JP2718659B2 - ヤロウイア酵母種 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、ヤロウイア・リポ
リティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、
以下Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａと略す）の工業的目的に
おける利用性を改善するためのＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａの形質転換方法に関する分野に属し、またその方法に
有用なベクターおよびそのサブクローン、とくに大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、以下Ｅ．ｃｏｌ
ｉと略す）内で自律的複製を行うが、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａ内では組込まれても自律的複製は行わないベク
ター、このベクターを含むＥ．ｃｏｌｉおよびＹ．ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａの形質転換体、ならびに蛋白製造のた
めのその使用に関する。 【０００２】 【従来の技術】分子クローニングに際しての宿主微生物
としては、とくに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）また最近では
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｐｔｉｌｉｓ）のよう
な原核生物に注意が向けられてきた。Ｅ．ｃｏｌｉは非
相同ＤＮＡのクローニングや発現のための宿主微生物と
して広く用いられているが、蛋白をその生育培地中に分
泌せず、したがってその単離が容易でないなどの問題点
があることはよく知られている。このように細胞内に生
成した蛋白は通常その天然の状態にはなく、封入体と呼
ばれる不溶性の集合体として存在する。この蛋白を回収
するためには細胞の破壊が必要になる場合があり、その
ため毒性物質が蛋白に夾雑する可能性を生じる。このよ
うな問題から、蛋白を分泌し、毒素を産生しない枯草菌
が宿主微生物として注目されるようになった。しかしな
がら、宿主微生物としては枯草菌にも限界がある。形質
転換された株が不安定なために、非相同ＤＮＡの消失
や、導入されたＤＮＡの宿主ＤＮＡとの共存能の低下が
起こるからである。 【０００３】原核生物にみられる上述のような宿主微生
物としての欠点から、宿主微生物として真核生物、とく
に酵母が研究されるようになった。工業的に重要な酵母
は毒性がなく、きわめて高濃度に生育させることができ
る。一部の種については遺伝的にもよく解析されている
し、蛋白を分泌することができる。 【０００４】酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換を最初に報告したのは（Ｈ
Ｉｎｎｅｎ）ら〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，７５：１９２９〜１９３３（１９７８）〕
で、彼らは、ＬＥＵ２座をコードする酵母ＤＮＡのクロ
ーン化分節が、復帰を示さないｌｅｕ２^- 突然変異体酵
母をＬＥＵ⁺ 表現型に形質転換できることを明らかにし
た。この形質転換はＤＮＡのＬＥＵ２分節を含むプラス
ミドの染色体への組込みによって生じることが示され
た。この組込みには、相同なＤＮＡ分節間の組換えが関
与している。 【０００５】ＨｉｎｎｅｎらはＫｒｕｍｐｈａｎｚｌら
編“Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．，ｃｈ．３０、１９８２）に、酵母形
質転換操作の総説を発表している。酵母の形質転換に必
要な前提条件については、Ｒａｔｚｋｉｎら〔Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，７４：４８
７〜４９１（１９７７）〕が、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌｅｕ
Ｂ突然変異体の相補による酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＥＵ２のクローニン
グに関連して述べている。Ｓｊｏｓｔａｋら〔Ｐｌａｓ
ｍｉｄ、２：５３６〜５５４（１９７９）〕は、酵母の
ＬＥＵ２遺伝子とｒＤＮＡ断片を含むプラスミドの構
築、このプラスミドのｒＤＮＡ座への組込み、酵母の形
質転換について記載している。彼らの研究の基本点は、
ｒＤＮＡ遺伝地図作製のための遺伝的マーカーとして、
ｒＤＮＡ座に挿入された遺伝的マーカー、ＬＥＵ２遺伝
子の組込みにあった。報告されているプラスミドのひと
つであるｒＤＮＡのＢｇｌ II−Ｂ断片とはＳａｌＩ−
Ｘｈｏ Ｉ ＬＥＵ２断片を含むｐＳＺ２０は、酵母に
酵母ＤＮＡの断片をクローニングするのに有用なベクタ
ーであることが確認されている。 【０００６】Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら〔Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，７８：６３５４〜６
３５８（１９８１）〕は、ｐＢＲ３２２由来の線状プラ
スミド高頻度な組込みを示した。そのすべてが酵母内で
は複製を行わず、プラスミドが酵母染色体に相同のＤＮ
Ａ配列内で切断された場合、組込みによってのみＳａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに形質転
換を認める。工業的に重要な酵母種であるＹ．ｌｉｐｏ
ｌｙｔｉｃａはクエン酸や単一細胞蛋白の製造に用いら
れる。また、エリスリトール、マニトールおよびイソプ
ロピルリンゴ酸の製造にも使用することができる。Ｙ．
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａには利用可能な炭素源のスペクト
ルが限定されているといった固有の欠点がある。しかし
ながら、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの総合点な価値はこ
のような欠点を、たとえば他の種からの矯正ＤＮＡを導
入することによって増大させることが可能と思われる。
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは蛋白 (アルカリ性プロテア
ーゼ、酸性プロテアーゼおよびＲＮＡｓｅ）をその生育
培地に分泌することができ、したがって非相同蛋白を、
産生細胞を破壊する必要なく自然の状態で回収すること
が可能であるという点で価値があり、とくに興味がもた
れる。 【０００７】Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅのいずれでも選択でき、両者から回収可能な複製ハ
イブリドプラスミド、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ−Ｅ．ｃ
ｏｌｉハイブリドプラスミドからなるＳ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓａｅの形質転換のための効率の高いシステムがＢｅｇ
ｇｓによって報告されている〔Ｎａｔｕｒｅ ２７５：
１０４〜１０９（１９７８）〕。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅおよびＫｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓの高頻度形質転換システム
は、それぞれＢｅａｃｈら〔Ｎａｔｕｒｅ、２９０：１
４０〜１４２（１９８１）およびＤａｓら〔Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６：１２３〜１２８（１９８
２）により報告されている。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はＹ．ｌ
ｉｐｏｌｙｔｉｃａの工業的目的における利用性を改善
するための宿主としてＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＡＴ
ＣＣ２０６８８を提供するものである。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明に関して、Ｙ．ｌ
ｉｐｏｌｙｔｉｃａに相同の領域と検出可能な遺伝的マ
ーカーからなるＤＮＡをＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに導
入することによるＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの形質転換
方法が発見され、完成された。とくに興味深いものは、
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内で検出可能なＹ．ｌｉｐｏ
ｌｙｔｉｃａＤＮＡの断片または好ましくはＹ．ｌｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡの断片を含有もしくは包含する
ベクターをＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに導入する方法、
その方法に有用なベクター、そのベクターからなる微生
物形質転換体である。一般に、この形質転換方法におい
ては、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡ断片はＹ．ｌ
ｉｐｏｌｙｔｉｃａ内で機能する選択可能なマーカーを
含有する。とくにその選択可能なマーカーに相当する遺
伝子に突然変異を有するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内で
機能する選択可能なマーカーを含有する。本発明におい
てとくに興味深く価値が大きいものは、生合成または代
謝酵素をコードする遺伝子たとえばＬＥＵ２遺伝子（酵
素β−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼＥＣ１，
１，１，８５をコードする）、ＨＩＳ１遺伝子（酵素Ａ
ＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼＥＣ２，４，
２，１７をコードする）、ＵＲＡ３遺伝子（酵素、オロ
チジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼＥＣ
４，１，１，２３をコードする）またはＸＰＲ２遺伝子
（酵素アルカリ性細胞外プロテアーゼＥＣ３，４，２
１，１４）を有するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡ
断片と、それぞれｌｅｕ２^-、ｈｉｓ１^- 、ｕｒａ３^-
またはｘｐｒ２^- 突然変異を有するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔ
ｉｃａ株の使用である。 【００１０】本発明に係る新規なプラスミド（またはベ
クター、本明細書においてはこの２つの語は同義に用い
られている）は共通のいくつかの性質を有する。すなわ
ち、大腸菌内で増幅を可能にする微生物レプリコンであ
り、大腸菌内で機能し検出できる選択可能な遺伝子マー
カーの存在、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内で生理的に機
能し大腸菌内でもしばしば機能する構造遺伝子の存在お
よびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのゲノムへの組込みに必
要なＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡ断片の存在を特
徴とする。 【００１１】一般に、本発明に係る有用なベクターの製
造は、異種微生物（すなわち、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ以外の任意の種）内で、望ましくは細菌内で、好まし
くは大腸菌内で、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内と同時に
機能するベクター、すなわちハイブリッドベクターの製
造に基づくものである。このようなベクターは微生物Ｄ
ＮＡと、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの染色体ＤＮＡの断
片からなり、この断片は少なくとも１個の選択可能な遺
伝子マーカー、すなわちＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内で
機能し検知可能な遺伝子を含有する。このように構築さ
れたベクターはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内の相同染色
体配列と相互に作用し、その染色体に組込まれ、かくし
て形質転換が行われる。 【００１２】本技術分野の熟練者には明らかなように、
酵母起源の２個以上の遺伝子を含むベクターを形成すれ
ば、そのベクターからの組込み体、すなわちそのベクタ
ーからなる形質転換体、とくに２個以上の遺伝子を有す
る組込み体の形成が容易になる。多数の遺伝子の存在に
より、酵母内におけるベクターの存在の検出能が増加
し、改善されるのはもちろんである。 【００１３】組込みは、このベクターの環状型、直線型
および切れ目のある直線型によって行われる。直線型お
よび切れ目のある直線型ベクターが環状型ベクターより
も高い効率で組込まれる。したがって、ベクターは独特
