固形培地上 で培養することができる。液内培養法については、栄養培地は比較的高潤度であ り（乾燥物含有量的１０〜１５％）、蛋白の含有ｍが高いのが好ましい。培地は 、澱粉、澱粉誘導体もしくは糖のような炭水化物を、好ましくは炭水化物濃度が 常に低く保持されるように〔いわゆる供給−バッチ法（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ　ｐ ｒｏｃｅｓｓ　）　）、地（例えば小麦ふすま）は乾燥物含有量的５０％まで湿 してもよく、所望の産物を産出する生物の胞子を接種し次いで通気下で放置され る。増殖条件は、菌類の最適増９ｒＪ温度と無ＦＭ塩もしくは痕跡の無機物質の ようなある種の特別な栄養物とを適用することが含まれる。

得られる遺伝子産物の収穫は、産出される産物のタイプ、この産物の最終用途、 および最も重要なのは、産物が培地に放出されるのかいなかに左右されるが、用 いられる製造方法に最も好都合なしかたの通常の方法によって行なうことができ る。通常、培地中に溶解した形態で見出される放出産物を処理する場合、固体（ 培地成分の残漬や宿主生物を含有）を濾過や遠心分前によって除去する（例えば 、Ｋ、　Ａｕｎ５ｔｒｕｐ、　”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ。

ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ　Ｏｆ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ ｕｌａｒ　ＥｎＺＹｍｅＳ”　。

ｉｎ　１．　Ｂ、　Ｗｉｎｇａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、（ｅｄｓ、＞　Ａｐｐｌｉｅ ｄ３　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　３　ｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖ ｏｌ、２．　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７９．ｐ ｐ、２８−６９参照）。

遺伝子産物の生産に用いられる菌類がムコール属の菌類の場合、ムコール種の培 養に最適の増殖条件には、大豆蛋白、カゼイン、ホエイ粉末、醸造用酵母または 酵母エキスのような蛋白栄養素：例えばとうもろこしもしくは大麦のような穀類 をひいたもの、例えばとうもろこし澱粉もしくはじゃがいも澱粉のような澱粉、 １２粉の氷解物、またはグルコース、ラクトースもしくは蔗糖のような糖類のご とき炭水化物含有栄養素ニリン酸塩、マグネシウム塩、炭ｖｉ塩、１ｉｉＩｉ酸 塩、アンモニウム塩または硝酸塩のような塩類；および亜鉛、鉄もしくは銅のよ うな無機物の痕跡の存在が含まれる。培地の特定の組成は、ある程度、産出され る産物に左右される。例えば酵素類の産出に適切な特定の培地は、例えば米国特 許第３，９８８，２０７号に２駿されている。生物の増殖に影響する他の因子と して増殖温度が挙げられる。

上記のように、チゴミセテス綱、特にムコール属の菌類の価値ある性質の一つは 、いくらかの代謝物や酵素のような産物のいくつかを、例えば酸化プロテアーゼ や他の′ｆｉ！ｆ累の場合のように、培養基に放出することができるということ である。この発明の好ましい実施態様において、この方法が利用され、その菌類 の細胞に挿入されたＤＮＡ塩基配列の産物は、これら生物の自然の経路によって 培地に放出され、確立された工業的手順で培地から回収される。

かくして、産物を放出させるため、発現ベクターを、宿主染色体に、その遺伝子 産物が生物によって培養基中に放出されることが知られている遺伝子の部位に組 込むことが考えられる。

この組込みは、例えば相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａ ｔｉｏｎ）によって行うことができ、導入された遺伝子の発現が、遺伝子産物を 培養基に最終的に放出させる遺伝を含めて、前記導入遺伝子が取って代わった内 在遺伝子の信号を利用するようなしがたで行われる。

この発明の方法の有利な特徴の一つは、宿主細胞によって培地中に放出される産 物が、宿主生物と培地成分残漬とを単に濾過もしくは遠心分離で除去することに よって、さらに精製を追加する必要なしに、回収できるということにある。この ことは、もちろん問題の産物のコストを大きく低減する。

しかし、高純度を要求する特別の応用例については、必要に応じて産物をさらに 種々の精製法、例えばそれ自体公知のしかたの濾過法、沈澱法（通常、アセトン もしくはある種のアルコール類のような水溶性有機溶媒または硫酸アンモニウム もしくは硫酸ナトリウムのような無機塩を用いる）に付しても、←い。

追加の精製が必要な際は、部分的に精製された産物を再溶解し、ゲル濾過法もし くはイオン変換クロマトグラフィのような種々の公知のアフィニティークロマト グラフィに付してもよい。この精製法は、高速液体クロマ１−グラフィーを用い ることによって加速することができる。情裂の方法と程度は産出される産物に左 右される。したがって産物が産業に用いるものであれば、宿主生物を濾別するこ とによる基本的な回収処理以上に追加して精製を行う必要はない。

この発明の方法によってチゴミセテス種の菌類から産出される遺伝子産物は、組 換えＤＮＡ技術によって簡便に産出されるいずれの産物であってもよい。したが ってこの産物としては、ポリペプチド蛋白もしくはそのフラグメント、酵素もし くは培Ｍｕ中の化合物と酵素との反応による非常蛋白の産物、またはホルモン類 や核酸類のような低分子Ｍの産物が挙げられる。特に興味深い産物は、細菌や酵 母のような他の産物への発現もしくはこれら生物からの放出が非常に困難なこと が知られているかもしくは予測される産物である。かよう産物には、チゴミセテ ス綱の菌類の特にムコール種よりも十分にその工業的醗酵法が開発されていない 他の属の菌類からの遺伝子またはより高い真核細胞の遺伝子からの産物が含まれ る。興味深い遺伝子産物はｌＩ？Ｘ’類であり、リパーゼ、アミログルコシダー ゼ、α−アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、セルラーゼまたはキモシンのよう な蛋白分解酵素が含まれる。これらの遺伝子産物のいくつかは、ある種のチゴミ セテス種（例えばムコール種）の菌類によって産出することができるが、不充分 な垣でしか産出されないとか、または過剰な耐熱性もしくは不耐熱性のごとき望 ましくない性質を有する場合があり、その結果、産業上有用とするために改質を 要するときがある。そして、その遺伝子産物に異なる特性を、遺伝的改変によっ て与えることが望ましい。改変された遺伝子産物のためのＤＮＡ塩基配列は、ベ クターに挿入され、次いで宿主生物中に導入され発現される。例えばその塩基配 列が、この発明の方法によって、自然産物のための固有のＤＮＡ塩基配列に取っ て替るしかたで行われる。

チーズ生産時に牛乳凝固酵素として広く用いられるキモシン（小生レンネット） をコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリの細胞内に導入発現され（Ｎｉｓｈ ｉｍｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　２９゜１９８４、ｐ、４１　；　Ｅｍｔ ａｇｃ　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、３ｃｉ、　ＵＳＡ　 ８０，１９８３．ｐｐ、３６７１〜３６７５参照）、また酵母のサツカロミセス ・セレビシアの細胞内に導入発現された（Ｍｅｌｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｇｅｎｅ　２４，１９８３，０１　：　Ｇｏｔｒ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ　 ２７，１９８４．０３５　）ことは留意されるへきである。発現がこれらの生物 内に得られた際でも、産物を得るために細胞を粉砕する必要があり、その後細胞 の断片は除去しなければならない。かような精製工程は、前記のように遺伝子産 物が放出されるようなしかたでチゴミセテス綱の種に、同じ遺伝子を導入すれば 、必要でない。

チゴミセテスの胞子のう胞子もしくはヂャームリングをこの発明の発現ベクター で形質転換することによって、ヂゴミセテス綱の菌類から遺伝子産物を製造する この発明の方法は、フィラメント状菌類について用いられる公知の遺伝子形質転 換とは、次のように区別される。

この発明の方法によれば、野生型菌株のグツミック・ライブラリィ（ｇｅｎｏｍ ｉｃ　１ｉｂｒａｒｙ　）がらの挿入物を含有するプラスミドＤＮＡで、受取り 菌株（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ　５ｔｒａｉｎ）中（Ｄ５Ｖｒ切な突然変異体を相補 することによって、遺伝子のクローニングを直接行うことができる。そのプラス ミドは受取り菌株中で発現される仙の遺伝子をもっていてもよい。この方法は、 イー・コリもしくはニス・セレどシア中の突然変異株を相補するためにグネミッ ク・ライブラリィをスクリーン（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　）するような間接的な手 段を用いるところの、特定遺伝子のクローニング用のフラメント状菌類について 用いられる公知の方法とは異なっている。チゴミセテス汝伝子は組み換えＤＮＡ 法に一般に用いられる上記二つの宿主中では機能上発現することができないので 、この公知の方法はチゴミセテス種には適用できない。メッセンヂャーＲＮＡか らの捕捉ＤＮＡを合成法とアスコミセテス菌類のアスペルギルス・ニジュランス およびニューロスポラ・クラップについて用いられる合成オリゴヌクレオチドプ ローブへのハイブリッド形成法との生体外での技術は、チゴミセテス菌類につい ても適用できるかもしれないが、この発明の方法よりもやっかいである。この発 明は実際に、チゴミセテス綱の細菌の遺伝子形質転換の最初の例であると信じる ものである。菌類に導入される発現ベクターは前記のベクター類のうちの一つで あってもよく、またその菌類としては、前記栄養要求性変異株のようなムコール 属の菌類が好ましい。

所望の遺伝子産物をコードするＤＮＡ塩基配列の発現ベクターへの挿入は、下記 のように行うことができる。

発現ベクターを１以上の制限酵素で消化してその環状分子をひとつの部位で開環 する。また挿入すべきＤＮＡ塩基配列を、１つ以上の制限酵素で消化し、酵素の Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用イて直接に（相補的付着端の場合）、またはＣＩＮＡ ポリメラーゼ１（フレノウフラグメント）もしくはＳ１ヌクレアーゼで処理して プラント末端をつくった後に、発現ベクターの両端に連結させることのできる端 部を形成させる。所望の遺伝子産物をコードするＤＮＡＷ基配列全配列する座位 は、ムコール菌類中で鵬能することが知られているプロモーター・シーケンスに 続くように選択される。、後省の例は、ムコール・シルシネロイの２．１ｋｂＡ Ｖ８１−　Ｋ　Ｉｌｎ　Ｉフラグメントに見出されることが知られている。

