JPH06225784A - 蛋白質の高分泌生産方法 - Google Patents
蛋白質の高分泌生産方法Info
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- JPH06225784A JPH06225784A JP5017132A JP1713293A JPH06225784A JP H06225784 A JPH06225784 A JP H06225784A JP 5017132 A JP5017132 A JP 5017132A JP 1713293 A JP1713293 A JP 1713293A JP H06225784 A JPH06225784 A JP H06225784A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】炭素源としてグルコース、シュクロース又はマ
ンノース、窒素源として硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、トリプトファン等ビタミンとしてビオチン、無
機栄養塩類として、ほう酸、硫酸銅、ヨウ化カリウム等
を含む培地中で酵母を培養する場合において、培地中に
チアミンを含有せしめることにより酵母由来又は外来性
蛋白質を菌体外培養液に分泌させ、培養液から該蛋白質
を採取することを特徴とする蛋白質の製造法を提供す
る。 【効果】酵母由来又は外来性の蛋白質の分泌生産に最低
限必須な培地成分が明らかとなり、より安価な培地を使
用して、酵母により蛋白質を大量に生産できる。
ンノース、窒素源として硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、トリプトファン等ビタミンとしてビオチン、無
機栄養塩類として、ほう酸、硫酸銅、ヨウ化カリウム等
を含む培地中で酵母を培養する場合において、培地中に
チアミンを含有せしめることにより酵母由来又は外来性
蛋白質を菌体外培養液に分泌させ、培養液から該蛋白質
を採取することを特徴とする蛋白質の製造法を提供す
る。 【効果】酵母由来又は外来性の蛋白質の分泌生産に最低
限必須な培地成分が明らかとなり、より安価な培地を使
用して、酵母により蛋白質を大量に生産できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、チアミン添加培地で酵
母を培養することにより酵母由来又は外来性蛋白質を菌
体外培養液に高い効率で分泌生産させ、菌体外培養液か
ら該蛋白質を採取する、蛋白質の製造法に関する。
母を培養することにより酵母由来又は外来性蛋白質を菌
体外培養液に高い効率で分泌生産させ、菌体外培養液か
ら該蛋白質を採取する、蛋白質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、遺伝子組換え技術の発展に伴い、
酵母を宿主に用いて、ヒト等の他の生物由来の蛋白質を
大量に生産することが工業規模で行われている。酵母を
宿主に用いた場合には大腸菌を宿主に用いた場合に比べ
て、遺伝子産物を菌体外に分泌させることが可能であ
り、また、発熱物質等の混入を避けやすく、さらに、高
等生物由来の遺伝子産物が正しい立体構造をとりやすい
等の利点があるため、その利用度は高まっている。
酵母を宿主に用いて、ヒト等の他の生物由来の蛋白質を
大量に生産することが工業規模で行われている。酵母を
宿主に用いた場合には大腸菌を宿主に用いた場合に比べ
て、遺伝子産物を菌体外に分泌させることが可能であ
り、また、発熱物質等の混入を避けやすく、さらに、高
等生物由来の遺伝子産物が正しい立体構造をとりやすい
等の利点があるため、その利用度は高まっている。
【０００３】また、酵母由来の蛋白質を菌体外に分泌さ
せ、培養物から該蛋白質を採取することも工業規模で行
われている。
せ、培養物から該蛋白質を採取することも工業規模で行
われている。
【０００４】従来、かかる分泌生産においては、ＹＰ
Ｄ、ＳＤ培地等の栄養培地が用いられていたため、培地
中の各構成成分と酵母の分泌能との関連性は明らかにさ
れていなかった。
Ｄ、ＳＤ培地等の栄養培地が用いられていたため、培地
中の各構成成分と酵母の分泌能との関連性は明らかにさ
れていなかった。
【０００５】なお、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地の組成は、以
下の表１及び表２に表される通りである。
下の表１及び表２に表される通りである。
【０００６】
【表１】 ＹＰＤ 培地 バクト・イ−ストエキストラクト（ディフコ社製） 1% バクト・ペプトン（ディフコ社製） 2% グルコース 2%
【０００７】
【表２】 ＳＤ培地 バクト・イースト・ナイトロジェン・ベース・ウィズアウト・アミノアシッド （ディフコ社製） 0.67% グルコース 2 % リン酸カリウム緩衝液(pH 8.0) 50 mM ガラクトース 2 % トリプトファン （和光純薬） 0.02 g/L ウラシル （和光純薬） 0.2 g/L ヒスチジン （和光純薬） 0.02 g/L リジン （和光純薬） 0.03 g/L アルギニン （和光純薬） 0.02 g/L スレオニン （和光純薬） 0.2 g/L メチオニン （和光純薬） 0.02 g/L チロシン （和光純薬） 0.03 g/L フェニルアラニン（和光純薬） 0.05 g/L イソロイシン （和光純薬） 0.03 g/L バリン （和光純薬） 0.15 g/L アデニン硫酸 （和光純薬） 0.02 g/L グルタミン酸 （和光純薬） 0.1 g/L アスパラギン酸 （和光純薬） 0.1 g/L セリン （和光純薬） 0.375 g/L
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、他のビ
タミン類を有しない完全合成培地（基本培地）にチアミ
ンを添加した培地を用いて酵母を培養した場合、チアミ
ンを添加しない場合に比較して、酵母由来又は外来性の
蛋白質の分泌が著しく増大することを見出し、本発明を
完成した。
タミン類を有しない完全合成培地（基本培地）にチアミ
ンを添加した培地を用いて酵母を培養した場合、チアミ
ンを添加しない場合に比較して、酵母由来又は外来性の
蛋白質の分泌が著しく増大することを見出し、本発明を
完成した。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、(1)炭素源と
してグルコース、シュクロース又はマンノース、窒素源
として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、トリプト
ファン、ウラシル、ヒスチジン、リジン、アルギニン、
スレオニン、メチオニン、チロシン、フェニルアラニ
ン、イソロイシン、アデニン、グルタミン酸、アスパラ
ギン酸、セリン又はバリン、ビタミンとしてビオチン、
無機栄養塩類として、ほう酸、硫酸銅、ヨウ化カリウ
ム、塩化第二鉄、硫酸マンガン、モリブデン酸ナトリウ
ム、硫酸亜鉛、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム又は塩化カルシウムを含む培地中で酵母
を培養する場合において、培地中にチアミンを含有せし
めることにより酵母由来又は外来性蛋白質を菌体外培養
液に分泌させ、培養液から該蛋白質を採取することを特
徴とする蛋白質の製造法、(2)(1) 記載の製造法におい
て、培地中のチアミンの濃度が少なくとも 10 μg/ml以
上である製造法、(3)(1) 又は(2) 記載の製造法におい
て、酵母がサッカロミセス・セルビシエである製造法に
関する。
してグルコース、シュクロース又はマンノース、窒素源
として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、トリプト
ファン、ウラシル、ヒスチジン、リジン、アルギニン、
スレオニン、メチオニン、チロシン、フェニルアラニ
ン、イソロイシン、アデニン、グルタミン酸、アスパラ
ギン酸、セリン又はバリン、ビタミンとしてビオチン、
無機栄養塩類として、ほう酸、硫酸銅、ヨウ化カリウ
ム、塩化第二鉄、硫酸マンガン、モリブデン酸ナトリウ
ム、硫酸亜鉛、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム又は塩化カルシウムを含む培地中で酵母
を培養する場合において、培地中にチアミンを含有せし
めることにより酵母由来又は外来性蛋白質を菌体外培養
液に分泌させ、培養液から該蛋白質を採取することを特
徴とする蛋白質の製造法、(2)(1) 記載の製造法におい
て、培地中のチアミンの濃度が少なくとも 10 μg/ml以
上である製造法、(3)(1) 又は(2) 記載の製造法におい
て、酵母がサッカロミセス・セルビシエである製造法に
関する。
【００１０】本発明において、好適には(2) 又は(3) 記
載の製造法であり、さらに好適には(3) 記載の製造法で
ある。
載の製造法であり、さらに好適には(3) 記載の製造法で
ある。
【００１１】本発明において使用される酵母は、該酵母
より分泌される酵母由来の蛋白質を利用し得るもの、又
は、遺伝子組換え技術の宿主として利用し得るものなら
ばいずれのものも使用し得るが、サッカロミセス（Sacc
haromyces ）属に属する酵母が好適であり、さらに好適
には、サッカロミセス・セルビシエ（Saccharomycescer
evisiae）である。
より分泌される酵母由来の蛋白質を利用し得るもの、又
は、遺伝子組換え技術の宿主として利用し得るものなら
ばいずれのものも使用し得るが、サッカロミセス（Sacc
haromyces ）属に属する酵母が好適であり、さらに好適
には、サッカロミセス・セルビシエ（Saccharomycescer
evisiae）である。
【００１２】さらに、サッカロミセス・セルビシエに属
する各菌株のうち、KK4株 (α,gal80, ura3, leu2, his
1,trp1)（Molecular and General Genetics, (1984), 1
95, 29-34）、106-3D株（Genetics, (1966), 54, 911-9
16 ）、SHY3 株（Gene, (1979), 8, 17-24 ）、KS58-
2D 株( α, ssl1, leu2, his3, ura3) 、KS51-3C 株（M
olecular and General Genetics, (1989), 219, 58-6
4）、KSM-I69 株( α, ssl1, leu2, his1 or 3, ura3)
（Molecular and General Genetics, (1989), 219, 58-
64）、KS45-3D 株（Molecular and General Genetics,
(1989), 219, 58-64 ） KS77-5D 株 (α, ssl1, leu2, his3, ura3) KS58-2D 株× KS77-2D 株、SANK 50182株（ P株：Appl
ied and Environmental Microbiology, (1992), 58, 94
8--952）等が好ましい。
する各菌株のうち、KK4株 (α,gal80, ura3, leu2, his
1,trp1)（Molecular and General Genetics, (1984), 1
95, 29-34）、106-3D株（Genetics, (1966), 54, 911-9
16 ）、SHY3 株（Gene, (1979), 8, 17-24 ）、KS58-
2D 株( α, ssl1, leu2, his3, ura3) 、KS51-3C 株（M
olecular and General Genetics, (1989), 219, 58-6
4）、KSM-I69 株( α, ssl1, leu2, his1 or 3, ura3)
（Molecular and General Genetics, (1989), 219, 58-
64）、KS45-3D 株（Molecular and General Genetics,
