JPS61209593A - 新規なプラスミドおよびそれを含有する微生物 - Google Patents
新規なプラスミドおよびそれを含有する微生物Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
産業上の利用分野：
この発明はサツ力ロミセス−セレピシエ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）およびアク
レモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃ
ｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ）の各微生物の細胞内でＤＮＡ
複製起点（ＡＲ５）として機能し得る新規なりＮＡ、そ
れを含む新規なベクターおよびこのベクターを含む微生
物に関するものである。 従来の技術： エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ）宿主−ベクター系が組換えＤＮＡ技術において有
用であることは周知である。 発明が解決しようとする問題点： しかしながら、このエシェリヒア・コリの宿主−ベクタ
ー系は、例えば、高等動物によって産生される有用物質
の生産のためには十分なものではない。 このため、例えば酵母、かび等の宿主−ベクター系の開
発研究が行われており、高等生物に由来する有用物質を
生産する、より有利な宿主−ベクター系の開発が望まれ
ている。 問題点を解決するための手段： アクレモニウム・クリソゲナム（以下Ａ、クリソゲナム
と略す場合がある） Ａ１：ＣＣＩＬ５５０は多数の臨
床上重要な半合成セファ０スポリン抗生物質の製造に使
用されていることは周知であり、さらに、Ａ、クリソゲ
ナムＡＴＣＣ１１５５０は細胞外にアルカリプロテアー
ゼを大量に（Ｉｇ／Ｆ！以上）産生することが知られて
いるが、この発明者等はこのＡ、クリソゲナムＡｔＣＣ
１１５５０のＤＮＡのＤＮＡ複製起点（ＡＲ５）をクロ
ーニングし、該ＡＲ５をエシェリヒア・コリ（以下、Ｅ
、フリと略す場合がある）およびサッカロミセス・セレ
ビシエ（以下Ｓ、セレビシェと略す場合がある）のシャ
トルベクター中に導入し、Ａ、クリソゲナムまたはＳ、
セレビシェを宿主として使用する組換えＤＮＡ技術にお
けるベクターとして有用な新規プラスミドを構築するの
に成功した。 第３．４．５，６図にそれぞれ示した制限酵素切断地図
で特徴づけられるこの発明のプラスミドｐＬＥＵ１３５
、ｐＬＥＵ９７、ｐＣＥＰ９７およびｐＣＹＧ９７は既
知の方法により製造される。 以下にプラスミドｐＬＥＵ１３５、ｐＬＥＵ９７、ｐＣ
ＥＰ９７およびｐＣＹＧ９７の一般的製造法を示す。 １）栄養マーカーであるプラスミドＹＥｐ１３の遺伝子
ＬＥＬＩ＋をプラスミドｐＢＲ３２５のｐｓｔ Ｉ部位
に導入してプラスミドｐＢＲ−ＬＥＤを得、これをＤＮ
Ａ複製起点（ＡＲ５）検出のためのベクターとして使用
する。 出発物質として使用するプラスミドｐＢＲ３２５は周知
のプラスミドであるＣ Ｇｅｎｅ、 １４（１９８１’
） ２８９−２９９１゜ プラスミドＹＥｐ１３はまた、Ｅ、フリおよびＳ。 セレビシェのシャトルベクターとして知られているＣ
Ｊ、Ｒ，Ｂｒｏａｃｈ ａｔ ａｌ、 、Ｇａｎ＠、
８（１９７９） １２１ ］。 プラスミドｐＢＲ３２５およびＹＥｐ１３を別々に制限
酵素Ｐｓｔ Ｉで消化し、得られた反応混合物を合わせ
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結する。 連結されたＤＮＡを用いてＥ、コリＣ６Ｃ６００ｒ−（
ＡＩ’Ｑ：３３５２５）を形質転換し、ＡｐＳｒｃＲＣ
ｍＲＬｅｕ”−ｙ口二一を選択する。 このようにして構築されたプラスミドをｐＢＲ−ＬＥＵ
と命名する。そしてこのプラスミドは第７図に示す制限
酵素地図で特徴づけられる。 ２）Ａ、クリソゲナムＡＩ’ＣＣ１１５５０の細胞を例
えばザイモリエイス（商標、生化学工業社製）のような
細胞壁溶解酵素で処理し、次いで得られたプロトプラス
トをフェノールおよびクロロホルムで処理することによ
り得られる染色体ＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａで部分消
化し、ショ糖密度勾配超遠心分離法により精製して約１
−１０ＫｂｐのＤＮＡ断片を得る。 ３）この約１−１０ＫｂｐのＤＮＡ断片を前記１）で得
たプラスミドｐＢＲ−ＬＥＤのｌｌａｍＨＩ部位に次の
様にして導入するニ プラスミドｐＢＲ−ＬＥＵを制限酵素ＢａｍＨＩで消化
し、前記的１−１０ＫｂｐＤＮＡ断片を消化混合物に加
え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結する。 この連結したＤＮＡを用いてＥ、フリＣ６００ｒ”’ｍ
−（ＡＴＣＣ３３５２５）を形質転換し、ＴｃＳＣｍＲ
Ｌａｕ” フａ ＝ −を常法により選択する。得られ
たＣｍＲＴｃＳＬａｕ＋ハイブリッドプラスミドＤＮＡ
を用いてＳ、セレビシェ５ＨＹ３ （ＡＩ’Ｃ（：４４
７７１ ） ＣＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、 ７５（１９７８）１９２９コを形質転換
する。 そして高頻度のＬｅｕ＋形質転換コロニーを生じるハイ
ブリッドプラスミドを選択し、Ａ、クリソゲナムＡＴＣ
Ｃ１１５５０のＡＲ５を含有する二個のハイブリッドプ
ラスミドＤＮＡを得る。 得られた二つのハイブリッドプラスミドをそれぞれｐＬ
ＥＵ１３５およびｐＬＥＵ９７と命名する。 ４）前記３）で得たプラスミドｐＬＥＩＪ９７を制限酵
素Ｐｓｔ Ｉで消化し、得られた消化物をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結して、遺伝子Ｌｅｕを欠損したプラ
スミドｐＣＥＰ９７を得る。 ５） Ｔａ２０５のＰｖｕ Ｉ ＫｍＲ断片を前記４）
で得たプラスミドｐＣＥＰ９７に下記のように導入して
プラスミドｐＣＹＧ９７を得る： ここで使用するＴａ９０３のＰｖｕ Ｉ ＫｍＲ断片は
既知の遺伝子である［ Ａ、Ｏｋａ ａｔ ａｌ、 Ｊ
、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 １４７（１９８１）２１７
コ。 ｐＣＥＰ９７ ＤＮＡを制限酵素ｐｖｕ Ｉ［で部分消
化し、消化されたｐＣＥＰ９７ ＤＮＡとＰｖｕＩＫｍ
Ｒ断片をＴ、ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。 連結されたＤＮＡを用いてＥ、フリＣ６００ｒ’″ｍ−
（ＡＴＣＣ３３５２５）を形質転換し、常法によりＡｐ
ＲＫｍＲＣｍＲクローンを得る。このようにして得られ
たプラスミドをｐＣＹＧ９７と命名する。−このプラス
ミドｐＣＹＧ９７は、第６図に示すように、Ａ 、 り
’Ｊ ’／ゲナムＡｒＣＣ１１５５０ｃ７）ＡＲ５ＤＮ
ＡおよびＥ、コリのＴａ２０５のカナマイシン耐性遺伝
子（ＫｍＲ）を含有する。 プラスミドｐｃＹＧ９７を用いてＳ、セレビシェＹＮＮ
２７を形質転換することができ［Ｄ、 Ｔ、 Ｓｔｉｎ
ｃｈｃｏｍｂａｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７７（１９８０）４５
５９］、得られた形質転換株はアミノグリコシド抗生物
質０４１８を含有する寒天平板において直接選択するこ
とができる。 前記のようにして構築したプラスミドｐＬＥ０１３５は
第３図に示すような制限酵素切断地図で特徴づけられる
。 そしてアガロースゲル電気泳動法により測定したｐＬＥ
Ｕ１３５の分子量は約１４．９Ｋｂｐである。 この発明によって得られるプラスミドｐＬＥＵ１３５の
ＤＮＡ複製起点（ＡＲ５）部分は特有な制限酵素切断パ
ターンを示し、アガロースゲル電気泳動法により測定し
た同部分の分子量は約５．０４Ｋｂｐであり、新しいＤ
ＮＡであると認められる。 従って、このＡＲ５ＤＮＡを含有するプラスミドｐＬＥ
Ｕ１３５もまた新規なプラスミドであると認められる。 また、前記のようにして構築したプラスミドｐＬＥＵ９
７は第４図に示すような制限酵素切断地図で特徴づけら
れる。そしてアガロースゲル電気泳動法により測定した
ｐＬＥＵ９７の分子量は約１１．２Ｋｂｐである。 プラスミドｐＬＥＵ ９７のＤＮＡ複製起点（ＡＲ５）
ＤＮＡ部分（プラスミドｐＣＥＰ９７およびｐＣＹＧ
９７！；：おけるＡＲ５ＤＮＡ部分と同じ）は特有な制
限酵素切断パターンを示し、アガロースゲルおよびポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により測定した同部分の
分子量は約１．３９Ｋｂｐであり、新規なりＮＡである
と認められる。 従って、このような新規なＡＲ５ＤＮＡを含有するプラ
スミド９ＬＥＵ９７もまた新規なプラスミドであると認
められる。 また、９ＬＥＵ９７を制限酵素ｆ’ｓｔＩで消化し、消
化物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結することにより
得られるプラスミドｐＣＥＰ９７は第５図に示すような
制限酵素切断地図で特徴づけられる。そしてアガロース
ゲルおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測
定したｐＣＥＰ９７の分子量は約７．３８Ｋｂｐである
。 ｐＣＥＰ９７ノＤＮＡ複製起点（ＡＲ５） ＤＮＡ部分
はｐＬＥＵ ９７のそれと同じものである。 従って、このような新規なＡＲ５ＤＮＡを含有するプラ
スミドｐＣＥＰ９７もまた新規なプラスミドであると認
められる。 さらにまた、前記のようにして構築したプラスミドｐＣ
ＹＧ９７は第６図に示すような制限酵素切断地図で特徴
づけられる。そしてアガロースゲルおよびポリアクリル
アミドゲル電気泳動法により測定したｐＣＹＧ９７の分
子量は約９．０８Ｋｂｐである。 ｐＣＹＧ９７のＤＮＡ複製起点（ＡＲ５） ＤＮＡ部分
はｐＬＥＵ ９７のそれと同じものである。 従って、このような新規なＡＲ５ＤＮＡおよびＥ６コリ
のＴｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ）を含
有するブラスミ、ドｐＣＹＧ９７もまた新規なプラスミ
ドであると認められる。 発明の効果： この発明によるハイブリッドプラスミドｐＬ）Ｉ１１３
５、ｐＬＥＵ９７、ｐＣＥＰ９７およびｐＣＹＧ９７は
例えば以下のような有用性を有している。 Ａ、クリソゲナムＡｌＣＣ１１５５０の特異的ＡＲ５Ｄ
ＮＡを含有するプラスミドｐＬＥＵ１３５は、Ａ、クリ
ソゲナムまたはＳ、セレビシェを宿主として用い、ロイ
シンを選択マーカーとして用いる組換えＤＮＡ技術にお
けるベクターとして有用である。 また、Ａ、クリソゲナムＡｌＣＣ１１５５０（７）特異
的ＡＲ５ＤＮＡを含有するプラスミドｐＬＥＵ９７は、
Ａ、クリソゲナムまたはＳ、セレビシェを宿主として用
い、ロイシンを選択マーカーとして用いる組換えＤＮＡ
技術におけるベクターとして有用である。 Ａ、クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０の特異的ＡＲ５Ｄ
ＮＡを含有するプラスミドｐＣＥＰ９７はそれ自体プラ
スミドｐＣＹＧ９７の構築のための中間体として有用で
あり、また適当な選択マーカーをこのｐＣＥＰ９７に導
入することによって、Ａ、クリソゲナムまたはＳ、セレ
ビシェを宿主として用いる組換えＤＮＡ技術におけるベ
クターとして有用である。 さらにまた、Ａ、クリソゲナムＡｌＣＣ１１５５０の特
異的ＡＲ５ＤＮＡを含有するプラスミドｐＣＹＧ９７は
、Ａ、クリソゲナムまたはＳ、セレビシェを宿主として
用い、アミノグリフシト抗生物質０４１８耐性を選択マ
ーカーとして用いる（このほか、きらに抗生物質０４１
８のほかにカナマイシンおよびネオマイシンもまたＡ、
クリソゲナムにおける選択マーカーとして用いられる）
組換えＤＮＡ技術におけるベクターとして有用である。 従って、この発明のプラスミドｐＬＥＵ１３５、ｐＬａ
１９７およびｐＣＹＧ９７は、特にＳ、セレビシェのよ
うな酵母およびＡ、クリソゲナムＡｌＣＣ１１５５０の
ような真菌の性質を改良する菌株改良のためのベクター
として有用である（例えば、セファロスポリンＣの生産
性の改善等に有用である）。 さらにまた、Ａ、クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０は前
述のように細胞外にアルカリプロテアーゼを大量に（Ｌ
ｘ／ｌ１以上）産生ずる。従って、プラスミドｐＬＥＵ
１３５、ｐＬＥＵ９７およびｐＣＹＧ９７は、前記アル
カリプロテアーゼの遺伝子をクローニングすることによ
りＳ、セレビシェまたはＡ、クリソゲナムにおいてヒト
組織プラスミノーゲン活性化因子（ＨＴＰＡ ）のよう
なヒト活性ペプチドの細胞外生産に使用きれる発現ベク
ター構築のための中間体としても有用である。 この発明により構築されたプラスミドｐＬＥＵ１３７、
ｐＬＥＵ９７、ｐＣＥＰ９７およびｐＣＹＧ９７を用い
てそれぞれＥ 、 ｃｏｉｌ Ｃ６Ｃ６００ｒ−″（Ａ
ＴＣＣ３３５２５）を常法により形質転換することによ
り、次のような形質転換株を得ることができる。 エシェリヒア・コリ６００ｒ−ｍ−（ｐＬＥＵ１３５
）エシェリヒア・コリ６Ｃ６００ｒ−（ｐＬＥＵ９７
）エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−（ｐＣＥＰ９７
）エシェリヒア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−（ｐＣＹＧ９