の制限部位、すなわち起源の微生物ＤＮＡベクターまた
はベクターのＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ断片成分内の他
の部分に存在しない部位を有することが望ましい。ベク
ターをこのような部位で直線化すれば、同種染色体配列
における組込みによるＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの形質
転換が可能な高頻度組換え末端を有する二重鎖ＤＮＡが
生成する。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（前出）がＳ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅで示したように、切れ目のある直線状
プラスミドも組込み可能である。この種のプラスミド
は、ベクターのＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色体ＤＮＡ
セグメント内で制限酵素による２個所の切断を行えば製
造できる。後述するｐＬＤ２５の場合、Ｂｇｌ II部位
が２個所存在するので、切れ目のある直線状プラスミド
の製造に便利である。 【００１４】本発明に係るベクターの価値は、その内部
に、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内で検出でき、機能する
選択可能な遺伝子マーカー、すなわち検出可能マーカー
が存在することである。適当なマーカーとしては、以下
のＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子、すなわちＬＥＵ
２、ＡＤＥ１、ＵＲＡ３、ＸＲＰ２、ＨＩＳ１がある
が、選択を与えるＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの任意の遺
伝子が使用可能なことは、本技術分野の熟練者には自明
のとおりである。ＬＥＵ２遺伝子の全部または一部はと
くに有用である。この遺伝子またはその部分はＹ．ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａの染色体ＤＮＡを、適当な制限酵素た
とえばＳａｕ３Ａで部分消化することにより、Ｙ．ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａから得られる。このベクターまたはそ
のサブクローンは、公知方法に従ってＤＮＡのランダム
セグメントを挿入することにより、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔ
ｉｃａクローニングベクターの産生を可能にする。得ら
れたベクターをついで、選択可能マーカーに相当する遺
伝子内に突然変異を有するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株
の形質転換に用いられる。このようなＹ．ｌｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａマーカーを有する形質転換ＤＮＡは受容株に選
択的生育の利益を与えたり、受容株の栄養要求性変異を
矯正することができる。 【００１５】一般的には、全ＬＥＵ２遺伝子を含有する
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡ断片を用いることが
好ましい。この断片によれば、大腸菌内でもＹ．ｌｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ内でも生理的に機能するベクターの製造
が可能だからである。しかしながら、全ＬＥＵ２遺伝子
を有するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡ断片の使用
が本発明の方法で好結果を得るのに必須なわけではな
い。受容株に組込まれて野生型遺伝子を生成するのに十
分な量の野生型配列を包含するＤＮＡ断片を用いさえす
ればよい。この断片は大腸菌内で機能しないが、Ｙ．ｌ
ｉｐｏｌｙｔｉｃａ内で検出できる。 【００１６】本発明に係る有用なベクターの製造には、
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色体ＤＮＡの完全Ｂａｍ
ＨＩ消化により得られＨＩＳ１遺伝子を含むか、または
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ 染色体ＤＮＡの部分Ｓａｕ
３Ａ消化により得られＵＲＡ３遺伝子を含むＹ．ｌｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡの断片も価値がある。これらの
断片は結合可能な末端を有し、直線状の、たとえばＢａ
ｍ ＨＩ、ＹＥｐ２４を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅベクター（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら；Ｇｅ
ｎｅ ８：１７〜２４、１９７９）と結合させれば、Ｈ
ＩＳ１遺伝子またはＵＲＡ３遺伝子を持つハイブリッド
ベクターが得られる。 【００１７】本明細書に述べる新規なベクターを用い、
ショットガン法で、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのランダ
ムセグメントを挿入することができる。生成したベクタ
ーは、標準方法で選ばれる各種突然変異体、形質転換体
の形質転換に使用できる。たとえば、ＬＥＵ２含有ベク
ターは、他のＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子たとえば
ＵＲＡ３のクローニングに使用できる。選択された任意
の形質転換体中にクローン化されたＵＲＡ３遺伝子は、
ＬＥＵ２遺伝子とは別にサブクローン化でき、有効な
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａベクターとして利用できる。 【００１８】一般に、バクテリアたとえば大腸菌のプラ
スミド複製起源とそのバクテリアの選択可能な遺伝子マ
ーカーは、公知の方法に従い、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ内で検出可能な選ばれたＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
遺伝子の全部または一部と結合させることができる。大
腸菌クローニングシステムは、大腸菌内での生育および
増幅によりプラスミドＤＮＡの大量（バルク）産生が容
易で、大腸菌内でのベクターおよび遺伝子ライブラリー
の構築が可能なので、とくに有用である。 【００１９】本明細書に述べるプラスミドは、組換えＤ
ＮＡ技術におけるベクターとして有用である。たとえ
ば、適当な制限酵素で切断して接合可能末端を有する直
線状ＤＮＡを得、ついでこれを結合可能末端を有する外
因性遺伝子と反応させることにより、プラスミドに各種
の遺伝子を挿入することができる。得られたプラスミド
で次に適当な宿主微生物、たとえばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅやＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのような酵母の形質
転換を行い、これを適当な条件下に培養すれば、所望の
生成物を産生する。いずれもＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
からのＬＥＵ２遺伝子を含むプラスミドｐＬＤ２５およ
びｐＬＤ２８は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ受容株内で
選択され、検出可能である。したがって、これらはＹ．
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａクローニングベクターの製造に使
用できる。 【００２０】さらに、本明細書に述べるプラスミドは、
微生物とくにＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの発酵特性を改
良し、その固有の欠点を除去し、工業的有用性を増大さ
せる方法を提供する。たとえば、各種の炭素源の利用を
コードする遺伝子をプラスミドに導入し、得られたプラ
スミドでＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのような適当な宿主
を形質転換すれば、その宿主の栄養特性を改良し、Ｙ．
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに利用可能な炭素源スペクトルを
拡大することができる。 【００２１】この目的に必要なベクター、たとえばプラ
スミドまたはコスミドは組換えＤＮＡ技術の技術分野に
おける熟練者によく知られた技術によって構築される。
特定のペリプラズム酵素をコードするＹ．ｌｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａ ＤＮＡ配列が公知方法で単離され、たとえば
ｐＬＤ２５またはその誘導体に挿入される。所望の構造
遺伝子、たとえばマルターゼの遺伝子は、ペリプラズム
酵素のＤＮＡ配列に融合され、得られたプラスミドで
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを形質転換することができ
る。このプラスミドは本発明の方法によってＹ．ｌｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａの遺伝子のひとつに組込まれる。かくし
て産生された形質転換体は、培養するとマルトースをグ
ルコースに加水分解することができ、しかも母株の持っ
ていなかった望ましい性質を有する。 【００２２】プラスミドｐＬＤ２５は大腸菌内で自律複
製を行う。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内では組込まれる
が自律複製はしない。大腸菌複製プラスミドｐＢＲ３２
２内に、望ましくは以下の２つの識別性、すなわち第一
にＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内でまた好ましくは同時に
大腸菌内でも生理的に機能し、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ内で検出可能な構造遺伝子の存在、第二にＹ．ｌｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ宿主の製造遺伝子における欠点矯正の目
的で宿主に導入されたＤＮＡ配列の側面に位置する領域
における独特の制限部位（起源の大腸菌プラスミド、
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ宿主断片の他の場所に存在し
ない）の所持、が与えられたＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
ＤＮＡ断片を挿入することにより得られる。高頻度形
質転換を達成するためには、独自の制限部位の所持が必
須である。 【００２３】それぞれＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＨＩ
Ｓ１遺伝子を持つ後述のプラスミドｐＬＤ２１およびｐ
ＬＤ２３は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの染色体ＤＮＡ
の完全Ｂａｍ ＨＩ消化によって得られる断片をそれぞ
れＹＥｐ２４およびｐＢＲ３２２に挿入して作製される プラスミドｐＬＤ２５は大腸菌ｌｅｕＢ^- 突然変異と相
補的なＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡ断片を含有
し、プラスミドｐＬＤ２１およびｐＬＤ２３は大腸菌ｈ
ｉｓＧ^- 突然変異と相補的な断片を含有する。プラスミ
ドｐＬＤ２８も、大腸菌内で自律的に複製するが、Ｙ．
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内では組込み能はあるものの自律
的複製はしない。これは、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
ＬＥＵ２遺伝子を含むＳａｌ Ｉ断片をＹＥｐ２４のＳ
ａｌＩ部位に挿入して構築される。これはｌｅｕ２突然
変異株で選択可能なＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内組込み
ベクターであり、ｕｒａ３またはｌｅｕ２突然変異株に
おいて選択可能なＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内マルチコ
ピープラスミドであり、アンシピリン抵抗性によって選
択可能な大腸菌内マルチコピーである。ｐｙｒＦ突然変
異株内でもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＵＲＡ３遺伝子
の適切な機能、また効率は悪いが、ｌｅｕ Ｂ突然変異
株内でのＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＥＵ２遺伝子の
弱いが検知可能な機能によっても選択可能である。 【００２４】プラスミドｐＬＤ２５は大腸菌とＹ．ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａのシャトルベクターである。これは、
大腸菌内でＤＮＡ複製を可能にするバクテリア配列と酵
母内での組込みを可能にする配列との両者を含む。すな