さらにこの発明を図面によって説明する。

第１図はこの発明の発現ベクターを作るために用いられる親プラスミドのＹＲｐ １７のｔｌＪ限地図を示す。第１図において、点をうった領域はイー・コリ由来 のＤＮＡを意味し黒く塗った領Ｉｇ　（ｆｉｌｌｅｄ−ｉｎ　ａｒｅａｓ　）は ニスーセレどシア由来のＤＮＡを意味する。矢印は転写の方向である。

第２図はこの発明の二つの発現ベクター、ＩＩＭ　ＣＬ　１３０２とＩ）Ｍ　Ｃ １１６４７の制限地図を示す（同スケールでは画いていない）。太線はＹＲｐ１ ７　ＤＮＡ　（ハツチをした領じはイー・コリ由来のＤＮＡを、黒く塗った領域 はニス・セルビシア由来のＤＮＡを意味する）および細線領域はムコールＤ　Ｎ 　Ａの挿入物を意味する。点線部は二つの挿入部門のホモロジー領域を意味する 。

第３図は、ｐＭ　ＣＬ　１３０２の誘導係であるｐＭＣＬＯＯ２とｐＭＣＬ　０ ０９の制限地図であり、ハツチをした領域はイー・コリＤＮＡを示し細線はムコ ールＤＮＡを意味する。

次いでこの発明を実施例によって説明する。

原料と方法 菌株類 ムコール・シルシネロイデス・エフ・ルシタニカス（Ｍｕｃｏｒｃｉｒｃｉｎｅ ｌｌｏｉｄｅｓ　ｒ、１ｕｓｉｔｏｎｉｃｕｓ　）　ＣＢＳ　２７７．４９　（ ムコール・ラセモスス（Ｍｕｃｏｒ　ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）　Ａ　Ｔ　Ｃ０１２ １６と同じ意味）。

Ｍｙｃｏｌｏｐｙ　１２，１９７６、ｐｏ、１−４０の研究課題；ムコール・ミ ニヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ　）　ＣＢＳ　３７０，６５゜Ｍｙｃｏｌｏ ｇｙ　１７，１９７７ｇ、ｐｐ、５３−７１の研究課題：ムコール・ラセモスス 第５０号、日本震藝化学会誌５５，１９８１゜ｐｐ、５６１−５７１　： ムＤ−ルーロウキシイ（ｔｖｌｕｃｏｒ　ｒｏｕｘｉｉ　）　ＣＢＳ　４１６， ７７゜Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　、Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　５８，１９６２， １１０．１０２−１１９　；ムｔ−ルー　プシルス　アイエムアイ（Ｍｕｃｏｒ 　ｐｕｓｉｌｌｕｓ　Ｉ　Ｍ　Ｉ　）９６２１１、Ａｐｌ）１．Ｍ　１ｃｒｏｂ ｉｏｌ、１６，１９６Ｂ、ｔ）ｐ、１７２７−１７３３　；エム−シルシネロイ デス１ｅｕ−２Ａは、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

１０５．１９７８．ｐｐ、７７−８１の記載と同様にして得た；ストレプトミセ ス−ニスビイ第６　Ｎ　（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ。

Ｎｏ、６　）　、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　＆　５ｅｒ０１．８４，１９ ６８．＋）ｌ）、１７３−１８２、およびＪ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、７２，１９７２．１１１）、２８１−２９０　；エシェリヒア・コリ　ＨＢ　 １０１．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、４１．ｐ４５９培地と培養条件 完全培地：ＹＰＧ（酵母エキス３（１，ペプトンｌ０ＣＩおよびグルコース２０ Ｑの蒸溜水（ＩＱ）溶液〕 最少培地：ＹＮＢ（アミノ酸類とｇＩＢアンモニウムとを含有しないディフコ（ ｔ）ｉｒｃｏ＞　・酵母窒素ベース０．５０と硫酸アンモニウム１．５９とグル タミンＭ　１．５ｇとの蒸溜水（１ｇ）溶液に、滅菌後グルコース１％、１μｇ ／ｌ！チアミンとナイアシンを添加〕 栄養要求株の培養用として、前記最少培地に、最終濃度１００μＱの種々のアミ ノ酸類もしくは２ｍｇ／ｘ１の濃度のカザミノ酸類を補充した。限定されたコロ エイを増９Ｎさせるために、培地は、滅菌後に１Ｍ塩酸を加えてｐＨ３，ｏｌ、 ：調整された。それ以外の場合、培地は上記と同様にしてｐ）１４．５に調整し た。固体培地は、ｐ＋＜が４．５で２０！＋／ｉｆの寒天を含有させた。ＰＨ３ ，０の培地の場合、寒天と他の培地成分それぞれの２倍の濃度の溶液を別々にオ ートクレーブに入れて処理し、塞大の酸による加水分解を回避した。

エム・シルシネロイデス、ラセモススおよびロウキシイの培養物は２８℃で培養 し、エム・ミニヘイおよびブシルスの培養物は４０℃で１８養した。

イー・コリは、必要に応じて５０μＱ／’Ｉ！のアンピシリンもしくは２５μｇ ／ｌ！のテトラサイクリンを含有するＬＢ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１，１９５ ５．ｐＤ、１９０−２０６）中３７℃で培養した。

化学試薬類 Ｎ−グリコシルーポリファンジンをドイツ国特許第２２３９８９１号に記載され ているのと同様にして作製した。キチンとキトサンは、カニの甲Ｕから製造した 実用的なグレードのものであった。制限酵素類、小生のアルカリ性ホスファター ゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼ■はペーリンガー ー？ンハイム社（Ｅ３ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）ドイツ国から 入手した。また次の酵素が用いられた。ノボチム２３４（Ｎｏｖｏｚｙｍ　２３ ４　；　トリコデル？−ハルチアナム（Ｔ　ｒ　ｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉ ａｎｕｍ）から裂ｊ告され、主としてα−１，３−グルカナーゼ活性を有し、デ ンマークのノボ・インダストリーズ・エイ／ニス（ＮＯＶＯｌ　ｎｄｕｓｔｒｉ ｅｓ　Ａ／Ｓ　＞から青た〕、ヘリカーゼ〔ルインダストリエ・ビオロジーク（ ＋−１ｎｄｌＪｓｔｒｉｅ１３　ｉｏ＋００ｉＱｔｌｅ　）　、フランス〕、ラ ミナリナーゼ（ｌａｍｉｎａｒｉｎａｓｅ、軟体動物からのβ−１，３−グルカ ナーゼ、カルビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　）米国）、ペニシリウム・エ メルソニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｕｅｒｓｏｎ？　）から単離されたβ−グ ルカナーゼ（ＢＤＨバイオケミカル社、英国）およびキチナーゼ〔シグマ社（Ｓ ｉｇｍａ）、活性３．０単位／　ｍ（１−’　）　。Ｒ’を素はすヘテ製造元が 記述している条件にしたがって用いた。ポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ　 ）　４０００Ｇ、ｔスイスノア／Ｌ、力・エイジ−（Ｆｌｕｋａ　ＡＧ）から入 手し、ヘパリン、ウシ血清アルブミン（特に脂肪酸を含有しないもの）、３−（ Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）およびＲＮアーゼＡはシグマ 社、米国から入手し、セファデックスＧｏｏ　（５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５０）は ファーマシア社、ス工−デンから入手し、またニドＤセルロース・フィルター（ ＢＡＢ５）は西独のシュライバー・アンド・シュニル社（３ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ 　＆　３ｃｈｕｅｌｌ）から、α３２Ｐ−ｄＡＴＰ（＞　６００Ｃｉ　／ｍｍｏ ｌ）はニュー・イングランド・ニュクリアー社（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕ ｃｌｅａｒ）米国から入手した。

ストレプトチーム（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｙｍｅ）の単離と分析ストレプトミセス− ニスビイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　３１）、）　Ｎｏ、６は、５ｋｕｊｉｎ ｓ　ｅｔ　ａｔ、、Ａｒｃｈ、３　ｉｏｃｈｅｍ、１３１ｏｐｈｙｓ、１１１， １９６５゜ｐｐ、３５８〜３６４による培地〔０，５％（Ｗ／ν）キチンと０． １％（Ｗ　／Ｖ　”）の再沈澱キトサン（１％酢酸にキトサンを溶解しＮａ　Ｏ Ｈで中和接水で充分洗浄）を炭素源として含有〕中で！瀉下７〜８日間培養した 。細胞を遠心分離（５０００ｘａ　、　３０分間）で除去し、上澄液を、４℃に おいてｌｉｉ！ｔＭアンモニウムで９５％飽和とし、撹拌しながら一夜放置した 。沈澱を５０００Ｘｇ　６０分間の遠心分動で集め０．０２Ｍリン酸ナトリウム の冷緩衝液（ＰＨ６，５）の最少ω中に再び懸濁させ、４℃で同じ緩衝液に対し て十分透析させた。遠心分動じて不溶物を除去し、得られた製剤を乾燥し、−２ ０℃で貯蔵した。Ａ　ｎａｌ、３　ｉｏｃｈｅｍ、７２，１９７６、ｐｐ、２４ ８〜２５４に記載されたのと同様にして、標準物としての瓜どりの卵アルブミン を用いるバイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）蛋白分析キットｌによって、蛋白を 測定１ノだ。キトサナーゼの活性はＪ。

Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌ　、１２４．１９７５．　ｐＯ，１５７４−１５８５に記 載されているのと同様にして測定した。キト勺ンを０．０５　Ｍマレイン酸に、 ２ｍ（１／ｉｆとなるように溶解し、水で２倍に希釈し、−をＫＯＩ−１で６． ０に調整した。３７５Ａを３０℃で１５分間予備培養した後、酵素含有０．０１ 　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）　＜　１２５４）を添加し、最終的 に０．５ｍＱ／１１のキトサン含有の５０ＯＡとする。ことによって反応を開始 させたａ３０℃で１５分後、ＩＭＫＯ８１０Ｍを添加して反応を停止させ、氷上 で３０分間培養することによってキトサンを沈澱させた。エツペンドルフ・ミニ ヒュージ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ４　ｍｉｎｉｆｕｇｅ　）を用いて１０分間遠心分 離して得られた上澄液のへキトサン含有団を、ＭｅｔｈｏｒＪｓ　ｏｆ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ、Ｄ、　Ｇ１１ｃｈ　Ｌ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉ ｅｎｃｅ　ＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＩｎｃ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９５５．　Ｖ ｏｌ　２．ｐｐ、３１３−３５８に記載のインドール法で測定した。キトサナー ゼ活性の１単位は、１分間当り１μｍｏｌのへキソサミン（当ｍの単糖もしくは オリゴ糖）を産出するのに必要な活性と定義した。

Ｄ　Ｎ　Ａ、の単離 イー・コリの小培養物からのプラスミドＤＮＡの製剤は、Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、１１４．１９８１．　Ｄｐ、１９３〜１９７に記載の急速沸騰法によ って得た。これら製剤をＲＮアーゼＡ　（１１００／ｙｊ。

９０℃で１０分間予備加熱）によって３７℃で１時間処理し、次いで制限酵素消 化法とアガロースゲル電気泳動法で分析した。イー・コリの大培養物からのプラ スミドの製剤は、培養物が１５０μＱ／１１のクロラムフェニコールの存在下− 夜増８され、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　ＡＣｔａ　２９９．１９７３ ．　ｌ）ｐ、５１６〜５２０に記載の方法を１こし改変した方法で得られた。細 胞溶解物（ｃｅｌｌ　Ｉｙｓａｔｅ）を高速遠心分離に付して得た上澄液を、０ ＳＣＩグラジ工ント遠心分離法（ｐ　−１，５５、０，７５＋ｎｏ　／ｘｉイー ・フリの形質転換 イー・コリ１−（Ｂ１０１を、Ｍｏ１．５ｉｏｌ　、　５３．１９７０．　ＤＩ ）、１５０−１６２に記載のＱａ　Ｃ１２法によって、細胞受容能力を誘導した 後、アンピシリン耐性に形質転換した。

ハイブリッド形成の分析 制限酵素処理で生成したＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上に電気泳動法で 分離し、次いでＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ　、　９８゜１９７５、１ｌｌ）、５ ０３−５１７に記載の方法によってニトロセルロースフィルターに移した６Ｊ、 　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ　、１１３．１９７７、　ｐｐ。

２３７−２５１に記載の方法のニックトランスレーションにより、プラスミドＤ ＮＡに、α　Ｐ−ｄ　ＡＴＰで生体外にて標識を付けた。１μＱ　ＣＩＮＡあた り３〜４Ｘ１０’　ＣＤＩＩＩの比放射能が得られた。”ＰｍＨのプラスミドＤ ＮＡとニトロセルロースに固定化されたＤＮＡとのハイブリッド形成は、Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｏ　、　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌ−１ａｒｂｏｒ　、　Ｎｅｗ　”ｙ’ｏｒｋ　、　１９８ ２に記載の方法によって、６８℃。

６ＸＳＳＣで行った。コダックＸ−ＱｍａｔｉＣｒｅｇｕｌａｒｉｎｔｅｎｓｉ ｆｙｉｎｇ　５ｃｒｅｅｎ付のコダックｘ−Ｑｍａｔ　ＲＰＸ線フィルムを用い てオートラジオグラフィーを一８０℃で行った。

１℃皿上 ムコール・シルシネロイデス　エフ　ルシタニクス（ＭＩＩｃＯｒｃｉｒｃｉｎ ｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｒ、Ｉｕｓｉｔａｎｉｃｕｓ　）　ＣＢＳ　２７７．４９の 栄養要求変異株の単離 野生型菌株のＣＢＳ　２７７．４９から約１０８の胞子を、２ｍＭｔｆのカザミ ノ酸を補充したＹＮＢ培地上にプレートした。その胞子に、０．５−２％が行き 残るような線屯で紫外線を照射し、完全栄養サイクルを完了させるように培養し た。制限コロニー培養のために培地は１Ｍ塩酸でｐ）＋３．０に調整し、２０ｏ 　／Ωの塞天を添加した。２８℃で７日後、各プレート上に産生された次世代の 胞子を別個に集め、使用するまで一２０℃に凍結して保管した。

生存力価（ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｔｉｔｒｅ　）は、突然変異誘発処理の前後での 希釈試料のコロニー計数から測定した。

１０ａ胞子を接種した培養物を液体の最少培地２５１中で培養し、次いで胞子集 団の約９０％が発芽し始めるまで（顕著鏡観察によって測定）、数時間２８℃で 洲脱しながら培養した。ジャームリングを遠心分離で収集し、硫酸アンモニウム なしの同容積のＹＮＢに再度懸濁させて、複数のチューブに入れ、種々の量のＮ −グリコシルーポリファンジン水’７ｇ８Ｉ２を添加した。抗生物質の存在下３ 時間培養した後、ジャームリングを３回水で洗い、プレート当り５０〜１００コ ロニーを得る希釈率のＹＮＢ培地上にプレートし、コロニー計数とレプリカ培養 のため３〜５日培養した。

抗生物質処理で行き残っているコロニーに胞子を形成させ、ＹＮＢ含有のプレー ト上とカザミノ酸含有のＹＮＢＮリプレート上複製し、栄養要求変異株を検出し た。選択最少培地ＣＹＮＢ）上で成長できないがカザミノ酸の存在下で成長しう るこれらのコロニーを栄養要求変異株として分類しこれらの表瑣型を識別した。

これらの栄養要求株を、種々の成分を補充した最少培地、４もしくは５の異なる アミノ酸を組合わせて含有している培地およびそれら全部を含有する培地（Ｒ， Ｈｏ１ｌｉｄａｙ　、　ｌ’Ｊａｔｕｒｅ１７Ｂ、　１９５Ｇ、　ｐｐ、９８７ ）に移した。特定の変異株の栄養所要日を、上記組合せの培地の一つ以上でのｉ Ｆ１養試験で同定した。

得られた栄養要求株のタイプは、ロイシン要求型２．イソロイシン要求型９．メ チオニン要求型２、プロリン要求型１、システィンもしくはメチオニン要求型１ であった。

ロイシン栄養要求株Ｒ７Ｂ、エム・シルシネロイデスＣＢ５２７７．４９１７） １１体は、委託番号ＣＢＳ　７５３．８４　ｒｃＢｓに冑託ムコール・ミニヘイ ＣＢＳ　３７０．６５の栄養要求変異株の単離培養物を４０℃で培養する以外は 実施例と同じしがたで行った。

得られた１２の栄養要求株はりシンを要求した。

実施例３ エム・シルシネロイデス・エフ・ルシタニクスからの原形質イ４−の形成 ＹＰＧ、ｐＨ４，５の寒天プレート上で空温下４〜６日間ｊ８養したエム・シル シネロイデス・エフ・ルシタニクスＪ８養物がら生成した胞子のう胞子を、ガラ ス棒でおだやかに蒸溜水中にこすり落して収穫した。蒸留水中で１回洗浄した後 、１０’／ｙｆの数でＹＰＧ、ＰＨ４，５中に再懸濁させ、２８℃で振鋸しなが ら発芽させた。発芽しない胞子を、メツシュサイズ１６μＩのナイロン布で濾過 して除去し、そのジｒ−ムリングを０．５Ｍソルビトールで２回洗浄した。０． ５Ｍソルビトールと０．０１　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）に再懸 濁させ、そのジャームリングを同じ緩衝液に溶解した同容積のス１〜ｌノプトチ ーム（原料と方法の項参照）に添加して、最終濃度を１０７／ｘｉのジャームリ ングと０．５〜１．Ｏｍ　ｇ　／ｘｉのストレプトチーム（約１．２単位／ｙＩ キトサナーゼに対応する）どした。ゆるやかに断続的に撹拌しながら２３℃で４ 時間培養した後、１１！当りに産出された原形質体の数を、位相差顕微鏡を用い て血球計数器中の最小の二つの試料を計数することによって８１算した。必要に 応じて、原形黄体懸濁液をメツシュサイズ１０μｍのナイロン布でと過して消化 されなかった菌糸を除いた。

ストレプトチームでの処理によってジャームリングの細胞壁の消化が起こり、細 胞膜がふくれ上ってきりとられ、平均の大きさが７）ａ球形で浸透に感受性の原 形質体が放出される。細胞壁合成の主部位である菌糸の頂点に、原形質体が優先 的に形成される。形成される原形質体の合計数は用いられる条件で変動するが、 処理されたジャームリングの合ｈ１数の３倍になるであろう。ムコールは多核細 胞であり（すなわち隔膜のない菌糸を有する）、シたがって１ジャームリング当 り一つ以上の原形質体が形成するということは、一つの原形質体が放出された後 、細胞膜が有効に再シールされていることを示している。

このようにして形成されたエム・シルシネロイデス・エフ・ルシタニクスの原形 質体は安定であり、０．０１　Ｍリン酸ナトリウム緩暫液（ｐ＋＋　６．５）、 ０．５Ｍソルビトル中４℃で一夜培養後でさえ４０％もの頻度で再生した。固体 培地（２％Ｗ／Ｖ　９天）上でこれらの原形質体を再生させる種々のブレイテン グ条件（ｐｌａｔｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　）を比較したが、１％寒天上塗 り法が常によい結果を示した。

友ｉ匠土 ムコール・ミニヘイからの原形質体の作製実験は、エム・ミニヘイ培養物を４０ ℃で培養し、得られた胞子のう胞子を４０℃で２時間予備培養し、２５℃で発芽 さゼることを除いて、実施例３に２軟されているのと同様にして行った。

実施例５ ムコール・シルネロイデスＣＢＳ　２７７、４９のゲノム・ライブラリーｒ　（ ｇｅｎｏｍｉｃ　１ｉｂｒａｒｙ　）の組立てこのゲノム・ライブラリィの組立 てに用いた野生型ムコールＤＮＡを次のようにして作製した。