(1989), 219, 58-64 ） KS77-5D 株 (α, ssl1, leu2, his3, ura3) KS58-2D 株× KS77-2D 株、SANK 50182株（ P株：Appl
ied and Environmental Microbiology, (1992), 58, 94
8--952）等が好ましい。
【００１３】なお、 KK4株は、106-3D 株とSHY3 株と
の交配により得られた１倍体株であり、KS58-2D 株は、
KS51-3C 株とKSM-I69 株との交配により得られた１倍体
株である。KSM-I69 株は、KS45-3D 株の突然変異により
得られた１倍体株である。KS77-5D 株は、KS51-3C 株と
KSM-I69 株との交配により得られた１倍体由来の株であ
る。KS58-2D 株× KS77-2D 株は、KS58-2D 株と KS77-
2D 株とを交配させて得られた２倍体株である。SANK 5
0812株(P株) は、工業的に使用されている２倍体株であ
る。KS58-2D 株は、KS51-3C 株とKSM-I 69株（Molecula
r and GeneralGenetics, (1989), 219, 58-64）との交
配により得られた株である。また、KS77-5D 株は、KS51
-3C 株とKSM-I 69株との交配により得られた KS58-3A
株由来の株である。
の交配により得られた１倍体株であり、KS58-2D 株は、
KS51-3C 株とKSM-I69 株との交配により得られた１倍体
株である。KSM-I69 株は、KS45-3D 株の突然変異により
得られた１倍体株である。KS77-5D 株は、KS51-3C 株と
KSM-I69 株との交配により得られた１倍体由来の株であ
る。KS58-2D 株× KS77-2D 株は、KS58-2D 株と KS77-
2D 株とを交配させて得られた２倍体株である。SANK 5
0812株(P株) は、工業的に使用されている２倍体株であ
る。KS58-2D 株は、KS51-3C 株とKSM-I 69株（Molecula
r and GeneralGenetics, (1989), 219, 58-64）との交
配により得られた株である。また、KS77-5D 株は、KS51
-3C 株とKSM-I 69株との交配により得られた KS58-3A
株由来の株である。
【００１４】また、KS58-2D 株、KSM-I69 株、KS77-5D
株等の( α, ssl1, leu2, his3) 型の株を ssl 1株と総
称する。
株等の( α, ssl1, leu2, his3) 型の株を ssl 1株と総
称する。
【００１５】本発明において、基本培地とは、炭素源と
してグルコース、シュクロース又はマンノース、窒素源
として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、トリプト
ファン、ウラシル、ヒスチジン、リジン、アルギニン、
スレオニン、メチオニン、チロシン、フェニルアラニ
ン、イソロイシン、アデニン、グルタミン酸、アスパラ
ギン酸、セリン又はバリン、ビタミンとしてビオチン、
無機栄養塩類として、ほう酸、硫酸銅、ヨウ化カリウ
ム、塩化第二鉄、硫酸マンガン、モリブデン酸ナトリウ
ム、硫酸亜鉛、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム又は塩化カルシウムを含む培地をいう。
してグルコース、シュクロース又はマンノース、窒素源
として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、トリプト
ファン、ウラシル、ヒスチジン、リジン、アルギニン、
スレオニン、メチオニン、チロシン、フェニルアラニ
ン、イソロイシン、アデニン、グルタミン酸、アスパラ
ギン酸、セリン又はバリン、ビタミンとしてビオチン、
無機栄養塩類として、ほう酸、硫酸銅、ヨウ化カリウ
ム、塩化第二鉄、硫酸マンガン、モリブデン酸ナトリウ
ム、硫酸亜鉛、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム又は塩化カルシウムを含む培地をいう。
【００１６】この場合、グルコース、シュクロース又は
マンノースは、少なくとも20g/L 含む培地が好適であ
る。
マンノースは、少なくとも20g/L 含む培地が好適であ
る。
【００１７】硫酸アンモニウムは少なくとも 5g/L 、塩
化アンモニウムは少なくとも 5g/L、トリプトファンは
少なくとも 20 mg/L、ウラシルは少なくとも 200 mg/L
、ヒスチジンは少なくとも 20 mg/L 、リジンは少な
くとも 30 mg/L、アルギニンは少なくとも 20 mg/L、ス
レオニンは少なくとも 200 mg/L 、メチオニンは少なく
とも 20 mg/L、チロシンは少なくとも 30 mg/L、フェニ
ルアラニンは少なくとも50 mg/L、イソロイシンは少な
くとも 30 mg/L、アデニンは少なくとも 20 mg/L、グル
タミン酸は少なくとも 100 mg/L、アスパラギン酸は少
なくとも、セリンは少なくとも 375 mg/L又はバリンを
少なくとも 50 mg/Lを含む培地が好適である。
化アンモニウムは少なくとも 5g/L、トリプトファンは
少なくとも 20 mg/L、ウラシルは少なくとも 200 mg/L
、ヒスチジンは少なくとも 20 mg/L 、リジンは少な
くとも 30 mg/L、アルギニンは少なくとも 20 mg/L、ス
レオニンは少なくとも 200 mg/L 、メチオニンは少なく
とも 20 mg/L、チロシンは少なくとも 30 mg/L、フェニ
ルアラニンは少なくとも50 mg/L、イソロイシンは少な
くとも 30 mg/L、アデニンは少なくとも 20 mg/L、グル
タミン酸は少なくとも 100 mg/L、アスパラギン酸は少
なくとも、セリンは少なくとも 375 mg/L又はバリンを
少なくとも 50 mg/Lを含む培地が好適である。
【００１８】ビオチンは少なくとも 2 μg/L を含む培
地が好適である。
地が好適である。
【００１９】ほう酸は少なくとも 500 μg/L 、硫酸銅
は少なくとも 40 μg/L 、ヨウ化カリウムは少なくとも
100μg/L 、塩化第二鉄は少なくとも 200 μg/L 、硫
酸マンガンは少なくとも 400 μg/L 、モリブデン酸ナ
トリウムは少なくとも 200μg/L 、硫酸亜鉛は少なくと
も 400 μg/L 、リン酸二カリウムは少なくとも 0.5%
、硫酸マグネシウムは少なくとも 0.05% 、塩化ナト
リウムを少なくとも 0.01% 又は塩化カルシウムを少な
くとも 0.01% を含む培地が好適である。
は少なくとも 40 μg/L 、ヨウ化カリウムは少なくとも
100μg/L 、塩化第二鉄は少なくとも 200 μg/L 、硫
酸マンガンは少なくとも 400 μg/L 、モリブデン酸ナ
トリウムは少なくとも 200μg/L 、硫酸亜鉛は少なくと
も 400 μg/L 、リン酸二カリウムは少なくとも 0.5%
、硫酸マグネシウムは少なくとも 0.05% 、塩化ナト
リウムを少なくとも 0.01% 又は塩化カルシウムを少な
くとも 0.01% を含む培地が好適である。
【００２０】培地中のチアミン濃度は、少なくとも 400
μg/L 以上であることが好適であり、さらに少なくと
も 10 μg/L 以上であることが好適である。
μg/L 以上であることが好適であり、さらに少なくと
も 10 μg/L 以上であることが好適である。
【００２１】本発明におけるチアミン含有培地中で酵母
を培養することにより、酵母由来又は外来性蛋白質を菌
体外培養液に分泌させることができる。
を培養することにより、酵母由来又は外来性蛋白質を菌
体外培養液に分泌させることができる。
【００２２】本発明において「酵母由来蛋白質」とは、
酵母菌体内で生産され、チアミン非含有培地では菌体外
培養液に分泌されないが、チアミン含有培地では菌体外
培養液に分泌される蛋白質をいう。このような蛋白質と
しては、酵母サッカロミセス・セルビシエが有するイン
ベルターゼ等を例示できる。
酵母菌体内で生産され、チアミン非含有培地では菌体外
培養液に分泌されないが、チアミン含有培地では菌体外
培養液に分泌される蛋白質をいう。このような蛋白質と
しては、酵母サッカロミセス・セルビシエが有するイン
ベルターゼ等を例示できる。
【００２３】本発明において、「外来性蛋白質」とは、
外来性蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベク
ターにより形質転換された酵母により発現される蛋白質
であって、チアミン非含有培地では菌体外培養液に分泌
されないが、チアミン含有培地では菌体外培養液に分泌
される蛋白質をいう。
外来性蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベク
ターにより形質転換された酵母により発現される蛋白質
であって、チアミン非含有培地では菌体外培養液に分泌
されないが、チアミン含有培地では菌体外培養液に分泌
される蛋白質をいう。
【００２４】このような蛋白質としては、外来性酵母カ
ルボキシペプチダーゼＹをコードする遺伝子を組み込ん
だ発現ベクターにより形質転換された酵母 ssl 1株によ
り発現される組換え型カルボキシペプチダーゼＹ、外来
性ヒトリソゾームをコードする遺伝子を組み込んだ発現
ベクターにより形質転換された酵母 ssl 1株により発現
される組換え型ヒトリソゾーム等を例示できる。
ルボキシペプチダーゼＹをコードする遺伝子を組み込ん
だ発現ベクターにより形質転換された酵母 ssl 1株によ
り発現される組換え型カルボキシペプチダーゼＹ、外来
性ヒトリソゾームをコードする遺伝子を組み込んだ発現
ベクターにより形質転換された酵母 ssl 1株により発現
される組換え型ヒトリソゾーム等を例示できる。
【００２５】このように、チアミン含有培地中で酵母を
培養することにより、菌体外培養液に分泌された酵母由
来又は外来性蛋白質は、その物理学的性質や化学的性質
等を利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製
し、培養液から採取することができる。このような方法
としては、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、
分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC）等の各種液体クロマトグラフィー、透析
法、及びこれらの組み合わせ等を例示できる。
培養することにより、菌体外培養液に分泌された酵母由
来又は外来性蛋白質は、その物理学的性質や化学的性質
等を利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製
し、培養液から採取することができる。このような方法
としては、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、
分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC）等の各種液体クロマトグラフィー、透析
法、及びこれらの組み合わせ等を例示できる。
【００２６】
【００２７】
【実施例】以下、参考例及び実施例により本発明をさら
に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００２８】参考例１ サッカロマイセス・セルビシエ
の染色体ＤＮＡの分離 サッカロマイセス・セルビシエＳＡＮＫ50182 菌株を、
ＹＰＤ培地（１％バクト・イーストエキストラクト（Ｄ
ｉｆｃｏ社製）／２％バクト・ペプトン（Ｄｉｆｃｏ社
製）／２％グルコース）において、２８℃で２日間振と
う培養し、染色体分離の為の菌体とした。菌体を遠心分
離（トミー精工（株）ＲＳ−２０II、ローター：ＲＰＲ
２０−２）により回収後、１０ｍｌの菌体処理液Ａ（1.