わち、大腸菌の複製起点と相同のＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉ
ｃａ領域を含む。「シャトル」の語は、大腸菌内で構築
されたそのベクターがＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色体
へ組込み可能で、大腸菌に再導入されて環を完成できる
ことを意味する。プラスミドｐＬＤ２８もＳ．ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅのシャトルベクターである。これらのシャ
トルベクターは大腸菌の突然変異株の相補により、また
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉ
ｃａの突然変異株の直接相補により、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａ遺伝子のクローニングを可能にする。これらの
現象は、機能性ＬＥＵ２遺伝子産生物が両異種システム
内で形成されることを示している。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔ
ｉｃａにおける直接相補の発見により、突然変異を同定
できる任意の遺伝子のクローニングが可能になった。 【００２５】以下に述べるプラスミドｐＬＤ４０は、ｐ
ＢＲ３２２のＥｃｏ ＲＩ部位に、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔ
ｉｃａのＬＥＵ２領域を含む、ｐＬＤ２５の部分Ｅｃｏ
ＲＩ消化で得られた小セグメントを挿入することによ
り構築される。プラスミドｐＬＤ５５は、ＵＲＡ３含有
プラスミドで、ｐＬＤ４０のＢａｍ ＨＩ部位にＹ．ｌ
ｉｐｏｌｙｔｉｃａのＵＲＡ３遺伝子を挿入することに
より得られた。 【００２６】図１は、ｐＢＲ３２２中Ｙ．ｌｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａのＳａｕ３Ａ部分消化遺伝子ライブラリーであ
る。このアガロースゲルは、このライブラリー（ＬＩ
Ｂ）は２．３ｋｂ ｌａｍｂｄａ−Ｈｉｎｄ III標準
（ＳＴＤ）のわずか上部に移動し、挿入ＤＮＡのないｐ
ＢＲ３２２超らせんプラスミドを含むこと、一方、分子
の残部は、標準４．３ｋｂ上にほぼ連続したスミアとし
て移動したＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡの多様の
（４〜１０ｋｂ）大きさに分割された挿入体を含んでい
る。中間のレーンは切断されていないプラスミド（ｐＬ
Ｄ２１）で、２個の分離したバンドが認められる。 【００２７】図２は、Ｅｃｏ ＲＩ消化Ｙ．ｌｉｐｏｌ
ｙｔｉｃａバルクＤＮＡと放射活性ｐＬＤ２５で確認さ
れたｐＬＤ２５のサザーンハイブリダイゼイションであ
る。ｐＬＤ２５のｂ，ｃ，ｄの３個の内部バンドは、全
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａＤＮＡの同じ大きさの小片に
相同であることを示している。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａのレーンのさらに２個の薄いバンド（１および２）は
多分、プラスミドバンドａおよびｅの小Ｙ．ｌｉｐｏｌ
ｙｔｉｃａ部分に相同性を有するものと思われる。ＳＴ
Ｄと記したレーンはｌａｍｂｄａ−Ｈｉｎｄ IIIサイズ
標準を含有する。Ｐと記したレーンは約２ｎｇのＥｃｏ
ＲＩ消化ｐＬＤ２５を含有する。Ｙｌと記したレーン
は全Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡ約１μｇを含有
する。ｐＢＲ３２２をプローベとして用いた同様のサザ
ーン実験では、ｐＬＤ２５からのバンドａおよびｅのみ
がハイブリッドされる。 【００２８】図３は、ｐＬＤ２５の制限酵素地図であ
る。単一消化および一部の二重消化に基づく部分制限酵
素地図を示す。括弧を付した部分は相互の関係が決定さ
れていない。大きさはすべてアガロースゲルでの観察に
基づく推測値である。細線はｐＢＲ３２２ＤＮＡ（Ｅｃ
ｏ ＲＩ部位を１２時の位置にした標準ホーマットにお
いて）で、太線はＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａからの挿入
ＤＮＡである。この挿入体は３個のＥｃｏＲＶ（Ｒ
Ｖ）、８個のＡｖａ Ｉ（Ａ、１個しか地図化されてい
ない）、１個のＳｐｈ Ｉ（Ｓｐ）、１個のＫｐｎ Ｉ
（Ｋ）、２個のＳａｌＩ（Ｓ）、４個のＥｃｏ ＲＩ
（ＲＩ）、２個のＸｈｏ Ｉ（Ｘ）および２個の互いに
接したＢａｌII（Ｂ）部位を有する。挿入体にはＨｉｎ
ｄ III、ＣｌａＩ、Ｂａｍ ＨＩおよびＮｒｕ Ｉ部位
を欠く。Ｅｃｏ ＲＩ末端、ｌｅｕ２マーカーを有する
２．３ｋｂのサブクローンはｐＢＲ３２２のＥｃｏ Ｒ
Ｉ部位においてただ１個のオリエンテーションでのみ大
腸菌内で機能する。 【００２９】図４は、放射性ｐＢＲ３２２プローベを有
するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ形質転換体からＨｉｎｄ
III消化バルクＤＮＡのサザーンハイブリダイゼーショ
ンである。４種の異なる形質転換体および母株から単離
された全ＤＮＡのＨｉｎｄ III消化物をアガロースゲル
にかけ、ブロットし、標識ｐＢＲ３２２でプローベす
る。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ形質転換体＃６は完全な
環状ｐＬＤ２５で形質転換した培地からランダムに選択
した。形質転換体１１，１２および１５はＫｐｎＩ直線
化ｐＬＤ２５で形質転換した培地から得られた。Ｙ．ｌ
ｉｐｏｌｙｔｉｃａ形質転換体はすべてハイブリダイゼ
ーションの２個のバンド、すなわち長さ２３ｋｂ以上の
強いバンド１と長さ９．３ｋｂのｌａｍｂｄａ−Ｈｉｎ
ｄ III標準と同じ大きさの薄いバンド２を与えた。ＰＣ
と記したレーンは母株（ＰＣ ３０８２７、ＡＴＣＣ
２０６８８）ＤＮＡで、プローベに対する有意なハイブ
リダイゼーションはみられない。 【００３０】図５は、ｐＬＤ２３およびｐＬＤ２４によ
る制限消化である。このアガロースゲルはｌａｍｂｄａ
−Ｈｉｎｄ IIIサイズ標準を左外側のレーンに含み、そ
れぞれａ）Ｅｃｏ ＲＩ処理、ｂ）Ｂａｍ ＨＩ処理、
ｃ）ｐＬＤ２３（相補的Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｉｓ Ｇ突然
変異体）およびｐＬＤ２４（相補性なし）の酵素非処理
である。それぞれのレーンｂは２個の互いに隣接するＢ
ａｍ ＨＩバンドを含む。大きい方はｐＢＲ３２２に相
当し、わずかに小さいバンド（約４ｋｂ）はＹ．ｌｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ Ｂａｍ ＨＩ挿入体を表す。Ｅｃｏ
ＲＩ消化体はＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ小片が２個のプ
ラスミドの逆方向にあることを示している。 【００３１】図６は、ｐＬＤ２８の制限酵素地図であ
る。ＬＥＵ２領域を含む５．３ｋｂのＹ．ｌｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａ ＳａｌＩ小片に加えて、このプラスミドは酵
母２ミクロンプラスミドからの複製起点をもつ２．２ｋ
ｂ Ｅｃｏ ＲＩ小片と、ｐＢＲ３２２の相当部位に挿
入されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＵＲＡ３遺伝子を
もつ１．１ｋｂ Ｈｉｎｄ III小片を含んでいる。 【００３２】図７は、ｐＬＤ４０の制限酵素地図であ
る。制限部位の略号は前図と同じである。さらにＮｃｏ
Ｉ（Ｎ）、Ａｐａ Ｉ（Ａｐ）およびＢｓｔ Ｘ Ｉ
（Ｂｓ）の地図が地図化されている。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａ ＬＥＵ２含有セグメントは２．３〜２．４ｋ
ｂで、ｐＢＲ３２２のＥｃｏ ＲＩ部位に挿入されてい
る。ｐＢＲ３２２中の制限部位は示されていない。 【００３３】図８は、ｐＬＤ５５とｐＬＤ４０の制限消
化を比較したものである。このゲルのレーン（ｌａｍｂ
ｄａ−Ｈｉｎｄ IIIサイズ標準に加えて）は、ａ）非消
化ｐＬＤ４０、ｂ）Ａｐａ Ｉ消化ｐＬＤ４０、ｃ）Ｅ
ｃｏ ＲＩ消化ｐＬＤ４０、ｄ）Ｅｃｏ ＲＩ消化ｐＬ
Ｄ５５である。これらの消化体から、クローン化された
ＵＲＡ３含有領域は２個のＥｃｏ ＲＩ部位を有し、長
さは約４ｋｂであることを示している。 【００３４】プラスミド プラスミドｐＬＤ２５は大腸菌およびＹ．ｌｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａに対する選択可能な遺伝子マーカーを含有し、
マルチコピープラスミドである大腸菌複製プラスミドｐ
ＢＲ３２２から誘導される。これはｐＢＲ３２２のＢａ
ｍ ＨＩ部位に、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色体ＤＮ
ＡのＳａｕ３Ａによる部分消化で得られた約６．６ｋｂ
の断片を挿入することにより構築される。プラスミドｐ
ＬＤ２８はｐＬＤ２５のサブクローンで、これも大腸菌
とＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに対する選択可能なマーカ
ーと、さらにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対し選択可能
な遺伝子マーカーも有し、ＹＥｐ２４から誘導される。
これはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＥＵ２遺伝子を含
む約５．３ｋｂのＳａｌ Ｉ断片をＹＥｐ２４のＳａｌ
Ｉ部位に挿入して構築される。プラスミドｐＬＤ４０
もｐＬＤ２５のサブクローンで、ｐＬＤ２５からの２．
３〜２．４ｋｂ Ｅｃｏ ＲＩ部分消化断片をｐＢＲ３
２２のＥｃｏ ＲＩ部位に挿入して構築される。 【００３５】微生物 使用した微生物は大腸菌の株およびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔ
ｉｃａの株で、これらはＰｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．の培養
コレクションにそれぞれＥ．ｃｏｌｉ ＪＣ−３５５
〔Ｃｌａｒｋら：Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅ
ｔ．，１０５：１（１９６９）、大腸菌遺伝株センタ
ー、エール大学から８６７号株として得られた〕および
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＰＣ−３０８２７として寄
託されている。このＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａはＪ．
Ｒ．ＤｅＺｅｅｕｗの米国特許出願第５３９，３６３号
（１９８３年１０月６日出願）の主題となっている。ベ
クターｐＢＲ３２２中でＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの遺
伝子ライブラリーの製造に用いた他の微生物、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＭＣ１０６１はＣａｓａｄａｂａｎら：Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，１３８：１７９〜２０７（１９８０）
に記載されている。この微生物は高頻度形質転換が可能
なので、この目的にとくに有用である。他の微生物も
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１に代わりに使用できる。適
当な微生物の代表は、制限マイナスの大腸菌株、たとえ
ばＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ＮＲＲＬＢ１１３７１、
またはＡＴＣＣ３３６９４としても入手可能）であり、
この株は形質転換のためコンピテントにすることができ
る。ロイシンおよびウラシル遺伝子を欠く大腸菌株（Ｄ
Ｂ６５０７、ＡＴＣＣ３５６７３、ＨＢ１０１のＴｎ５
挿入突然変異体、Ｄ．Ｂ．Ｂｏｔｓｔｅｉｎより）はｌ
ｅｕＢ ｐｙｒＦ ７４：：Ｔｎ５ ｈｓｂＲ^- Ｍ
^- で、プロリンも要求する。 【００３６】以下の微生物がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ (Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に寄託
されていて利用できる。すなわち、 ＡＴＣＣ ２０６８８ Yarrowia lipolytica ＰＣ−３０８２７ ＡＴＣＣ ２０６８７ Yarrowia lipolytica ＰＣ−３０８２７のｐＬＤ２５ による形質転換体 ＡＴＣＣ ３９４６４ Escherichia coli ＪＣ−３５５のｐＬＤ２５による 形質転換体 ＡＴＣＣ ２０７１８ Yarrowia lipolytica ＰＣ−３０８２７のｐＬＤ ５５ による形質転換体 【００３７】これらはブタペスト協約に基づいてＡｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に
寄託されている。公認された寄託機関は永久寄託とこの
出願が登録されれば公衆への提供とが保証される。この
出願の係属中には、米国特許庁のコミッショナーが３７
ＣＦＲ１．１４および３５ＵＳＣ１２２により資格あり
と定めた者に、また本願の対応特許または関連特許が出