胞子のう胞子を１ΩのＹＰＧ　（ＰＨ４，５）中に１０５／ν！の密度で接種し 、ｆｉｌしながら１６時間２８℃で培養した。菌糸体をナイロン布〔モノダー（ ＭｏｎｏｄＵｒ）　、２２μｍメツシュサイズ）で濾過して収穫し、冷蒸溜水で 洗浄し、液体窒素中で凍結し、乳鉢と乳棒を用いて粉砕した。この凍結粉末を０ ℃まであたため、同溶液のＴＥＷ析液（ＩＯＩＩＩＭ−トリス、１ｍ　Ｍ−ＥＤ ＴＡ）（ｐＨ８，２）を添加した。次いで得られたスラリイをナイロン布（モノ ダー、メツシュサイズ１０μｌｌ１）で濾過した。固体の残渣を再凍結、再粉砕 し０℃まであたため濾液と合した。Ｒ後のスラリイを、１．５％Ｗ／Ｖ　５ＤＳ （ナトリウムドデシルサルフェート）に入れ、フェノール（０，１％Ｗ／Ｖ　８ −ビドＯキシーキノリンを含有しＴＥ緩衝液（Ｐ）＋　８．２）で飽和されたい る）とクロロホルムとイソアミルアルコールとの２５：２４：１の比率の混合物 の同容積と合した。空温で５時間振盪後、遠心分離（１２０００Ｘｇ　、　至Ｗ で１０分間）で得た水層を、同容りの、クロロホルムとイソアミルアルコールと の（２４：　１）混合物で２度抽出し、次いでＣｓＣｌグラジェント遠心分離法 でｍｌした。

使用したプラスミドは、酵母−イー・コリ　シャトルベクターＹＲｐ１７　（第 １図）であった（０−３ｏｔｓｔｅｉｎおよびＲ，Ｗ。

［）ａＶｉＳ　ｌｎ　ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　３ｉｏ１ｏｇｙ　ｏｆ　ｔ ｈｅｙｅａｓｔ　３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、　（： ｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　１９８２．　 Ｖｏｌ　１１Ｂ、　ｐＨ，６０７）　、このプラスミドは酵母中での選択のため のＴＲＰＩおよびＵＲＡ３の遺伝子と、アンピシリンとテトラサイクリンに対す る耐性をイー・コリに与える遺伝子を有する。ＹＲＩ］１７をＢａ１ｌｌＨＩで 直線化し、小生アルカリ性ホスファターゼで処理して再度環になるのを防止し、 次いで平均サイズが１０ｋｂのフラグメントを産生するためにＭｂｏｌで部分的 に消化されたムコールＤＮＡの開缶と混合した。１６時間１２℃にて７１ＤＮＡ リカーゼで処理した後、得られた連結反応混合物を、イー・コリ）−１３１０１ をアンピシリン耐性に形質転換するのに用いたＢ４．　Ｍａｎｄｅｌ　ａｎｄＡ 、　Ｈｉｉｌｌａ、Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ　、　５３．１９７０．　ｐｐ、 １５９）　、　得られた形質転換細胞の９３％がテトラサイクリン感受性であり 、これらプラスミドがムコールＤＮＡ挿入物を有することを示した。

合計６０，０００の形質転換＠胞を、それぞれほば２０００のコロニーを有する 群に分け、１ρの培地で一夜培養して増幅し、組換えプラスミドＤＮＡの３０の 独立のプールを作製するのに用いた。得られたプラスミドのプールの一部をＢａ ｍＨＩで消化しアガロースゲル（０，７％Ｗ／Ｖ）中で電気泳動に付してムコー ルＤＮＡ挿入物をの大きさを測定した。

実施例６ ムコール・シルシネロイデスのロイシン栄養要求変異株Ｒ７Ｂ−ＣＢＳ　７５３ ．８４の形質転換 エム・シルシネロイデスＲ７Ｂの胞子のう胞子を、１０’／ｙｆの濃度で１５０ 　’１１のＹＰＧ、ｐＨ４，５中に懸濁させ、３−５時間２８℃で振盪しながら 光芽させた。ジャームリングをナイロン布（モノダー、メッシコサイズ２２μｌ １ｌ）で濾過して収穫し・、０．０１　Ｍリン酸ナトリウム綴街液ｐＨ６，５で 充分洗浄し、０．５Ｍ／／Ｌ、どトール、１．５ｍ　Ｑ　／ｖｔノボチム２３４ および０．５＋ｎ　ｇ／ｙ！のストレプトチーム（ＳｋｕｊｉｎＳｅｔ　ａｌ、 　、　、Ａ、ｒｃｈ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

［３ｉｏρｈｙｓ、１１１．１９６５．　ｐＤ３５８　＞含有の同じ綴衝液中で 、実施例３に記載したのと同様にして２〜３時間２３℃で培養した。原形質体と 残った消化されていない細胞を遠心分離（４００ＸＱ、５分間空温）でベレット 化し、０．５Ｍソルビトールで２回、ＭＯＰＳ緩衝液（１０ｍＭ３−（Ｎ−モル ホリノ）プロパンスルボン酸、ｐＨ６，３，５０ｍ　ＭＣａ　Ｃ＋　２　）　Ｔ ”　１回洗浄し、次イＴ”同し；溶液に再度懸濁させて最終容積を２１！にした 。

実施例５で得たプラスミドＤＮＡ２０μＱ（０，１〜５０ｔ！＋＋　。

１ｍｇヘパリン含有の０．５Ｍソルビトール、ＭＯＰＳ緩衝液とともに２０分間 氷上で前処理したもの）プラス４０％Ｗ／Ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ ）４０００含有のＭＯＰＳ暖酎液２耐μｇに、上記再Ｆ！、濁液の０，２ｘｆを 添加した。氷上で３０分間培養後、４０％Ｗ／Ｐ　Ｅ　Ｇ４０００含有のＭＯＰ Ｓ緩衝液２　、５　ｘｉを添加し、空温で２５分間培養を続けた。１りられた懸 濁液を、０．５Ｍソルビトール含有のＭＯＰＳ緩酎液２耐１！で希釈し、遠心分 離しく　４００ｘｇ、５分間、空温）、得られたベレットをＹＰＧｐＨ４，Ｓ、 ０．５Ｍソルビトールに再度懸濁させた゛。空温で３０分分間８養後、細胞を遠 心分離しく　４００ｘｇ　、５分間、空温）、次いでＹＮＢｐＨ４，５，０，５ Ｍソルビトールの５１！に再度懸濁させ、その懸濁液の１ν！づつを、ＹＮＢｐ ）＋３．０．０．５Ｍソルビトール寒天プレート上のソフト寒天上塗り層＜ＹＮ ＢＳｐＨ３，０，０，５Ｍソルビトール、１％Ｗ／ｌ天）上にプレートした。ユ ニットを形成するコロ−二の数の測定は、ＹＰＧｐＨ３，０゜０．５Ｍソルビト ール上に希釈したものをプレートすることによって行った。プレートは空温で２ 〜３日間培養した後コロニーを数えた。

菌株Ｒ７Ｂの約２Ｘ　１０’の生存している原形黄体全部を、前記のようにＰＥ ＧとＱａ　Ｃｌ　２の存在下、１０〜５０μΩの組換えプラスミドＤＮＡととも に培養し、次いで最小培地上にプレートした。空温で２日後に、胞子を形成する ことができ、新しい最少培地に移して成育させ続けさぜることのできる原形質体 のわりに２５μ９のＹ　Ｒｐ１７を用い、平行して行った形質転換実験では１． 原形質体のコロニーが全く得られなかった。試験された、１０の異なる組換えプ ラスミドプールのうち合計四つに、Ｌｅｕ争コロニーが生じた。１Ｓられたコロ ニーの数は、プール毎に変動したが、１〜３８の範囲であった。ｌｅｕ◆表１型 は、最初の突然変異をプラスミドが仲介して、相補することによるものテアッテ 自然の帰先遺伝（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ　）によるもの でないという事実が、下記実施例に記載されているように、ムコールの形質転換 細胞のＤＮＡからの組換えプラスミドの回収によって示された。

実施例７ ムコールの形質転換細胞から得た組換えプラスミドによるイー・コリの形質転換 形質転換細胞の分析用のムコールの小培養物からのＤＮＡはｙｅ＋ｔｏｎ　、ｅ ｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ　、　Ｎａ口、　Ａｃａｃｌ　、　Ｓｃｉ、　ＵＳ△８４ 、１９８４、ｐｐ、　１４７０の記載と、実質的に同様にして得た。

ＹＮ３ｐＨ４，５の１００ｙｆへ胞子を接種したものから、２０時間２８℃で培 養して培養物を得、実施例５に記載したのと同様に菌糸体を収穫して粉砕した。

粉砕された細胞を、１０ｙｆ５．Ｏｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ△、ｐＨ８，５，０，２ ％Ｗ／ＶＳＤＳ中に懸濁させ、空温で１分間温合した。この溶解物（Ｉｙｓａｔ ｅ）を６８℃で１５分間加熱し、空温まで冷却し遠心分離した（　１２０００ｘ ｇ　、１５分間、４旧。上澄液（１０１Ｆ）を氷上で冷却し、８．０Ｍ酢酸カリ ウムｐ）１４．２の０．６１１を添加し、得られた混合物を氷上で６０分間培養 した。遠心分離の後（２５０００ａ、　１５分間、４℃）、上澄液に存在する核 酸を同容積のイソプロパツールを加えることによって空温下沈澱させ、遠心分０ １　（１２００’０Ｘ（１、３０分間、空温）で集めた。得られたベレットを、 ６．０ｆｆｆのＴＥ緩衝液（ｐＨ７，＋３）に再度懸濁させ、次いで６０μΩの ＲＮアーゼＡ　（１０ｍ　Ｑ　／１！、９０℃で１０分間予備加熱）で１時間３ ７℃にて処理した。同容積のフェノールで抽出後、０、１ｆｆｆ［ｔ（７）　３ ．・Ｏ，’ＭＭ’Ｍナト’Ｊ　ラム（ｐ）＋　４．５）　（！：　２．５容ｆｆ ｉ部ノエタノールとを添加し一２０℃で、核酸を沈澱させた。遠心分離＜　１２ ０００ｘｇ　、３．Ｃｌ分間、４℃）して臂られたベレットを５００μΩのＴＥ 緩衝液（ｐ）＋　８．０）中に再び懸濁させ、ＤＮＡ含有倒をアガロースゲル電 気泳動法によって測定した。