2 Ｍソルビトール／１０mMＥＤＴＡ（エチレンジアミン
四酢酸ニナトリウム）／２０mMトリス−塩酸（ｐＨ7.6
））に懸濁した後に、１０μｌのβ−メルカプトエタ
ノールと４０ｍｇのザイモリエイス−１００Ｔ（100,00
0 ｕｎｉｔｓ／ｇ）を加え、３７℃で３０分間放置し
た。その後、5,000 ｒｐｍ、５分間の遠心分離（トミー
精工（株）ＲＳ−２０II、ローター：ＲＰＲ２０−２）
により菌体を回収後、再度１０ｍｌの菌体処理液Ａに懸
濁し、遠心分離（トミー精工（株）ＲＳ−２０II、ロー
ター：ＰＲＲ２０−２）を5,000 ｒｐｍ、５分間行なっ
て菌体を洗浄した。回収した菌体を５ｍｌの菌体処理液
Ｂ（５０mMＥＤＴＡ／５０mMトリス−塩酸（ｐＨ7.6
））に懸濁後、１ｍｌの１０％ＳＤＳ（トデシル硫酸
ナトリウム）溶液を加えて菌体を破壊した。すぐに、７
ｍｌのフェノールとクロロホルムの１：１混合液を加え
てゆるやかに攪拌後、7,000 ｒｐｍ、１０分間遠心分離
（トミー精工（株）ＲＳ−２０II、ローター：ＲＰＲ２
０−２）を行なって遠心上清を駒込ピペットで回収し
た。0.6 ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えて攪拌し
た後に、１５ｍｌの冷エタノールを加えて、−８０℃に
１時間放置した。10,000ｒｐｍ、１５分間遠心分離（ト
ミー精工（株）ＲＳ−２０II、ローター：ＲＰＲ２０−
２）を行なって染色体ＤＮＡを沈殿させた後、７０％エ
タノールで洗浄し、減圧乾燥後、１ｍｌのＴＥ溶液（１
０mMトリス−塩酸（ｐＨ7.6 ）／１mMＥＤＴＡ）に懸濁
した。次に５０μｌのＲＮａｓｅ溶液（２０ｍｇ／１０
ｍｌ ＲＮａｓｅＡ、25,000ｕｎｉｔ／１０ｍｌ ＲＮ
ａｓｅＴ1 ）を加え、３７℃で３０分間反応させた後
に、２５μｌのプロテイネースＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）と
５０μｌの１０％ＳＤＳを加え、３７℃で１時間反応さ
せた。反応終了後、1.2 ｍｌのフェノールとクロロホル
ムの１：１混合液を加えてゆるやかに攪拌後、遠心分離
し遠心上清を回収し、さらに1.2 ｍｌのフェノール溶液
を加えて同様の操作を繰り返した。得られた遠心上清約
１ｍｌに2.5 倍量の冷エタノールを加え、−８０℃に３
０分間放置した後、遠心分離によりエタノール沈殿物を
得た。それを７０％エタノールで洗浄後、減圧乾燥し、
１００μｌのＴＥ溶液に懸濁した。
の染色体ＤＮＡの分離 サッカロマイセス・セルビシエＳＡＮＫ50182 菌株を、
ＹＰＤ培地（１％バクト・イーストエキストラクト（Ｄ
ｉｆｃｏ社製）／２％バクト・ペプトン（Ｄｉｆｃｏ社
製）／２％グルコース）において、２８℃で２日間振と
う培養し、染色体分離の為の菌体とした。菌体を遠心分
離（トミー精工（株）ＲＳ−２０II、ローター：ＲＰＲ
２０−２）により回収後、１０ｍｌの菌体処理液Ａ（1.
2 Ｍソルビトール／１０mMＥＤＴＡ（エチレンジアミン
四酢酸ニナトリウム）／２０mMトリス−塩酸（ｐＨ7.6
））に懸濁した後に、１０μｌのβ−メルカプトエタ
ノールと４０ｍｇのザイモリエイス−１００Ｔ（100,00
0 ｕｎｉｔｓ／ｇ）を加え、３７℃で３０分間放置し
た。その後、5,000 ｒｐｍ、５分間の遠心分離（トミー
精工（株）ＲＳ−２０II、ローター：ＲＰＲ２０−２）
により菌体を回収後、再度１０ｍｌの菌体処理液Ａに懸
濁し、遠心分離（トミー精工（株）ＲＳ−２０II、ロー
ター：ＰＲＲ２０−２）を5,000 ｒｐｍ、５分間行なっ
て菌体を洗浄した。回収した菌体を５ｍｌの菌体処理液
Ｂ（５０mMＥＤＴＡ／５０mMトリス−塩酸（ｐＨ7.6
））に懸濁後、１ｍｌの１０％ＳＤＳ（トデシル硫酸
ナトリウム）溶液を加えて菌体を破壊した。すぐに、７
ｍｌのフェノールとクロロホルムの１：１混合液を加え
てゆるやかに攪拌後、7,000 ｒｐｍ、１０分間遠心分離
（トミー精工（株）ＲＳ−２０II、ローター：ＲＰＲ２
０−２）を行なって遠心上清を駒込ピペットで回収し
た。0.6 ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えて攪拌し
た後に、１５ｍｌの冷エタノールを加えて、−８０℃に
１時間放置した。10,000ｒｐｍ、１５分間遠心分離（ト
ミー精工（株）ＲＳ−２０II、ローター：ＲＰＲ２０−
２）を行なって染色体ＤＮＡを沈殿させた後、７０％エ
タノールで洗浄し、減圧乾燥後、１ｍｌのＴＥ溶液（１
０mMトリス−塩酸（ｐＨ7.6 ）／１mMＥＤＴＡ）に懸濁
した。次に５０μｌのＲＮａｓｅ溶液（２０ｍｇ／１０
ｍｌ ＲＮａｓｅＡ、25,000ｕｎｉｔ／１０ｍｌ ＲＮ
ａｓｅＴ1 ）を加え、３７℃で３０分間反応させた後
に、２５μｌのプロテイネースＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）と
５０μｌの１０％ＳＤＳを加え、３７℃で１時間反応さ
せた。反応終了後、1.2 ｍｌのフェノールとクロロホル
ムの１：１混合液を加えてゆるやかに攪拌後、遠心分離
し遠心上清を回収し、さらに1.2 ｍｌのフェノール溶液
を加えて同様の操作を繰り返した。得られた遠心上清約
１ｍｌに2.5 倍量の冷エタノールを加え、−８０℃に３
０分間放置した後、遠心分離によりエタノール沈殿物を
得た。それを７０％エタノールで洗浄後、減圧乾燥し、
１００μｌのＴＥ溶液に懸濁した。
【００２９】参考例２ カルボキシペプチダーゼＹ遺伝
子のクローニング 得られたサッカロマイセス・セルビシエＳＡＮＫ50182
株由来の染色体ＤＮＡ２０μｇに５０μｌの制限酵素緩
衝液Ｍ（１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ7.5 ）、１００
ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭディチオスレイトー
ル、５００ｍＭ塩化ナトリウム）および２００単位の制
限酵素ＨｉｎｄIII （宝酒造（株）製）を加えて全量を
滅菌脱イオン水で５００μｌとした後に、３７℃で３時
間反応させ切断反応を行ない、その後ＴＥ飽和フェノー
ルを等量添加して攪拌することにより反応を停止した。
トミー精工（株）製微量高速遠心機ＭＲＸ−１５０（ロ
ーター同社ＴＭＡ−４）を用いて、15,000ｒｐｍ、５分
間遠心分離を行ない、水層を分取し（以下「ＴＥ飽和フ
ェノール処理」とする）、その後１／１０量の３Ｎ酢酸
ナトリウム溶液を加えて攪拌した後に、2.5 倍量の冷エ
タノールを加え、−８０℃に１５分間放置し、トミー精
工（株）製微量高速遠心機ＭＲＸ−１５０（ローター同
社ＴＭＡ−４）を用いて、15,000ｒｐｍ、１５分間遠心
分離を行ない沈殿物を得た（以下、「エタノール沈殿処
理」とする）。それを７０％エタノールで洗浄後、減圧
乾燥し、ＴＥ溶液に懸濁して、これをＳＡＮＫ50182 株
由来染色体ＤＮＡ断片とした。クローニングの為のベク
ターとしては、同様に制限酵素ＨｉｎｄIII で切断した
ＰＵＣ１８（宝酒造社製）３μｇを用い、子牛腸由来の
アルカリホスファターゼ（東洋紡績（株））２０単位を
使い、３６０μｌのＴＥ緩衝液中で３７℃、３０分間イ
ンキュベートすることにより脱リン酸化反応を行なった
（以下、「アルカリホスファターゼ処理」とする）。以
上のように作成した大腸菌ベクターＰＵＣ１８とＳＡＮ
Ｋ50182 株由来染色体ＤＮＡ断片を宝酒造社製ＤＮＡラ
イゲーションキットを用いて１６℃、１４時間反応させ
連結反応を行なわせた。この反応液をエタノール沈殿処
理した後に、７０μｌのＴＥ溶液に懸濁し、それぞれ１
０μｌずつ１００ｍＭ塩化カルシウム、１００ｍＭ塩化
マグネシウム、１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ7.6 ）を
加えた後に、１００μｌの宝酒造（株）製大腸菌ＪＭ１
０９コンピテントセルを加えて氷中に２０分間放置し
た。そして４２℃のヒートショックを９０秒間行なった
後に、氷中で２分間冷却し、１ｍｌの２×ＹＴ培地（1.