願された外国ではその国の特許法により、利用が許され
る。寄託された微生物の公衆利用に関するすべての制限
は、特許登録時に解除される。 【００３８】Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＡＴＣＣ２０
６８８の分類学的研究はＬ．Ｈ．Ｈｕａｎｇ博士によっ
て行われた。これを以下に示す。使用したメジウムおよ
び方法はＬｏｄｄｅｒ著：Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔｓ第２
版、Ｎ．Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９７０に推賞されたもの
である。Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ〔Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓｌｉｐｏｌｙｔｉｃａと
しても知られている。現在はＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍら）としてｖａｎ
ｂｅｒ Ｗａｌｔおよびｖｏｎ Ａｒｘ（Ａｎｔｏｎ
ｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ ４６：５１７
〜５２１、１９８０）により分類されている〕の培養菌
株ＣＢＳ ５９９と比較した。 【００３９】ＰＣ−３０８２７株はロイシンおよびウラ
シルを要求する（Ｊ．Ｒ．Ｄｅｚｅｅｕｗ）ので、ロイ
シンエチルエステルおよびウラシルをそれぞれ１４９ｍ
ｇ／ｌおよび２０ｍｇ／ｌの濃度、以下の培地、すなわ
ち、炭素化合物の同化をみる基礎培地、硝酸カリウムの
同化をみる肉汁、生育をみるビタミンを含まない肉汁、
および生育刺激に対するビタミンの効果をみる肉汁であ
る。ロイシンエステルはロイシンに比べ、炭素源として
ゆっくり利用される。他の培地は有機性で、添加物なし
で生育を支持するものでなければならない。上述の培地
に添加物を加えまたは加えないで、ＣＢＳ−５９９株に
ついても使用した。 【００４０】以下に述べるように、両株は大部分の培養
的および形態的特性が等しい。２，３の相違がみられる
のみである。たとえばＣＢＳ−５９９をグルコース−酵
母抽出物−ペプトンアガール上で画線培養すると、わず
かに粗またはわずかに縮毛状を呈するのに対し、ＰＣ−
３０８２７の場合は明瞭な縮毛状を示す。ＰＣ−３０８
２７はＣＢＳ−５９９株に比べて、コーンミールアガー
ル上での生育が貧弱で、真の菌糸体の産生は低い。 【００４１】ＣＢＳ−５９９では、上述の培地にロイシ
ンエチルエステルおよびウラシルを補給した場合の結果
は、補給物がないときはクエン酸を使うが補給物がある
ときは使わないとするほかは補給物を用いない場合の結
果と同一であった。これは補給物が炭素源としても窒素
源としても利用されていないことを示し、したがってＰ
Ｃ−３０８２７株の培地への添加物の添加は容認でき
る。 【００４２】ＣＢＳ−５９９株に比べて、ＰＣ−３０８
２７株は、コハク酸、Ｄ−グルシトールおよびグリセロ
ール上、「良好」ではなく「なし」〜「弱」の生育を示
し、ビタミンを含まないメジウムおよびサリシン上の生
育は「弱」ではなく「なし」、生育刺激に対するチアミ
ンの効果は「良好」ではなく「なし」〜「弱」である。
ＰＣ−３０８２７株はＬ−ソルボース上では生育しない
のに対し、ＣＢＳ−５９９では逆である。生化学的試験
におけるＰＣ−３０８２７とＣＢＳ−５９９の間のいく
つかの相違は、定量的なものである。ＰＣ−３０８２７
の突然変異株の生化学的試験結果はＣＢＳ−５９９菌型
培養の場合と等しかった。この結果をｖａｎ Ｕｄｅｎ
とＢｕｃｋｌｅｙが提案したＣａｎｄｉｄａ種に対する
キーに用いると（ＴｈｅＹｅａｓｔ、Ｅｄ． Ｊ．Ｌｏ
ｄｄｅｒ、１９７０）、この２株はそれぞれＣａｎｄｉ
ｄａ ｌｏｐｏｌｙｔｉｃａ、すなわちＹｅｒｒｏｗｉ
ａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの不完全状態に分類される。 【００４３】ＣＢＳ−５９９株 グルコース−酵母抽出物−ペプトン水上での生育 ３日間２８℃で培養後、細胞は丸、長丸〜長で、１〜３
個の芽胞をと伴う。丸い細胞は５〜１６×３〜７μｍ、
長い細胞は３０μｍまでの長さを示す。擬菌糸体あり。
菌膜あり。沈殿。グルコース−酵母抽出物−ペプトンアガール上での生育 ２８℃で１ヵ月培養後、培地はクリーム状で、隆起。わ
ずかに粗またはわずかに縮毛状、光沢のないあるいは湿
潤した表面を呈す。コーンミールアガール上Ｄａｌｍａｎ平板培養 生育：中等度。灰白色。擬菌糸体および真の分かれた菌
糸体あり。単一、対または３個の卵状の芽胞が菌糸また
は擬菌糸上、末端または側面に、あるいは輪生状に形成
される。 【００４４】発酵 グルコース、ガラクトース、シュクロース、マルトー
ス、トレハロースおよびラクトース上で発酵しない。 【００４５】炭素化合物の同化：基礎培地（基礎培地＋
ロイシンエチルエステルおよびウラシル） グルコース ＋（＋） ガラクトース −（−） Ｌ−ソルボース ＋（＋） シュクロース −（−） マルトース −（−） セロビオース −（−） トレハロース −（−） ラクトース −（−） メリビオース −（−） ラフィノース −（−） メレジトース −（−） クエン酸 ＋（−） 可溶性デンプン −（−） Ｄ−キシロース −（−） Ｌ−アラビノース −（−） Ｄ−アラビノース −（−） Ｄ−リボース 弱（弱） Ｌ−ラムノース −（−） エタノール ＋（＋） グリセロール ＋（＋） エリスリトール ＋（＋） イノシトール −（−） リビトール −（−） ガラクチトール −（−） Ｄ−マニトール ＋（＋） Ｄ−グルシトール ＋（＋） サリシン 弱（弱） ＤＬ−乳酸 弱（＋） α−メチル−Ｄ−グルコシド −（−） コハク酸 ＋（＋） 【００４６】硝酸カリウムの同化（ロイシンエチルエス
テルおよびウラシルの添加または非添加） なし 【００４７】ビタミンを含まないメジウム中での生育
（ロイシンエチルエステルおよびウラシルの添加または
非添加） 弱い生育 【００４８】ビタミン刺激の生育 ロイシンエチルエステルおよびウラシルを含むまたは含
まない肉汁中でチアミンは生育を刺激する。 【００４９】食塩耐性 １１％〜１２％生育最高温度 ３７℃〜４５℃ 【００５０】ＰＣ−３０８２７株 グルコース−酵母抽出物−ペプトン水上での生育 ３日間２８℃で培養後、細胞は丸、長丸、長型、まれに
楕円形で、１〜３個の芽胞を伴う。丸型細胞の大きさは
５〜１４×３〜６μｍ、長型細胞の大きさは２５μｍま
でである。擬菌糸体あり。菌膜あり。沈殿。グルコース−酵母抽出物−ペプトンアガール上での生育 ２８℃で１ヵ月間、画線培養後、培地はクリーム状、隆
起。明瞭に縮毛状。光沢のない表面を示す。コーンミールアガール上Ｄａｌｍａｎ平板培養 生育：貧弱。灰白色、擬菌糸体あるが、希薄で短い。真
の分かれた菌糸体はまれにある。単一、対または３個の
卵状ないし球形の芽胞が、末端または側面に、ときには
群生して、形成される。 【００５１】発酵 グルコース、ガラクトース、シュクロース、マルトー
ス、トレハロースおよびラクトース上で発酵しない。 【００５２】炭素化合物の同化：基礎培地（基礎培地＋
ロイシンエチルエステルおよび ウラシル） グルコース 弱 ガラクトース − Ｌ−ソルボース − シュクロース − マルトース − セロビオース − トレハロース − ラクトース − メリビオース − ラフィノース − メレジトース − 可溶性デンプン − Ｄ−キシロース − Ｌ−アラビノース − Ｄ−アラビノース − Ｄ−リボース 弱 Ｌ−ラムノース − エタノール 弱 グリセロール −〜弱 エリスリトール ＋ リビトール − ガラクチトール − Ｄ−マニトール ＋ Ｄ−グルシトール −〜弱 サリシン − ＤＬ−乳酸 弱 α−メチル−Ｄ−グルコシド − コハク酸 −〜弱 クエン酸 − イノシトール − 【００５３】硝酸カリウムの同化（ロイシンエチルエス
テルおよびウラシル添加） なしビタミンを含まないメジウム中での生育 （ロイシンエチ
ルエステルおよびウラシルの添加） なしビタミン刺激の生育 ロイシンエチルエステルおよびウラシルを含む肉汁中で
チアミンの生育刺激は「弱」〜「なし」である。食塩耐性 １１％〜１２％生育最高温度 ３７℃〜４５℃ 【００５４】Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＰＣ−３０８
２７は希にしか復帰突然変異しないｌｅｕ２−３５を含
んでいる。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＥＵ２遺伝子
は、酵素β−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ
（ＥＣ １，１，１，８５）をコードし、大腸菌のｌｅ
ｕＢ遺伝子によりまたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＬＥ
Ｕ２遺伝子によりコードされる。 【００５５】Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＣ−３５５およびＹ．ｌ
ｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＡＴＣＣ２０６８８のそれぞれに
ｐＬＤ２５を挿入すると、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＣ−３５５
およびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＡＴＣＣ２０６８８
それぞれのｐＬＤ２５を有する形質転換体が得られる。
これらは、ファイザー社（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）の
カルチャーコレクション（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ）によりそれぞれＦ．Ｄ．２７５３４および
Ｆ．Ｄ．２７５３３と同定されている。 【００５６】Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株ＮＲＲＬ Ｙ
−１０９４、野生型株（すなわち、微生物学の分野での
熟練者によって通常用いられている株）からの染色体Ｄ
ＮＡをＨｅｒｅｆｏｒｄら：Ｃｅｌｌ、１８：１２６１
〜１２７１（１９７９）の方法で得た。 【００５７】本発明に係る新規プラスミドｐＬＤ２５
は、直線化ｐＢＲ３２２を、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
染色体ＤＮＡの部分Ｓａｕ３Ａ消化体と、Ｔ₄ リガーゼ
を用いて結合させることにより構築される。ｐＢＲ３２
２はバクテリアＤＮＡからの共有結合的に閉じた超コイ
ルｐＢＲ３２２を分離するため、ＣｓＣｌ−エチジウム
グロマイド勾配で遠心分離して単離された。ｐＢＲ３２
２を制限酵素Ｂａｍ ＨＩで消化してテトラサイクリン
抵抗性遺伝子（Ｔｃ^R ）内で分裂させ、直線化すると、
コヘッシブ末端（粘着末端）を有し、アンシピリン抵抗
性（Ａｍｐ^R ）を表現型形質として残した線状の断片を
生じる。ゲル（アガロース）電気泳動に付すと、このベ
クターはバクテリアＤＮＡを実質的に含まないことがわ
かる。かくして得られた線状ｐＢＲ３２２を所望により
アルカリホスファターゼで処理し、自己結合、すなわち
ベクターＤＮＡの再環化およびタイマー形成を防止す
る。 【００５８】ｐＬＤ２５の第二の成分は、Ｙ．ｌｉｐｏ
ｌｙｔｉｃａ株ＮＲＲＬ Ｙ−１０９４、野生型株の染
色体ＤＮＡを、コヘッシブ末端を有して、ｐＢＲ３２２
のＢａｍ ＨＩ開裂の断片に相補性のほぼランダムな断
片を生成する制限酵素Ｓａｕ３Ａ部分消化に付すと得ら
れる。アガロースゲルから収穫される、範囲４〜１０ｋ
ｂのＤＮＡを公知方法で精製したのち、Ｂａｍ ＨＩ切
断部でアルカリホスファターゼ処理ベクターｐＢＲ３２
２を結合させる。 【００５９】本発明に係る方法においては、ＤＮＡ断片
の大きさには制限はない。ＤＮＡ断片に関する限定は、
それが検出可能なマーカーたとえばＬＥＵ２遺伝子のす
べてまたは十分な部分を含有することである。さらに、
大腸菌プラスミド、この場合はｐＢＲ３２２の制限酵素
開裂によって生じた断片に相補的なコヘッシブ末端を待
たねばならないことである。ベクターＤＮＡと、Ｙ．ｌ
ｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色体ＤＮＡの３ａｕ３Ａ部分消化
体は、補因子としてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存
在下にＴ₄ リガーゼを用いて結合させる。 【００６０】結合混合物は、まずＥ．ｃｏｌｉ ＭＣ１
０６１（Ｃａｓｄａｂａｎら：Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏ
ｌ．，１３８：１７９〜２０７、１９８０）の形質転換
に用いる。この大腸菌の株はきわめて高い形質転換頻度
を示し、ｈａｄＲ^- 、ｈｓｄＭ ⁺ であるので、上記大腸
菌でＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子ライブラリーを与
える。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１の全く異なるアンピ
シリン抵抗性形質転換体をアンピシリン＋Ｌ−アガール
平板上で生育させ、収穫した。収穫した培養細胞をアン
ピシリン含有メジウム１リットル中で生育させた。遺伝
子ライブラリーを作るための標準方法で混合プラスミド
が単離された。このライブラリーの一部をとり、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＪＣ−３５５を形質転換させた。形質転換体は