最少培地中で培養された１９の異なる１−ｅｕ◆ムコール形質転換細胞からの全 ＤＮＡ　（実施例６参照）をＫｐｎｌで処理し、自己連結さぜイー・コリＨＢ　 １０１を形質するのに用いたく原料と方法の項参照）。アンピシリン耐性のコロ ニーを一つ得た。この形質転換細胞から回収されたプラスミドをｐＭｃＬ１３０ ２と命名した。イー・コリｌ−Ｉ　Ｂ　１０１１］Ｍ　ＣＬ　１３０２の菌株は 、ｔｈｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　ｌｖｌｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｔ　 ［）ｅｌｆｔ（ＬＭＤ）に寄託番号ＬＭＤ８４．９４号で寄託されている。

得られた細菌の形質転換細胞の数を増すために、ムコールＤＮＡをＣｓ　Ｃｌグ ラジェント通心弁離で精製した。次いで五つのｌｅｕ◆形質転換細胞からのＤＮ Ａをうま＜５ａｌＩで消化し、自己通結し、イー・コリを形質転換するのに使用 した。このようにして、四つのアンピシリン耐性のコロニーを二つのことなるＤ ＮＡ製剤から得た。これらの一つから回収したプラスミドをＩ）ＭＣ１１６４７ と命名した。イー・コリＨ８１０１ｐＭ　ＣＬ　１６４７の菌株は、寄託番号Ｌ ＭＤ８４，９５でＬＭＤに寄託されている。イー・コリの小ｉＢ養物からのプラ スミドＤＮＡとイー・コリの大きな方の１８養物からのプラスミドＤＮＡを原料 と方法の項に記載したのと同署正にして作製した。

プラスミドＩ）ＭＣＬ１３０２とプラスミドｐＭＣＬ１６４７の物理地図を、七 つの制限酵素によって単一および二重消化によって得たく第２図）。これらはそ れぞれ、０，５ｋｂと４．ＯｋｂのムコールＤＮＡ挿入物を有するＹ　Ｒｐ１７ で構成されている。二つのプラスミドへの挿入物は、二つのＡｖａｉｉ位によっ て境界が定められる３、７ｋｂの相同領域を有するが、ＹＲｐ１７の配列に対し て逆の配向で位置している。これらのプラスミドはそれぞれ、第１３号と第１６ 号プールからの組換えプラスミドＤＮＡでｌ　ｅｕ’に形質転換されたムコール コロニーから生成したものである。

プラスミドＩ）ＭＣ１１６４７は、第１６号プールからの元の形質転換プラスミ ドよりも小さく、その挿入物は少なくとも９，９ｋｂであるど４１１定すること ができる。

実施例８ エル・シルシネロイデスＲ７Ｂの形質転換この形質転換は実流例６に記載したの と同様にして行った。

プラスミドｐＭｃＬ１３０２を用いて、Ｒ７８ｍ株をｌｅｕ÷に形質転換する場 合の頻度を下記表に示す。

ＤＮＡの濃度とプレートされた細胞の密度との両者が、得らた。１μｇＤＮＡ当 り７２０までの形質転換細胞が０．１〜１．０μｇのプラスミドＤＮＡを用いて 得られた。使用ＤＮＡのｍが増えると、形質転換細胞の数は増大したが、形質転 換の頻度（１μａ　ＤＮＡ豊り）は順次減少した。これは、ＤＮＡ６度が唯一の 限定因子でなかったとを示す。プレートされて生存する細胞の数によって、形質 転換の頻度は２．５ｘ１０’から８ｘ１０’まで変動した。最高のブレーティン グデンシティで、比較的低い頻度が得られたのは、形質転換されてない細胞によ って、形質転換された細胞の成育が阻害されることをおそらく現わしているので あろう。

Ｒ’　７　Ｂ菌株をｌ）ＭＣＬ１６４７で処理してもｌｅｕ◆コロニーを住する が、形質転換の頻度はｌ１Ｍｃ１３０２を用いた場合よりもなるかに低い。１． ０μｇと５．０μｇのｌ）ＭＣＬ１６４７で上記実験１と同時に行った実験によ って、それぞれ６と１７の安定な１−ｅｕ÷コロニーを得た。

これらの結果は、二つのプラスミドｌ］ＭｃＬ１３０２とＩ）ＭＣＬ１６４７が ムコール−酵母−イー・コリのシャトルベクターとして有用であり、したがって ムコールを組換えＤＮＡによって高頻度で遺伝形質転換するのに用いることがで きることを証明している。

両方のベクターは、所望の遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を挿入するのに用 いる独特のＳａｔ　Ｉ制限座位（第２図）を有１゛る。この座位へのクローニン グは、酵母遺伝子ＴＲＰＩとＵＲＡ３の発現とそのベクター（ＡＲ８）の自律的 複製とに必要なりＮＡ配列には影響しない。所望の産物のためのＤＮＡ配列をこ の座位にクローニングすることは、ロイシンブロトトロフイ（ｌｅｕｃｉｎｅ　 ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ　）をコードするムコール遷伝子とイー・コリのアンピ シリン耐性遺伝子を阻害せず、三つのすべての宿主の維持と選択が可ロヒどなる 。

プラスミドｐＭＣＬ１３０２を有するエム・シルシネロイデスＲ７Ｂ　−１３０ ２ｉ、ｔ　、寄託番号ＣＢＳ　７５４．８４でＣＢＳに奇託されている。

プラスミドｌ）ＭＣＬ１６４７を有τるエム・シルシネロイデスＲ７Ｂ−１６４ ７は寄託番号ＣＢＳ　７５５．８４でＣＢＳに奇託されている。

実施例９ １　ｅｕ’　ムコール形質転換細胞のハイブリッド形成分析実施例６で得たｌ　 ｅｕ’コロニーが形質転換細胞であったということは、コロニーのＤＮＡ中にＹ Ｒｐ１７ブラスミド配列が検出されたことによって最終的に確認された。全ＤＮ Ａを多数の形質転換細胞から単離し、ＯＳ　ＣＩグラジェント遠心分前によって 精製した。ＢａｍＨＩもしくはｐｓ目での消化によって得たフラグメントをアガ ロース・ゲル（０，７％Ｗ／Ｖ）電気泳動法で分離し、ニトロセルロースフィル ターに移しくＥ、Ｍ。

５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂ　ｉｏｌ、９ｇ、１９７５．ｐｐ　５０ ３）　、ｇ２Ｐで標識された（Ｐ、　Ｗ、　Ｊ、　Ｒｔｇｂｙ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１１３゜１９７７、ｐ、２３７）　ＹＲＩ］１７と のハイブリッドを形成させた。バイブｌＪ７ド形成は、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ 　ａｌ、の方法（Ｃｏｌｄ　３ｐｒｉｎｇ１−１ａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 、１９８２）にしたがって、６８℃、６Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃで行った（　０．１５　 ＭＮａ’　ＣＩ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム、ｐＨ７，０）。オートラ ジオグラフィーを、コダックＸ−ＱｍａｔｉＣｒｅｇｕｌａｒ　ｒｎｔｅｎｓｒ ｒｙｒｎｇ　５ｃｒｅｅｎｓを有するコダックＸ−ＯｍａｔＲＰ　Ｘ線フィルム を用いて一８０℃で行った。

試験した２２の形質転換細胞はすべて、ＹＲｐ１７に対し特定のハイブリッド形 成性を示したが、−力受取り菌株（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓｔｒａｉｎ）　Ｒ７Ｂ から単離されたＤＮＡはこのプローブを相補する配列を全くもっていなかった。

得られたハイブリッド形成のパターンには二つのタイプがあり、下記表に示す。

下記酵素で消化した後に標識されたＹＲｐ１７に対してハイブリッドを形成させ た。

形質転換細胞１３０２に与えられたバタ〜ン（ユ、第１３号プラスミドブールか ら生成したもので試験された５の形質転換細胞全部を示すものである。同様に、 １６１１について与えられたパターンは第１６号プラスミドブールから生成した もので試験され１；１４の形質転換ｍ胞全部を示すものである。一方ＹＲｐ１７ の３．２ｋｂと１，５ｋｂのＰＳｔｌフラグメントは、全形質転換細胞に存在し くＢａｍＨＩクローニング座位を有する２、３ｋｂのｐｓＢフラグメントは二つ のより弱いハイブリッド形成性のフラグメントによって置換されたが）少なくと も一つの内部ｐｓｔｉ座位をもつ挿入物が存在ブることを示している。８ａｌ＋ ＋）−ＩＦでの消化の後、単一のハイブリッド形成フラグメントがすべての形質 転換細胞に得られた。これらのフラグメントは直線状のＹＲｐ１７より大ぎく、 そのプラスミドＤＮＡ内に挿入物が存在することを示す。

２ｉｐで標識されたプラスミドＭ　ＣＬ　１３０２と、形質転換されていない菌 株Ｒ７Ｂとｌ　ｅｕ’形質転換ｍ胞１３０２のそれぞれからのＤＮＡのＢａｍＨ ＩとＰＳｔｌによる消化物とでハイブリッドを形成させた結果、このプラスミド がムコールＤＮＡの挿入物を有することが明らかになった。

下記酵素で消化後、標識されたｐＭ　ＣＬ　１３０２に対しハイブリッドを形成 させた。

（以下余白、次頁に続く） 菌株Ｒ７Ｂ由来のＤＮＡは、ＹＲｐ１７と全く相同性を共有していないので、Ｒ ７Ｂ由来のハイブリッドを形成するフラグメントは、ｐｌｙｌ　ＣＬ　１３０２ の挿入物中にのみ存在するムコールのゲノムＤＮＡを示している。ｐＭ　ＣＬ　 １３０２がＬ　ｅｕ４形質転換細胞１３０２由来のＤＮＡとハイブリッドを形成 することから、ＹＲｐ１７ブラスミド由来の配列と菌株Ｒ７Ｂ中に存在するゲノ ム配列（ｇｅｎｏｍｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）との両者とのハイブリッド形成が 明らかになった。上記の表において相同のフラグメントには下線を付した。