6 ％バクト・トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）／1.0％パ
クト・イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）／0.
5 ％塩化ナトリウム／0.1 ％グルコース）を加えて、３
７℃で１時間振とう培養した。そしてこれを培地１リッ
トルあたり８０ｍｇのアンビシリンを添加した２×ＹＴ
培地プレートにまき、３７℃で、１２時間培養を行なっ
た。その結果、約32,000個のアンピリシン耐性株を得た
ので、これをカルボキシペプチダーゼＹ遺伝子をクロー
ニングするための遺伝子ライブラリーとした。
子のクローニング 得られたサッカロマイセス・セルビシエＳＡＮＫ50182
株由来の染色体ＤＮＡ２０μｇに５０μｌの制限酵素緩
衝液Ｍ（１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ7.5 ）、１００
ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭディチオスレイトー
ル、５００ｍＭ塩化ナトリウム）および２００単位の制
限酵素ＨｉｎｄIII （宝酒造（株）製）を加えて全量を
滅菌脱イオン水で５００μｌとした後に、３７℃で３時
間反応させ切断反応を行ない、その後ＴＥ飽和フェノー
ルを等量添加して攪拌することにより反応を停止した。
トミー精工（株）製微量高速遠心機ＭＲＸ−１５０（ロ
ーター同社ＴＭＡ−４）を用いて、15,000ｒｐｍ、５分
間遠心分離を行ない、水層を分取し（以下「ＴＥ飽和フ
ェノール処理」とする）、その後１／１０量の３Ｎ酢酸
ナトリウム溶液を加えて攪拌した後に、2.5 倍量の冷エ
タノールを加え、−８０℃に１５分間放置し、トミー精
工（株）製微量高速遠心機ＭＲＸ−１５０（ローター同
社ＴＭＡ−４）を用いて、15,000ｒｐｍ、１５分間遠心
分離を行ない沈殿物を得た（以下、「エタノール沈殿処
理」とする）。それを７０％エタノールで洗浄後、減圧
乾燥し、ＴＥ溶液に懸濁して、これをＳＡＮＫ50182 株
由来染色体ＤＮＡ断片とした。クローニングの為のベク
ターとしては、同様に制限酵素ＨｉｎｄIII で切断した
ＰＵＣ１８（宝酒造社製）３μｇを用い、子牛腸由来の
アルカリホスファターゼ（東洋紡績（株））２０単位を
使い、３６０μｌのＴＥ緩衝液中で３７℃、３０分間イ
ンキュベートすることにより脱リン酸化反応を行なった
（以下、「アルカリホスファターゼ処理」とする）。以
上のように作成した大腸菌ベクターＰＵＣ１８とＳＡＮ
Ｋ50182 株由来染色体ＤＮＡ断片を宝酒造社製ＤＮＡラ
イゲーションキットを用いて１６℃、１４時間反応させ
連結反応を行なわせた。この反応液をエタノール沈殿処
理した後に、７０μｌのＴＥ溶液に懸濁し、それぞれ１
０μｌずつ１００ｍＭ塩化カルシウム、１００ｍＭ塩化
マグネシウム、１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ7.6 ）を
加えた後に、１００μｌの宝酒造（株）製大腸菌ＪＭ１
０９コンピテントセルを加えて氷中に２０分間放置し
た。そして４２℃のヒートショックを９０秒間行なった
後に、氷中で２分間冷却し、１ｍｌの２×ＹＴ培地（1.
6 ％バクト・トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）／1.0％パ
クト・イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）／0.
5 ％塩化ナトリウム／0.1 ％グルコース）を加えて、３
７℃で１時間振とう培養した。そしてこれを培地１リッ
トルあたり８０ｍｇのアンビシリンを添加した２×ＹＴ
培地プレートにまき、３７℃で、１２時間培養を行なっ
た。その結果、約32,000個のアンピリシン耐性株を得た
ので、これをカルボキシペプチダーゼＹ遺伝子をクロー
ニングするための遺伝子ライブラリーとした。
【００３０】次にこの遺伝子ライブラリー中よりカルボ
キシペプチダーゼＹ遺伝子をクローニングする目的で、
ミリポア社製ニトロセルロースフィルター上に遺伝子ラ
イブラリーとしてのアンピシリン耐性株をレプリカし、
一晩３７℃で２×ＹＴプレート上で増殖させた後に、こ
のニトロセルロースフィルターを0.5 Ｎ水酸化ナトリウ
ム溶液に１０分間浸し、さらに１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ
7.5 ）溶液に５分間、0.5 Ｍトリス−塩酸（ｐＨ7.5 ）
／1.5 Ｍ塩化ナトリウム溶液に５分間、そして２×ＳＳ
Ｃ溶液（１×ＳＳＣは、0.875 ％塩化ナトリウム／0.44
％クエン酸ナトリウム）に５分間浸した後に、８０℃で
２時間焼き付けを行ない６×ＳＳＣ溶液（5.25％塩化ナ
トリウム／2.64％クエン酸ナトリウム）中で菌体を除い
た後に風乾させた。次に目的のＤＮＡを選別するための
プローブとして、アプライドバイオシステム社製３８０
ＢＤＮＡ合成機を用いてカルボキシペプチダーゼＹ構造
遺伝子の一部である２０塩基のＤＮＡ（５’−ＴＧＴＴ
ＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＴＴＴＡＴＴ−３’：配列表の配
列番号１）を化学合成し、その中の８００ｎｇのＤＮＡ
に、１μｌの末端リン酸化緩衝液（0.5 Ｍトリス−塩酸
（ｐＨ7.6 ）／0.1Ｍ塩化マグネシウム／５０ｍＭジチ
オスレイトール／１ｍＭスペルミジン／１mMＥＤＴ
Ａ）、１０μｌの［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（アマシャムジャ
パン（株）製、１０μＣｉ／μｌ）、およびＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ（宝酒造社製）２μｌを加えて全量
を４０μｌとした後、３７℃で３０分間反応させてＤＮ
Ａの５’末端にラベル体のリン酸基をとり込ませた。７
０℃で１０分間放置することで反応を停止させ、１００
μｌの８Ｍ塩化アンモニウムを加えた後に、エタノール
沈殿処理を行ない、７０％エタノールで洗浄後、減圧乾
燥してラベルしたＤＮＡプローブを作成した。そこでこ
のＤＮＡプローブを用いてカルボキシペプチターゼＹ遺
伝子をクローニングするため、まず、上記のように作成
したニトロセルロースをハイブリダイゼーション溶液
（0.1 ％牛血清アルブミン、0.1 ％フィコール、0.1 ％
ポリビニルピロリドン、５０％（Ｕ／Ｖ）ホルムアミ
ド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ7.5 ）、
１０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中で、４９℃で３時間
振とうした後に、上記のように調製したＤＮＡプローブ
を添加したハイブリダイゼーション溶液中でさらに４９
℃で３０時間振とうさせ、ＤＮＡを特異的に結合させ
た。次に、２×ＳＳＣ溶液中で４９℃で１時間振とう
し、0.1 ％のＳＤＳを添加した２×ＳＳＣ溶液中で、４
９℃で３０分間さらに振とうしてフィルターを洗浄し、
さらに0.5 ×ＳＳＣ溶液中で４９℃で１時間振とうした
後に、ペーパータオル上で風乾させ、オートラジオグラ
フィーによる検出を行なった。その結果、約32,000コロ
ニー中２２コのＣＰＹ遺伝子を有すると思われるコロニ
ーが得られた。
キシペプチダーゼＹ遺伝子をクローニングする目的で、
ミリポア社製ニトロセルロースフィルター上に遺伝子ラ
イブラリーとしてのアンピシリン耐性株をレプリカし、
一晩３７℃で２×ＹＴプレート上で増殖させた後に、こ
のニトロセルロースフィルターを0.5 Ｎ水酸化ナトリウ
ム溶液に１０分間浸し、さらに１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ
7.5 ）溶液に５分間、0.5 Ｍトリス−塩酸（ｐＨ7.5 ）
／1.5 Ｍ塩化ナトリウム溶液に５分間、そして２×ＳＳ