アンピシリン抵抗性によって選択した。これらの形質転
換体を次にレプリカ法で、ロイシンを含まない合成培地
に転写した。また、形質転換混合物を直接、ロイシンを
含まないアンピシリン含有合成培地に置いてもよい。こ
のようにして選択された形質転換体はロイシン原栄養株
である。この形質転換体中のプラスミドを標準方法によ
って単離し、ｐＬＤ２５と比較する。 【００６１】ロイシン原栄養性形質転換体から得られた
プラスミドの微量サンプルをＨｉｎｄ IIIおよびＳａｌ
Ｉで消化させて分析したところ、期待されたｐＢＲ３
２２からの３．７ｋｂ断片、および約６．６ｋｂのサイ
ズの挿入体を示す２個の大きな断片を含むことが明らか
にされた。また、小さな断片（ｐＢＲ３２２のＳａｌＩ
部位から挿入体のＳａｌ Ｉ部位近くまで、第３図参
照）も発見された。プラスミドｐＬＤ２５のサザーンブ
ロットハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ：
Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，９８：５０３〜５１７、１
９７５）を、Ｅｃｏ ＲＩ消化Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ染色体ＤＮＡのハイブリダイゼーションと比較する
と、クローン化挿入体の内容の３個のＤＮＡは染色体Ｄ
ＮＡのものと同一であることがわかった。 【００６２】Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの完全ｐＬＤ２
５およびＫｐｎＩ切断ｐＬＤ２５による形質転換につい
て、それが組込まれたかまたは独立に複製されるｐＬＤ
２５（ＬＥＵ２含有プラスミド）を含むかどうかを試験
した。染色体ＤＮＡはロイシン原栄養性形質転換体と母
株のＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、ＡＴＣＣ ２０６８８
から作成した。ＤＮＡサンプルはＨｉｎｄ IIIで切断
し、０．５％アガロースゲルにかけ、サンプル中のプラ
スミドｐＬＤ２５の存在を調べるため放射性ｐＢＲ３２
２を用いるサザーンブロット法により解析した。母株の
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株とプローベの間には相同性
は認められなかった。ｐＬＤ２５には１個のＨｉｎｄ I
II部位がある（ｐＢＲ３２２セグメント内）から、そし
てＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａセグメントにはないので、
ｐＬＤ２５が形質転換体内で独立に複製されているので
あれば、ｐＬＤ２５サイズの１個のバンド（約１１ｋ
ｂ）がみられるばずである。このようなバンドがないこ
とは、形質転換体はいずれも組込み体であるとの結論に
なる。環状、直線状および切れ目のある直線状プラスミ
ドは、相同の染色体配列との組換えによって、Ｙ．ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａを形質転換できる。 【００６３】しかしながら、形質転換頻度は、完全プラ
スミド処理細胞におけるよりも、Ｋｐｎ Ｉ−切断プラ
スミド処理細胞の方が著しく高いことから、さらに、Ｏ
ｒｒ−ＷｅａｖｅｒらによりＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
について記述された組込み形質転換（Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，７８：６３５４〜６３
５８、１９８１）がＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａでも同様
に起こることを示している。上述のサザーンブロットは
直線分子から誘導された組込み形質転換体の構造は、環
状分子（すなわちプラスミド）から誘導された形質転換
体と同じ挙動をすることを示している。さらに、サザー
ンブロット実験により、完全なプラスミド処理から生じ
る希な形質転換体の一部はｐＢＲ３２２ハイブリッド可
能材料を欠き、多分、遺伝子変換または二重組換えによ
って生じたものと思われる。本明細書に記載の形質転換
システムの有用性は、その形質転換システムに述べた組
込みプラスミドのＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａから大腸菌
へのシャトルリングにより、サイクルを完成することか
ら明白である。さらに、組込みシャトルベクターは、遺
伝子ライブラリーの構築により所望のＹ．ｌｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａ遺伝子のクローニングを可能にする。Ｙ．ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ受容株内でついで選択またはスクリー
ニングする。 【００６４】実 験 材料と方法 Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｂｇｌ II、Ｈｉｎｄ III
およびＳａｕ３Ａを含めた大部分の制限酵素はＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＳ）から、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼおよびＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼ１も同
様に得られた。Ａｐａ ＩはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍから得られた。すべての酵素は各製造業
者によって記載されているその使用条件に従って使用し
た。Ｓａｌ Ｉは、バクテリアアルカリホスファター
ゼ、Ｋｐｎ ＩおよびＸｈｏ Ｉと同様Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂ
ＲＬ）から得た。バクテリアアルカリホスファターゼ
は、直線状プラスミドＤＮＡ１μｇにつき約１００単位
の割合で、６５℃において、Ｂａｍ ＨＩアッセー緩衝
液中、２時間使用した。制限消化体はＴｒｉｓ−Ｂｏｒ
ａｔｅ−ＥＤＴＡ緩衝液を用い、浸漬０．８％アガロー
ス中電気泳動によって解析した（Ｍａｎｉａｔｉｓら：
“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
Ｎ．Ｙ．，１９８２）。 【００６５】メジウム 大腸菌用メジウムは１リットルあたり、１０ｇのＢａｃ
ｔｏ−トリプトン、５ｇのＢａｃｔｏ−酵母抽出物、お
よび食塩５ｇを含み、ｐＨを７．５に調整したＬ苦汁で
ある。大腸菌最小培地は０．３３％デキストロースに５
６種の塩を含む（Ｌｏｗ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
１１３：７９８〜８１２，１９７３）。アミノ酸または
塩基は必要な場合、５０μｇ／ｍｌ添加した。バクテリ
アは３７℃で生育させた。酵母用メジウムは１％Ｂａｃ
ｔｏ−酵母抽出物、２％Ｂａｃｔｏ−ペプトン、２％デ
キストロースを含むＹＰＤである。酵母最小粘地、ＳＤ
は、０．６７％Ｂａｃｔｏ酵母窒素塩基（アミノ酸を含
まない）および２％デキストロースを含有する、合成完
全培地は、アデニン硫酸塩、ウラシル、トリプトファン
ヒスチジン塩酸塩、アルギニン塩酸塩およびメチオニン
各２ｇ、チロシン３ｇ、ロイシン６ｇ、フェニルアラニ
ン５ｇ、スレオニン２０ｇ、リジン３ｇを合して乳鉢、
乳棒を用いて粉砂して粉末添加材を８７０ｍｇ／ｌの割
合で含有する。栄養試験または選択に際しては、完全メ
ジウムから適当な成分をぬく。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａは２８℃で生育させた。 【００６６】Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色体ＤＮＡの
単離 ａ）ＤＮＡのクローニング：野性型株ＮＲＲＬ Ｙ−１
０９４を、振盪Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコを用い、ＹＰ
Ｄ ４×３００ｍｌ中１ｍｌにつき１〜２×１０⁸ 個の
細胞をとり２８℃で生育させ、ついで新鮮な静的相培地
から１５μｌを接種した。以下の細胞操作はすべて２８
℃また室温で実施した。細胞は遠心分離で収穫し、５０
ｍｌの１Ｍ−ＮａＣｌで洗浄し、再び遠心分離した。遠
心分離収穫後に、５０ｍｌの０．２Ｍトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン塩酸塩（Tris-HCl) ｐＨ８．
５、０．０２Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、
１Ｍ食塩および０．１Ｍ２−メルカプトエタノール中で
前スフェロプラスト接種を１５分行う。細胞ペレット
を、１ｍｌにつき１ｍｇのザイモリアーゼ５０００（Ｋ
ｉｒｉｎ Ｂｒｅｗｅｒｉｅｓ，Ｊａｐａｎ）を含む１
Ｍ−ＮａＣｌ ４０ｍｌ中に再懸濁し、４５分間インキ
ュベートした。この時点で９０％以上の細胞は、水中へ
の希釈による細胞分解で顕微鏡的に検査すると。スフェ
ロプラストに変換されていた。 【００６７】スフェロプラストを遠心分離し、計１６ｍ
ｌの１Ｍ−ＮａＣｌに４本の試験管に分けて再懸濁し
た。分解緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、１
００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）〕、０．１ｍｇ／ｍ
ｌプロテナーゼＫ含有、４０ｍｌを加え、リゼートを３
７℃で１．５時間インキュベートした。リゼートを等容
量のフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出した。
９，０００ｒｐｍで遠心分離して相を分け、水相は再び
フェノール−クロロホルムで抽出した。最終水相を２容
量のエタノールと合し、ＤＮＡを沈殿させる。液体を傾
瀉、ぺレットを７０％および１００％エタノールで洗浄
したのち、真空乾燥した。乾燥ペレットを８ｍｌのＴＥ
（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）に６５℃で再溶解し、ついで３００μｌのＲＮＡｓ
ｅ Ａ（１ｍｇ／ｍｌ、５分間煮沸）を加えて３７℃で
１時間ＲＮＡｓｅ消化を行う。混合物をフェノール−ク
ロロホルムで２回抽出し、前と同様にエタノールで沈殿
させた。最終沈殿をエーテルで洗浄したのち、真空乾燥
した。 【００６８】ＤＮＡペレットを前回と同様にしてＴＥに
再溶解し、１００×ＴＥ ２ｍｌついで水を加えて２
９．０４ｇとした。この溶液をＣｓＣｌ ３７．６９ｇ
に加え、遠沈管に移し、ＶＴｉ５０ローターを用いたＢ
ｅｃｋｍａｎ Ｌ８−７０超遠心分離機により、４０，
０００ｒｐｍで１７時間、遠心分離した。針で孔をあけ
て、遠沈管の底から約１．２５ｍｌを含むフラクション
に分けて、勾配を収穫した。各フラクションのサンプル
を０．５ｍｃｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含むア
ガロースゲル上を走らせてＤＮＡを分析し、分画１６、
１７および１８（全２６から）を集めた。これらのＤＮ
Ａ含有分画をプールし、１×ＴＥを４回かえて透析し、
エタノールで沈殿させた。ＤＮＡを１×ＴＥ ０．６ｍ
ｌに再溶解し、この生成物を２６０ｎｍの吸収で評価す
ると、ＤＮＡ１２９μｇを含むことが明らかにされた。 【００６９】ｂ．サザーンブロット用ＤＮＡ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの微量処理法（Ｓｈｅｒｍａ
ｎら：Ｍｅｔｈｏｄｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ．，１９８１）からのＳＤＳ
スフェロプラスト分解と酢酸カリウム処理が、Ｙ．ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡを得るのに便利であった。プラスミドＤＮＡの調製 バクテリアプラスミドＤＮＡを、Ｈｏｌｍｅｓら〔Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１４：１９３〜１９７（１
９８１）〕の急速煮沸法で製造した。大量の製造の場合
のみ、次にＣｓＣｌ−エチジウムブロマイド勾配中の遠
心分離を行った。ＤＮＡ製品は滅菌ＴＥ緩衝液中４℃に
保存した。大腸菌の形質転換 Ｄａｇｅｒｔら〔Ｇｅｎｅ，６：２３〜２８（１９７
９）〕のＣａＣｌ₂ 法を用いた。形質転換には一夜Ｃａ
Ｃｌ₂ 処理および短時間処理細胞の両者を用いた。 【００７０】サザーンブロット実験 ニトロセルロースに移送した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ １９
７５）ＤＮＡを、６×ＳＣＰ緩衝液（２０×ＳＣＰ保存
液は２．０Ｍ ＮａＣｌ、０．６Ｍ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 、
および０．２Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ６．２を含有する）
中、３２Ｐ標識「ニック翻訳」プローベにハイブリダイ
ズした。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩとともに、ニック
翻訳法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出）を用いた。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡのＳａｎ３Ａ部分消