７ ）実施例：実施例： 以下、実施例によりこの発明を説明する。 下記実施例において以下の略号を使用する。 Ａ’ｌ’Ｐ ： アデノシン−５′−トリホスフェー
トＤＴ’Ｔ ： ジチオスレイトール エｒｉｓ： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン ＥＤＴＡ ： エチレンジアミンテトラ酢酸ＳＯＳ
： ラウリル硫酸ナトリウムＰＥＧ ： ポリエチ
レングリコールｂｐ＝ 塩基対 Ｋｂｐ ： キロ塩基対 ＡＲ５： ＤＮＡ複製起点 Ｒｏ Ａｐ、Ｅ、コリにおけるアンピシリン耐性ＡｐＳ、
Ｅ、フリにおけるアンピシリン感受性ＣｍＲ： Ｅ、
コリにおけるクロラムフェニフール耐性 ＣｍＳ： Ｅ、コリにおけるクロラムフェニコール感
受性 Ｒｏ Ｔｃ、Ｅ、コリにおけるテトラサイタリン耐性ＴｃＳ：
Ｅ、フリにおけるテトラサイタリン感受性 ＫｍＲ： Ｅ、フリにおけるカナマイシン耐性ＮｍＲ
： Ｅ、コリにおけるネオマイシン耐性Ｋｍ”：
Ｅ、コリにおけるカナマイシン感受性Ｇ４１８Ｒ： ｓ
、セレビシェにおける抗生物質０４１８耐性 Ｌｅｕ” ： Ｅ 、 ’：２すｌａｕ ＢおよびＳ
、セレビシェ１ａｕ２のロイシン栄養要求性変異の相補
性 緩衝液・培地 Ｌ： ２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）１
０ｍｌｉ ＭｇＣ１ｚ ６ｍＭ ２−メルカプトエタノール １００１１ｇ／ｍｌｌ牛血清アルブミン（ＢＲＬ）Ｍ
： ５０ｍＭ ＮａＣ１含有り緩衝液Ｈ： １０
０ｍＭ ＮａＣ１含有り緩衝液Ｓ ： ２０ｍＭ
ＫＣＩ含有し緩衝液ＴＥ緩衝液： ２０ｍＭτｒｉｓ
−ＨＣＩ （ｐＨ７，５）０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ＴＰＥ緩衝液： ３６ｍＭ Ｔｒｉｓ ３０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １ｍＭ ＥＤＩＡ ｐ）１７．８ ＫＰ緩衝液： ７４．５６ｇ ／ ＲＫＣｌ０．２５ｇ
＃！ Ｋ２ＳＯ３ ０−２０ｇ ／ ｌ Ｍｇｃｔ２・６Ｈ２００，０５ｇ
＃！ ＫＨ２ＰＯ４ ０、３７ｇ ／ ｉ ＣａＣ１ｚ −２Ｈ２Ｈ２Ｏ２５
Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ（ｐＨ７，２）ＹＰ緩衝液： Ｌ
Ｍ ＫＣｌ １０ｍＭ Ｉｒ１ｓ −ＨＣＩ （ｐＨ７，５）２Ｍソ
ルビトール緩衝液； ２Ｍソルビトール １０ｍＭ Ｉｒ１ｓ −ＨＣＩ （ｐＨ７，５）１０ｍ
Ｍ ＣａＣ１ｚ ＬＢ寒天：１０ｇ／ｊ２ バタトトリプトン（ＤＩＦＣ
Ｏ）５ｇ／！酵母エキス（ＤＩＦＣＯ） ５ ｇ ／ ｌ ＮａＣ１ １５トｑ寒天（ＤＩＦＣＯ） ｐＨ７，２ 北寒天： １０．５ｇ＃！ Ｋ２ＨＰＯ４４，５ｇ
／ （ｌ ＫＨ２ＰＯ４ １，０ｇ ／ １ （ＮＨ４）２５０４０．５ｇ／ｌ
クエン酸三ナトリウム（・２Ｈ２０） １．２ｇ／りＭｇ５Ｏ，・７７Ｈ２ Ｏ２／ｊ！ グルコース １５ｇ／ｊ２ 寒天（ＤＩＦＣＯ） ＡＣ培地：３６ｇ／ｊ！ シュウクロース２７ｇ／Ｎ
グルコース ３ｇ／ｌ Ｌ−メチオニン ７．５ｇ／ｌ （ＮＨ４＞２Ｓｏ４ １３．８ｇ＃！ Ｋ１２ＰＯ４ １４、ｏｇ／ｌ Ｋ２ＨＰ０゜ １０ｇ／ｊ！ ペプトン（ＤＩＦＣＯ）ＹＥＰＤ培地：
１０ｇ／ｌ酵母エキス（ＤｌＦＣＯ）２０ ｇ ／ ｌ
ペプトン（ＤＩＦＣＯ）２０区／ｆ グルコース 酵母用補足ＭＭ培地（ロイシン非含有）：１０ｇ／ｊ！
グルコース ６．７ｇ／ｊ２ イーストナイトロジェンベース（Ｄ
ＩＦＣＯ） ２１８ｇ／ｌ ソルビトール １０ｍｇ／Ｆ！ アデニン １０ｍｇ／ ｆｌ ウラシル ４０ｍｇ／ゑ ヒスチジン ４０ｍｇ／ ｊ！ トリプトファン 再生寒天培地：１．２Ｍソルビトールおよび３％寒天含
有ＹＥＰＤ培地 ＹＥＰＤ下層培地：１．２Ｍソルビトール、２％寒天、
０．２％（賢／Ｖ）−リン酸水素 二カリウム含有ＹＥＰＤ培地 ＹＥＰｉ）寒天上層培地：１．２Ｍソルビトールおよび
２％寒天含有ＹＥＰＤ培地 さらに、種々のプラスミドを制限酵素で切断するため、
次の組合せの制限酵素および緩衝液を以下の実施例にお
いて使用した。 制限酵素 艷Ｉ痙Ａｖａ Ｉ
、 Ｃ１ａ Ｉ 、 ＥｃｏＲＩ 、 ＨｉｎｃｌＩ
。 Ｈｉｎｄｌ［［、ＭｌｕＩ 、 ＰｓｔＩ 、 Ｐｖｕ
ｌ、 Ｈ緩衝液Ｓａｌ Ｉ 、 Ｘｈｏ Ｉ Ａａｔｌ［、５ｐｈＩ Ｍ緩衝液
ＡｃｃＩ 、 ＢａｍＨＩ 、 Ｂｇｌｌ［、Ｌ緩衝液
ＨｐａＩ 、 ＫｐｎＩ 、 ５ａｃＩ ＋ ＳａｃＩ
Ｓｍａ Ｉ Ｓ 緩衝液
ｐＬＥＵ９７およびｐＬＥＵ１３５の構築：（１）ベク
ターｐＢＲ−ＬＥＵの構築 ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ ）製の
市販品として得られるベクターｐＢＲ３２５ＤＮＡ １
（をＨ緩衝液１０縛中においてＰｓｔＩ３単位を用い１
時間消化する。 一方、Ｊ、 Ｒ，Ｂｒｏａｃｈ ａｔ ａｌ ［Ｇｅｕ
＠、 ８ （１９７９）１２１］の方法により調製きれ
るベクターＹＥｐｌＳ ＤＮＡ１（をＨ緩衝液１０４中
においてＰｓｔＩ３単位を用いて１時間消化する。上記
二つの反応混合物を合せ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．５単
位、０．５ｍＭ ＡＩＰおよび１０ｍＭ ＤＴＴ中、４
℃で２０時間反応する。 このようにして得た連結されたＤＮＡを用い、Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ２５０頁（コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、１９８２）に記
載の方法によりエシェリヒア・コリＣ６００ｒ″’ｍ−
（ＡＴＣＣ３３５２５）を形質転換する。 形質転換した細胞を、テトラサイクリン５（／酸含有Ｌ
Ｂ寒天にブレーティングし、３７℃で一晩培養する。テ
トラサイクリン耐性コロニーを、それぞれ、クロラムフ
ェニコール２０ｆｆｌ／１Ｉ１１含有ＬＢ寒天、アンピ
シリン５０（／−含有ＬＢ寒天、およびスレオニンＳＯ
ｘ／ｍＱ含有北寒天（ロイシン非含有）に移し、３７℃
で一晩培養するｅ Ａｐ”ＴｃＲＣｍＲＬｅｕ” コロ
ニーを得、この構築されたプラスミドＤＮＡをｐＢＲ−
ＬＥＤと命名する。 このｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮＡは、Ａｄｖａｎｃ＠ｄ Ｂ
ａｃｔ、ａｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ １１６頁（コー
ルド・スプリング・ハーバ−ラボラトリ−１１９８０）
に記載の方法により単離する。 （２）アクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５
０ＤＮＡ由来ＡＲ５のクローニング １） ＡｌＣＣ１１５５０ＤＮＡの抽出無菌ＡＣ培地（
１００ｆｆｌｌｌ ）に、Ａ、クリソゲナムＡ’ｆＯ：
１１５５０の寒天斜面培養から得た菌糸体を接種し、５
００−容振盪フラスコ中２５℃、２５０ｒｐｍで３日間
培養する。細胞を集めＫＰｆｉ衝液で洗浄する。この細
胞を１０ｍＭ ＤＴＴ含有ＫＰＩＩ衝液２０−に懸濁し
、３７℃で３０分間振盪する１次いでこの細胞懸濁液に
ザイモＩＪ エイス６０．０００ （生化学工業株式会
社） ２０ｍｇを加え、３７℃で２時間振盪する。細胞
を１００ＯＸ ｇで１０分間遠心分離する。菌体を１０
ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳ含有５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５） １０ｍ１１に懸濁し
、等容量のフェノールおよびクロロホルムで２回抽出す
る。このＤＮＡ溶液をＲＮａｓｅ Ａ （シグマ社）１
０に／戒で処理し、次いでプロテアーゼＫ（メルク社）
２０ＯＮｇ／ ｒｎＱで処理する。ＤＮＡ溶液を等容
量のフェノールで抽出し、二倍容量のエタノールを加え
、−２０℃で２時間沈殿させる。沈殿を遠心分離により
集め、ＴＥ緩衝液ｏ、 ｓｍｉに再懸濁する。このＤＮ
Ａ溶液を同緩衝液で十分透析し、約５０（のＤＮＡを得
る。 ２） ＡＴＣＣ１１５５０ＤＮＡのｐＢＲ−ＬＥＵ Ｂ
ａｍＨＩ部位へのクローニング（第１図） 前記１）のようにして調製したＡＴＣＣ１１５５０ＤＮ
Ａ約１０葱をＬ緩衝液２００４中で５ａｕ３ Ａ （Ｂ
ＲＬ） １単位を用い１０分間消化する０反応は６５°
Ｃで１０分間加熱することにより停止させる。消化され
たＤＮＡはショ糖密度勾配遠心分離法により約１−１０
ＫｂｐＤＮＡサイズに精製する。サイズにより分別した
ＤＮＡは最終的にＴＥ緩衝液１０４に懸濁する。 前記１）に記載のようにして調製したｐＢＲ−ＬａＪＤ
ＮＡＩＸをＬ緩衝液１０４中でＢａｍＨＩ （ＢＲＬ）
１単位を用い１時間消化する。得られた消化物と前述
のＴＥ緩衝液中サイズ分別ＤＮＡ懸濁液を混合する。こ
の混合物に１４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ） （０，５単
位）、１０×Ｌ緩衝液ＩＰｊ１および５ ｍＭ ＡｒＰ
および１０〇−ＭＴの２−を加える。続いてこの混合物
を４℃で２０時間反応する。連結されたＤＮＡを用い、
１（ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ２５０頁に記載
の方法に従ってＥ、コリＣ６００ｒ−ｍ−（ＡＴＣＣ３
３５２５）を形質転換する。形質転換された細胞をクロ
ラムフェニコール２０８Ｅフ 一晩培養する。得られたクロラムフェニコール耐性コロ
ニーをテトラサイクリン５肩／−含有ＬＢ寒天およびス
レオニン５（ｂ＋ｇ／ｎｉｌ含有聞寒天（ロイシン非含
有）にそれぞれ移す。ＴｃＳＣｍＲＬｅｕ＋コロニーを
得（１０８クローン）、これらプラスミドＤＮＡをＡｄ
ｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔａｒｉａｌ Ｇａｎｅｔｉｃｓ
１１６に記載の方法に従い単離する。 ３）サッカロミセス・セレビシエＳＨＹ ３ （ ＡＴ
ＣＣ４４７７１ ’）の形質転換（ｗ＆１図）Ｓ．セレ
ビシェＳＨＹ ３ （ ＡＴＣＣ４４７７１ ’）を、
Ｈｉｎｎｅｎａｔ ａｌの方法［ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ７５（ １９
７８ ） １９２９ ］に従い形質転換する．アデニン
およびウラシルの１０に／ｍＱを含有する無菌ＹＥＰＤ
培地（ ５０１１１１ ）にＳ．セレビシェＳＨＹ ３
（ ＡＴＣＣ４４７７１ ）の寒天斜面培養物を接種
し、２５０１１１１容振盪フラスコ中にて３０°Ｃで一
晩培養する．細胞を遠心分離して、集め、２５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡおよび５０ｍＭ ＤＴＴ含有１．２Ｍソルビトー
ル溶液５緘に懸濁し、３０℃で１０分分間中かに振盪す
る。次いで細胞を遠心分離により集め、Ａ１２Ｍソルビ
トール溶液で洗浄し、１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ
Ｅ ＤＴＡおよび２０（１−ｇ ／ ｍＱザイモリエイ
ス６０，０００（生化学工業株式会社）含有６７ｍＭリ
ン酸緩衝液（ ｐＨ７．５） ５ ｍＱに懸濁し、３０
°Ｃで６０分分間中かに振盪する．得られるプロトプラ
ストを低速遠心分離により集め、１．２Ｍソルビトール
溶液で洗浄し、１０ｍＭ ＣａＣ １２含有１．２Ｍソ
ルビトール溶液４ ＩＱに懸濁する。 このプロトプラスト懸濁液（ ０． ２！ｄ ）と前記
２）で調製したＣｒｎＲＴｃＳＬｅｕ＋ハイブリッドＤ
ＮＡ Ｃ ２０ｔａＱ ）（約５（）を混合し、室温で
２０分間振盪する。 １０ｍＭ ＣａＣｌ２およびＬ ＯｍＭτｒｉｓ −
ＨＣｌ（ ｐＨ７． ５ ）含有２０％ＰＥＧ４．ＯＯ
Ｏ溶液２踵をこの懸濁液に加え、室温で２０分間静置す
る．形質転換されたプロトプラストを低速遠心分離によ
り集め、１．２Ｍソルビトールおよび１０ｍＭ ＣａＣ
１２含有１ ０ｍＭ工ｒｉｓーＨＣＩ緩衝液（ ｐＨ
７． ５ ） ０． ５１１１Ｑに懸濁する．形質転換
された細胞（０． １１ＩＩＱ ）を酵母用３％寒天含
有（ロイシン非含有）補足間培地１０１ｄで希釈し、２
％寒天含有の同下層培地の上に上層し、３０℃で４日間
培養する。 二種のハイブリッドプラスミドＤＮＡから約５００コロ
ニーが得られるが、他の１０６ハイブリツドプラスミド
ＤＮＡおよびｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮＡからは１コロニー
しか得られない。この結果からＡ．クリソゲナムＡＴＣ
Ｃ１１５５０のＡＲ５含有の二種のハイブリッドプラス
ミドＤＮＡが得られ、それぞれｐＬＥＵ９７およびｐＬ
ＥＵ１３５と命名する。 Ｓ．セレビシェＳＨＹ ３ （ ＡＴＣＣ４４７７１
）の形質転換頻度に対するｐＬＥＵ９７およびｐＬＥｔ
？１３５ ＤＮＡ量の効果を、ｐＢＲ − ＬＥＵおよ
びＹＥｐ１３ ＤＮＡと比較して表１−１に示す。ＹＥ
ｐ１３ ＤＮＡはＳ．セレビシェの２−プラスミドＤＮ
Ａを含有している。 表１−１ ｐＬＥＵ９７およびｐＬＥＵ１３５ ＤＮ
ＡのＳ，セレビシェＳＨＹ ３ （ ＡＴＣＣ４４７７
１ ）への形質転換頻度 ＤＮＡ ＤＮＡ ｔ ＬＥＤ＋形質転換数
（ｍｃｉ） （ＣＦＵ” ）７、５