Ｃ溶液（１×ＳＳＣは、0.875 ％塩化ナトリウム／0.44
％クエン酸ナトリウム）に５分間浸した後に、８０℃で
２時間焼き付けを行ない６×ＳＳＣ溶液（5.25％塩化ナ
トリウム／2.64％クエン酸ナトリウム）中で菌体を除い
た後に風乾させた。次に目的のＤＮＡを選別するための
プローブとして、アプライドバイオシステム社製３８０
ＢＤＮＡ合成機を用いてカルボキシペプチダーゼＹ構造
遺伝子の一部である２０塩基のＤＮＡ（５’−ＴＧＴＴ
ＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＴＴＴＡＴＴ−３’：配列表の配
列番号１）を化学合成し、その中の８００ｎｇのＤＮＡ
に、１μｌの末端リン酸化緩衝液（0.5 Ｍトリス−塩酸
（ｐＨ7.6 ）／0.1Ｍ塩化マグネシウム／５０ｍＭジチ
オスレイトール／１ｍＭスペルミジン／１mMＥＤＴ
Ａ）、１０μｌの［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（アマシャムジャ
パン（株）製、１０μＣｉ／μｌ）、およびＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ（宝酒造社製）２μｌを加えて全量
を４０μｌとした後、３７℃で３０分間反応させてＤＮ
Ａの５’末端にラベル体のリン酸基をとり込ませた。７
０℃で１０分間放置することで反応を停止させ、１００
μｌの８Ｍ塩化アンモニウムを加えた後に、エタノール
沈殿処理を行ない、７０％エタノールで洗浄後、減圧乾
燥してラベルしたＤＮＡプローブを作成した。そこでこ
のＤＮＡプローブを用いてカルボキシペプチターゼＹ遺
伝子をクローニングするため、まず、上記のように作成
したニトロセルロースをハイブリダイゼーション溶液
（0.1 ％牛血清アルブミン、0.1 ％フィコール、0.1 ％
ポリビニルピロリドン、５０％（Ｕ／Ｖ）ホルムアミ
ド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ7.5 ）、
１０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中で、４９℃で３時間
振とうした後に、上記のように調製したＤＮＡプローブ
を添加したハイブリダイゼーション溶液中でさらに４９
℃で３０時間振とうさせ、ＤＮＡを特異的に結合させ
た。次に、２×ＳＳＣ溶液中で４９℃で１時間振とう
し、0.1 ％のＳＤＳを添加した２×ＳＳＣ溶液中で、４
９℃で３０分間さらに振とうしてフィルターを洗浄し、
さらに0.5 ×ＳＳＣ溶液中で４９℃で１時間振とうした
後に、ペーパータオル上で風乾させ、オートラジオグラ
フィーによる検出を行なった。その結果、約32,000コロ
ニー中２２コのＣＰＹ遺伝子を有すると思われるコロニ
ーが得られた。
【００３１】次に、このようにして得られたポジティブ
なクローンより以下の方法に従がってプラスミドを回収
した。まず、２×ＹＴ培地1.5 ｍｌにて一晩培養した
後、遠心分離（トミー精工（株）製微量高速遠心機ＭＲ
Ｘ−１５０（ローター同社ＴＭＡ−４））により大腸菌
を回収し、２００μｌの溶液 I（５０ｍＭグルコース、
１０mMＥＤＴＡ、２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ8.0 ）、リ
ゾチーム８００μｇ）に懸濁した。氷中に１０分間放置
した後、４００μｌの溶液II（0.2 Ｎ NaOH、１％ＳＤ
Ｓ）を加え懸濁した後に、氷中でさらに５分間放置し、
次に３００μｌの溶液III （３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
4.8 ））を加えてゆるやかに攪拌し、氷中で２０分間放
置した。そしてトミー精工（株）製微量高速遠心機ＭＲ
Ｘ−１５０（ローター同社ＴＭＡ−４）にて、14,500ｒ
ｐｍ、１５分間遠心し、遠心上清を回収した。これに冷
エタノール１ｍｌを添加して−８０℃で１０分間放置し
てエタノール沈殿を行なった。得られたエタノール沈殿
物をＴＥ溶液に懸濁後、以下ダイデオキシシークエンス
法によりその塩基配列の確認を行なった。すなわち、１
８μｌのプラスミドＤＮＡ（５μｇ）に２μｌの２Ｎ水
酸化ナトリウムを加え、全量を２０μｌとした後に、室
温で５分間反応させ、５μｌの８Ｍ酢酸アンモニウムと
１００μｌの冷エタノールを加えて、−８０℃で５分間
放置し、トミー精工（株）製微量高速遠心機にて12,000
ｒｐｍで５分間遠心してエタノール沈殿物を得た。これ
を７０％エタノールで２回洗浄後、減圧乾燥してアルカ
リ変性させた一本鎖プラスミドＤＮＡを得た。次に東洋
紡績（株）製ＤＮＡシークエンシングキット（Ｖｅｒ．
2.0 ）を用いて、この変性一本鎖プラスミドＤＮＡの塩
基配列確認を行なった。シークエンシングのためのプラ
イマーとしてアプライドバイオシステム社製３８０ＢＤ
ＮＡ合成機を用いて化学合成した１４本の合成ＤＮＡ断
片（(1) ５’−ＡＣＴＴＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＴＡＣＧ
ＣＴ−３’：配列表の配列番号２、(2) ５’−ＴＧＡＴ
ＧＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＴＡ−３’：配列表の配列番号
３、(3) ５’−ＡＴＧＣＴＴＧＴＣＣＴＣＧＴＣＴＴＣ
ＣＡＣ−３’：配列表の配列番号４、(4) ５’−ＴＴＴ
ＧＧＴＴＧＡＡＣＧＧＧＧＧＴＣ−３’：配列表の配列
番号５、(5) ５’−ＧＴＴＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＴＣＧ
ＣＣ−３’：配列表の配列番号６、(6) ５’−ＣＣＣＴ
ＴＧＴＴＧＡＣＧＴＡＴＴＣＡＧＧＧ−３’：配列表の
配列番号７、(7) ５’−ＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡ
ＴＴＴＡＴＴ−３’：配列表の配列番号８、(8) ５’−
ＴＣＣＴＧＡＴＡＴＣＧＴＡＡＡＣＧＴＴＴ−３’：配
列表の配列番号９、(9) ５’−ＧＧＴＧＡＴＴＧＧＡＴ
ＧＡＡＧＣＣＴＴＡ−３’：配列表の配列番号１０、(1
0)５’−ＣＴＴＡＴＴＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＴ−
３’：配列表の配列番号１１、(11)５’−ＴＴＣＴＴＣ
ＧＴＣＧＴＡＣＴＴＣＣ−３’：配列表の配列番号１
２、(12)５’−ＡＣＡＣＡＴＡＣＡＣＧＣＴＴＴＡＴＡ
ＡＧＧ：配列表の配列番号１３、(13)５’−ＧＡＴＡＡ
ＴＡＡＡＡＡＣＧＧＴＡＴＧＣＣＴ−３’：配列表の配
列番号１４、(14)５’−ＣＡＧＣＴＧＡＴＴＴＴＧＴＡ
ＧＴＴＡＴＧ−３’：配列表の配列番号１５）を使用し
た。アルカリ変性一本鎖ＤＮＡ0.5 ｐｍｏｌに対し、上
記の化学合成したＤＮＡプライマーをそれぞれ0.5 ｐｍ
ｏｌ加え、さらに５×シークエンシング緩衝液２μｌを
加えて、全量を１０μｌとした後に、６５℃で１５分、
室温で３０分間放置することによってプライマーＤＮＡ
をアルカリ変性一本鎖ＤＮＡにはりつかせ、東洋紡績
（株）社製キット内のＤＴＴ１μｌ、ラベリングミック
スチャー（ｄＧＴＰ用）１５倍希釈液２μｌ、シークエ
ネース酵素８倍希釈液２μｌ、およびアマシャム社製
［γ−32Ｐ］ｄＣＴＰ（１０μＣｉ／μｌ）１μｌを加
えて、室温で５分間反応させた。そして、ダイデオキシ
ＧＴＰ，ＡＴＰ，ＴＴＰ，ＣＴＰそれぞれのターミネー
ションミックスチャーを2.5 μｌずつ小分けしたチュー
ブに、反応液3.2 μｌずつを添加して室温で５分間反応
後、停止液を４μｌずつ添加し、８０℃で２分間放置す
ることで反応を停止した。そしてこの中の３μｌずつを
８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、
ゲルを乾燥後、オートラジオグラフィーにより、その塩
基配列を確認した。その結果、Ｌ．Ａ．Ｖａｌｌｓらが
報告しているサッカロマイセス・セルビシエＡＢ３２０
株のカルボキシペプチダーセＹ構造遺伝子［セル（Ｃｅ