化体の製造 このＤＮＡ約１５μｇを、４個の各試験管にＤＮＡ １
μｇあたり、０．０５、０．１、０．２および０．４酵
素単位の制限酵素３ａｕ３Ａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）により、３７℃で０．５時間、購入
会社のプロトコールに従って部分消化した。６５℃に１
０分間加熱して反応を停止し、ついで０．８％の製造用
アガロースゲルに負荷した。サイズ範囲４〜１０ｋｂの
ＤＮＡ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ
からのＨｉｎｄ III切断ｌａｍｂｄａサイズ標準と比
較）をゲルから収穫し、電気溶出し、ＤＥ５２カラム上
で精製し（Ｙａｎｇら：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、６８：１７６、１９７９）、エタノー
ルで沈殿させ、ついでＢａｍ ＨＩ切断、アルカリホス
ファターゼ処理ベクターｐＢＲ３２２と結合させた。 【００７１】ベクターｐＢＲ３２２内Ｙ．ｌｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａ遺伝子ライブラリーの構築 約１μｇのＤＮＡを含む結合混合物をＥ．ｃｏｌｉ株Ｍ
Ｃ １０６１（Ｃａｓａｄａｂａｎら：Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ. １３８：１７９〜２０７、１９８０）の形質
転換に用い、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子ライブラ
リーの作成に用いた。形質転換混合物は１０ｍｇ／ｍｌ
アンピシリン＋Ｌアガール平板上に約１．４×１０⁴ 個
のコロニーを与えた。５０個のコロニーを１個の平板上
に置き、レプリカ法で５ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリン
に対する抵抗性を試験した。４４個（８８％）は感受性
を示し、大部分はＢａｍ ＨＩ部位にｐＢＲ３２２の抵
抗性^R 遺伝子を妨害する挿入体を含むものと考えられる
１８個のランダムに選んだａｍｐ^R コロニーからの微量
プラスミド製造について、Ｈｉｎｄ IIIおよびＳａｌ
Ｉ二重消化ならびにＢａｍ ＨＩ消化を行い、制限酵素
の消化を検討した。１０個のプラスミドが平均約７ｋｂ
の大きさの挿入体を持っていた。 【００７２】約１．４×１０⁴ の大腸菌形質転換体コロ
ニーを含む４８個のアンピシリン平板をＬＢ＋１０μｇ
／ｍｌアンピシリンに転写し、試験した。レプリカをそ
れぞれ０．８５％ＮａＣｌ ５ｍｌで洗浄した。細胞を
プールし、遠心分離してペレット化し、１１ｍｌＬＢお
よび２．５ｍｌの８０％グリセロールに再懸濁した。１
リットルのＬＢと１０μｇ／ｍｌのアンピシリンを加え
たＦｅｒｎｂａｃｈフラスコ２個に、それぞれプールし
たバクテリア４ｍｌをとって培養した。残りのバクテリ
アは−７０℃に保存した。この培養はｐＢＲ３２２中Ｓ
ａｕ３Ａ部分消化断片のＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝
子ライブラリーであるプラスミドＤＮＡの調製に用いら
れた。 【００７３】大腸菌突然変異株の遺伝子ライブラリーの
スクリーニング 各種遺伝子マーカーのために数種の大腸菌突然変異株を
遺伝子ライブラリーで形質転換した。遺伝的相補性を得
るためには、２つの主要な因子が必須である。 （１）相当するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子が、こ
のライブラリー中のプラスミドの少なくとも１個に完全
に含有されていること、（２）Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ遺伝子は十分な程度、大腸菌細胞内で機能しなければ
ならない。ライブラリーは適当なメジウム上での各マー
カーの直接選択と同時に、まずアンピシリン抵抗性の選
択、ついで選択されたメジウム上へのレプリカ転写によ
ってスクリーニングされた。検査した各遺伝子マーカー
について、少なくとも１０⁵個の形質転換体が検査を受
けた。菌株ＪＣ３５５はＬＥＵ２遺伝子を有効にクロー
ン化するのに用いられた。 【００７４】選択メジウム上に生育した任意の大腸菌コ
ロニーについて、さらに再形質転換試験を実施した。こ
の試験に際しては、選択メジウム上に生育した菌株の培
地５ｍｌからプラスミドを製造した。母体である大腸菌
突然変異株を形質転換するためにプラスミド微量製造法
を用いた。多くのアンピシリン抵抗性形質転換体が選択
メジウム上に存在するが、コロニーはほとんどまたは全
くないことから、はじめのコロニーは所望のＹ．ｌｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ遺伝子を含まず、プロトロフへの突然変
異のため生育したと考えてよいように思われる。アンピ
シリン抵抗性コロニーのすべてが、やはり試験した遺伝
子に対する選択メジウム上で生育するのであれば、はじ
めのコロニーから得られたプラスミドは大腸菌突然変異
を相補する挿入体を含んでいたと結論される。ｐＢＲ３
２２に同一の挿入体が含有されたＪＣ３５５のロイシン
独立性形質転換体（ｌｅｕ Ｂ６）は全部で７個発見さ
れた。これらのコロニーの２個からプラスミド微量製造
法を行うと、再形質転換試験においてアンピシリン抵抗
性、ロイシンプロトロフ形質転換体が１００％（３７／
３７および３１／３１）認められた。このプラスミドは
ｐＬＤ２５と命名された。 【００７５】Ｅ．ｃｏｌｉ ｌｅｕ Ｂ６捕足ＤＮＡが
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のものであることの証明 ｐＬＤ２５からの挿入ＤＮＡがＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａに由来することを確認するため、サザーンブロット実
験を実施した。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ全ＤＮＡの製
造を新たに行った。ただし、最終のＣｓＣｌ勾配工程は
省略した。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡのＥＣＯ
ＲＩ消化パターンからｐＬＤ２５（図２）の挿入体の
内部の３個のバンドと同一であることが明らかにされ
た。ｐＬＤ２５内挿入体のその他の特性 数種の通常の酵素を用いてｐＬＤ２５の部分制限酵素地
図を作成した（図３）。このプラスミドに含有された
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡの総量は約６．６ｋ
ｂと評価された。 【００７６】形質転換プロトコール 酢酸リチウム法（Ｉｔｏら：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１５３：１６３〜１６８、１９８３）をＳ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅの形質転換に用いた超音波処理キャリヤーＤ
ＮＡ添加で改良し、この方法を用いてＹ．ｌｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａの形質転換を行った。対数期の後期の３〜１０
×１０⁷ 細胞／ｍｌでの培養が、対数期（１×１０⁷ 細
胞／ｍｌ）培養よりも、多い形質転換体を与える。ＹＰ
Ｄ培養物５０ｍｌをペレット化し、ついで１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５の１０ｍｌに再
懸濁した。これを再びペレット化し、上記緩衝液にさら
に０．１Ｍ酢酸リチウムをプラスした緩衝液２〜３容量
に再懸濁し、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋローラードラ
ム上、２８℃で１時間おだやかに混合した。リチウム処
理細胞を０．１〜１．０個に分け、形質転換プラスミド
１μｇおよび超音波処理異種キャリヤーＤＮＡ（大きさ
の範囲はアガロースゲル上で０．５〜９ｋｂと推定され
た）とともに多形質転換管にとった。形質転換管を２８
℃に３０分間放置したのち、ＰＢＧ試薬（４０％ポリエ
チレングリコール４０００、０．１ＭＬｉＡＣ、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５───滅
菌ろ過）７容量を加えた。さらに１時間２８℃に放置し
たのち、熱衝撃を加えた（通常は３７℃、５分間）。最
後に細胞を３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、水に
再懸濁し、適当なメジウム上に置く。 【００７７】ｐＬＤ２８の構築 ｐＬＤ２５およびＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ ３７０５１）
各２μｇの混合物を、Ｓａｌ Ｉ緩衝液５０μｌ中、Ｓ
ａｌ Ｉ ６．２５単位とともに、３７℃で１．５時間
インキュベートした。消化物を等容のフェノールで１
回、エーテルで３回（１．５ｍｌ）抽出した。これに食
塩と無水エタノールをそれぞれ濃度が０．１Ｍおよび７
０％にするのに十分な量を加えてＤＮＡを沈殿させた。
ＤＮＡを取り出し、等容のＴＥ緩衝液に溶解した。ＤＮ
Ａ溶液１０μｌを、反応容量２０μｌでＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより、１４℃において１時間処理した。所望の組
換えプラスミドの選択は、以下の方法に従ってＥ．ｃｏ
ｌｉ ＤＢ６５０７を形質転換して実施した。すなわ
ち、形質転換混合物を、スレオニン、プロリンおよびロ
イシンを含み、ウラシルを含まない１１ Ｅ．ｃｏｌｉ
合成培地平板上に置いた。平板１個に１００個以上のコ
ロニーが得られた。生成した形質転換体はロイシン欠乏
平板を用いたレプリカ法で検査し、各プラスミド上の
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＥＵ２遺伝子の存在を調
べた。ロイシンを添加しないで徐々に成長させたこれら
のコロニーをアンピシリン平板上で単一のコロニーに画
線し、テトラサイクリンに対する感受性を試験した。ア
ンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感受性の２４個の
コロニーをプラスミド微量製造に用いた。プラスミドＤ
ＮＡ製品をＳａｌ Ｉ消化によって期待される２個のバ
ンド（ＹＥｐ２４からの７．５ｋｂとＬＥＵ２からの
５．３ｋｂ）およびＥｃｏ ＲＩ消化によって期待され
る５個のバンドを調べた（図６）。２個のプラスミドは
適当なパターンを示した。最初のプラスミドを集め、ｐ
ＬＤ２８と命名した。 【００７８】ｐＬＤ２５またはｐＬＤ２８のいずれより
も小さいＬＥＵ２セグメントを有するプラスミドｐＬＤ
４０の構築 約２５μｇのｐＬＤを２００μｌ中、２０単位の制限酵
素で処理して、ｐＬＤ２５の部分Ｅｃｏ ＲＩ消化を行
い、９、１２、１５、１８および２１分後にサンプルを
採取した。各時点で総容量の２０％を、３３ｍＭ ＥＤ
ＴＡ含有（希釈後）ゲルサンプル緩衝液にとり、反応を
停止させた。各時点をゲル上で追い、所望のバンド
（２．３ｋｂのｌａｍｂｄａ Ｈｉｎｄ IIIサイズ標準
よりもわずかに遅く移動）をカミソリで切り取った。バ
ンドを透析袋中で電気溶出し、ミニカラム（Ｓｃｈｌｅ
ｉ−Ｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｅｌｕｔｉｐ
Ｄ）を供給会社の指示に従って用い、精製した。ＬＥＵ
２含有バンドのクローニングに使用したベクターは、Ｅ
ｃｏ ＲＩ消化、バクテリアアルカリホスファターゼ処
理ｐＢＲ３２２であった。ベクターと挿入ＤＮＡをＴ４
ＤＮＡリガーゼと合し、得られた混合物をＥ．ｃｏｌ
ｉ ＭＣ １０６１株のアンピシリン抵抗性への形質転
換に使用した。 【００７９】プラスミドの微量製造後、Ｅｃｏ ＲＩ制
限酵素で消化して試験した。最初の３４個の製品中、４
個が所望の挿入体を含んでいた。各プラスミド中での挿
入体の方向性を試験するため、Ｈｉｎｄ IIIおよびＸｈ
ｏｌ Ｉ二重消化を行った。３個がｐＬＤ４０（図７）
と同じ方向性を示した。これらのプラスミドの２個を
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＣ−３５５の形質転換に用い（ＭＣ
１０６１中で大規模生産後）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ ＬＥＵ２遺伝子の表現を試験した。驚くべきこと
に、ｐＬＤ４０を含む形質転換体はロイシンを含まない
メジウム上でも生育した（ｐＬＤ２５またはｐＬＤ２８
を含む形質転換体よりも良好）が、ｐＬＤ４１を含む形
質転換体はロイシンを添加しないと生育しなかった。こ
の実験のバクテリア完全培地は５６／２＋ビタミン
Ｂ₁ 、グルコース、ヒスチジン、アルギニン、メチオニ
ン、ロイシンおよび２０μｇ／ｍｌのアンピシリンであ
った。ｐＬＤ４０中でのＬＥＵ２遺伝子の転写はＳｔｕ
ｂｅｒとＨ．Ｂｕｊａｒｄ（１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｓｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：１６７〜１７
１）によって報告された反時計回りのプロモーターによ
ってプロモートされると結論された。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａ ＬＥＵ２遺伝子のｐＬＤ２５およびｐＬＤ２
８内での低いバクテリア性表現（ｐＬＤ４０と比べて）