このことは、プラスミドであるＩＢＭ　ＣＬ　１３０２とｐＭ　ＣＬ　１６４７ とが同様に、ムコール、イー・コリおよび酵母の遺伝子を有するプラスミドであ ることを証明している。

夫医級工Ｊ ムコール中での自律的複製 ムコールの形質転換細胞中のＴｉ離型プラスミド分子の存在を検出するため、そ の形質転換細胞から単離されたＤＮＡを、制限酵素で前処理するかヒずに０．４ ％Ｗ／Ｖアガロースゲル上で電気泳動法に付して分離し、次いで５ｏｕｔｈｅｒ ｎが記載した方法によってニトロセルロースフィルターに移した。

ｐＭ　ＣＬ　１３０２プラスミドの、ＡｖａＩフラグメント（３，７ｋｂ）の標 識を付したものに対してハイブリッドを形成させた。

（以下余白、次頁に続く） ムコール形質転換細胞から単離された全ＤＮＡを０．４％Ｗ／Ｖのアガロースゲ ル上で電気泳動に付し、ｐｌｙｌ　ＣＬ　１３０２のＡｖａｌフラグメント（３ ，７ｋｂ）の３２Ｐで１ｍを付けたも゛のに対してハイブリッドを形成させたと ころ、上表に示したように、該形質転換細胞の消化されないＤＮＡに特異なハイ ブリッド形成バンド（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｂａｎｄ）がみとめられる が、１ｅｕ−菌株のそれには認められない。これらのバンドの電気泳動移動度は 形質転換するプラスミドの大きさに反比例し、最も低いバンドはイー・コリから 単離された、共有結合的に閉環されたプラスミドコー数ルとコミグレートしてい る（ｃｏｍｉｇｒａｔｅ　）。このハイブリッド形成バンドが遊離型のプラスミ ド分子を示すということを確認するため、そのＤＮＡを、切ｒＩｆＩ座位（ｃｌ ｅａｖａｇｅｓ　ｉ　ｔｅｓ　）がそのゲノムＤＮＡには存在するがＤＭ　ＣＬ 　１３０２ニ＋、を存在しない、制限酵素Ｈｐａｌで処理した。ゲノムＤＮＡに 組込まれたいずれの配列も、Ｈｐａｒによる消化によって電気泳動移動度が変化 したはずであり、一方遊離型のプラスミド分子は影響されないま）であるにちが いない。菌株Ｒ７ＢのゲノムＤＮＡの消化によって、３，９ｋｂのＡ、ｖａｌプ ローブとハイブリッド形成する特異なバンド（〜２５ｋｂ）が発現したのである 。これとは異なり、形質転換細胞ＤＮＡは消化しても得られたハイブリッド形成 パターンを変えなかった。同じ結果が、プラスミドｐＭＣ１１６４７で形質転換 された菌株Ｒ７Ｂについても得られた。

さらに自律的に複２するプラスミドの存在を訂明するために、ＤＮＡから回収さ れた。エム・シルシネロイデスＲ７Ｂを、プラスミドｐＭ　ＣＬ　１３０２もし くはＩＢＭ　ＣＬ　１６４７で、Ｌ　ｅｕ”に形質転換を行った後、ＤＮＡを実 施例７に記載したのと同様にして形質転換細胞から単離し、次いでイー・コリＨ Ｂ　１０４を直接形質転換（゛るのに用いた。得られたａｍｐ’　コロニーの数 は１μＱＤＮＡ当り０・〜４であり、１００ｉｆの培養物から抽出されたＤＮＡ から合計２００まであった。単離されたプラスミドの制限フラグメント分析によ れば３５を示し、もとの形質転換するプラスミドと同じであった。

自律的に複製するプラスミドの分裂安定性を次のようにして試験した。

エム・シルシネロイデスＲ７ＢをＤＭ　ＣＬ　１３０２で１−ｅｕ◆に形質転換 し、次いで、三つの形質転換細胞を最少培地と完全培地とに移し、胞子のう胞子 が最高度に形成される完全成長サイクルを完了さぜた。ｌｅｕ◆表現型全現型す る生存胞子のう胞子の百分率は、胞子のう胞子の懸渦液な完全培地にプレートし 、次いで最少培地へのコロニーのレプリカブレーティングおよび／または完全お よび最少培地への、希釈物の平行ブレーティングを行うことによって推定した。

完全培地に最初に移した後、生存胞子のう胞子の５％だけが１−ｅｕ◆であった が、これに比べて、培養を選択条件下で続けた場合は４５％であった。さらに二 つの、完全培地への連続的な移動によってｌ　ｅｕ”胞子のう胞子の百分率はそ れぞれ、０．８％と０．０５６％に減少した。

ＤＭ　ＣＬ　１３０２で形質転換されたＲ７Ｂ菌株のプラスミドコピー数を測定 するため、菌株Ｒ７Ｅ３とＲ７Ｂ　１３０２由来のムコールＤＮＡ全部を５ａｌ ｌで消化し、０，４ＭＮａ　０Ｈｒ１０分間変性し、冷却し、同容積の冷２Ｍ酢 酸アンモニウムで希釈した。その１００沁について２倍連続希釈法を行ない、３ 　ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅｌｌ　ｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ　ｍａｎｉ ｆｏｌｄを用いてニトロセルロースフィルターに移した。そのフィルターを、１ Ｍ酢酸アンモニウム、２ＸＳＳＣ次いでデンハート溶液（［）ｅｎｇａｒｄｔ’ ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）　テ洗浄し、次いで８０℃で２時間ベイクした。

このフィルター上のＤＮＡとムコールＤＮＡの３．７ｋｂＡｖａｌフラグメント とがハイブリッドを形成するということは、プラスミド分子が１半数体ゲノム当 り４〜５コピーで形質転換細胞中に存在することを示している。

上記データは、Ｙ　Ｒｐｉ７に挿入されたムコールＤＮＡのフラグメントでｌ１ １立てられたハイブリッドプラスミドが、ムコール中で自律的に？！２製してい る証拠である。これらのプラスミドはムコールを茗しく高い頻度で形質転換し、 その形質転換細胞のＤＮＡから、改変されていない形態で回収することができる 。

これらプラスミドは、遺伝物質をムコール、イー・コリおよびニス・セレビシア 間に伝達するために有効なシャトルベクターであり、ひとつのゲノムライブラリ ィからの直接相補によってクローンされたムコール遺伝子を容易に回収可能とす る。

実施例１１ ムコールの自律的複製配列の同定 プラスミドｐＭ　ＣＬ　１３ｏ２　（第２図）は、△Ｒ８およびＯＲＩと呼ばれ る配列を有しているが、このプラスミドは、これらの配列によって、サツカロミ セス・セレビシアおよびエシェリヒア・コリのそれぞれの中に自律的に複製する ユニットとして維持されているのである。ムコール内でＩＢＭ　ＣＬ　１３０２ が自律的に複製する際のこれらの配列の役割を確認するために、これらの配列を 欠いたサブクローン作製し、エム・シルシネロイデスＲ７Ｂをｌｅｕ◆に形質転 換するのに用いた。

プラスミドｌ］ＭｃＬＯＯ２（第３図）は、ｐＢＲ３２２にクローンされたＩＢ Ｍ　ＣＬ　１３０２のムコールＤＮＡ挿入物で構成されている。これには、ｐＭ 　ＣＬ　１３０２中に存在する酵母配列全部が欠けているが、ムコール形質転換 細胞中には’；’ｆｉ離型プラスミドとして以前として存在するのがみとめられ る。

プラスミドＩ）ＭＣＬＯＯ９（第３図）を、ｐＢＲ３２２配列内の三つの部位で 切断するが、ムコールＤＮＡの挿入物については全く切断しないＢｇｌｌで、Ｍ ＣＬｏｏ２を消化して作製した。

得られた制限フラグメントの最大のものは、全ムコールＤＮＡ挿入物プラス１． ８ｋｌ＋のＤＢＲ３２２を有するが、イー・コリＯＲＩプラス少なくとち１ｋｂ のｐＢＲ３２２がこの領域の両側に欠けている。アガロースゲル電気泳動法で単 頭した後、このフラグメントをＴ４−ＤＮＡリガーゼで処理し、得られた連結反 応混合物を、エム・シルシネロイデスＲ７Ｂをｌｅｕ◆に直接形質転換するのに 用いた。ＤＮＡを四つの形質転換細胞から単離し、５ＯＵｔｌＴｅｒｎの、　Ｐ ｅＥ　ｆ）ＭＣＬ　００２とのハイブリッド形成法によって分析した。これら形 質転換細胞の切断されずに単離されたＤＮＡ１よ、ｉＥｍ型プラスミド分子の存 在を示すハイブリッド形成のパターンを示した。ＡｖａＩで消化した結果、形質 転換細胞中にｐＭｃＬＯＯ９は存在するがｐＭｃＬＯｏ２は存在しないことを示 すハイブリッド形成のパターンがｊｑられる。イー・コリＯＲＩ領域が存在しな いことは、ｔ１ＭｃＬＯＯ２の４．１ｋｂと４．７ｋｂのΔＶａ）フラグメント が単一の６．５ｋｂのフラグメントによって置換されることによって示される。

引用文献 Ｍ、　Ｅ、　Ｃａ５ｅ　、　Ｍ、　Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ、　３．　Ｒ，１（ｕｓ ｈｎｅｒ　＆Ｎ、　Ｈ，Ｇ１１ｅｓ、”［ｆｉｃｉｅｎｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ａｔｉｏｎ　ｏｆＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ　ｂｙ　ｕｔｉｌｉｚｉ ｎｇ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｌａｓｍｉｄ　［）ＮＡ”　。

ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａ口、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７６．１９７９．ｐｐ、 ５２５９−５２６３゜Ｕ、　５ｔａｈ１．Ｐ、　Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ、　Ｌｌ、 　Ｋｊｃｈ　＆　Ｋ、Ｅｓ５ｅｒ。