５．４ Ｘ １０３ｐＬＥＵ９７ ３．０
１．６ ｘ １０３１、５ ５．
３ Ｘ １０２６、０ １．Ｉ Ｘ １０３
ｐＬＥＵ１３５ ２．４ ４．７ ｘ
１０２１、２ ２．１ Ｘ １０２６、０１ ｐＢＲ−ＬＥＵ ２．４ １１、
２ １ ７、５ ２．５ Ｘ １０３ＹＥｐ１３
３．０ １．Ｉ Ｘ １０３１、５５。 Ｏ×１０２ １）ＣＦＵｉコロニー形成単位 （３） ｐＢＲ−ＬＥＵ， ｐＬＥＵ１３５およびｐＬ
ＥＵ９７ ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析 １） ｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮＡの制限酵素地図の決定前
述のようにして調製したｐＢＲ−ＬＥＤ ＤＮＡの制限
酵素地図の決定は、表１−２に示す種々の制限酵素によ
る切断により行う。該制限酵素は、ベテスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ、宝酒造株式会社および東洋紡株式会
社の市販品として得られる。 ｐＢＲ−ＬＥＬＩ ＤＮＡ（０，５−１ｐｇ ）と表１
−２記載の各制限酵素（３−６単位）をＨ緩衝液または
Ｌ緩衝液２０４中において３７°Ｃで６０−１８０分間
反応する。 消化物を０．８％アガロースゲルにて、垂直ゲル電気泳
動法（０，３Ｘ １６Ｘ Ｌ６ｃ＋ｎ ）によりＴＰＥ
緩衝液中８０ｖで２〜３時間電気泳動する。 アガロースゲルにおけるＤＮＡバンドの検出は、Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ １６１頁（１９８２）
に記載のように行う、切断ＤＮＡ断片の分子サイズは、
アガロースゲルにおけるそれらの相対移動度をλ−Ｈ１
ｎｄＩ［断片のそれ［Ｌ、Ｈ，Ｒｏ！：＋１ｎｓｏｎ
ａｎｄ Ａ、 Ｌａｎｄｙ、 Ｇｅｎａ！（１９７７）
１ ］と比較して測定する。 各種制限酵素で切断したｐＢＲ−ＬＥＬＩ ＤＮＡのア
ガロースゲル電気泳動分析の結果は表２に要約して示す
。ｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮＡ制限酵素消化断片の分子サイ
ズは表１−２に示す。ｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮＡに対する
制限酵素の切断地図は第７図に示す。 表１−２ 、 ｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮＡ制限酵素消化断
片２）の分子量１） Ｐｓｔ Ｉ ６．００ ３．８５
９．８５Ｓａｌ Ｉ 、 ５．７
２ ４．１３ ９．８５ＥｃｏＲＩ
６．８５ ３．００ ９．８５Ｂｇｌ
Ｉ［７，２０２，６５９，８５ｐＶｕｎ
６．４６ ３． ＄９ ９．８５Ｋｐｎ Ｉ
７．４５ ２．４０ ９．８
５Ｈｐａ Ｉ ７．７５ ２．１０
９．８５１）断片サイズはＫｂｐで表わす。 ２）小さなサイズの断片は測定していない。 ２） ｐＬＥＵ１３５およびｐＬＥＵ９７ ＤＮＡの制
限酵素地図の決定 表２に示す種々の制限酵素によるｐＬＥＵ１３５および
ｐＬＥＬＩ９７ ＤＮＡの切断およびアガロースゲル電
気泳動は前記ｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮＡの場合と同じ方法
で行う。 １１種の制限酵素で切断したｐＬＥＵ１３５およびｐＬ
ＥＵ９７ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析の結果は
表２に要約して示す。ＡＲ５ＤＮＡ断片の制限酵素切断
部位の数は、ｐＬＥＵ９７およびｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮ
Ａのそれ、およびｐＬＥｕ １３５およびｐＢＲ−ＬＥ
Ｕ ＤＮＡのそれと比較して決定する。 ｐＬＥＵ１３５およびｐＬＥＵ９７ ＤＮＡ制限酵素消
化断片の分子量はそれぞれ表３および４に示す。ｐＬＥ
Ｕ１３５およびｐＬＥＵ９７ ＤＮＡの制限酵素の切断
地図はそれぞれ第３および４図に示す。 表２ 、 ｐＬＥＵ９７およびｐＬＥＵ１３５ ＤＮＡ
の制限酵素切断部位の数 ｐＬＥｕ９７ ｐＬＥＵ１３５ ｐＢＲ−ＬＥＵＢａｍ
ＨＩ Ｇ↓ＧＡＩＣＣ０（０）２）出）２）ＩＢｇｌ
ｌＩ Ａ’ＧＡτＣＴ ２（０） ３（１）
２ＥｃｏＲＩ Ｇ↓ＡＡｒＴＣ２（０）
３（１） ２Ｈｉｎｄｌｌ［Ａ↓ＡＧＣ’ｆＴ
１（０） ３（２） ＩＨｐａＩ Ｇ買
↓ＡＡＣ２（０） ３（１） ２Ｋｐｎ Ｉ
ＧＧＴＡＣ’ Ｃ２（０） ２（０） ２
Ｐｓｔ Ｉ ＣＴＣＧＡ ’ Ｇ ２（０）
５（３） ２Ｐｖｕ Ｉ［ＣＡＧ↓ＣＴＧ
２（０） ４（２） ２Ｓａｃ Ｉ Ｇ
ＡＧＣＴ↓Ｃ２（１） ２（１） ｌ５ａｌ
Ｉ Ｇ ’ ＴＣＧＡＣ２（０） ２（０）
２Ｓｍａ Ｉ ＣＣＣ↓ＧＧＧ ２（１）
１（０） １１）制限酵素切断部位の数は０
．８％アガロースゲル電気泳動により測定する。小言な
サイズの断片は調べていない。 ２） （）： ＡＲ５ＤＮＡ断片の制限酵素切断部位の
数制限酵素 ＡＢＣＤＥ 計 Ｂｇｌ［７，６３４，６２２，６５１４，９ＥｃｏＲＩ
９．８３ ２．９９ ２．０８ １４．
９Ｈｉｎｄｌｌ［１０，８２，５５１，５６１４，９Ｋ
ｐｎ Ｉ １２．５ ２．４０
１４．９ＰｓｔＩ ５．７１ ３．８５ ３．１０
１．７５ ０．４９ １４．９ＳａｃＩ １０．
９ ３．９６ １４．９ＳａｌＩ
９．１９ ５．７１ １４．９１）
断片サイズはＫｂｐで表わす。 ２）小さなサイズの断片は測定していない。 制限酵素 Ａ Ｂ 計Ｂｇ１ｍ
８．５８ ２．６５ １１．２ＥｃｏＲＩ
８．２３ ３．００ １１．２Ｈｐａ
Ｉ ９．１３ ２．１０ １１．２Ｋ
ｐｎＩ ８．８３ ２．４０ １１．
２Ｐｓｔｌ ７．３８ ３．８５ １
１．２Ｐｖｕｌ［６，４６４，７７１１，２ ＳａｃＩ ６．８２ ４．４２ １１
．２ＳａｌＩ ５．７２ ５．５１ １
１．２ＳｍａＩ ６．７５ ４．４９
１１．２１）断片サイズはＫｂｐで表わす。 ２）小さなサイズの断片は測定していない。 実施例２ ｐＣＹＧ９７およびｐＣＥＰ９７の構築：（１）ｐＣＥ
Ｐ９７の構築： １） ｐＬＥＵ９７からｐＣＥＰ９７の構築（第２図）
実施例１に記載のようにして調製したｐＬＥＵ９７ＤＮ
Ａ（３４）をＨ緩衝液２０１ＪＩｌ中においてＰｓｔ１
１０単位で３時間消化し、続いてＴ４ＤＮＡリガーゼ（
ＢＲＬ）０．５単位、および５ ｍＭ ＡＴＰおよび１
００ｍＭ ＤＴＴの２所をこの反応混合物に加え、４℃
で２０時間反応する。連結されたＤＮＡを用い、Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎｉ ｎｇ２５０頁に記載の方法
に従ってＥ、コリ Ｃ６００ｒ−ｍ′″（ＡＴＣＣ３３
５２５）を形質転換する。形質転換された細胞はアンピ
シリン２Ｑ＜／ｍＱ含有ＬＢ寒天上にブレーティングし
、３７℃で一晩培養する。約５００のアンピシリン耐性
コロニーを得、ｐＣＥＰ９７と命名する。 ｐＣＥＰ９
７ＤＮＡを、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔａｒｉａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１１６頁に記載の方法により単離する
。 ２） ｐＣＥＰ９７ ＤＮＡの制限酵素地図の決定前記
１）に記載のようにして調製したｐＣＥＰ ９７ＤＮＡ
の制限酵素地図の決定は、表５に示す種々の制限酵素に
よる切断により行う、該制限酵素はベテスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ、宝酒造株式会社および東洋紡株式会
社から市販品として得られる。 ｐＣＥＰ９７ ＤＮＡ（０，５−ＸＸ）と各制限酵素を
Ｈ緩衝液、Ｍ緩衝液、Ｌ緩衝液またはＳ緩衝液中におい
て３７℃で６０−１８０分間反応する。 消化物を０．８％アガロースゲルにて、垂直ゲル電気泳
動法（０，３Ｘ １６Ｘ １６ｃ＋ｎ ）により、ＴＰ
Ｅ緩衝液中、ＳＯＶで２−３時間電気泳動する。 アガロースゲルにおけるＤＮＡバンドの検出は、Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ １６１頁（１９８２）
に記載のように行う。 制限酵素消化ＤＮＡ断片の分子サイズは、アガロースゲ
ルにおけるそれらの相対移動度をλ−Ｈ１ｎｄ■および
切断されたｐＢＲ３２５ＤＮＡ断片のそれ［断片サイズ
はｐＢＲ３２５のＤＮＡ配列から計算する［ Ｐ、 Ｐ
ｒａｎｔｋｉｅｔ ａｌ、 、 Ｇｅｎｅ １４ （１
９８１） ２８９ ］ ］と比較することにより測定す
る。 一方、前記１）において調製したｐＣＥＰ９７ ＤＮＡ
はさらに５ａｌ ＩおよびＨｉｎｄ Ｔｆｌで消化し、
小さなりＮＡ断片はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ １６４頁（１９８２）に記載の方法に従って電気的
に溶出する。そのＤＮＡ断片（２−３ｇ）の制限酵素（
Ａｖａｌ 、 ＳｍａＩ 、 Ｃ１ａ１．５ａｃＩおよ
び５ａｃｌ［）による切断は前述のように行う。ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（５％濃度）は、Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ １７３頁（１９８２）に記
載のように行う。ポリアクリルアミドゲルにおけるＤＮ
Ａバンドの検出は、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ １６１頁（１９８２）に記載のように行う。ＤＮＡ
断片の分子サイズは、ポリアクリルアミド平板ゲルにお
けるそれらの相対移動度をｐＢＲ３２２−Ｈａｅ ＤＩ
のそれ［５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ、Ｇ、ｅｔ ａｌ、
コールド・スプリング・ハーバ−５ｙｍｐ、 Ｑｕａｎ
ｔ、 Ｂｉｏｌ、 ４３ （１９７９） ７７コと比較
することにより測定する。 ２０種の制限酵素で切断したｐＣＥＰ９７のアガロース
およびポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果は表
５に要約して示す。ＡＲ５ＤＮＡ断片の制限酵素切断部
位の数はｐＣＥＰ９７およびｐＢＲ３２５ＤＮＡのそれ
と比較することにより決定する。制限酵素の切断地図お
よびｐＣＥＰ９７でのそれら断片サイズは第５図に示す
。断片サイズはＫｂｐであられす。 （Ｉｆ ）ｐＣＹＧ９７の構築： １） Ｔｈ９０３のＫｍＲ−Ｐｖｕ Ｉｔ ＤＮＡ断片
のｐＣＥＰ９７ ＤＮＡ（ＡｐＲＫｍＳ）へのクローニ
ング（第２図）Ｉｎ９０３のＫｍＲ遺伝子（Ｐｖｕ Ｉ
Ｉ １６９６ ｂｐ断片）をＰｖｕ Ｉｆ消化ｐＡＯ４
３ＤＮＡから精製する［ Ａ、Ｏｋａ ａｔ ａｌ。 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 １４７ （１９８１）
２１７コ、前記（１）−１＞で調製したｐＣＥＰ９７
ＤＮＡを一部Ｈ緩衝液２０縛中においてＰｖｕｌｌ（１
０単位）を用い３７℃で６０分間消化する。 ＫｍＲ−Ｐｖｕ Ｉ［ＤＮＡ断片（１（）と得られたＰ
ｖｕ ＩＩで部分消化したｐＣＥＰ９７ＤＮＡ（５Ｋ
）を０．５ｍＭ ＡＴＰおよび１０ｍＭ ＤＴτ、およ
びτ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ） （４単位）を含有す
るし緩衝液４０Ｐｄ１中において４℃で２日間反応する
。連結きれたＤＮＡを用い、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ ２５０頁に記載の方法に従いＥ、コリＣ６０
０ｒ’ｍ−（ＡＴＣＣ３３５２５）を形質転換する。形
質転換された細胞をアンピシリン２０ｘ／ｍｌ含有ＬＢ
寒天上にブレーティングし、３７℃で一晩培養する。こ
のアンピシリン耐性コロニーをカナマイシン５ＯＮｇ／
ｍｌ含有ＬＢ寒天およびクロラムフェニコール・４０
ｐｇ ／ ｍｌ含有ＬＢ寒天に移す。ＡｐＲＫｍＲＣｍ
Ｒ（１）およびＡｐＲＫｍＲＣｍＳ（２３９） ：Ｉ
口＝−を得、ＡｐＲＫｍＲＣｍＲクローンをｐＣＹＧ９
７と命名する。ｐＣＹＧ９７ ＤＮＡは、Ａｄｖａｎｃ
ｅ ｄＢａｃｔａｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１６
頁に記載の方法により単離する。 ２） ｐＣＹＧ９７ ＤＮＡの制限酵素地図の決定実施
例２の（Ｉ）−２）と同じ方法により、前述のように調
製したｐＣＹＧ９７ ＤＮＡを表５に示す種々の制限酵
素により切断し、ＤＮＡ断片を０．８％アガロースでの
ゲル電気泳動に付し分子量を測定する。 一方、前記１）で調製したｐＣＹＧ９７ ＤＮＡをＳａ
ｌ ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、小さなりＮＡ断片を
実施例２の（Ｉ）−２）に記載と同じ方法に従い精製す
る。 得られたＤＮＡ断片の制限酵素（ＨｉｎｄｌｌＩ、Ａｖ
ａＩ。 ＳｍａＩ 、 Ｃ１ａｌ 、 ５ａｃＩおよび５ａｃｌ
ｌ）での切断は前述のように従う、 ＤＮＡ断片のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（５％濃度）および分子量
の測定は、実施例２の（Ｉ）−２）に記載の方法と同じ
方法に従って行う。 ２０種の制限酵素で切断したｐＣＹＧ９７ ＤＮＡのア
ガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の
結果は表５に要約して示す、 ＡＲ５ＤＮＡ断片の制限
酵素切断部位数は、ＰＣＹＧ９７、ｐＣＥＰ９７および
ＫｍＲ−Ｐｖｕ ［ＤＮＡ断片のそれと比較することに
より決定する（断片サイズはＩｎ９０３のＤＮＡ配列か
ら決定する（ Ａ、Ｏｋａ ａｔ ａｌ、 Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、 １４７（１９８１）２１７））。 ｐＣＹＧ９７ ＤＮＡの制限酵素切断地図および断片サ
イズは第６図に示す。断片サイズはＫｂｐで表わす。 表５ 、 ｐＣＹＧ９７およびｐＣＥＰ９７ ＤＮＡの
制限酵素切断部位数 １） ＱはＡまたはＣを、ＲはＧまたはＴを、Ｙはｐｙ
を、ＵはＰｕをそれぞれ意味する。 ２） （） ： ＡＲ５ＤＮＡ断片の制限酵素切断部位
数３）制限酵素切断部位はＤＮＡ配列から決定する。 （ＩＩＩ ）ｐＣＹＧ９７ ＤＮＡを用いての互、セレ
ビシェＹＮＮ２７（α７毀１−２８９．田３−５２．
ｍ１２） ［Ｄ、Ｔ。 Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ａｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃｅｄ、 Ｓｃｉ。 ＵＳＡ ７７（１９８０） ４５５９コの形質転換：１
）酵母への形質転換 ウラシル１０＜／ｍｌｌおよびトリプトファン４ｏｓｇ
／戚含有無菌ＹＥＰＤ培地（２０ｍ１ｌ ）にＳ、セレ
ビシェ■Ｎ２７の寒天斜面培養物を接へし、３０°Ｃで
６時間培養する。この細胞１×１０ 個をウラシルおよ
びトリプトファン補足無菌ＹＥＰＤ培地ＩＱＱｍＱに移
し、５ｏｏｍｕ容振盪フラスコ中で３０℃で一晩培養す
る。細胞を低速遠心分離により集め、新しい前記培地１
００−に懸濁し、３０℃で３時間培養する。 細胞を遠心分離により集め、ＹＰ緩衝液５０戚で２回洗
浄し、５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール含有叩緩衝
液５０ｍＱに懸濁し、３０℃で３０分分間中かに振盪す
る。次いで細胞を集め、７５ｍＭ２−メルカプトエタノ
ールおよび２１０＜／ｍｌザイモリエイス５０００ （
生化学工業株式会社）含有ＹＰ緩衝液１９踵に懸濁し、
３０°Ｃで１０分分間中かに振盪する。プロトプラスト
を低速遠心分離により集め、ＹＰ緩衝液で２回洗浄し、
２Ｍソルビトール緩衝液０．６誠に懸濁する。 ＤＮＡ溶液（１０鴻）（前記（ＩＩ）−１）で調製した
ｐＣＹＧ９７ ＤＮＡの表６に示す容量、およびキャリ
ヤー１）ＢＲ３２２ＤＮＡ ｓ ＜ ）および２Ｍソル
ビトール緩衝液（２０４）を混合する。混合したＤＮＡ
１液（３０ｔＪｌ ）とプロトプラスト懸濁液（６０４
）を混合し、室温で１０分間培養する。この反応混合物
に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ （ｐＨ７，５）および
１０ｍＭ ＣａＣ１ｚ含有２０％ＰＥＧ４０００溶液１
ｒｎＱを加え、室温で２０分間静置する。形質転換され
たプロトプラストを低速遠心分離により集め、２Ｍソル
ビトール緩衝液０．４ｍ１ｌに懸濁する。 ２）抗生物質Ｇ４１８耐性形質転換株の選択Ｇ４１８Ｒ
形質転換株の選択は、Ｗｅｂｓｔａｒ ａｎｄＤｉｃｋ
ｓｏｎの方法［Ｇａｎ８．２６（１９８３） ２４３
］に従って行う、前記（Ｉ［［）−１）で調製した形質
転換細胞（０，２ｍＱ）を再生寒天培地Ｂｒｍで希釈し
、ウラシルｌｏｄ／ＩＱおよびトリプト７７ン４０に／
ＩｎＱ補足ＹＥＰＤ下層培地（１５ｍ１１ ）のプレー
トの上に注ぐ、固化後、さらにＹＥＰＤ寒天上層培地８
１ｎＱをプレートに注ぎ、３０℃で一晩培養する。抗生
物質０４１８は、１００ｍｇ／ｍｌｌ原液からの１０ｍ
ｇを各プレート上に広げる。 形質転換コロニーは３０℃で３−４日以内に出現する。 Ｓ。セレビシェＹＮＮ２７の形質転換頻度に対するｐＣ
ＹＧ９７ ＤＮＡ量の影響は、ｐＢＲ３２２ＤＮＡと比
較して表６に示す。ｐＣＹＧ９７ ＤＮＡを用いるとＳ
、セレビシェＹＮＮ２７はＧ４１８耐性に効率的に形質
転換きれる。 表６ 、 ｐＣＹＧ９７ ＤＮＡのＳ、セレビシェＹＮ
Ｎ２７への形質転換頻度 ０．５０ １．１ Ｘ １０’ ｐＣＹＧ９７ ０．０５０ ３．ＯＸ １０３
０．００５ ２．２ Ｘ １０２ ｐＢＲ３２２５，０１ １）ＣＦＵ；コロニー形成単位 （ＩＶ ） ｐＣＹＧ９７のＡＲ５のＤＮＡ塩基配列決
定ニプラスミドｐＣＹＧ９７のＡＲ５のＤＮＡ配列を、
Ｍａｘａｎｒ−Ｇ１１ｂｅｒｔ法［Ａ、Ｍ、Ｍａｘａｍ
ａｎｄ ＳＪ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、 Ｍｅｔｈｏｄｓｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ６５．４９９（１９８０
） ］およびＭ１３ＩＩＩｐ１０およびＭ１３ｍｐＨベ
クターを用いるジデオキシ配列決定法［Ｊ、Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
。 １０１、７８（１９８３） ］により決定し、その結果
を第８図に示す。 （Ｖ）プラスミドｐｃＹＧ９７ ＤＮＡを用いるアクレ
モニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０の形質転換
：Ｉ、緩衝液および培地 コーン・スチープ培地： Ｃ５Ｌ ３０ｇ／ｊ！ グルコース １０ｇ／ｌ スターチ ３０ｇ／ｌ （ｐＨ６，８） ＣａＣＯｓ Ｓ ｇ ／ Ｉ ＹＰＳ培地：シュークロース ２０ｇ／り一ポリペプ
トン １０ｇ／ｊ！ 酵母エキス ５ｇ／ｌ に２ＨＰＯ４１ｇ ／ ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１ｇ ／ Ｎ （ｐＨ７，０） プロトプラスト緩衝液： ＫＣＩ ０．６Ｍ ＭｇＣ１２１０ｍＭ ＣａＣ１２２５ｍＭ ＢＲＭ （再生培地）： Ａ ： ＮａＮＯ３２ｇ ／ ９００ｍＫＨ２Ｐ０．
１ ｇ ／９００ａｌｌシュークｏ −
ス２７５ ｇ ／ ９００ｍ１ｌカザミノ酸
１０ ｇ ／９００戚寒天 ７．
５ｇ／９００絨（ｐＨ６，０） Ｂ：グルツース ２００ ｇ ／ ｊ！Ｍｇ
Ｃｌ２ ２０ｍＭ ＣａＣ１２５０ｍＭ 上記Ａ培地およびＢ培地を個々に高圧滅菌し、Ａ培地９
００ｍ１ｌとＢ培地１００ｍ１ｌを混合する。 ■、方法・結果 （１）プロトプラスト形成 無菌コーン・スチーブ培地（５０＋１１１１ ）にＡ、
クリソゲナムＡｌＣＣ１１５５０の寒天斜面培養から菌
を接種し、２５０眠容振盪フラスコ中において３０℃で
９６時間培養する。このコーン・スチープ培地における
前培養物５眠を無菌ＹＰＳ培地５０誠に移し、前述のよ
うに２５°Ｃで２４時間培養する。菌体を遠心分離によ
り集め、滅菌水で洗浄し、１０ｍＭジチオスレイトール
溶液１５戚に懸濁し、３０℃で１時間穏やかに振県する
１次いで、菌体を遠心分離し、洗浄してザイモリエイス
２０Ｔ（生化学工業株式会社） ２０１Ｑｇ含有プロト
プラスト緩衝液２０−に再懸濁する。３０℃で２時間穏
やかに振盪した後、プロトプラストを低速遠心分離によ
り集め、プロトプラスト緩衝液で洗浄し、プロトプラス
ト緩衝液０．５ｍ１１に再懸濁する。 （２）形質転換 プロトプラスト懸濁液（１００ＩＪｉ１”）およびプラ
スミドｐＣＹＧ９７ （１０縛、約５肩ＤＮＡ ）を混
合し、室温で１０分間静置する。この混合物に、２５ｍ
Ｍ ＣａＣｌ２含有２０％ポリエチレングリフール（Ｐ
ＥＧ ） ４０００溶液（ｐＨ６，３）１−を加える。 室温で２０分間静置した後、プロトプラストを遠心分離
し、プロトプラスト緩衝液０．９誠に再懸濁する。 （３）抗生物質０４１８耐性形質転換株の選択形質転換
細胞０．２−を再生寒天（ＢＲｔｌｌＳ証）プレートに
注ぎ、次いでＢＲＭ５ｆｆｌｌｌを注ぐ、３０℃で一晩
培養した後、抗生物質Ｇ４１８０．２ｍＱ （ＧＩＢＣ
Ｏラボ）を各プレートに広げ、３０℃で１週間培養する
。プラスミドｐｃＹＧ９７ ＤＮＡを用いてのΔ、クリ
ソゲナムＡＴＣＣ１１５５０の形質転換頻度は表７に示
す。 表７．９ＣＹＧ９７ ＤＮＡを用いるアクレモニウム・
クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０１〉の形質転換頻度Ｇ
４１８の濃度 ＤＮＡ量 １）１０１０／ｍＱプロトプラスト溶液１００４を用い
形質転換する。約１０９／プレートのプロトプラストを
プレートに塗抹する。 Ｘ轟透１ プラスミドｐＬＥυ１３５、ｐＬＥＵ９７、ｐＣＥＰ９
７およびｐＣＹＧ９７のそれぞれを用い常法によりＥ、
フリＣ６Ｃ６００ｒ−（ＡＴＣＣ３３５２５）を形質転
換して下記の形質転換株を得る。 エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−（ｐＬＥＵ１３５
）エシェリヒア・コリ６Ｃ６００ｒ−（ｐＬＥＵ９７
）エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−−（ｐＣＥＰ９７
）エシェリヒアｅ）リ Ｃ６００ｒ−ｍ−（ｐＣＹＧ
９７ ）４、
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）およびアク
レモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃ
ｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ）の各微生物の細胞内でＤＮＡ
複製起点（ＡＲ５）として機能し得る新規なりＮＡ、そ
れを含む新規なベクターおよびこのベクターを含む微生
物に関するものである。 従来の技術： エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ）宿主−ベクター系が組換えＤＮＡ技術において有
用であることは周知である。 発明が解決しようとする問題点： しかしながら、このエシェリヒア・コリの宿主−ベクタ
ー系は、例えば、高等動物によって産生される有用物質
の生産のためには十分なものではない。 このため、例えば酵母、かび等の宿主−ベクター系の開
発研究が行われており、高等生物に由来する有用物質を
生産する、より有利な宿主−ベクター系の開発が望まれ
ている。 問題点を解決するための手段： アクレモニウム・クリソゲナム（以下Ａ、クリソゲナム
と略す場合がある） Ａ１：ＣＣＩＬ５５０は多数の臨
床上重要な半合成セファ０スポリン抗生物質の製造に使
用されていることは周知であり、さらに、Ａ、クリソゲ
ナムＡＴＣＣ１１５５０は細胞外にアルカリプロテアー
ゼを大量に（Ｉｇ／Ｆ！以上）産生することが知られて
いるが、この発明者等はこのＡ、クリソゲナムＡｔＣＣ
１１５５０のＤＮＡのＤＮＡ複製起点（ＡＲ５）をクロ
ーニングし、該ＡＲ５をエシェリヒア・コリ（以下、Ｅ
、フリと略す場合がある）およびサッカロミセス・セレ
ビシエ（以下Ｓ、セレビシェと略す場合がある）のシャ
トルベクター中に導入し、Ａ、クリソゲナムまたはＳ、
セレビシェを宿主として使用する組換えＤＮＡ技術にお
けるベクターとして有用な新規プラスミドを構築するの
に成功した。 第３．４．５，６図にそれぞれ示した制限酵素切断地図
で特徴づけられるこの発明のプラスミドｐＬＥＵ１３５
、ｐＬＥＵ９７、ｐＣＥＰ９７およびｐＣＹＧ９７は既
知の方法により製造される。 以下にプラスミドｐＬＥＵ１３５、ｐＬＥＵ９７、ｐＣ
ＥＰ９７およびｐＣＹＧ９７の一般的製造法を示す。 １）栄養マーカーであるプラスミドＹＥｐ１３の遺伝子
ＬＥＬＩ＋をプラスミドｐＢＲ３２５のｐｓｔ Ｉ部位
に導入してプラスミドｐＢＲ−ＬＥＤを得、これをＤＮ
Ａ複製起点（ＡＲ５）検出のためのベクターとして使用
する。 出発物質として使用するプラスミドｐＢＲ３２５は周知
のプラスミドであるＣ Ｇｅｎｅ、 １４（１９８１’
） ２８９−２９９１゜ プラスミドＹＥｐ１３はまた、Ｅ、フリおよびＳ。 セレビシェのシャトルベクターとして知られているＣ
Ｊ、Ｒ，Ｂｒｏａｃｈ ａｔ ａｌ、 、Ｇａｎ＠、
８（１９７９） １２１ ］。 プラスミドｐＢＲ３２５およびＹＥｐ１３を別々に制限
酵素Ｐｓｔ Ｉで消化し、得られた反応混合物を合わせ
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結する。 連結されたＤＮＡを用いてＥ、コリＣ６Ｃ６００ｒ−（
ＡＩ’Ｑ：３３５２５）を形質転換し、ＡｐＳｒｃＲＣ
ｍＲＬｅｕ”−ｙ口二一を選択する。 このようにして構築されたプラスミドをｐＢＲ−ＬＥＵ
と命名する。そしてこのプラスミドは第７図に示す制限
酵素地図で特徴づけられる。 ２）Ａ、クリソゲナムＡＩ’ＣＣ１１５５０の細胞を例
えばザイモリエイス（商標、生化学工業社製）のような
細胞壁溶解酵素で処理し、次いで得られたプロトプラス
トをフェノールおよびクロロホルムで処理することによ
り得られる染色体ＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａで部分消
化し、ショ糖密度勾配超遠心分離法により精製して約１
−１０ＫｂｐのＤＮＡ断片を得る。 ３）この約１−１０ＫｂｐのＤＮＡ断片を前記１）で得
たプラスミドｐＢＲ−ＬＥＤのｌｌａｍＨＩ部位に次の
様にして導入するニ プラスミドｐＢＲ−ＬＥＵを制限酵素ＢａｍＨＩで消化
し、前記的１−１０ＫｂｐＤＮＡ断片を消化混合物に加