ｌｌ），４８，８８７−８９７（１９８７）］と同一で
あることが確認された。
なクローンより以下の方法に従がってプラスミドを回収
した。まず、２×ＹＴ培地1.5 ｍｌにて一晩培養した
後、遠心分離（トミー精工（株）製微量高速遠心機ＭＲ
Ｘ−１５０（ローター同社ＴＭＡ−４））により大腸菌
を回収し、２００μｌの溶液 I（５０ｍＭグルコース、
１０mMＥＤＴＡ、２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ8.0 ）、リ
ゾチーム８００μｇ）に懸濁した。氷中に１０分間放置
した後、４００μｌの溶液II（0.2 Ｎ NaOH、１％ＳＤ
Ｓ）を加え懸濁した後に、氷中でさらに５分間放置し、
次に３００μｌの溶液III （３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
4.8 ））を加えてゆるやかに攪拌し、氷中で２０分間放
置した。そしてトミー精工（株）製微量高速遠心機ＭＲ
Ｘ−１５０（ローター同社ＴＭＡ−４）にて、14,500ｒ
ｐｍ、１５分間遠心し、遠心上清を回収した。これに冷
エタノール１ｍｌを添加して−８０℃で１０分間放置し
てエタノール沈殿を行なった。得られたエタノール沈殿
物をＴＥ溶液に懸濁後、以下ダイデオキシシークエンス
法によりその塩基配列の確認を行なった。すなわち、１
８μｌのプラスミドＤＮＡ（５μｇ）に２μｌの２Ｎ水
酸化ナトリウムを加え、全量を２０μｌとした後に、室
温で５分間反応させ、５μｌの８Ｍ酢酸アンモニウムと
１００μｌの冷エタノールを加えて、−８０℃で５分間
放置し、トミー精工（株）製微量高速遠心機にて12,000
ｒｐｍで５分間遠心してエタノール沈殿物を得た。これ
を７０％エタノールで２回洗浄後、減圧乾燥してアルカ
リ変性させた一本鎖プラスミドＤＮＡを得た。次に東洋
紡績（株）製ＤＮＡシークエンシングキット（Ｖｅｒ．
2.0 ）を用いて、この変性一本鎖プラスミドＤＮＡの塩
基配列確認を行なった。シークエンシングのためのプラ
イマーとしてアプライドバイオシステム社製３８０ＢＤ
ＮＡ合成機を用いて化学合成した１４本の合成ＤＮＡ断
片（(1) ５’−ＡＣＴＴＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＴＡＣＧ
ＣＴ−３’：配列表の配列番号２、(2) ５’−ＴＧＡＴ
ＧＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＴＡ−３’：配列表の配列番号
３、(3) ５’−ＡＴＧＣＴＴＧＴＣＣＴＣＧＴＣＴＴＣ
ＣＡＣ−３’：配列表の配列番号４、(4) ５’−ＴＴＴ
ＧＧＴＴＧＡＡＣＧＧＧＧＧＴＣ−３’：配列表の配列
番号５、(5) ５’−ＧＴＴＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＴＣＧ
ＣＣ−３’：配列表の配列番号６、(6) ５’−ＣＣＣＴ
ＴＧＴＴＧＡＣＧＴＡＴＴＣＡＧＧＧ−３’：配列表の
配列番号７、(7) ５’−ＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡ
ＴＴＴＡＴＴ−３’：配列表の配列番号８、(8) ５’−
ＴＣＣＴＧＡＴＡＴＣＧＴＡＡＡＣＧＴＴＴ−３’：配
列表の配列番号９、(9) ５’−ＧＧＴＧＡＴＴＧＧＡＴ
ＧＡＡＧＣＣＴＴＡ−３’：配列表の配列番号１０、(1
0)５’−ＣＴＴＡＴＴＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＴ−
３’：配列表の配列番号１１、(11)５’−ＴＴＣＴＴＣ
ＧＴＣＧＴＡＣＴＴＣＣ−３’：配列表の配列番号１
２、(12)５’−ＡＣＡＣＡＴＡＣＡＣＧＣＴＴＴＡＴＡ
ＡＧＧ：配列表の配列番号１３、(13)５’−ＧＡＴＡＡ
ＴＡＡＡＡＡＣＧＧＴＡＴＧＣＣＴ−３’：配列表の配
列番号１４、(14)５’−ＣＡＧＣＴＧＡＴＴＴＴＧＴＡ
ＧＴＴＡＴＧ−３’：配列表の配列番号１５）を使用し
た。アルカリ変性一本鎖ＤＮＡ0.5 ｐｍｏｌに対し、上
記の化学合成したＤＮＡプライマーをそれぞれ0.5 ｐｍ
ｏｌ加え、さらに５×シークエンシング緩衝液２μｌを
加えて、全量を１０μｌとした後に、６５℃で１５分、
室温で３０分間放置することによってプライマーＤＮＡ
をアルカリ変性一本鎖ＤＮＡにはりつかせ、東洋紡績
（株）社製キット内のＤＴＴ１μｌ、ラベリングミック
スチャー（ｄＧＴＰ用）１５倍希釈液２μｌ、シークエ
ネース酵素８倍希釈液２μｌ、およびアマシャム社製
［γ−32Ｐ］ｄＣＴＰ（１０μＣｉ／μｌ）１μｌを加
えて、室温で５分間反応させた。そして、ダイデオキシ
ＧＴＰ，ＡＴＰ，ＴＴＰ，ＣＴＰそれぞれのターミネー
ションミックスチャーを2.5 μｌずつ小分けしたチュー
ブに、反応液3.2 μｌずつを添加して室温で５分間反応
後、停止液を４μｌずつ添加し、８０℃で２分間放置す
ることで反応を停止した。そしてこの中の３μｌずつを
８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、
ゲルを乾燥後、オートラジオグラフィーにより、その塩
基配列を確認した。その結果、Ｌ．Ａ．Ｖａｌｌｓらが
報告しているサッカロマイセス・セルビシエＡＢ３２０
株のカルボキシペプチダーセＹ構造遺伝子［セル（Ｃｅ
ｌｌ），４８，８８７−８９７（１９８７）］と同一で
あることが確認された。
【００３２】参考例３ カルボキシペプチダーゼＹ発現
プラスミド（ｐＣＹ３０３）の構築 参考例２で得られたカルボキシペプチダーゼＹ構造遺伝
子部分を含むプラスミドｐＣＹ１０１にＳａｌＩサイト
を導入するため、ｐＣＹ１０１ ５μｇに３０μｌの制
限酵素緩衝液Ｍおよび５０単位の制限酵素ＡｃｃＩ（宝
酒造（株）製）を加えて全量を滅菌脱イオン水で３００
μｌとした後に、３７℃で３時間反応させ、切断反応を
行ない、ＴＥ飽和フェノールを等量添加して攪拌するこ
とにより反応を停止した。このフェノール処理後、エタ
ノール沈殿処理し、得られたＤＮＡ断片を0.8 ％アガロ
ースゲル電気泳動で分離し、4.8 キロベースペアー（以
下、「ｋｂ」とする）のカルボキシペプチダーゼＹ構造
遺伝子部分を含むＤＮＡ断片をゲルより回収した。この
回収したＤＮＡをフェノール処理、エタノール沈殿処理
した後に宝酒造社製、ＤＮＡブランティングキットを用
いて末端の平滑化を行なった。すなわち回収したＤＮＡ
断片を１×ＴＥ緩衝液に懸濁後、その全量にキット内の
１０×緩衝液１μｌを加え全量を９μｌとした後に、７
０℃で５分間放置し、さらにＴ４−ＤＮＡポリメラーゼ
（キット）１μｌを添加し、３７℃で５分間正確に反応
させた後に、キット内のＤＮＡ希釈緩衝液３５０μｌと
４０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加え、フェノール
処理、エタノール沈殿処理を行なった。得られたエタノ
ール沈殿物を１０μｌの１×ＴＥ緩衝液に懸濁後、その
うちの５μｌに宝酒造（株）製の末端がリン酸化された
ｐＳａｌＩリンカー（ｄ（ｐＧＧＴＣＧＡＣＣ））２μ
ｌを加え、さらに宝酒造（株）製ＤＮＡライゲーション
キットのＡ溶液５６μｌ、Ｂ溶液７μｌを加えた後に、
１６℃で１４時間反応させ連結反応を行なわせた。この
反応液をエタノール沈殿処理した後に、７０μｌのＴＥ
緩衝液に懸濁し、参考例２で述べた方法と同様の方法
で、宝酒造（株）製大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル
内に導入し、アンピシリンを添加した２×ＹＴ培地プレ
ート上で生育可能なアンピシリン耐性株を得た。そこで
参考例２で述べた方法と同様の方法で、３２コのコロニ
ーについて、1.５ｍｌの２×ＹＴ培地で培養を行ない、
プラスミドＤＮＡの回収を行なった。得られたプラスミ
ドＤＮＡの一部を用いて制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄII
I で切断した後に、0.8％アガロースゲル電気泳動に
て、2.2 ｋｂのＤＮＡ断片が生じたプラスミドＤＮＡを