”ＲｅＤｌｉＣａｔｉＯｎ　ａｎｄ　ｅＸＤｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｒ　ａ　ｂａｃ ｔｅｒｉａｌ−ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｌａｓｍｉｄ　 ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｕｎｇｕｓ、ｐｏｄｏｓｐｏｒａａｎｓｅｒｉｎａ　”　、　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ　、　３ｃｉ、　ＬＩＳＡ７９，１９８２゜ ｐＩ）、３６４１−３６４５゜ Ｄ、　Ｊ、　３ａｌｌａｎｃｅ、Ｆ、　Ｐ、　３ｕｘｔｏｎ　＆　Ｇ、　Ｔｕｒ ｎｅｒ　。

６°Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕ ｌａｎｓ　ｂｙ　ｔｈｅｏｒｏｔｉｃｌｉｎｅ−５−−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄ ｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｏｆＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓ ａ”　、　３　ｉｏｃｈｅｍ、　３１ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　ｃｏｍｍｕｎ。

１１２、’１９８３．Ｄｐ、　２８４−２８９゜Ｍ、　３ｔｅｒｎｂｅｒｇ、　 ”Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　’７ｔ！ｎｎｅ４！：”　、　Ａｄｖａｎｃｅｓ　１ｎ Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２０，１９７６、ｐｐ、１３５−１ ５７゜Ｋ、△１Ｉｎｓｔｒｕｐ　、”ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ”　、　ｉｎ　Ａ 、　Ｈ，Ｒｏｓｅ、ｅｄ、。

Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　＆　Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｓ　； ［ｇ：ｃｏｎｏｍｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖａｔ、５．　Ａｃａｄｅｍ ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｊ９８０、ｐｐ、５０−１１５゜ ＵＳ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、３，９８８，２０７゜Ｋ、　Ａｕｎ５ｔｒｕｐ、　 ”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　Ｊｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ ｏｆ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｅｎｚｙｍｅｓ”　、ｉｎ　：　Ｌ、　Ｂ 、　Ｗｔｎｇａｒｄ。

Ｅ、　ＫａｔＣｈａｌＳｋｉ−ＫａｔＺｉｒ　ａｎｄ　Ｌ、　ＧＯＩｄＳｔｅｉ ｎ、ｅ（ＩＳ、、ＡｐＤｌｉｅｄＢ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂ　ｉ ｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ、２　、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｎ ｅｗ、　Ｙｏｒｋ、１９７９．Ｄｐ、２ｇ−６９゜Ｗ、　Ｍ、Ｆｏｑａｒｔｙ、 ＆　Ｃ，Ｔ、　Ｋｅｌｌｙ、’′Ａｌｌ１ｙｌａｓｅｓ。

ａｍｙｌｏｇｌｕｅｏｓｉｄａｓｅｓ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｌｕｃａｎ ａｓｅｓ　”　、ｉｎ　Ａ、Ｈ。

Ｒｏｓｅ、ｅｄ、、　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　＆　Ｂｉｏｃｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎｓ　：Ｅ　ｃｏｎｏｍｉｃ　Ｍ　ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖ 　ｏｆ、５．　Ａｃａｄ、　Ｐ　ｒｅＳＳ、Ｎ　０ＷＹｏｒｋ、１９８０．ｐＩ ｌ、１＋６−１７０゜Ｋ、　ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ、　Ｎ、　３ｈｉｍｉｚｕ、　 Ｙ、　Ｋａｗａｇｕｃｈｉ、　Ｍ。

Ｈｉｄａｋａ、Ｔ、　Ｖｏｚｕｍｉ　＆　Ｔ、　Ｂｅｐｌ）ｕ、　”Ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ　ｏｒＣｌｏｎｅｄ　Ｃａ１ｆ　Ｐｒｏｃｙｍｏｓｉｎ　ｃＤＮＡ　 ｕｎｄｅｒ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆｔｈｅ　Ｔ　ｒｙｐｔｏｐｈａｎ　Ｐｒｏｍ ｏｔｅｒ　”　、　Ｇｅｎｅ　２９，１９８４．ｐｐ、４４−１９゜Ｊ、　Ｓ、 Ｅｍｔａｇｅ、Ｓ、　Ａｒ＋ｇａｌ、　Ｍ、　Ｔ、　Ｄｏｅｌ、Ｔ、　Ｊ、　Ｒ 。

Ｈａｒｒｉｓ、Ｂ、　Ｊｅｎｋｉｎｓ、　Ｇ、　Ｌ　１ｌｌｅｙ　＆　Ｐ、　Ａ 、　ｌｏｗｅ。

５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｃａ１ｆ　ｐｒｏｃｈｙｍｏｓｉｎ　（Ｐｒｏｒｅ ｎｎｉｎ）　１ｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　”　、ＰｒｏｃＪｌａｔ ｌ、△ｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８０゜１９８３、ｐｐ、３Ｇ７１−３６７５゜ Ｊ、　Ｍｅｌｌｏｒ、Ｍ、Ｊ、Ｄｏｂｓｏｎ、Ｎ、　Ａ、Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｍ 、Ｆ。

Ｔｕｉｔｅ、Ｊ、　Ｓ、Ｅｍｔａｇｅ、３．　Ｗｈｉｔｅ、ｐ、　Ａ、ｌｏｗｅ 、Ｔ。

Ｐａｔｅｌ、Ａ、Ｊ、Ｋｉｎｇｓｍａｎ　＆　Ｓ、　Ｍ、Ｋｉｎｇｓｍａｎ。

”ＥＨｉＣｉｅｎｔ　３ｙｎｔｈｅｓ＊ｓ　Ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｌｃａ＋＋ｙ 　ＡｃｔｉｖｅＣａｌｆ　Ｃｈｙｍｏｓｉｎ　ｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　”　、　Ｑｅｎｅ２４、１９８３．ＤＩｌｌ、　１ −１４゜Ｃ，Ｇ、　ＧｏＮ、［）、　Ｔ’、　Ｍｏ１ｒＪ、　）（ｏｈｎｏ、　 ７’、ｃ。

Ｇｒａｖｉｕｓ、　Ｒ，Ａ、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｅ、　Ｙａｍａｓａｋｉ　＆　Ａ 、　Ｔａｕｎｔｏｎ−Ｒｉｇｂｙ、”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａ１ｆ　 Ｐｒｏｃｈｙｍｏｓｉｏｎ　ｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ　”　Ｇｅｎｅ　２７，１９８４．ｐｐ、３５−４６゜Ｍ、　Ａ、　Ａ、 　５ｃｈｉｐｐｅｒ、　”Ｏｎ　Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、 Ｍｕｃｏｒｒａｃｅｍｏｓｕｓ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　３ｐｅｃｉｅｓ”　 、　５ｔｕｄｉｅｓ　ｉｎＭｙｃｏｌｏｇｙ　１２，１９７６、ｐｐ、１−４０ ゜Ｒ，）−１ｏ１１ｉｄａｙ、　ｔＶ、Ｎｅｗ　ＭｅｔｈＯｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ 　（ｄｅｎｔｉｒｉｃａ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｆｖｌ ｕｔａｎｔｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ″′。

Ｎａｔｕｒｅ　１７８，１９５６．ｐＤ、９８７゜Ｄ、　Ｂｎｔｓｔｅｉｎ、＆ Ｒ，Ｗ、　［）ａｖｉｓ、”Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏ ｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈｗｉｔｈｙｅａｓｔ” 　、　ｉｎ　Ｊ、　Ｎ、　５ｔｒａｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　Ｗ、　ＪＯｎｅＳ　ａ ｎｄ　Ｊ。

Ｒ，３ｒｏａｃｈ、ｅｄｓ、、　Ｔｉｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ 　ｏｆ　ｔｈｅＹｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ、Ｖｏｌ、Ｉ　ＩＳ　、Ｃｏ１ｄＳＤｒｉｒ＋ｏ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ、１９８２．ｐｐ、６０７−６３６゜Ｍ、　１ｖｌａｎｄｅｌ、＆　Ａ、 　Ｈｉｇａ、”ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ［３ａｃｔｅｒｉｏｐｈａ ｇｅ　ＤＮＡ　Ｉｎｒｅｃｔｉｏｎ”、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

５３、１９７０．ｐＩ）、　１５９−１６２゜Ｊ、　Ｊ、　５ｋｕｊｉｎｓ、　 Ｈ、Ｊ、　ｐｏｔｇｉｅｊｅｒ　＆　ｌｙｌ。

Ａ　Ｉｅｘａｎｄｃｒ、”Ｑ　１ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏ（ｆｕｎｇａｌ　ｃｅ ｌｌｓ　ｂｙ　ａｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｒｅ　ＣｈｉｔｉｎａＳｅ　ａｎｄ　 β（＋−３）　ｇｌｕｃａｎａｓｅ”　。

Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｏｔ＋ｙｓ、１１１，１９６５．Ｄｆｌ、３ ５８−３６４゜Ｍ、　Ｍ、Ｙｅｌｔｏｎ、Ｊ、Ｅ、Ｈａｍｅｒ　＆　−Ｗ、Ｅ、 Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ。

”７ｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌ ａｎｓ　ｂｙ　ＩＪｓｉｎｇ　ａｔｒｐｃ　Ｐｌａｓｍｉｄ”　、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４゜１９８４、ｐ、　１４７０−１４７４ ゜Ｐ、　Ｓ、Ｈｏｌｍｅｓ、＆　Ｍ、　Ｑｕｉｇｌｅｙ、”Ａ　Ｒａｐｉｄ　３ ｏｉ１ｉｎｇＭｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｒ　 ３ａｃｔｅｒｉａｌ　Ｐｌａｓｍｉｄｓ　”　。

Ａ　ｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、１１４，１９８１．ｐｐ、１９３−１９７゜ Ｐ、Ｓ、　Ｇｏｒｄｏｎ、＆　Ｄ、　Ｖａｐｎｅｋ、　”Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　Ｍ ｅｔｈｏｄ　ｏｆＰ　ｒｅｐａｒｉｎｇ　ｌ　ａｒｇｅ　Ａ　ｍｏｕｎｔｓ　ｏ ｆφＸ１７４ＲＦＩＳｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ　ＤＮＡ”　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　２９９゜１９７３、ｐｐ、５１６−５２０゜ Ｅ、　Ｍ、　３ｏｕｔｈｅｒｎ、“［）ｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｐｅｃｉｒ ｉｃ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｍｏｎｇ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　５ｅｐａ ｒａｔｅｄｂｙ　Ｇｅ１Ｅ　Ｉｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ”　、Ｊ　、　ＭＯ ＋、３　ｉｏｌ、９ｇ、１９７５．ｐｐ、ｆｉ０３−５１７゜Ｐ、　Ｗ、　Ｊ、 Ｒｉｏｂｙ、　Ｍ、　Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ、Ｃ，Ｒｈｏｄｅｓ　＆　Ｐ。