え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結する。 この連結したＤＮＡを用いてＥ、フリＣ６００ｒ”’ｍ
−（ＡＴＣＣ３３５２５）を形質転換し、ＴｃＳＣｍＲ
Ｌａｕ” フａ ＝ −を常法により選択する。得られ
たＣｍＲＴｃＳＬａｕ＋ハイブリッドプラスミドＤＮＡ
を用いてＳ、セレビシェ５ＨＹ３ （ＡＩ’Ｃ（：４４
７７１ ） ＣＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、 ７５（１９７８）１９２９コを形質転換
する。 そして高頻度のＬｅｕ＋形質転換コロニーを生じるハイ
ブリッドプラスミドを選択し、Ａ、クリソゲナムＡＴＣ
Ｃ１１５５０のＡＲ５を含有する二個のハイブリッドプ
ラスミドＤＮＡを得る。 得られた二つのハイブリッドプラスミドをそれぞれｐＬ
ＥＵ１３５およびｐＬＥＵ９７と命名する。 ４）前記３）で得たプラスミドｐＬＥＩＪ９７を制限酵
素Ｐｓｔ Ｉで消化し、得られた消化物をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結して、遺伝子Ｌｅｕを欠損したプラ
スミドｐＣＥＰ９７を得る。 ５） Ｔａ２０５のＰｖｕ Ｉ ＫｍＲ断片を前記４）
で得たプラスミドｐＣＥＰ９７に下記のように導入して
プラスミドｐＣＹＧ９７を得る： ここで使用するＴａ９０３のＰｖｕ Ｉ ＫｍＲ断片は
既知の遺伝子である［ Ａ、Ｏｋａ ａｔ ａｌ、 Ｊ
、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 １４７（１９８１）２１７
コ。 ｐＣＥＰ９７ ＤＮＡを制限酵素ｐｖｕ Ｉ［で部分消
化し、消化されたｐＣＥＰ９７ ＤＮＡとＰｖｕＩＫｍ
Ｒ断片をＴ、ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。 連結されたＤＮＡを用いてＥ、フリＣ６００ｒ’″ｍ−
（ＡＴＣＣ３３５２５）を形質転換し、常法によりＡｐ
ＲＫｍＲＣｍＲクローンを得る。このようにして得られ
たプラスミドをｐＣＹＧ９７と命名する。−このプラス
ミドｐＣＹＧ９７は、第６図に示すように、Ａ 、 り
’Ｊ ’／ゲナムＡｒＣＣ１１５５０ｃ７）ＡＲ５ＤＮ
ＡおよびＥ、コリのＴａ２０５のカナマイシン耐性遺伝
子（ＫｍＲ）を含有する。 プラスミドｐｃＹＧ９７を用いてＳ、セレビシェＹＮＮ
２７を形質転換することができ［Ｄ、 Ｔ、 Ｓｔｉｎ
ｃｈｃｏｍｂａｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７７（１９８０）４５
５９］、得られた形質転換株はアミノグリコシド抗生物
質０４１８を含有する寒天平板において直接選択するこ
とができる。 前記のようにして構築したプラスミドｐＬＥ０１３５は
第３図に示すような制限酵素切断地図で特徴づけられる
。 そしてアガロースゲル電気泳動法により測定したｐＬＥ
Ｕ１３５の分子量は約１４．９Ｋｂｐである。 この発明によって得られるプラスミドｐＬＥＵ１３５の
ＤＮＡ複製起点（ＡＲ５）部分は特有な制限酵素切断パ
ターンを示し、アガロースゲル電気泳動法により測定し
た同部分の分子量は約５．０４Ｋｂｐであり、新しいＤ
ＮＡであると認められる。 従って、このＡＲ５ＤＮＡを含有するプラスミドｐＬＥ
Ｕ１３５もまた新規なプラスミドであると認められる。 また、前記のようにして構築したプラスミドｐＬＥＵ９
７は第４図に示すような制限酵素切断地図で特徴づけら
れる。そしてアガロースゲル電気泳動法により測定した
ｐＬＥＵ９７の分子量は約１１．２Ｋｂｐである。 プラスミドｐＬＥＵ ９７のＤＮＡ複製起点（ＡＲ５）
ＤＮＡ部分（プラスミドｐＣＥＰ９７およびｐＣＹＧ
９７！；：おけるＡＲ５ＤＮＡ部分と同じ）は特有な制
限酵素切断パターンを示し、アガロースゲルおよびポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により測定した同部分の
分子量は約１．３９Ｋｂｐであり、新規なりＮＡである
と認められる。 従って、このような新規なＡＲ５ＤＮＡを含有するプラ
スミド９ＬＥＵ９７もまた新規なプラスミドであると認
められる。 また、９ＬＥＵ９７を制限酵素ｆ’ｓｔＩで消化し、消
化物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結することにより
得られるプラスミドｐＣＥＰ９７は第５図に示すような
制限酵素切断地図で特徴づけられる。そしてアガロース
ゲルおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測
定したｐＣＥＰ９７の分子量は約７．３８Ｋｂｐである
。 ｐＣＥＰ９７ノＤＮＡ複製起点（ＡＲ５） ＤＮＡ部分
はｐＬＥＵ ９７のそれと同じものである。 従って、このような新規なＡＲ５ＤＮＡを含有するプラ
スミドｐＣＥＰ９７もまた新規なプラスミドであると認
められる。 さらにまた、前記のようにして構築したプラスミドｐＣ
ＹＧ９７は第６図に示すような制限酵素切断地図で特徴
づけられる。そしてアガロースゲルおよびポリアクリル
アミドゲル電気泳動法により測定したｐＣＹＧ９７の分
子量は約９．０８Ｋｂｐである。 ｐＣＹＧ９７のＤＮＡ複製起点（ＡＲ５） ＤＮＡ部分
はｐＬＥＵ ９７のそれと同じものである。 従って、このような新規なＡＲ５ＤＮＡおよびＥ６コリ
のＴｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ）を含
有するブラスミ、ドｐＣＹＧ９７もまた新規なプラスミ
ドであると認められる。 発明の効果： この発明によるハイブリッドプラスミドｐＬ）Ｉ１１３
５、ｐＬＥＵ９７、ｐＣＥＰ９７およびｐＣＹＧ９７は
例えば以下のような有用性を有している。 Ａ、クリソゲナムＡｌＣＣ１１５５０の特異的ＡＲ５Ｄ
ＮＡを含有するプラスミドｐＬＥＵ１３５は、Ａ、クリ
ソゲナムまたはＳ、セレビシェを宿主として用い、ロイ
シンを選択マーカーとして用いる組換えＤＮＡ技術にお
けるベクターとして有用である。 また、Ａ、クリソゲナムＡｌＣＣ１１５５０（７）特異
的ＡＲ５ＤＮＡを含有するプラスミドｐＬＥＵ９７は、
Ａ、クリソゲナムまたはＳ、セレビシェを宿主として用
い、ロイシンを選択マーカーとして用いる組換えＤＮＡ
技術におけるベクターとして有用である。 Ａ、クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０の特異的ＡＲ５Ｄ
ＮＡを含有するプラスミドｐＣＥＰ９７はそれ自体プラ
スミドｐＣＹＧ９７の構築のための中間体として有用で
あり、また適当な選択マーカーをこのｐＣＥＰ９７に導
入することによって、Ａ、クリソゲナムまたはＳ、セレ
ビシェを宿主として用いる組換えＤＮＡ技術におけるベ
クターとして有用である。 さらにまた、Ａ、クリソゲナムＡｌＣＣ１１５５０の特
異的ＡＲ５ＤＮＡを含有するプラスミドｐＣＹＧ９７は
、Ａ、クリソゲナムまたはＳ、セレビシェを宿主として
用い、アミノグリフシト抗生物質０４１８耐性を選択マ
ーカーとして用いる（このほか、きらに抗生物質０４１
８のほかにカナマイシンおよびネオマイシンもまたＡ、
クリソゲナムにおける選択マーカーとして用いられる）
組換えＤＮＡ技術におけるベクターとして有用である。 従って、この発明のプラスミドｐＬＥＵ１３５、ｐＬａ
１９７およびｐＣＹＧ９７は、特にＳ、セレビシェのよ
うな酵母およびＡ、クリソゲナムＡｌＣＣ１１５５０の
ような真菌の性質を改良する菌株改良のためのベクター
として有用である（例えば、セファロスポリンＣの生産
性の改善等に有用である）。 さらにまた、Ａ、クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０は前
述のように細胞外にアルカリプロテアーゼを大量に（Ｌ
ｘ／ｌ１以上）産生ずる。従って、プラスミドｐＬＥＵ
１３５、ｐＬＥＵ９７およびｐＣＹＧ９７は、前記アル
カリプロテアーゼの遺伝子をクローニングすることによ
りＳ、セレビシェまたはＡ、クリソゲナムにおいてヒト
組織プラスミノーゲン活性化因子（ＨＴＰＡ ）のよう
なヒト活性ペプチドの細胞外生産に使用きれる発現ベク
ター構築のための中間体としても有用である。 この発明により構築されたプラスミドｐＬＥＵ１３７、
ｐＬＥＵ９７、ｐＣＥＰ９７およびｐＣＹＧ９７を用い
てそれぞれＥ 、 ｃｏｉｌ Ｃ６Ｃ６００ｒ−″（Ａ
ＴＣＣ３３５２５）を常法により形質転換することによ
り、次のような形質転換株を得ることができる。 エシェリヒア・コリ６００ｒ−ｍ−（ｐＬＥＵ１３５
）エシェリヒア・コリ６Ｃ６００ｒ−（ｐＬＥＵ９７
）エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−（ｐＣＥＰ９７
）エシェリヒア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−（ｐＣＹＧ９
７ ）実施例：実施例： 以下、実施例によりこの発明を説明する。 下記実施例において以下の略号を使用する。 Ａ’ｌ’Ｐ ： アデノシン−５′−トリホスフェー
トＤＴ’Ｔ ： ジチオスレイトール エｒｉｓ： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン ＥＤＴＡ ： エチレンジアミンテトラ酢酸ＳＯＳ
： ラウリル硫酸ナトリウムＰＥＧ ： ポリエチ
レングリコールｂｐ＝ 塩基対 Ｋｂｐ ： キロ塩基対 ＡＲ５： ＤＮＡ複製起点 Ｒｏ Ａｐ、Ｅ、コリにおけるアンピシリン耐性ＡｐＳ、
Ｅ、フリにおけるアンピシリン感受性ＣｍＲ： Ｅ、
コリにおけるクロラムフェニフール耐性 ＣｍＳ： Ｅ、コリにおけるクロラムフェニコール感
受性 Ｒｏ Ｔｃ、Ｅ、コリにおけるテトラサイタリン耐性ＴｃＳ：
Ｅ、フリにおけるテトラサイタリン感受性 ＫｍＲ： Ｅ、フリにおけるカナマイシン耐性ＮｍＲ
： Ｅ、コリにおけるネオマイシン耐性Ｋｍ”：
Ｅ、コリにおけるカナマイシン感受性Ｇ４１８Ｒ： ｓ
、セレビシェにおける抗生物質０４１８耐性 Ｌｅｕ” ： Ｅ 、 ’：２すｌａｕ ＢおよびＳ
、セレビシェ１ａｕ２のロイシン栄養要求性変異の相補
性 緩衝液・培地 Ｌ： ２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）１
０ｍｌｉ ＭｇＣ１ｚ ６ｍＭ ２−メルカプトエタノール １００１１ｇ／ｍｌｌ牛血清アルブミン（ＢＲＬ）Ｍ
： ５０ｍＭ ＮａＣ１含有り緩衝液Ｈ： １０
０ｍＭ ＮａＣ１含有り緩衝液Ｓ ： ２０ｍＭ
ＫＣＩ含有し緩衝液ＴＥ緩衝液： ２０ｍＭτｒｉｓ
−ＨＣＩ （ｐＨ７，５）０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ＴＰＥ緩衝液： ３６ｍＭ Ｔｒｉｓ ３０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １ｍＭ ＥＤＩＡ ｐ）１７．８ ＫＰ緩衝液： ７４．５６ｇ ／ ＲＫＣｌ０．２５ｇ
＃！ Ｋ２ＳＯ３ ０−２０ｇ ／ ｌ Ｍｇｃｔ２・６Ｈ２００，０５ｇ
＃！ ＫＨ２ＰＯ４ ０、３７ｇ ／ ｉ ＣａＣ１ｚ −２Ｈ２Ｈ２Ｏ２５
Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ（ｐＨ７，２）ＹＰ緩衝液： Ｌ
Ｍ ＫＣｌ １０ｍＭ Ｉｒ１ｓ −ＨＣＩ （ｐＨ７，５）２Ｍソ
ルビトール緩衝液； ２Ｍソルビトール １０ｍＭ Ｉｒ１ｓ −ＨＣＩ （ｐＨ７，５）１０ｍ
Ｍ ＣａＣ１ｚ ＬＢ寒天：１０ｇ／ｊ２ バタトトリプトン（ＤＩＦＣ
Ｏ）５ｇ／！酵母エキス（ＤＩＦＣＯ） ５ ｇ ／ ｌ ＮａＣ１ １５トｑ寒天（ＤＩＦＣＯ） ｐＨ７，２ 北寒天： １０．５ｇ＃！ Ｋ２ＨＰＯ４４，５ｇ
／ （ｌ ＫＨ２ＰＯ４ １，０ｇ ／ １ （ＮＨ４）２５０４０．５ｇ／ｌ
クエン酸三ナトリウム（・２Ｈ２０） １．２ｇ／りＭｇ５Ｏ，・７７Ｈ２ Ｏ２／ｊ！ グルコース １５ｇ／ｊ２ 寒天（ＤＩＦＣＯ） ＡＣ培地：３６ｇ／ｊ！ シュウクロース２７ｇ／Ｎ
グルコース ３ｇ／ｌ Ｌ−メチオニン ７．５ｇ／ｌ （ＮＨ４＞２Ｓｏ４ １３．８ｇ＃！ Ｋ１２ＰＯ４ １４、ｏｇ／ｌ Ｋ２ＨＰ０゜ １０ｇ／ｊ！ ペプトン（ＤＩＦＣＯ）ＹＥＰＤ培地：
１０ｇ／ｌ酵母エキス（ＤｌＦＣＯ）２０ ｇ ／ ｌ
ペプトン（ＤＩＦＣＯ）２０区／ｆ グルコース 酵母用補足ＭＭ培地（ロイシン非含有）：１０ｇ／ｊ！
グルコース ６．７ｇ／ｊ２ イーストナイトロジェンベース（Ｄ
ＩＦＣＯ） ２１８ｇ／ｌ ソルビトール １０ｍｇ／Ｆ！ アデニン １０ｍｇ／ ｆｌ ウラシル ４０ｍｇ／ゑ ヒスチジン ４０ｍｇ／ ｊ！ トリプトファン 再生寒天培地：１．２Ｍソルビトールおよび３％寒天含
有ＹＥＰＤ培地 ＹＥＰＤ下層培地：１．２Ｍソルビトール、２％寒天、
０．２％（賢／Ｖ）−リン酸水素 二カリウム含有ＹＥＰＤ培地 ＹＥＰｉ）寒天上層培地：１．２Ｍソルビトールおよび
２％寒天含有ＹＥＰＤ培地 さらに、種々のプラスミドを制限酵素で切断するため、
次の組合せの制限酵素および緩衝液を以下の実施例にお
いて使用した。 制限酵素 艷Ｉ痙Ａｖａ Ｉ
、 Ｃ１ａ Ｉ 、 ＥｃｏＲＩ 、 ＨｉｎｃｌＩ
。 Ｈｉｎｄｌ［［、ＭｌｕＩ 、 ＰｓｔＩ 、 Ｐｖｕ
ｌ、 Ｈ緩衝液Ｓａｌ Ｉ 、 Ｘｈｏ Ｉ Ａａｔｌ［、５ｐｈＩ Ｍ緩衝液
ＡｃｃＩ 、 ＢａｍＨＩ 、 Ｂｇｌｌ［、Ｌ緩衝液
ＨｐａＩ 、 ＫｐｎＩ 、 ５ａｃＩ ＋ ＳａｃＩ
Ｓｍａ Ｉ Ｓ 緩衝液
ｐＬＥＵ９７およびｐＬＥＵ１３５の構築：（１）ベク