は、弱いバクテリアプロモーターとして作用するＹ．ｌ
ｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡのセグメントから生じるも
のである。 【００８０】Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ｌｅｕ２突然
変異株のｐＬＤ２５による形質転換 Ｊ．Ｒ．ＤｅＺｅｅｕｍによって構築されたＹ．ｌｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ ＰＣ−３０８２７株（ＭＡＴＡ ｌｅ
ｕ ２−３５、ｕｒａ ３−１１）ＡＴＣＣ２０６８８
をｐＬＤ２５にクローン化されたＬＥＵ２遺伝子の受容
株として用いた。生長後期での培養が、対数期初期の細
胞より高い形質転換頻度を与えることがわかった。この
所見は、ほぼ同数の初期および後期対数期細胞を別個に
ＤＮＡで処理し、ロイシン欠乏平板に置いたときにも確
認された。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡを独特の
制限部位で切断するかまたは小さな切れ目（Ｂｇｌ II
切断）を残すことによって直線化プラスミドとすると、
完全なｐＬＤ２５またはＨｉｎｄ III 制限酵素で切断
して直線化したプラスミドよりもはるかに形質転換頻度
が高い。この結果はＯｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（前出）に
よって開発されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける組
込み形質転換システムと類似している。形質転換に使っ
たｐＬＤ２５に超音波処理Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡを添加
すると、もっと高分子のＤＮＡを加えたかあるいはキャ
リヤーＤＮＡを加えなかったときに比べて形質転換頻度
は高い。細胞をＤＮＡやポリエチレングリコールとイン
キュベートしたのちの熱衝撃の持続や温度を少し変えて
も、形質転換体の収率にはわずかな影響がみられたにす
ぎなかった。 【００８１】形質転換体の安定性 Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＡＴＣＣ ２０６８７にｐ
ＬＤ２５を有する形質転換体（本明細書ではＤＬ１０と
呼ぶ）のコロニーをＹＰＤ平板上、１個のコロニーずつ
に画線し、ついでＹＰＤ平板上非選択生育させた。生じ
たＹＰＤ培養平板をロイシン欠乏合成メジウム上に転写
した。約５０個の完全に分離されたコロニーはすべてロ
イシンに独立で、形質転換体は安定なことが明らかにさ
れた。 【００８２】ｐＬＤ２５の組込みを試験するためのサザ
ーンブロット Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの形質転換体は安定で、形質
転換頻度も受容体プラスミドＤＮＡの直線化によって著
しく上昇する。これはＯｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ（前出）に
よりS. cerevisiae システムに発見されたように、形質
転換体は受容体ＤＮＡの末端に相同な部位で染色体ＤＮ
Ａにプラスミドが組込まれて生じたことを示している。
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡのＨｉｎｄ III消化
体のサザーンブロット実験（図４）では、完全または直
線化プラスミドのいずれから生じた形質転換体にもｐＢ
Ｒ３２２と相同の同じ２つのバンドがみられた。１つの
バンドは２３ｋｂ ｌａｍｂｄａサイズ標準より大きい
という所見は、染色体ＤＮＡへのプラスミドの組込みの
証拠である。 【００８３】Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＨＩＳＩ遺伝
子のクローニング遺伝子ライブラリーの構築 ベクターＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら：Ｇｅｎｅ，
８：１７〜２４、１９７９）をｐＢＲ３２２について前
述したと同様にＢａｍ ＨＩで消化し、アルカリホスタ
ファーゼで処理した。結合反応に用いた挿入体ＤＮＡ
は、前述のように、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＮＲＲ
Ｌ Ｙ−１０９４から得られたＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ染色体ＤＮＡの完全Ｂａｍ ＨＩ消化体であった。染
色体ＤＮＡ消化は、結合前に大きさによる分画化を行わ
ず、フェノール抽出のみを実施した。結合生成物を用い
てＥ．ｃｏｌｉ ＭＣ １０６１のアンピシリン抵抗性
形質転換体コロニーが計約２７，０００個得られた。こ
れらのプールされた形質転換体コロニーの培養から得ら
れたプラスミドＤＮＡはＹＥｐ２４中のＹ．ｌｉｐｏｌ
ｙｔｉｃａ Ｂａｍ ＨＩ断片のライブラリーと命名し
た。挿入頻度は９５％と評価され（１９／２０の形質転
換体がテトラサイクリン感受性であった）、平均挿入サ
イズは４．２ｋｂであった。 【００８４】ＨＩＳＩ遺伝子の単離 突然変異Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子を相補するとＹ．ｌｉｐｏ
ｌｙｔｉｃａ遺伝子の発見を試みて、Ｂａｍ ＨＩライ
ブラリーを多くの異なるＥ．ｃｏｌｉ栄養素要求株の形
質転換に用いた。Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｉｓ Ｇ１突然変異
株ＡＴ ２５３５（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓ
ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙａｌｅ大学で＃４５１７と
して得られる）の２種の形質転換体のコロニーがヒスチ
ジンを欠き、アンピシリンを含む合成メジウム上に単離
された。いずれのコロニーも同じプラスミドｐＬＤ２１
を含み、これはベクター内に約４ｋｂの挿入部を形成し
ていた。再形質転換試験は、ＡＴ ２５３５のアンピシ
リン抵抗性形質転換体と、レプリカ法でヒスチジン独立
と評価されたｐＬＤ２１とで４１９／４１９陽性であっ
た。サザーンハイブリダイゼーション実験では、ｐＬＤ
２１中のＢａｍ ＨＩ挿入体もＢａｍ ＨＩ＋Ｅｃｏ
ＲＩ二重消化により生じた２個の挿入体断片も、同様に
して切断したＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色体ＤＮＡと
一緒に移動した。 【００８５】ｈｉｓＧの他の対立遺伝子がｐＬＤ２１に
よって相補されるかどうかを試験するために、ＨＩＳ
Ｇ遺伝子へのＴｎ１０挿入体を含むＥ．ｃｏｌｉ ＮＫ
−５５２６株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏ
ｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ＃６４１６）をプラスミドで形質転
換した。すべてのアンピシリン抵抗性形質転換体コロニ
ーは、レプリカ法についでヒスチジンを含まないメジウ
ムでの遅い生育が可能であった。これは、ヒスチジンオ
ペロンの下流遺伝子に対するＴｎ１０の極性効果から期
待されたとおりであった。ヒスチジンを欠き、アンピシ
リンを含まないメジウム上での形質転換体の直接選択は
不可能であった。多分、強い極性効果によるものと思わ
れる。ｐＬＤ２１へのＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮ
Ａ挿入はＥ．ｃｏｌｉのｈｉｓＧ突然変異を相補するこ
とができ、それがＥ．ｃｏｌｉ内で機能できる形でＹ．
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＨＩＳＩ遺伝子を含むものと結
論された。 【００８６】方向性の表現に与える影響 Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡ挿入体がベクターＹ
Ｅｐ２４と独立に機能するかどうかを試験するために、
Ｂａｍ ＨＩ小片をｐＢＲ３２２内にサブクローン化し
た。両方向での挿入体をＥｃｏ ＲＩ消化パターンによ
って決定した（図５）。ｐＢＲ３２２のＥｃｏ ＲＩ部
位のほかさらに挿入体のＥｃｏ ＲＩ部位を持つプラス
ミド、プラスミドｐＬＤ２３は前に用いた２種のｈｉｓ
Ｇ Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異株を相補したが、他の方向
性では突然変異株を相補できなかった。すなわち、Ｙ．
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＨＩＳＩ遺伝子のこのＥ．ｃｏ
ｌｉシステムにおける効率的な発現には、プラスミド上
での配列が必要である。ｐＢＲ３２２のｔｅｔ^R プロモ
ーターが必要な因子であると考えられる。 【００８７】染色体ＤＮＡの拡大セグメントによる形質
転換 ＬＥＵ２遺伝子を含むＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮ
Ａの約５．３〜５．４ｋｂのＳａｌ Ｉ小片（プラスミ
ド消化体からゲル精製）がＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
ｌｅｕ２突然変異受容株を高頻度で原栄養体に形質転換
できることが明らかにされた（１μｇにつき１０００個
以上の形質転換体）。この組込みにより、直線化プラス
ミドでの形質転換から異種の組換え法が提供される。そ
れは、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＤＮＡの領域内に所
望の配列を挿入し、また所望の配列をバクテリアベクタ
ーに組込むことなく宿主に組込むことを可能にする。こ
の種のシステムは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｅｉａｅでＲ．Ｒ
ｏｔｈｓｔｅｉｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、１０１：２０２、１９８３）により開発さ
れている。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色体ＤＮＡプレ
パレーションは、高分子のものでも短く切断したもので
も、ＬＥＵ２形質転換体を得るために使用できる。 【００８８】ＵＲＡ３遺伝子のクローニング 第一工程はｐＬＤ４０のＢａｍ ＨＩの部位でのＹ．ｌ
ｉｐｏｌｙｔｉｃａＤＮＡのＳａｕ３Ａ部分消化体の遺
伝子ライブラリー構築である。これはｐＢＲ３２２遺伝
子ライブラリーの構築について前述した操作による。高
頻度の形質転換を達成し、またライブラリーにおける分
子をＬＥＵ２部位における組込み体に集中させるため
に、ライブラリーＤＮＡを母体ベクターｐＬＤ４０のＬ
ＥＵ２領域で１個所だけ切断する酵素Ａｐａ Ｉで消化
した（未知のＵＲＡ ３遺伝子自体がＡｐａ Ｉ部位を
含むかどうかはわからないので、ライブラリーＤＮＡの
サンプルの部位Ａｐａ Ｉ消化も実施して、そのように
製造された分子では１個所だけで切断されることをこと
を確認した。しかしながら、部分消化は必要でなかっ
た。 【００８９】Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＵＲＡ３突然
変異株のｐＬＤ４０ライブラリーによる形質転換 Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＰＣ３０８２７株（ＡＴＣ
Ｃ ２０６８８）を受容株とし、その培養液５０ｍｌ
を、ＹＰＤ肉汁中、６００ｎｍのＯＤが４．９になるま
で生育された。これは細胞の圧縮容量０．９ｍｌに相当
し、以下、前述の形質転換プロトコールに従ってｐＨ
７．５のＴＥ緩衝液で洗浄した。ついで細胞をＴＥ中酢
酸リチウムの２倍容に懸濁し、回転ドラム上、３０℃で
１時間おだやかに混合し、ついで３本の形質転換管に分
けた。各管（１５ｍｌのコーニングポリスチレン遠沈
管）に、細胞懸濁液０．９ｍｌ、超音波処理、異種Ｅ．
ｃｏｌｉキャリヤーＤＮＡ３００μｇ（１００μｌ）お
よびＡｐａ Ｉ処理ライブラリーＤＮＡ６μｇをとっ
た。形質転換管を３０℃で３０分間インキュベートし、
７ｍｌのＰＥＧ試薬（前述）と混合し、さらに１時間イ
ンキュベートした。この管をついで、３７℃、１０分間
の熱ショックに付し、細胞を３，０００ｒｐｍで２分間
遠心分離した。各管からの細胞を０．６ｍｌの滅菌水に
再懸濁し、ロイシン欠乏合成完全メジウムの１２個の平
板に置いた。 【００９０】３日後に、合計約１０，０００個のコロニ
ーがロイシン欠乏メジウム上に生育した。形質転換実験
に平行して行った陰性対照板（ＤＮＡは用いず、ほかは
形質転換細胞と全く同様に処理した）にはロイシン独立
コロニーの生育は認められなかった。３６個の形質転換
平板をウラシル欠乏合成メジウムの平板に転写した。ウ
ラシル独立の唯１個のコロニーが翌日認められた。この
コロニーをさらに下記のように処理して、ＵＲＡ３遺伝
子を回収した。第２の形質転換は、プラスミドを受けた
細胞の第一選択（ロイシン独立）よりもウラシル独立の
直接選択が所望の形質のスクリーニングに先立ち可能か
どうかを決定するために行われた。この第２の実験は第
１の実験に類似したが、形質転換ＤＮＡ １μｇにつき
５，０００〜１０，０００個の形質転換体が得られ、高
頻度の形質転換が達成された。この実験で、さらに３個
のＵＲＡ３形質転換体がウラシル欠乏メジウム上での直
接選択により、またさらに１個がロイシン選択ついでス