選別した結果、１０コのコロニーにおいてカルボキシペ
プチダーゼＹ構造遺伝子上流のＡｃｃＩサイトがＳａｌ
Ｉサイトに置き換わったプラスミドＤＮＡ（ｐＣＹ２０
１）を得た。そこでこのｐＣＹ２０１ ５μｇに２０μ
ｌの制限酵素緩衝液Ｍおよび５０単位のＨｉｎｄIII
（宝酒造（株）製）を加えて全量を滅菌脱イオン水で２
００μｌとした後に３７℃で２時間反応させ、さらに１
０μｌの１ＭNaClと５０単位のＳａｌＩ（宝酒造（株）
製）を加え、３７℃で２時間反応させることで切断反応
を行ない、ＴＥ飽和フェノールを等量添加して攪拌する
ことにより反応を停止した。フェノール処理、エタノー
ル沈殿処理して得られたＤＮＡを0.8 ％アガロースゲル
電気泳動で分離し、カルボキシペプチダーゼ構造遺伝子
部分を含む2.2 ｋｂのＳａｌＩ−ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断
片をゲルより回収した。次にベクターＤＮＡとしてプラ
スミドＹＥｐ−ＨＬＹＳＩＧ５μｇを同様の条件で宝酒
造（株）製の制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄIII で切断
し、フェノール処理、エタノール沈殿処理を行なった後
に、0.8 ％アガロースゲル電気泳動によりＧＡＬ１０プ
ロモーター部分を含む7.1 ｋｂのＳａｌＩ−ＨｉｎｄII
I ＤＮＡ断片をゲルより回収した。そしてフェノール処
理、エタノール沈殿処理を行なった後に、子牛腸由来の
アルカリホスファターゼ（東洋紡績（株））２０単位を
使い、３６０μｌのＴＥ緩衝液中で３７℃、３０分間イ
ンキュベートすることによりアルカリホスファターゼ処
理を行なった。フェノール処理を３回繰り返した後、エ
タノール沈殿処理した後に、ＴＥ緩衝液に懸濁してこれ
をベクターＤＮＡとした。以上のようにして作成したベ
クターＤＮＡ0.5 μｇとカルボキシペプチダーゼＹ構造
遺伝子部分を含む2.2 ｋｄのＳａｌＩ−ＨｉｎｄIII 断
片0.5 μｇに、宝酒造（株）製ＤＮＡライゲーションキ
ットのＡ溶液４８μｌ、Ｂ溶液６μｌを加えて全量を６
０μｌとした後に、１６℃で１５時間反応させて連結反
応を行なわせた。以下参考例２にて述べた方法と同様の
方法で、宝酒造（株）製大腸菌ＪＭ１０９コンピテント
セルに導入し、アンピシリン耐性株を得た。次に参考例
２で述べた方法と同様の方法で、３２コのコロニーにつ
いて、1.5 ｍｌの２×ＹＴ培地で培養を行ない、プラス
ミドＤＮＡの回収を行なった。得られたプラスミドＤＮ
Ａの一部を用いて制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄIII で切
断し、0.8 ％アガロースゲル電気泳動にて生じたＤＮＡ
断片を検討した結果、ＧＡＬ１０プロモーターの直下に
カルボキシペプチダーゼＹ遺伝子が連結されたプラスミ
ドＤＮＡを有する株が９コロニー得られた。そこでこの
得られたＧＡＬ１０プロモーターの直下にカルボキシペ
プチダーゼＹ構造遺伝子が連結された酵母多コピー型プ
ラスミドをｐＣＹ３０３と名付けた。（図１参照） 参考例４ ｐＣＹ３０３プラスミドの酵母への導入 パン酵母サッカロマイセス・セルビシエＫＳ５８−２Ｄ
株（γ，ｓｓｌ１，ｌｅｕ２，ｈｉｓ１ ｏｒ ３，ｕ
ｒａ３）に、ｐＣＹ３０３プラスミドを以下のように導
入した。すなわち、１コロニーのＫＳ５８−２Ｄ株を５
０ｍｌのＹＰＤ培地に植菌し、２８℃で１２時間培養し
た後に、菌体を遠心分離（トミー精工（株）ＲＳ−２０
II、ローター：ＲＰＲ２０−２）により回収後、２０ｍ
ｌのＴＥ緩衝液で１回洗浄した後に、２×１０8 ｃｅｌ
ｌ／ｍｌの菌体濃度になるようにＴＥ緩衝液中に懸濁し
た。この菌体懸濁液２ｍｌを滅菌した１００ｍｌの三角
フラスコに移した後に、0.2 Ｍ酢酸リチウム溶液２ｍｌ
を加え、２６℃で１時間振とうした。そして１００％グ
リセロール溶液0.7 ｍｌを加えて懸濁した後にこの中の
0.3 ｍｌを５μｇのｐＣＹ３０３プラスミドを入れたエ
ッペンドルフチューブ（1.5 ml）に移し、攪拌後、３０
℃で３０分間放置した。そして７０％のポリエチレング
リコール溶液を0.3 ｍｌ加えて攪拌後、３０℃で１時間
放置した後に、４２℃で５分間ヒートショックを行なっ
た後に、トミー精工（株）微量高速遠心機ＭＲＸ−１５
０（ローター同社ＴＭＡ−４）にて、5000ｒｐｍ、１分
間遠心し、細胞を回収後、さらに１ｍｌの滅菌水にて洗
浄した後に、５００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。そし
てこの細胞懸濁液４５０μｌと５０μｌをそれぞれ０．
７％の寒天溶液に加えて、ＳＤ培地（0.667 ％イースト
・ナイトロジェン・ベースウィズアウトアミノアシッド
（Ｄｉｆｃｏ社製）２％グルコース／２％ガラクトース
／0.2 Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.6 ）／0.14％ア
ミノ酸混合液（ロイシンを除く）／0.5 ％牛血清アルブ
ミンフラクションＶ（シグマ社製））プレート上に重層
して、３０℃で３日間培養した。その結果、１２コのコ
ロニーが得られ、これをＫＳ５８−２Ｄ（ｐＣＹ３０
３）と名付けた。
プラスミド（ｐＣＹ３０３）の構築 参考例２で得られたカルボキシペプチダーゼＹ構造遺伝
子部分を含むプラスミドｐＣＹ１０１にＳａｌＩサイト
を導入するため、ｐＣＹ１０１ ５μｇに３０μｌの制
限酵素緩衝液Ｍおよび５０単位の制限酵素ＡｃｃＩ（宝
酒造（株）製）を加えて全量を滅菌脱イオン水で３００
μｌとした後に、３７℃で３時間反応させ、切断反応を
行ない、ＴＥ飽和フェノールを等量添加して攪拌するこ
とにより反応を停止した。このフェノール処理後、エタ
ノール沈殿処理し、得られたＤＮＡ断片を0.8 ％アガロ
ースゲル電気泳動で分離し、4.8 キロベースペアー（以
下、「ｋｂ」とする）のカルボキシペプチダーゼＹ構造
遺伝子部分を含むＤＮＡ断片をゲルより回収した。この
回収したＤＮＡをフェノール処理、エタノール沈殿処理
した後に宝酒造社製、ＤＮＡブランティングキットを用
いて末端の平滑化を行なった。すなわち回収したＤＮＡ
断片を１×ＴＥ緩衝液に懸濁後、その全量にキット内の
１０×緩衝液１μｌを加え全量を９μｌとした後に、７
０℃で５分間放置し、さらにＴ４−ＤＮＡポリメラーゼ
（キット）１μｌを添加し、３７℃で５分間正確に反応
させた後に、キット内のＤＮＡ希釈緩衝液３５０μｌと
４０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加え、フェノール
処理、エタノール沈殿処理を行なった。得られたエタノ
ール沈殿物を１０μｌの１×ＴＥ緩衝液に懸濁後、その
うちの５μｌに宝酒造（株）製の末端がリン酸化された
ｐＳａｌＩリンカー（ｄ（ｐＧＧＴＣＧＡＣＣ））２μ
ｌを加え、さらに宝酒造（株）製ＤＮＡライゲーション
キットのＡ溶液５６μｌ、Ｂ溶液７μｌを加えた後に、
１６℃で１４時間反応させ連結反応を行なわせた。この
反応液をエタノール沈殿処理した後に、７０μｌのＴＥ
緩衝液に懸濁し、参考例２で述べた方法と同様の方法
で、宝酒造（株）製大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル
内に導入し、アンピシリンを添加した２×ＹＴ培地プレ
ート上で生育可能なアンピシリン耐性株を得た。そこで
参考例２で述べた方法と同様の方法で、３２コのコロニ
ーについて、1.５ｍｌの２×ＹＴ培地で培養を行ない、
プラスミドＤＮＡの回収を行なった。得られたプラスミ
ドＤＮＡの一部を用いて制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄII
I で切断した後に、0.8％アガロースゲル電気泳動に
て、2.2 ｋｂのＤＮＡ断片が生じたプラスミドＤＮＡを
選別した結果、１０コのコロニーにおいてカルボキシペ
プチダーゼＹ構造遺伝子上流のＡｃｃＩサイトがＳａｌ
Ｉサイトに置き換わったプラスミドＤＮＡ（ｐＣＹ２０
１）を得た。そこでこのｐＣＹ２０１ ５μｇに２０μ