ターｐＢＲ−ＬＥＵの構築 ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ ）製の
市販品として得られるベクターｐＢＲ３２５ＤＮＡ １
（をＨ緩衝液１０縛中においてＰｓｔＩ３単位を用い１
時間消化する。 一方、Ｊ、 Ｒ，Ｂｒｏａｃｈ ａｔ ａｌ ［Ｇｅｕ
＠、 ８ （１９７９）１２１］の方法により調製きれ
るベクターＹＥｐｌＳ ＤＮＡ１（をＨ緩衝液１０４中
においてＰｓｔＩ３単位を用いて１時間消化する。上記
二つの反応混合物を合せ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．５単
位、０．５ｍＭ ＡＩＰおよび１０ｍＭ ＤＴＴ中、４
℃で２０時間反応する。 このようにして得た連結されたＤＮＡを用い、Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ２５０頁（コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、１９８２）に記
載の方法によりエシェリヒア・コリＣ６００ｒ″’ｍ−
（ＡＴＣＣ３３５２５）を形質転換する。 形質転換した細胞を、テトラサイクリン５（／酸含有Ｌ
Ｂ寒天にブレーティングし、３７℃で一晩培養する。テ
トラサイクリン耐性コロニーを、それぞれ、クロラムフ
ェニコール２０ｆｆｌ／１Ｉ１１含有ＬＢ寒天、アンピ
シリン５０（／−含有ＬＢ寒天、およびスレオニンＳＯ
ｘ／ｍＱ含有北寒天（ロイシン非含有）に移し、３７℃
で一晩培養するｅ Ａｐ”ＴｃＲＣｍＲＬｅｕ” コロ
ニーを得、この構築されたプラスミドＤＮＡをｐＢＲ−
ＬＥＤと命名する。 このｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮＡは、Ａｄｖａｎｃ＠ｄ Ｂ
ａｃｔ、ａｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ １１６頁（コー
ルド・スプリング・ハーバ−ラボラトリ−１１９８０）
に記載の方法により単離する。 （２）アクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５
０ＤＮＡ由来ＡＲ５のクローニング １） ＡｌＣＣ１１５５０ＤＮＡの抽出無菌ＡＣ培地（
１００ｆｆｌｌｌ ）に、Ａ、クリソゲナムＡ’ｆＯ：
１１５５０の寒天斜面培養から得た菌糸体を接種し、５
００−容振盪フラスコ中２５℃、２５０ｒｐｍで３日間
培養する。細胞を集めＫＰｆｉ衝液で洗浄する。この細
胞を１０ｍＭ ＤＴＴ含有ＫＰＩＩ衝液２０−に懸濁し
、３７℃で３０分間振盪する１次いでこの細胞懸濁液に
ザイモＩＪ エイス６０．０００ （生化学工業株式会
社） ２０ｍｇを加え、３７℃で２時間振盪する。細胞
を１００ＯＸ ｇで１０分間遠心分離する。菌体を１０
ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳ含有５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５） １０ｍ１１に懸濁し
、等容量のフェノールおよびクロロホルムで２回抽出す
る。このＤＮＡ溶液をＲＮａｓｅ Ａ （シグマ社）１
０に／戒で処理し、次いでプロテアーゼＫ（メルク社）
２０ＯＮｇ／ ｒｎＱで処理する。ＤＮＡ溶液を等容
量のフェノールで抽出し、二倍容量のエタノールを加え
、−２０℃で２時間沈殿させる。沈殿を遠心分離により
集め、ＴＥ緩衝液ｏ、 ｓｍｉに再懸濁する。このＤＮ
Ａ溶液を同緩衝液で十分透析し、約５０（のＤＮＡを得
る。 ２） ＡＴＣＣ１１５５０ＤＮＡのｐＢＲ−ＬＥＵ Ｂ
ａｍＨＩ部位へのクローニング（第１図） 前記１）のようにして調製したＡＴＣＣ１１５５０ＤＮ
Ａ約１０葱をＬ緩衝液２００４中で５ａｕ３ Ａ （Ｂ
ＲＬ） １単位を用い１０分間消化する０反応は６５°
Ｃで１０分間加熱することにより停止させる。消化され
たＤＮＡはショ糖密度勾配遠心分離法により約１−１０
ＫｂｐＤＮＡサイズに精製する。サイズにより分別した
ＤＮＡは最終的にＴＥ緩衝液１０４に懸濁する。 前記１）に記載のようにして調製したｐＢＲ−ＬａＪＤ
ＮＡＩＸをＬ緩衝液１０４中でＢａｍＨＩ （ＢＲＬ）
１単位を用い１時間消化する。得られた消化物と前述
のＴＥ緩衝液中サイズ分別ＤＮＡ懸濁液を混合する。こ
の混合物に１４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ） （０，５単
位）、１０×Ｌ緩衝液ＩＰｊ１および５ ｍＭ ＡｒＰ
および１０〇−ＭＴの２−を加える。続いてこの混合物
を４℃で２０時間反応する。連結されたＤＮＡを用い、
１（ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ２５０頁に記載
の方法に従ってＥ、コリＣ６００ｒ−ｍ−（ＡＴＣＣ３
３５２５）を形質転換する。形質転換された細胞をクロ
ラムフェニコール２０８Ｅフ 一晩培養する。得られたクロラムフェニコール耐性コロ
ニーをテトラサイクリン５肩／−含有ＬＢ寒天およびス
レオニン５（ｂ＋ｇ／ｎｉｌ含有聞寒天（ロイシン非含
有）にそれぞれ移す。ＴｃＳＣｍＲＬｅｕ＋コロニーを
得（１０８クローン）、これらプラスミドＤＮＡをＡｄ
ｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔａｒｉａｌ Ｇａｎｅｔｉｃｓ
１１６に記載の方法に従い単離する。 ３）サッカロミセス・セレビシエＳＨＹ ３ （ ＡＴ
ＣＣ４４７７１ ’）の形質転換（ｗ＆１図）Ｓ．セレ
ビシェＳＨＹ ３ （ ＡＴＣＣ４４７７１ ’）を、
Ｈｉｎｎｅｎａｔ ａｌの方法［ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ７５（ １９
７８ ） １９２９ ］に従い形質転換する．アデニン
およびウラシルの１０に／ｍＱを含有する無菌ＹＥＰＤ
培地（ ５０１１１１ ）にＳ．セレビシェＳＨＹ ３
（ ＡＴＣＣ４４７７１ ）の寒天斜面培養物を接種
し、２５０１１１１容振盪フラスコ中にて３０°Ｃで一
晩培養する．細胞を遠心分離して、集め、２５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡおよび５０ｍＭ ＤＴＴ含有１．２Ｍソルビトー
ル溶液５緘に懸濁し、３０℃で１０分分間中かに振盪す
る。次いで細胞を遠心分離により集め、Ａ１２Ｍソルビ
トール溶液で洗浄し、１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ
Ｅ ＤＴＡおよび２０（１−ｇ ／ ｍＱザイモリエイ
ス６０，０００（生化学工業株式会社）含有６７ｍＭリ
ン酸緩衝液（ ｐＨ７．５） ５ ｍＱに懸濁し、３０
°Ｃで６０分分間中かに振盪する．得られるプロトプラ
ストを低速遠心分離により集め、１．２Ｍソルビトール
溶液で洗浄し、１０ｍＭ ＣａＣ １２含有１．２Ｍソ
ルビトール溶液４ ＩＱに懸濁する。 このプロトプラスト懸濁液（ ０． ２！ｄ ）と前記
２）で調製したＣｒｎＲＴｃＳＬｅｕ＋ハイブリッドＤ
ＮＡ Ｃ ２０ｔａＱ ）（約５（）を混合し、室温で
２０分間振盪する。 １０ｍＭ ＣａＣｌ２およびＬ ＯｍＭτｒｉｓ −
ＨＣｌ（ ｐＨ７． ５ ）含有２０％ＰＥＧ４．ＯＯ
Ｏ溶液２踵をこの懸濁液に加え、室温で２０分間静置す
る．形質転換されたプロトプラストを低速遠心分離によ
り集め、１．２Ｍソルビトールおよび１０ｍＭ ＣａＣ
１２含有１ ０ｍＭ工ｒｉｓーＨＣＩ緩衝液（ ｐＨ
７． ５ ） ０． ５１１１Ｑに懸濁する．形質転換
された細胞（０． １１ＩＩＱ ）を酵母用３％寒天含
有（ロイシン非含有）補足間培地１０１ｄで希釈し、２
％寒天含有の同下層培地の上に上層し、３０℃で４日間
培養する。 二種のハイブリッドプラスミドＤＮＡから約５００コロ
ニーが得られるが、他の１０６ハイブリツドプラスミド
ＤＮＡおよびｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮＡからは１コロニー
しか得られない。この結果からＡ．クリソゲナムＡＴＣ
Ｃ１１５５０のＡＲ５含有の二種のハイブリッドプラス
ミドＤＮＡが得られ、それぞれｐＬＥＵ９７およびｐＬ
ＥＵ１３５と命名する。 Ｓ．セレビシェＳＨＹ ３ （ ＡＴＣＣ４４７７１
）の形質転換頻度に対するｐＬＥＵ９７およびｐＬＥｔ
？１３５ ＤＮＡ量の効果を、ｐＢＲ − ＬＥＵおよ
びＹＥｐ１３ ＤＮＡと比較して表１−１に示す。ＹＥ
ｐ１３ ＤＮＡはＳ．セレビシェの２−プラスミドＤＮ
Ａを含有している。 表１−１ ｐＬＥＵ９７およびｐＬＥＵ１３５ ＤＮ
ＡのＳ，セレビシェＳＨＹ ３ （ ＡＴＣＣ４４７７
１ ）への形質転換頻度 ＤＮＡ ＤＮＡ ｔ ＬＥＤ＋形質転換数
（ｍｃｉ） （ＣＦＵ” ）７、５
５．４ Ｘ １０３ｐＬＥＵ９７ ３．０
１．６ ｘ １０３１、５ ５．
３ Ｘ １０２６、０ １．Ｉ Ｘ １０３
ｐＬＥＵ１３５ ２．４ ４．７ ｘ
１０２１、２ ２．１ Ｘ １０２６、０１ ｐＢＲ−ＬＥＵ ２．４ １１、
２ １ ７、５ ２．５ Ｘ １０３ＹＥｐ１３
３．０ １．Ｉ Ｘ １０３１、５５。 Ｏ×１０２ １）ＣＦＵｉコロニー形成単位 （３） ｐＢＲ−ＬＥＵ， ｐＬＥＵ１３５およびｐＬ
ＥＵ９７ ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析 １） ｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮＡの制限酵素地図の決定前
述のようにして調製したｐＢＲ−ＬＥＤ ＤＮＡの制限
酵素地図の決定は、表１−２に示す種々の制限酵素によ
る切断により行う。該制限酵素は、ベテスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ、宝酒造株式会社および東洋紡株式会
社の市販品として得られる。 ｐＢＲ−ＬＥＬＩ ＤＮＡ（０，５−１ｐｇ ）と表１
−２記載の各制限酵素（３−６単位）をＨ緩衝液または
Ｌ緩衝液２０４中において３７°Ｃで６０−１８０分間
反応する。 消化物を０．８％アガロースゲルにて、垂直ゲル電気泳
動法（０，３Ｘ １６Ｘ Ｌ６ｃ＋ｎ ）によりＴＰＥ
緩衝液中８０ｖで２〜３時間電気泳動する。 アガロースゲルにおけるＤＮＡバンドの検出は、Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ １６１頁（１９８２）
に記載のように行う、切断ＤＮＡ断片の分子サイズは、
アガロースゲルにおけるそれらの相対移動度をλ−Ｈ１
ｎｄＩ［断片のそれ［Ｌ、Ｈ，Ｒｏ！：＋１ｎｓｏｎ
ａｎｄ Ａ、 Ｌａｎｄｙ、 Ｇｅｎａ！（１９７７）
１ ］と比較して測定する。 各種制限酵素で切断したｐＢＲ−ＬＥＬＩ ＤＮＡのア
ガロースゲル電気泳動分析の結果は表２に要約して示す
。ｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮＡ制限酵素消化断片の分子サイ
ズは表１−２に示す。ｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮＡに対する
制限酵素の切断地図は第７図に示す。 表１−２ 、 ｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮＡ制限酵素消化断
片２）の分子量１） Ｐｓｔ Ｉ ６．００ ３．８５
９．８５Ｓａｌ Ｉ 、 ５．７
２ ４．１３ ９．８５ＥｃｏＲＩ
６．８５ ３．００ ９．８５Ｂｇｌ
Ｉ［７，２０２，６５９，８５ｐＶｕｎ
６．４６ ３． ＄９ ９．８５Ｋｐｎ Ｉ
７．４５ ２．４０ ９．８
５Ｈｐａ Ｉ ７．７５ ２．１０
９．８５１）断片サイズはＫｂｐで表わす。 ２）小さなサイズの断片は測定していない。 ２） ｐＬＥＵ１３５およびｐＬＥＵ９７ ＤＮＡの制
限酵素地図の決定 表２に示す種々の制限酵素によるｐＬＥＵ１３５および
ｐＬＥＬＩ９７ ＤＮＡの切断およびアガロースゲル電
気泳動は前記ｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮＡの場合と同じ方法
で行う。 １１種の制限酵素で切断したｐＬＥＵ１３５およびｐＬ
ＥＵ９７ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析の結果は
表２に要約して示す。ＡＲ５ＤＮＡ断片の制限酵素切断
部位の数は、ｐＬＥＵ９７およびｐＢＲ−ＬＥＵ ＤＮ
Ａのそれ、およびｐＬＥｕ １３５およびｐＢＲ−ＬＥ
Ｕ ＤＮＡのそれと比較して決定する。 ｐＬＥＵ１３５およびｐＬＥＵ９７ ＤＮＡ制限酵素消
化断片の分子量はそれぞれ表３および４に示す。ｐＬＥ
Ｕ１３５およびｐＬＥＵ９７ ＤＮＡの制限酵素の切断
地図はそれぞれ第３および４図に示す。 表２ 、 ｐＬＥＵ９７およびｐＬＥＵ１３５ ＤＮＡ
の制限酵素切断部位の数 ｐＬＥｕ９７ ｐＬＥＵ１３５ ｐＢＲ−ＬＥＵＢａｍ
ＨＩ Ｇ↓ＧＡＩＣＣ０（０）２）出）２）ＩＢｇｌ
ｌＩ Ａ’ＧＡτＣＴ ２（０） ３（１）
２ＥｃｏＲＩ Ｇ↓ＡＡｒＴＣ２（０）
３（１） ２Ｈｉｎｄｌｌ［Ａ↓ＡＧＣ’ｆＴ
１（０） ３（２） ＩＨｐａＩ Ｇ買
↓ＡＡＣ２（０） ３（１） ２Ｋｐｎ Ｉ
ＧＧＴＡＣ’ Ｃ２（０） ２（０） ２
Ｐｓｔ Ｉ ＣＴＣＧＡ ’ Ｇ ２（０）
５（３） ２Ｐｖｕ Ｉ［ＣＡＧ↓ＣＴＧ
２（０） ４（２） ２Ｓａｃ Ｉ Ｇ
ＡＧＣＴ↓Ｃ２（１） ２（１） ｌ５ａｌ