Ｂｅｒｇ、”ｌ−ａｂｅｌｌｉｎｇ　［）ｅｏｘｙ−ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄｔｏ　ＨｉｇｈＳｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ　ｂｙ　Ｎ　ｉｃｋ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈＤ　Ｎ　Ａ　Ｐｏｌ ｙｍｅｒａｓｅ　ビ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１１３，１９７７、Ｄｐ。

２３７−２５１゜ Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ　＆　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 。

”ＭＯｌｅＣＩＩｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　’ｙ’ｏｒｋｊ９８ ２゜四　卑　禰　本　却　牛 １°ｍ＋＋１ｅ″′ｌ　ＡｏｓＪｃ＋ｌｌ＊ｎ　Ｎ″’　ＰＣＴ／ＤＫ３５１０ ０１２０１Ａｂｍｌｌｌａ？１１＾”””””ＰＣＴ／ＤＫＢ５１００１２０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．チゴミセテス綱（Ｃｌａｓｓ　Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）の菌類の胞子のう 胞子もしくはチャームリングを、上記菌類の種内で複製される組換え発現ベクタ ーで形質転換することからなるチゴミセテス綱の菌類の形質転換方法。 ２．菌類がムコール属（ｇｅｎｕｓ　Ｍｕｃｏｒ）の菌類である請求の範囲第１ 項の方法。 ３．ムコール菌株がエム・シルシネロイデス（Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅ ｓ）、エム・ラセモスス（Ｍ．ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）もしくはエム・ローキシー （Ｍ．ｒｏｕｘｉｉ）のごとき中温好性ムコール種、またはエム・ミエヘイ（Ｍ ．ｍｉｅｈｅｉ）もしくはエム・プシルス（Ｍ．ｐｕｓｉｌｌｕｓ）のごとき好 熱性ムコール種である請求の範囲第２項の方法。 ４．形質転換が、発芽中の胞子のう胞子を１以上の適切な溶解酵素で処理し、得 られた原形質体を発現ベクターで形質転換し、次いで細胞壁を再生させることに よって行われる請求の範囲第１〜３項のいずれか一つによる方法。 ５．溶解酵素がキトサナーゼである請求の範囲第４項の方法。 ６．チゴミセテス綱の菌類の菌株が、適切な栄養要求変異株または抗生物質感受 性変異株であって、形質転換される際、逆選択性原栄養性の遺伝子もしくは抗生 物質耐性の遺伝子を有する発現ベクターで相補される請求の範囲第１項の方法。 ７．発現ベクターが自己複製性である前記請求の範囲のいずれか一つの方法。 ８．発現ベクターが１以上の宿主染色体に安定に組込まれている請求の範囲第１ 〜６項のいずれか一つの方法。 ９．ベクターが・チゴミセテス綱の菌類の種、イー・コリおよび／または酵母内 で複製されうるシャトルベクターである前記請求の範囲のいずれか一つの方法。 １０．ベクターがｐＭＣＬ１３０２であり、ムコール・シルシネロイデスＲ７Ｂ （Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　Ｒ７Ｂ）に導入されてＣｅｎｔ ｒａａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託 番号第ＣＢＳ　７５４．８４号で寄託されている請求の範囲第９項の方法。 １１．ベクターがｐＭＣＬ１６４７であり、ムコール・シルシネロイデスＲ７Ｂ （Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　Ｒ７Ｂ）に導入されてＣｅｎｔ ｒａａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託 番号第ＣＢＳ　７５５．８４号で寄託されている請求の範囲第９項の方法。 １２．チゴミセテスＤＮＡのＤＮＡ配列、所望の遺伝子産物合成の遺伝情報を指 定するＤＮＡ配列およびベクターで形質転換された細胞を同定および／または選 択するためのマーカーを有し、チゴミセテス綱の菌類内で複製される、チゴミセ テス綱の菌類の形質転換用発現ベクター。 １３．マーカーが抗生物質に感受性の菌類菌株に、抗生物質耐性を仲介する遺伝 子または栄養要求菌類菌株に原栄養性を仲介する遺伝子である請求の範囲第１２ 項の発現ベクター。 １４．自己複製性である請求の範囲第１２項または第１３項の発現ベクター。 １５．１以上の宿主染色体に安定に組みこまれる請求の範囲第１２項または第１ ３項の発現ベクター。 １６．チゴミセテス綱の菌類の種、イー・コリおよび／または酵母内で複製され うるシャトルベクターである請求の範囲第１２〜１５項のいずれか一つの発現ベ クター。 １７．ＤＮＡ配列によってエンコードされる遺伝子産物が、ポリペプチドもしく は蛋白もしくはそのフラグメント、酵素もしくは培養基中の化合物と酵素との非 蛋白反応生成物、またはホルモンもしくは核酸のような低分子量の産物である請 求の範囲第１２〜１６項のいずれか一つの発現ベクター。 １８．遺伝子産物が酵素である請求の範囲第１７項の発現ベクター。 １９．酵素がリパーゼ、アミログルコシダーゼ、α−アミラーゼ、、β−ガラク トシダーゼ、セルラーゼまたはキモシンのようなプロテアーゼ類である都請求の 範囲第１８項の発現ベクター。 ２０．チゴミセテスＤＮＡのＤＮＡ配列、ベクターで形質転換された細胞を同定 および／または選択するためのマーカーおよび所望の遺伝子産物合成の遺伝情報 を指定するＤＮＡ配列を挿入するための少なくとも一つの制限座位からなり、チ ゴミセテス綱の菌類内で複製される、チゴミセテス綱の菌類の形質転換用発現ベ クター。 ２１．マーカーが、抗生物質に感受性の菌類菌株に、抗生物質耐性を仲介する遺 伝子または栄養要求菌類菌株に原栄養性を仲介する遺伝子である請求の範囲第２ ０項の発現ベクター。 ２２．自己複製性である請求の範囲第２０項または第２１項の発現ベクター。 ２３．１以上の宿主染色体に安定に組みこまれる請求の範囲第２０項または第２ １項の発現ベクター。 ２４．チゴミセテス綱の菌類の種、イー・コリおよび／または酵母内で複製され うるシャトルベクターである請求の範囲第２０〜２３項のいずれか一つの発現ベ クター。 ２５．ｐＭＣＬ１３０２であり、ムコール・シルシネロイデスＲ７Ｂ（Ｍｕｃｏ ｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　Ｒ７Ｂ）に導入されてＣｅｎｔｒａａｌＢ ｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託番号第ＣＢＳ ７５４．８４号で寄託されている請求の範囲第２４項の発現ベクター。 ２６．ｐＭＣＬ１６４７であり、ムコール・シルシネロイデスＲ７ＢＢ（Ｍｕｃ ｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　Ｒ７Ｂ）に導入されてＣｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託番号第ＣＢ Ｓ７５５．８４号で寄託されいる請求の範囲第２５項の発現ベクター。 ２７．生物内で複製される組み換え発現ベクターを有するチゴミセテス綱の菌類 。 ２８．発現ベクターが請求の範囲第１２〜１９項または第２０〜２６項のいずれ か一つのベクターである請求の範囲第２７項の菌類。 ２９．ムコール属の菌類である請求の範囲第２７項または第２８項の菌類。 ３０．エム・シルシネロイデス（Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、エム・ ラセモスス（Ｍ．ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）もしくはエム・ローキシー（Ｍ．ｒｏｕ ｘｉｉ）のごとき中温好性ムコール種、またはエム・ミエヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅ ｉ）もしくはエム・プシルス（Ｍ．ｐｕｓｉｌｌｕｓ）のごとき好熱性ムコール 種から選択されるムコール菌株である請求の範囲第２９項の菌類。 ３１．栄養要求変異菌株である請求の範囲第２７〜３０項のいずれか一つの菌類 。 ３２．チゴミセテス綱の菌類内で複製されるプラスミドに、ベクターで形質転換 された細胞を同定および／または選択するためのマーカーのＤＮＡ配列を挿入し 、所望の遺伝子産物合成の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列を挿入するための制限 座位を、そのＤＮＡ配列が複製および／または選択を阻害しない位置に与え、こ の座位に所望の遺伝子産物の前記ＤＮＡ配列を挿入することからなる請求の範囲 第１２〜１９項のいずれか一つの発現ベクターの製造方法。 ３３．チゴミセテス綱の菌類の胞子のう胞子もしくはチャームリングが、該菌類 の種内で複製しかつ所望の遺伝子産物合成の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列を有 する組み換え発現ベクターで形質転換され、形質転換された胞子のう胞子もしく はチャームリングが適切な培養基中で培養されて該ＤＮＡ配列を発現し、次いで 得られた産物を収穫する、チゴミセテス綱の菌穎からの遺伝子産物の製造方法。 ３４．挿入されたＤＮＡの産物が培地に放出され、次いでその培地から回収され る請求の範囲第３３項の方法。 ３５．チゴミセテス種から産出される遺伝子産物が、ポリペプチドもしくは蛋白 もしくはそのフラグメント、酵素もしくは培養基中の化合物と酵素との非蛋白反 応生成物、またはホルモンもしくは核酸のような低分子量の産物である請求の範 囲第３３項または第３４項の方法。 ３６．遺伝子産物が酵素である請求の範囲第３５項の方法。 ３７．酵素が、リパーゼ、アミログルコシダーゼ、α−アミラーゼ、β−ガラク トシダーゼ、セルラーゼ、またはキモシンのようなプロテアーゼ類である請求の 範囲第３６項の方法。 ３８．発現ベクターが請求の範囲第１２〜１９項のいずれか一つのベクターであ る請求の範囲第３３項の方法。 ３９．菌類がムコール属の菌類である請求の範囲第３８項の方法。