クリーニングにより得られた。 【００９１】ＵＲＡ ３含有プラスミドｐＬＤ５５の回
収 最初のウラシル独立形質転換体のＹＡＰ培養５０ｍｌを
一夜生育させ、前述のフェノール−クロロホルムとプロ
テアーゼ法を用いて、ＤＮＡプレパレーションを収穫し
た。この染色体ＤＮＡプレパレーション約３μｇ（７
％）を酵素ＡｐａＩで完全に消化し、ついでフェノー
ル、フェノール−クロロホルムおよびクロロホルム−イ
ソアミルアルコールで抽出し、エタノールで沈殿させ
た。このＤＮＡを総容量８０μｌ中でＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼにより結合させた。この反応液１０μｌを用いて、
コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１株１００μｌ
をアンピシリン抵抗性に形質転換した。９個の形質転換
体からＥ．ｃｏｌｉ ミニ−プラスミド製造を行い、制
限解析に使用した。開裂可能なＤＮＡを与えた７個のプ
レパレーションは酵素Ａｐａ ＩおよびＥｃｏ ＲＩと
同一の制限パターンを含んでいた（図８）。２個のプレ
パレーションは酵素消化が可能なほど十分精製されてい
なかったと考えられるが、他の７個と同様に移動する超
コイル化プラスミドを含んでいた。回収されたプラスミ
ドはｐＬＤ４０へのＬＥＵ２挿入体の特性を示す２個の
Ｅｃｏ ＲＩバンドと、さらに他の３個のバンドを含ん
でいた。ｐＬＤ４０中のＵＲＡ３含有挿入体はＡｐａ
Ｉ部位を欠き、２個のＥｃｏ ＲＩ部位を含んでいた。 【００９２】このプラスミドが本当にＵＲＡ３遺伝子を
含むかどうかを確認するため、再形質転換実験を行っ
た。ミニプレパレーションＡｐａ Ｉ消化体をＹ．ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ受容体の形質転換に用いた。この形質
転換混合物の一部をウラシル欠乏メジウム上に、一部を
ロイシン欠乏メジウム上に置いた。各メジウムごとに約
１００個の形質転換体を持つプレートを他のメジウムへ
のレプリカプレーティングのために選択した。ロイシン
選択コロニーはすべてウラシル独立であった。驚くべき
ことに、ウラシル欠乏メジウム上に選択されたコロニー
はほぼその半分だけがロイシン独立であった。後者の結
果は標的領域における形質転換ＤＮＡの分解および修復
に関するある仮説によって説明できるものと思われる
（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２２８、１９８３におけ
るように）。ロイシン独立形質転換体のすべてがウラシ
ル独立でもあったことから、ＬＥＵ２領域におけプラス
ミドの組込みはｕｒａ３突然変異を相補し、ｐＬＤ５５
と命名したプラスミドはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＵ
ＲＡ３遺伝子を含むと結論できる。 【００９３】シャトリングの実証 Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのｐＬＤ２５による形質転換
体（ＡＴＣＣ ２０６８７）から、前述のフェノール−
クロロホルム／プロテアーゼ法によるが、以後の塩化セ
シウム勾配の適用は行わないで、ＤＮＡを製造した。こ
のようにして単離された数種の微生物のＤＮＡを酵素Ｋ
ｐｎ Ｉ（形質転換に用いたと同じ酵素）で消化し、フ
ェノールで抽出し、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆ Ｓｃｈｕ
ｅｌｌ Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄミニカラムで精製し（製造会
社の指示に従い）、ついでＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合させた。両メジウム（１ｍｌ中ＤＮＡ５０μｇ以
上）で、低濃度（１０μｇ／ｍｌ以下）での結合がそれ
に続くバクテリアの形質転換を成功させた。結合混合物
を前述のようにしてＥ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１株のア
ンピシリン抵抗性への形質転換に用いた。１０個以上の
Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体が得られ、ミニプラスミドの製
造を実施した。これらの大部分は制限パターンがｐＬＤ
２５と同一のプラスミドを含有していた。ｐＬＤ２５の
Ｋｐｎ Ｉ部位に異なるＤＮＡ小片が挿入されたものが
わずかにあった。これらの異常小片は、結合の間に直線
化ベクターに挿入されたＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ Ｄ
ＮＡの異なるＫｐｎ Ｉフラグメントと考えられた。 【００９４】第２の実験はプラスミドｐＬＤ２８に関す
るもので、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａとＳ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅの間の遺伝機能的な差を示すものである。
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＡＴＣＣ ２０６８８株の
Ｂｇｌ II切断ｐＬＤ２８で形質転換するとＤＬ１１株
が生成し、これはロイシン欠乏合成メジウム上で選択さ
れた。ウラシル欠乏合成メジウムに移すと生育はみられ
ず（酵素定量試験では、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ Ｕ
ＲＡ３遺伝子はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＵＲＡ３遺
伝子と同じ酵素をコードするから）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ遺伝子は相当するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ突
然変異を相補しなかったと考えられる。回収されるプラ
スミドが小さいＢｇｌ II断片を欠くので酵素Ｂｇｌ
IIを用いたほかは前述のとおり処理して、プラスミドを
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａから回収した。Ｙ．ｌｉｐｏ
ｌｙｔｉｃａ ＬＥＵ２遺伝子が、Ｂｏｔｓｔｅｉｎの
研究室で構築され、プラスミドの宿主として広く用いら
れている（たとえばＧｕａｒｅｎｔｅおよびＰｔａｓｈ
ｎｅ、１９８１、Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ.
Ｓｃｉ. ＵＳＡ、７８：２１９９）Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅでも機能できるかどうかを試験するため、Ｄ
Ｂ７４５株（ｌｅｕ２−３、１１２ ｕｒａ３−５２
ａｄｅｌ−１００）（類似の株はＡＴＣＣ ４４７７３
およびＡＴＣＣ４４７７４として利用できる）をｐＬＤ
２８で形質転換し、ウラシル欠乏メジウム上で選択し
た。 【００９５】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換体をロ
イシン欠乏メジウムに移した場合、ロイシンを添加しな
くても徐々に生育することがわかった。ｌｅｕ２をわず
かに相補する能力に基づいて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ中のｐＬＤ２８を直接選択することも可能であるが、
形質転換体は２４〜４８時間後にはウラシル欠乏平板上
よりもロイシン欠乏平板上に多く生じ、わずかに低い形
質転換頻度を示した。すなわち、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉ
ｃａ ＬＥＵ２遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中
のこのマルチコピープラスミド上にある場合も、わずか
ではあるが機能できる。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝
子を、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内で機能するその遺伝
子を探すことによりライブラリーから得る上述の方法の
一般性は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａプロテアーゼ遺伝
子およびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａアデニン遺伝子の形
質転換成功例からもさらに明らかである。 【００９６】前述のｐＬＤ４０に基づくライブラリーと
本発明に係るシャトルシステムを用いて、Ｙ．ｌｉｐｏ
ｌｙｔｉｃａプロテアーゼ遺伝子（ＸＰＲ２）のクロー
ニングに成功した。使用した方法は、ＵＲＡ３のクロー
ニングについて前述した方法とほぼ同じである。ＸＰＲ
２は分泌されるアルカリプロテアーゼの構造遺伝子であ
る（ＳｉｍｓおよびＯｇｒｙｄｚｉａｋ：Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ. １４５：４０４、１９８１）。遺伝的マー
カーｌｅｕ２、ａｄｅｌおよびｘｐｒ２を含むＹ．ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａの受容株を標準遺伝子技術によって構
築した。（Ｏｇｒｙｄｚｉａｋら：Ｍｃｌ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｅｓ、１６３：２２９、１９７８）。ｌｅ
ｕ２突然変異株については本明細書に述べた。各種のｘ
ｐｒ２対立遺伝子およびａｄｅｌ対立遺伝子はＯｇｒｙ
ｄｚｉａｋによって寄託されたＡＴＣＣ ４６０２６〜
４６０２８号および４６０６７〜４６０７０から利用で
きる（ＳｉｍｓおよびＯｇｒｙｄｚｉａｋ、前出参
照）。 【００９７】Ｒ．Ｐａｒｋｅｒらのエチジウムブロマイ
ド部分消化法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ． Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、７４：８５１、１９７７）に従い、酵素
Ｂｇｌ IIを用いてライブラリーを処理した。Ｂｇｌ
II酵素の適当量を決定するため、エチジウムブロマイド
および使用するＤＮＡを、エチジウムブロマイドは濃度
範囲０．００５から１μｇ／μｌとし、１管中には酵素
４単位を含む１０μｌをライブラリーＤＮＡ約１μｇと
使用した。インキュベーション時間は３７℃で１時間と
した。約０．５μｇ／μｌのエチジウムブロマイドを含
む管で、ライブラリー中のプラスミドの直線化が最大と
なり、分子あたり２個以上の切断が行われたことを示す
小さな断片の産生もなかった。各成分をこの割合でスケ
ールアップして形質転換のためのライブラリーＤＮＡを
製造した。ライブラリーＤＮＡのこの処理により、標的
組込み部位（ＬＥＵ２領域）および所望の未知遺伝子
（ＸＰＲ２）の両者が、直線化に用いられる酵素（Ｂｇ
ｌ II）に対する部位をもっていたならば生じるであろ
う問題が回避される。このように処理したＤＮＡから得
られる形質転換体は、ゲノムのＬＥＵ２またはＸＰＲ２
のいずれの領域にも組込まれることになろう。前述した
と同じ形質転換法を用い、ロイシン欠乏合成メジウム上
に８０，０００個以上のコロニーが得られた。これらを
スキムミルクインディケーター平板にレプリカ法で転写
した（Ｄ．ＯｇｒｙｄｚｉａｋらＧｅｎｅｔｉｃｓ、８
７：６２１、１９７７）。プロテアーゼ陽性形質転換体
が、スキムミルク平板への透明ゾーンの形成により確認
された。 【００９８】さらに、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのアデ
ニン遺伝子が相補性によってクローニングされた。二重
突然変異受容株（ｌｅｕ２ ａｄｅｌ）を上述のように
形質転換し、ロイシン独立コロニーをＡＤＥ １を選択
するためのメジウムに転写培養した。ＡＤＥ １含有プ
ラスミドが形質転換体から回収され、再形質転換により
それが確認された。

【図面の簡単な説明】 【図１】クロマトグラフを示す写真であって、Ｙ．ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子のＳａｕ３Ａ部分消化した断片
をｐＢＲ３２２に結合させた遺伝子ライブラリーのアガ
ロースゲル電気泳動図（ＬＩＢ）である。 【図２】クロマトグラフを示す写真であって、Ｅｃｏ
ＲＩで消化したＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａバルクＤＮＡ
と放射性ｐＬＤ２５でプローブとしたｐＬＤ２５による
サザーンハイブリダイゼーションを行い、その電気泳動
分画である。 【図３】ｐＬＤ２５の制限酵素地図である。 【図４】クロマトグラフを示す写真であって、Ｈｉｎｄ
IIIで消化したＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａバルクＤＮＡ
と放射性ｐＢＲ３２２プローブとのサザーンハイブリダ
イゼーションの電気泳動分画である。 【図５】クロマトグラフを示す写真であって、ｐＬＤ２
３およびｐＬＤ２４の制限消化体の電気泳動分画であ
る。 【図６】ｐＬＤ２８の制限酵素地図である。 【図７】ｐＬＤ４０の制限酵素地図である。 【図８】クロマトグラフを示す写真であって、ｐＬＤ５
５の制限消化体の電気泳動分画をｐＬＤ４０の場合と比
較して示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．ヤロウイア・リポリティカＡＴＣＣ２０６８８