Ｉ Ｇ ’ ＴＣＧＡＣ２（０） ２（０）
２Ｓｍａ Ｉ ＣＣＣ↓ＧＧＧ ２（１）
１（０） １１）制限酵素切断部位の数は０
．８％アガロースゲル電気泳動により測定する。小言な
サイズの断片は調べていない。 ２） （）： ＡＲ５ＤＮＡ断片の制限酵素切断部位の
数制限酵素 ＡＢＣＤＥ 計 Ｂｇｌ［７，６３４，６２２，６５１４，９ＥｃｏＲＩ
９．８３ ２．９９ ２．０８ １４．
９Ｈｉｎｄｌｌ［１０，８２，５５１，５６１４，９Ｋ
ｐｎ Ｉ １２．５ ２．４０
１４．９ＰｓｔＩ ５．７１ ３．８５ ３．１０
１．７５ ０．４９ １４．９ＳａｃＩ １０．
９ ３．９６ １４．９ＳａｌＩ
９．１９ ５．７１ １４．９１）
断片サイズはＫｂｐで表わす。 ２）小さなサイズの断片は測定していない。 制限酵素 Ａ Ｂ 計Ｂｇ１ｍ
８．５８ ２．６５ １１．２ＥｃｏＲＩ
８．２３ ３．００ １１．２Ｈｐａ
Ｉ ９．１３ ２．１０ １１．２Ｋ
ｐｎＩ ８．８３ ２．４０ １１．
２Ｐｓｔｌ ７．３８ ３．８５ １
１．２Ｐｖｕｌ［６，４６４，７７１１，２ ＳａｃＩ ６．８２ ４．４２ １１
．２ＳａｌＩ ５．７２ ５．５１ １
１．２ＳｍａＩ ６．７５ ４．４９
１１．２１）断片サイズはＫｂｐで表わす。 ２）小さなサイズの断片は測定していない。 実施例２ ｐＣＹＧ９７およびｐＣＥＰ９７の構築：（１）ｐＣＥ
Ｐ９７の構築： １） ｐＬＥＵ９７からｐＣＥＰ９７の構築（第２図）
実施例１に記載のようにして調製したｐＬＥＵ９７ＤＮ
Ａ（３４）をＨ緩衝液２０１ＪＩｌ中においてＰｓｔ１
１０単位で３時間消化し、続いてＴ４ＤＮＡリガーゼ（
ＢＲＬ）０．５単位、および５ ｍＭ ＡＴＰおよび１
００ｍＭ ＤＴＴの２所をこの反応混合物に加え、４℃
で２０時間反応する。連結されたＤＮＡを用い、Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎｉ ｎｇ２５０頁に記載の方法
に従ってＥ、コリ Ｃ６００ｒ−ｍ′″（ＡＴＣＣ３３
５２５）を形質転換する。形質転換された細胞はアンピ
シリン２Ｑ＜／ｍＱ含有ＬＢ寒天上にブレーティングし
、３７℃で一晩培養する。約５００のアンピシリン耐性
コロニーを得、ｐＣＥＰ９７と命名する。 ｐＣＥＰ９
７ＤＮＡを、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔａｒｉａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１１６頁に記載の方法により単離する
。 ２） ｐＣＥＰ９７ ＤＮＡの制限酵素地図の決定前記
１）に記載のようにして調製したｐＣＥＰ ９７ＤＮＡ
の制限酵素地図の決定は、表５に示す種々の制限酵素に
よる切断により行う、該制限酵素はベテスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ、宝酒造株式会社および東洋紡株式会
社から市販品として得られる。 ｐＣＥＰ９７ ＤＮＡ（０，５−ＸＸ）と各制限酵素を
Ｈ緩衝液、Ｍ緩衝液、Ｌ緩衝液またはＳ緩衝液中におい
て３７℃で６０−１８０分間反応する。 消化物を０．８％アガロースゲルにて、垂直ゲル電気泳
動法（０，３Ｘ １６Ｘ １６ｃ＋ｎ ）により、ＴＰ
Ｅ緩衝液中、ＳＯＶで２−３時間電気泳動する。 アガロースゲルにおけるＤＮＡバンドの検出は、Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ １６１頁（１９８２）
に記載のように行う。 制限酵素消化ＤＮＡ断片の分子サイズは、アガロースゲ
ルにおけるそれらの相対移動度をλ−Ｈ１ｎｄ■および
切断されたｐＢＲ３２５ＤＮＡ断片のそれ［断片サイズ
はｐＢＲ３２５のＤＮＡ配列から計算する［ Ｐ、 Ｐ
ｒａｎｔｋｉｅｔ ａｌ、 、 Ｇｅｎｅ １４ （１
９８１） ２８９ ］ ］と比較することにより測定す
る。 一方、前記１）において調製したｐＣＥＰ９７ ＤＮＡ
はさらに５ａｌ ＩおよびＨｉｎｄ Ｔｆｌで消化し、
小さなりＮＡ断片はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ １６４頁（１９８２）に記載の方法に従って電気的
に溶出する。そのＤＮＡ断片（２−３ｇ）の制限酵素（
Ａｖａｌ 、 ＳｍａＩ 、 Ｃ１ａ１．５ａｃＩおよ
び５ａｃｌ［）による切断は前述のように行う。ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（５％濃度）は、Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ １７３頁（１９８２）に記
載のように行う。ポリアクリルアミドゲルにおけるＤＮ
Ａバンドの検出は、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ １６１頁（１９８２）に記載のように行う。ＤＮＡ
断片の分子サイズは、ポリアクリルアミド平板ゲルにお
けるそれらの相対移動度をｐＢＲ３２２−Ｈａｅ ＤＩ
のそれ［５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ、Ｇ、ｅｔ ａｌ、
コールド・スプリング・ハーバ−５ｙｍｐ、 Ｑｕａｎ
ｔ、 Ｂｉｏｌ、 ４３ （１９７９） ７７コと比較
することにより測定する。 ２０種の制限酵素で切断したｐＣＥＰ９７のアガロース
およびポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果は表
５に要約して示す。ＡＲ５ＤＮＡ断片の制限酵素切断部
位の数はｐＣＥＰ９７およびｐＢＲ３２５ＤＮＡのそれ
と比較することにより決定する。制限酵素の切断地図お
よびｐＣＥＰ９７でのそれら断片サイズは第５図に示す
。断片サイズはＫｂｐであられす。 （Ｉｆ ）ｐＣＹＧ９７の構築： １） Ｔｈ９０３のＫｍＲ−Ｐｖｕ Ｉｔ ＤＮＡ断片
のｐＣＥＰ９７ ＤＮＡ（ＡｐＲＫｍＳ）へのクローニ
ング（第２図）Ｉｎ９０３のＫｍＲ遺伝子（Ｐｖｕ Ｉ
Ｉ １６９６ ｂｐ断片）をＰｖｕ Ｉｆ消化ｐＡＯ４
３ＤＮＡから精製する［ Ａ、Ｏｋａ ａｔ ａｌ。 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 １４７ （１９８１）
２１７コ、前記（１）−１＞で調製したｐＣＥＰ９７
ＤＮＡを一部Ｈ緩衝液２０縛中においてＰｖｕｌｌ（１
０単位）を用い３７℃で６０分間消化する。 ＫｍＲ−Ｐｖｕ Ｉ［ＤＮＡ断片（１（）と得られたＰ
ｖｕ ＩＩで部分消化したｐＣＥＰ９７ＤＮＡ（５Ｋ
）を０．５ｍＭ ＡＴＰおよび１０ｍＭ ＤＴτ、およ
びτ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ） （４単位）を含有す
るし緩衝液４０Ｐｄ１中において４℃で２日間反応する
。連結きれたＤＮＡを用い、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ ２５０頁に記載の方法に従いＥ、コリＣ６０
０ｒ’ｍ−（ＡＴＣＣ３３５２５）を形質転換する。形
質転換された細胞をアンピシリン２０ｘ／ｍｌ含有ＬＢ
寒天上にブレーティングし、３７℃で一晩培養する。こ
のアンピシリン耐性コロニーをカナマイシン５ＯＮｇ／
ｍｌ含有ＬＢ寒天およびクロラムフェニコール・４０
ｐｇ ／ ｍｌ含有ＬＢ寒天に移す。ＡｐＲＫｍＲＣｍ
Ｒ（１）およびＡｐＲＫｍＲＣｍＳ（２３９） ：Ｉ
口＝−を得、ＡｐＲＫｍＲＣｍＲクローンをｐＣＹＧ９
７と命名する。ｐＣＹＧ９７ ＤＮＡは、Ａｄｖａｎｃ
ｅ ｄＢａｃｔａｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１６
頁に記載の方法により単離する。 ２） ｐＣＹＧ９７ ＤＮＡの制限酵素地図の決定実施
例２の（Ｉ）−２）と同じ方法により、前述のように調
製したｐＣＹＧ９７ ＤＮＡを表５に示す種々の制限酵
素により切断し、ＤＮＡ断片を０．８％アガロースでの
ゲル電気泳動に付し分子量を測定する。 一方、前記１）で調製したｐＣＹＧ９７ ＤＮＡをＳａ
ｌ ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、小さなりＮＡ断片を
実施例２の（Ｉ）−２）に記載と同じ方法に従い精製す
る。 得られたＤＮＡ断片の制限酵素（ＨｉｎｄｌｌＩ、Ａｖ
ａＩ。 ＳｍａＩ 、 Ｃ１ａｌ 、 ５ａｃＩおよび５ａｃｌ
ｌ）での切断は前述のように従う、 ＤＮＡ断片のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（５％濃度）および分子量
の測定は、実施例２の（Ｉ）−２）に記載の方法と同じ
方法に従って行う。 ２０種の制限酵素で切断したｐＣＹＧ９７ ＤＮＡのア
ガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の
結果は表５に要約して示す、 ＡＲ５ＤＮＡ断片の制限
酵素切断部位数は、ＰＣＹＧ９７、ｐＣＥＰ９７および
ＫｍＲ−Ｐｖｕ ［ＤＮＡ断片のそれと比較することに
より決定する（断片サイズはＩｎ９０３のＤＮＡ配列か
ら決定する（ Ａ、Ｏｋａ ａｔ ａｌ、 Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、 １４７（１９８１）２１７））。 ｐＣＹＧ９７ ＤＮＡの制限酵素切断地図および断片サ
イズは第６図に示す。断片サイズはＫｂｐで表わす。 表５ 、 ｐＣＹＧ９７およびｐＣＥＰ９７ ＤＮＡの
制限酵素切断部位数 １） ＱはＡまたはＣを、ＲはＧまたはＴを、Ｙはｐｙ
を、ＵはＰｕをそれぞれ意味する。 ２） （） ： ＡＲ５ＤＮＡ断片の制限酵素切断部位
数３）制限酵素切断部位はＤＮＡ配列から決定する。 （ＩＩＩ ）ｐＣＹＧ９７ ＤＮＡを用いての互、セレ
ビシェＹＮＮ２７（α７毀１−２８９．田３−５２．
ｍ１２） ［Ｄ、Ｔ。 Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ａｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃｅｄ、 Ｓｃｉ。 ＵＳＡ ７７（１９８０） ４５５９コの形質転換：１
）酵母への形質転換 ウラシル１０＜／ｍｌｌおよびトリプトファン４ｏｓｇ
／戚含有無菌ＹＥＰＤ培地（２０ｍ１ｌ ）にＳ、セレ
ビシェ■Ｎ２７の寒天斜面培養物を接へし、３０°Ｃで
６時間培養する。この細胞１×１０ 個をウラシルおよ
びトリプトファン補足無菌ＹＥＰＤ培地ＩＱＱｍＱに移
し、５ｏｏｍｕ容振盪フラスコ中で３０℃で一晩培養す
る。細胞を低速遠心分離により集め、新しい前記培地１
００−に懸濁し、３０℃で３時間培養する。 細胞を遠心分離により集め、ＹＰ緩衝液５０戚で２回洗
浄し、５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール含有叩緩衝
液５０ｍＱに懸濁し、３０℃で３０分分間中かに振盪す
る。次いで細胞を集め、７５ｍＭ２−メルカプトエタノ
ールおよび２１０＜／ｍｌザイモリエイス５０００ （
生化学工業株式会社）含有ＹＰ緩衝液１９踵に懸濁し、
３０°Ｃで１０分分間中かに振盪する。プロトプラスト
を低速遠心分離により集め、ＹＰ緩衝液で２回洗浄し、
２Ｍソルビトール緩衝液０．６誠に懸濁する。 ＤＮＡ溶液（１０鴻）（前記（ＩＩ）−１）で調製した
ｐＣＹＧ９７ ＤＮＡの表６に示す容量、およびキャリ
ヤー１）ＢＲ３２２ＤＮＡ ｓ ＜ ）および２Ｍソル
ビトール緩衝液（２０４）を混合する。混合したＤＮＡ
１液（３０ｔＪｌ ）とプロトプラスト懸濁液（６０４
）を混合し、室温で１０分間培養する。この反応混合物
に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ （ｐＨ７，５）および
１０ｍＭ ＣａＣ１ｚ含有２０％ＰＥＧ４０００溶液１
ｒｎＱを加え、室温で２０分間静置する。形質転換され
たプロトプラストを低速遠心分離により集め、２Ｍソル
ビトール緩衝液０．４ｍ１ｌに懸濁する。 ２）抗生物質Ｇ４１８耐性形質転換株の選択Ｇ４１８Ｒ
形質転換株の選択は、Ｗｅｂｓｔａｒ ａｎｄＤｉｃｋ
ｓｏｎの方法［Ｇａｎ８．２６（１９８３） ２４３
］に従って行う、前記（Ｉ［［）−１）で調製した形質
転換細胞（０，２ｍＱ）を再生寒天培地Ｂｒｍで希釈し
、ウラシルｌｏｄ／ＩＱおよびトリプト７７ン４０に／
ＩｎＱ補足ＹＥＰＤ下層培地（１５ｍ１１ ）のプレー
トの上に注ぐ、固化後、さらにＹＥＰＤ寒天上層培地８
１ｎＱをプレートに注ぎ、３０℃で一晩培養する。抗生
物質０４１８は、１００ｍｇ／ｍｌｌ原液からの１０ｍ
ｇを各プレート上に広げる。 形質転換コロニーは３０℃で３−４日以内に出現する。 Ｓ。セレビシェＹＮＮ２７の形質転換頻度に対するｐＣ
ＹＧ９７ ＤＮＡ量の影響は、ｐＢＲ３２２ＤＮＡと比
較して表６に示す。ｐＣＹＧ９７ ＤＮＡを用いるとＳ
、セレビシェＹＮＮ２７はＧ４１８耐性に効率的に形質
転換きれる。 表６ 、 ｐＣＹＧ９７ ＤＮＡのＳ、セレビシェＹＮ
Ｎ２７への形質転換頻度 ０．５０ １．１ Ｘ １０’ ｐＣＹＧ９７ ０．０５０ ３．ＯＸ １０３
０．００５ ２．２ Ｘ １０２ ｐＢＲ３２２５，０１ １）ＣＦＵ；コロニー形成単位 （ＩＶ ） ｐＣＹＧ９７のＡＲ５のＤＮＡ塩基配列決
定ニプラスミドｐＣＹＧ９７のＡＲ５のＤＮＡ配列を、
Ｍａｘａｎｒ−Ｇ１１ｂｅｒｔ法［Ａ、Ｍ、Ｍａｘａｍ
ａｎｄ ＳＪ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、 Ｍｅｔｈｏｄｓｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ６５．４９９（１９８０
） ］およびＭ１３ＩＩＩｐ１０およびＭ１３ｍｐＨベ
クターを用いるジデオキシ配列決定法［Ｊ、Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
。 １０１、７８（１９８３） ］により決定し、その結果
を第８図に示す。 （Ｖ）プラスミドｐｃＹＧ９７ ＤＮＡを用いるアクレ
モニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０の形質転換
：Ｉ、緩衝液および培地 コーン・スチープ培地： Ｃ５Ｌ ３０ｇ／ｊ！ グルコース １０ｇ／ｌ スターチ ３０ｇ／ｌ （ｐＨ６，８） ＣａＣＯｓ Ｓ ｇ ／ Ｉ ＹＰＳ培地：シュークロース ２０ｇ／り一ポリペプ
トン １０ｇ／ｊ！ 酵母エキス ５ｇ／ｌ に２ＨＰＯ４１ｇ ／ ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１ｇ ／ Ｎ （ｐＨ７，０） プロトプラスト緩衝液： ＫＣＩ ０．６Ｍ ＭｇＣ１２１０ｍＭ ＣａＣ１２２５ｍＭ ＢＲＭ （再生培地）： Ａ ： ＮａＮＯ３２ｇ ／ ９００ｍＫＨ２Ｐ０．
１ ｇ ／９００ａｌｌシュークｏ −
ス２７５ ｇ ／ ９００ｍ１ｌカザミノ酸
１０ ｇ ／９００戚寒天 ７．
５ｇ／９００絨（ｐＨ６，０） Ｂ：グルツース ２００ ｇ ／ ｊ！Ｍｇ
Ｃｌ２ ２０ｍＭ ＣａＣ１２５０ｍＭ 上記Ａ培地およびＢ培地を個々に高圧滅菌し、Ａ培地９
００ｍ１ｌとＢ培地１００ｍ１ｌを混合する。 ■、方法・結果 （１）プロトプラスト形成 無菌コーン・スチーブ培地（５０＋１１１１ ）にＡ、
クリソゲナムＡｌＣＣ１１５５０の寒天斜面培養から菌
を接種し、２５０眠容振盪フラスコ中において３０℃で
９６時間培養する。このコーン・スチープ培地における
前培養物５眠を無菌ＹＰＳ培地５０誠に移し、前述のよ
うに２５°Ｃで２４時間培養する。菌体を遠心分離によ
り集め、滅菌水で洗浄し、１０ｍＭジチオスレイトール
溶液１５戚に懸濁し、３０℃で１時間穏やかに振県する
１次いで、菌体を遠心分離し、洗浄してザイモリエイス
２０Ｔ（生化学工業株式会社） ２０１Ｑｇ含有プロト
プラスト緩衝液２０−に再懸濁する。３０℃で２時間穏
やかに振盪した後、プロトプラストを低速遠心分離によ
り集め、プロトプラスト緩衝液で洗浄し、プロトプラス
ト緩衝液０．５ｍ１１に再懸濁する。 （２）形質転換 プロトプラスト懸濁液（１００ＩＪｉ１”）およびプラ
スミドｐＣＹＧ９７ （１０縛、約５肩ＤＮＡ ）を混
合し、室温で１０分間静置する。この混合物に、２５ｍ
Ｍ ＣａＣｌ２含有２０％ポリエチレングリフール（Ｐ
ＥＧ ） ４０００溶液（ｐＨ６，３）１−を加える。 室温で２０分間静置した後、プロトプラストを遠心分離
し、プロトプラスト緩衝液０．９誠に再懸濁する。 （３）抗生物質０４１８耐性形質転換株の選択形質転換
細胞０．２−を再生寒天（ＢＲｔｌｌＳ証）プレートに
注ぎ、次いでＢＲＭ５ｆｆｌｌｌを注ぐ、３０℃で一晩
培養した後、抗生物質Ｇ４１８０．２ｍＱ （ＧＩＢＣ
Ｏラボ）を各プレートに広げ、３０℃で１週間培養する
。プラスミドｐｃＹＧ９７ ＤＮＡを用いてのΔ、クリ
ソゲナムＡＴＣＣ１１５５０の形質転換頻度は表７に示
す。 表７．９ＣＹＧ９７ ＤＮＡを用いるアクレモニウム・
クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０１〉の形質転換頻度Ｇ
４１８の濃度 ＤＮＡ量 １）１０１０／ｍＱプロトプラスト溶液１００４を用い
形質転換する。約１０９／プレートのプロトプラストを
プレートに塗抹する。 Ｘ轟透１ プラスミドｐＬＥυ１３５、ｐＬＥＵ９７、ｐＣＥＰ９
７およびｐＣＹＧ９７のそれぞれを用い常法によりＥ、
フリＣ６Ｃ６００ｒ−（ＡＴＣＣ３３５２５）を形質転
換して下記の形質転換株を得る。 エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−（ｐＬＥＵ１３５
）エシェリヒア・コリ６Ｃ６００ｒ−（ｐＬＥＵ９７
）エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−−（ｐＣＥＰ９７
）エシェリヒアｅ）リ Ｃ６００ｒ−ｍ−（ｐＣＹＧ
９７ ）４、
第１図はプラスミドｐＬＥυ１３５およびｐＬＥυ９７
の調製過程を、第２図はプラスミドｐＣＥＰ９７および
ｐＣＹＧ９７の調製過程を、第３図はプラスミドｐｕｕ
ｔｓｓの制限酵素切断地図を、第４図はプラスミドｐＬ
ＥＵ９７の制限酵素切断地図を、第５図はプラスミドｐ
ＣＥＰ９７の制限酵素切断地図を、第６図はｐＣＹＧ９
７の制限酵素切断地図を、第７図はプラスミドｐＢＲ−
ＬＥＵの制限酵素切断地図を、そして第８図はプラスミ
ドｐＣＹＧ９７のＡＲ５のＤＮＡ塩基配列をそれぞれ示
す。 図面の浄書（内容１０変更なし） 第２図 第５図 第６図 （Ｅ ： Ｃｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ、 Ｆ ：
Ｇ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ。 Ｋ ： Ａ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）Ｊ ：
Ｔ ｏｒ ｃｌｅｌｅｔｉｏｎ。 手続補正書（方式）５゜ 昭和６１年４月ｌ１日 特許庁長官 宇賀 道部 殿 ６゜昭和
６０年特許願第２９４９０７号 ２、発明の名称 新規なプラスミドおよびそれを含有する微生物 ３、補正をする者
の調製過程を、第２図はプラスミドｐＣＥＰ９７および
ｐＣＹＧ９７の調製過程を、第３図はプラスミドｐｕｕ
ｔｓｓの制限酵素切断地図を、第４図はプラスミドｐＬ
ＥＵ９７の制限酵素切断地図を、第５図はプラスミドｐ
ＣＥＰ９７の制限酵素切断地図を、第６図はｐＣＹＧ９
７の制限酵素切断地図を、第７図はプラスミドｐＢＲ−
ＬＥＵの制限酵素切断地図を、そして第８図はプラスミ
ドｐＣＹＧ９７のＡＲ５のＤＮＡ塩基配列をそれぞれ示
す。 図面の浄書（内容１０変更なし） 第２図 第５図 第６図 （Ｅ ： Ｃｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ、 Ｆ ：
Ｇ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ。 Ｋ ： Ａ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）Ｊ ：
Ｔ ｏｒ ｃｌｅｌｅｔｉｏｎ。 手続補正書（方式）５゜ 昭和６１年４月ｌ１日 特許庁長官 宇賀 道部 殿 ６゜昭和
６０年特許願第２９４９０７号 ２、発明の名称 新規なプラスミドおよびそれを含有する微生物 ３、補正をする者
Claims (10)
- （１）第３図における制限酵素切断地図並びに表２およ
び３に示されるような特徴を有するプラスミドｐＬＥＵ
１３５。 - （２）第４図並びに表２および４に示されるような特徴
を有するプラスミドｐＬＥＵ９７。 - （３）第５図および表５に示されるような特徴を有する
プラスミドｐＣＥＰ９７。 - （４）第６図および表５に示されるような特徴を有する
ｐＣＹＧ９７。 - （５）サッカロミセス・セレビシエおよびアクレモニウ
ム・クリソゲナムの各微生物の細胞内でＤＮＡ複製起点
（ＡＲＳ）として機能し、さらに次のような特徴を有す
るＤＮＡ： （イ）該ＤＮＡ挿入制限酵素地図は第３図に示す通りで
ある。 （ロ）該ＤＮＡの分子量は約５．０４Ｋｂｐである。 （ハ）該ＤＮＡの制限酵素切断部位数は表２に示す通り
である。 - （６）サッカロミセス・セレビシエおよびアクレモニウ
ム・クリソゲナムの各微生物の細胞内でＤＮＡ複製起点
（ＡＲＳ）として機能し、そして次のような特徴を有す
るＤＮＡ： （イ）該ＤＮＡ挿入制限酵素地図は第４〜第６図に示す
通りである。 （ロ）該ＤＮＡの分子量は約１．３９Ｋｂｐである。 （ハ）該ＤＮＡの制限酵素切断部位数は表５に示す通り
である。 （ニ）該ＤＮＡの塩基配列は第８図に示す通りである。 - （７）エシェリヒア・コリＣ６００ｒ＾−ｍ＾−（ｐＬ
ＥＵ１３５） - （８）エシェリヒア・コリＣ６００ｒ＾−ｍ＾−（ｐＬ
ＥＵ９７） - （９）エシェリヒア・コリＣ６００ｒ＾−ｍ＾−（ｐＣ
ＥＰ９７） - （１０）エシェリヒア・コリＣ６００ｒ＾−ｍ＾−（ｐ
ＣＹＧ９７）
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8500040 | 1985-01-02 | ||
| GB858500040A GB8500040D0 (en) | 1985-01-02 | 1985-01-02 | Hybrid plasmids & microorganisms containing them |
| GB858525667A GB8525667D0 (en) | 1985-10-17 | 1985-10-17 | Hybrid plasmids |
| GB8525667 | 1985-10-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61209593A true JPS61209593A (ja) | 1986-09-17 |
| JPH0616707B2 JPH0616707B2 (ja) | 1994-03-09 |
Family
ID=26288629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60294907A Expired - Lifetime JPH0616707B2 (ja) | 1985-01-02 | 1985-12-25 | 新規なプラスミドおよびそれを含有する微生物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4925794A (ja) |
| EP (1) | EP0187514B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0616707B2 (ja) |
| DE (1) | DE3585679D1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR0171897B1 (ko) * | 1989-12-27 | 1999-02-01 | 후지사와 도모끼찌로 | 7-아미노세펨 화합물 또는 그 염류의 제조 방법 |
| US7009045B2 (en) * | 2000-07-14 | 2006-03-07 | Archer-Daniels-Midland Company | Transformation systems for flavinogenic yeast |
| US7294401B2 (en) * | 2003-09-02 | 2007-11-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Mar-resistant oligomeric-based coatings for glass-plastic glazing products |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3141691A1 (de) * | 1981-10-21 | 1983-05-19 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Plasmid pac 1, verfahren zu seiner gewinnung und seine verwendung |
-
1985
- 1985-12-11 US US06/807,734 patent/US4925794A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-20 EP EP85309365A patent/EP0187514B1/en not_active Expired
- 1985-12-20 DE DE8585309365T patent/DE3585679D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-25 JP JP60294907A patent/JPH0616707B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-01-19 US US07/467,506 patent/US5132218A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0187514A2 (en) | 1986-07-16 |
| EP0187514B1 (en) | 1992-03-18 |
| JPH0616707B2 (ja) | 1994-03-09 |
| EP0187514A3 (en) | 1988-01-27 |
| US5132218A (en) | 1992-07-21 |
| DE3585679D1 (de) | 1992-04-23 |
| US4925794A (en) | 1990-05-15 |
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