ｌの制限酵素緩衝液Ｍおよび５０単位のＨｉｎｄIII
（宝酒造（株）製）を加えて全量を滅菌脱イオン水で２
００μｌとした後に３７℃で２時間反応させ、さらに１
０μｌの１ＭNaClと５０単位のＳａｌＩ（宝酒造（株）
製）を加え、３７℃で２時間反応させることで切断反応
を行ない、ＴＥ飽和フェノールを等量添加して攪拌する
ことにより反応を停止した。フェノール処理、エタノー
ル沈殿処理して得られたＤＮＡを0.8 ％アガロースゲル
電気泳動で分離し、カルボキシペプチダーゼ構造遺伝子
部分を含む2.2 ｋｂのＳａｌＩ−ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断
片をゲルより回収した。次にベクターＤＮＡとしてプラ
スミドＹＥｐ−ＨＬＹＳＩＧ５μｇを同様の条件で宝酒
造（株）製の制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄIII で切断
し、フェノール処理、エタノール沈殿処理を行なった後
に、0.8 ％アガロースゲル電気泳動によりＧＡＬ１０プ
ロモーター部分を含む7.1 ｋｂのＳａｌＩ−ＨｉｎｄII
I ＤＮＡ断片をゲルより回収した。そしてフェノール処
理、エタノール沈殿処理を行なった後に、子牛腸由来の
アルカリホスファターゼ（東洋紡績（株））２０単位を
使い、３６０μｌのＴＥ緩衝液中で３７℃、３０分間イ
ンキュベートすることによりアルカリホスファターゼ処
理を行なった。フェノール処理を３回繰り返した後、エ
タノール沈殿処理した後に、ＴＥ緩衝液に懸濁してこれ
をベクターＤＮＡとした。以上のようにして作成したベ
クターＤＮＡ0.5 μｇとカルボキシペプチダーゼＹ構造
遺伝子部分を含む2.2 ｋｄのＳａｌＩ−ＨｉｎｄIII 断
片0.5 μｇに、宝酒造（株）製ＤＮＡライゲーションキ
ットのＡ溶液４８μｌ、Ｂ溶液６μｌを加えて全量を６
０μｌとした後に、１６℃で１５時間反応させて連結反
応を行なわせた。以下参考例２にて述べた方法と同様の
方法で、宝酒造（株）製大腸菌ＪＭ１０９コンピテント
セルに導入し、アンピシリン耐性株を得た。次に参考例
２で述べた方法と同様の方法で、３２コのコロニーにつ
いて、1.5 ｍｌの２×ＹＴ培地で培養を行ない、プラス
ミドＤＮＡの回収を行なった。得られたプラスミドＤＮ
Ａの一部を用いて制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄIII で切
断し、0.8 ％アガロースゲル電気泳動にて生じたＤＮＡ
断片を検討した結果、ＧＡＬ１０プロモーターの直下に
カルボキシペプチダーゼＹ遺伝子が連結されたプラスミ
ドＤＮＡを有する株が９コロニー得られた。そこでこの
得られたＧＡＬ１０プロモーターの直下にカルボキシペ
プチダーゼＹ構造遺伝子が連結された酵母多コピー型プ
ラスミドをｐＣＹ３０３と名付けた。（図１参照） 参考例４ ｐＣＹ３０３プラスミドの酵母への導入 パン酵母サッカロマイセス・セルビシエＫＳ５８−２Ｄ
株（γ，ｓｓｌ１，ｌｅｕ２，ｈｉｓ１ ｏｒ ３，ｕ
ｒａ３）に、ｐＣＹ３０３プラスミドを以下のように導
入した。すなわち、１コロニーのＫＳ５８−２Ｄ株を５
０ｍｌのＹＰＤ培地に植菌し、２８℃で１２時間培養し
た後に、菌体を遠心分離（トミー精工（株）ＲＳ−２０
II、ローター：ＲＰＲ２０−２）により回収後、２０ｍ
ｌのＴＥ緩衝液で１回洗浄した後に、２×１０8 ｃｅｌ
ｌ／ｍｌの菌体濃度になるようにＴＥ緩衝液中に懸濁し
た。この菌体懸濁液２ｍｌを滅菌した１００ｍｌの三角
フラスコに移した後に、0.2 Ｍ酢酸リチウム溶液２ｍｌ
を加え、２６℃で１時間振とうした。そして１００％グ
リセロール溶液0.7 ｍｌを加えて懸濁した後にこの中の
0.3 ｍｌを５μｇのｐＣＹ３０３プラスミドを入れたエ
ッペンドルフチューブ（1.5 ml）に移し、攪拌後、３０
℃で３０分間放置した。そして７０％のポリエチレング
リコール溶液を0.3 ｍｌ加えて攪拌後、３０℃で１時間
放置した後に、４２℃で５分間ヒートショックを行なっ
た後に、トミー精工（株）微量高速遠心機ＭＲＸ−１５
０（ローター同社ＴＭＡ−４）にて、5000ｒｐｍ、１分
間遠心し、細胞を回収後、さらに１ｍｌの滅菌水にて洗
浄した後に、５００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。そし
てこの細胞懸濁液４５０μｌと５０μｌをそれぞれ０．
７％の寒天溶液に加えて、ＳＤ培地（0.667 ％イースト
・ナイトロジェン・ベースウィズアウトアミノアシッド
（Ｄｉｆｃｏ社製）２％グルコース／２％ガラクトース
／0.2 Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.6 ）／0.14％ア
ミノ酸混合液（ロイシンを除く）／0.5 ％牛血清アルブ
ミンフラクションＶ（シグマ社製））プレート上に重層
して、３０℃で３日間培養した。その結果、１２コのコ
ロニーが得られ、これをＫＳ５８−２Ｄ（ｐＣＹ３０
３）と名付けた。
【００３３】実施例１ チアミン添加によるカルボチキ
ペプチダーゼＹの分泌生産の増大 サッカロマイセス・セルビシエＫＳ５８−２Ｄ（ｐＣＹ
３０３）株を用いて、培養液中にカルボキシペプチダー
ゼＹを分泌生産させるにあたり、培地成分の１つである
チアミンがカルボキシペプチダーセＹの分泌生産にどの
ように影響を与えるかについて検討した。すなわち、参
考例４で示したサッカロマイセス・セルビシエＫＳ５８
−２Ｄ（ｐＣＹ３０３）株をＳＤ培地１０ｍｌ（１００
ｍｌ三角フラスコ）に植菌し、３日間、２６℃にて前々
培養を行なった後に、さらに、その１％を同様の培地１
００ｍｌ（５００ｍｌ三角フラスコ）に植菌して、３日
間、２８℃にて前培養を行ない、その１％を表３に示し
た組成の完全合成培地１００ｍｌ（５００ｍｌ三角フラ
スコ）に植菌するとともに、この完全合成培地中のチア
ミンを除いた培地１００ｍｌ（５００ｍｌ三角フラス
コ）に植菌し、２８℃で振盪培養（２００ｒｐｍ）を行
なった。そして培養開始後、７日間までの間、２４時間
ごとに培養液１ｍｌをサンプリングし、トミー精工
（株）製微量高速遠心機ＭＲＸ−１５０（ローター同社
ＴＭＡ−４）にて、８０００ｒｐｍ、５分間遠心分離
し、酵母菌体と培養液とを分離した。得られた培養液を
用いて以下のようにカルボキシペプチダーゼＹの活性を
測定した。
ペプチダーゼＹの分泌生産の増大 サッカロマイセス・セルビシエＫＳ５８−２Ｄ（ｐＣＹ
３０３）株を用いて、培養液中にカルボキシペプチダー
ゼＹを分泌生産させるにあたり、培地成分の１つである
チアミンがカルボキシペプチダーセＹの分泌生産にどの
ように影響を与えるかについて検討した。すなわち、参
考例４で示したサッカロマイセス・セルビシエＫＳ５８
−２Ｄ（ｐＣＹ３０３）株をＳＤ培地１０ｍｌ（１００
ｍｌ三角フラスコ）に植菌し、３日間、２６℃にて前々
培養を行なった後に、さらに、その１％を同様の培地１
００ｍｌ（５００ｍｌ三角フラスコ）に植菌して、３日
間、２８℃にて前培養を行ない、その１％を表３に示し
た組成の完全合成培地１００ｍｌ（５００ｍｌ三角フラ
スコ）に植菌するとともに、この完全合成培地中のチア
ミンを除いた培地１００ｍｌ（５００ｍｌ三角フラス
コ）に植菌し、２８℃で振盪培養（２００ｒｐｍ）を行
なった。そして培養開始後、７日間までの間、２４時間
ごとに培養液１ｍｌをサンプリングし、トミー精工
（株）製微量高速遠心機ＭＲＸ−１５０（ローター同社
ＴＭＡ−４）にて、８０００ｒｐｍ、５分間遠心分離
し、酵母菌体と培養液とを分離した。得られた培養液を
用いて以下のようにカルボキシペプチダーゼＹの活性を
測定した。
【００３４】
【表３】
【００３５】カルボキシペプチダーゼＹの活性測定は、
Ｎ−ベンゾイル−L-チロシン−ｐ−ニトロアニリド（Ｂ
ＴＰＮＡ）を基質として用いる方法で行なった。すなわ
ち、６mMＢＴＰＮＡ１００μｌおよび０．１Ｍトリス−
塩酸（ｐＨ７．６）４５０μｌを含む溶液に、５０μｌ
の酵素液を添加し、３７℃で２０分間反応させた後に、
沸騰水中で３分間保温することで反応を停止させ、生成
したｐ−ニトロアニリドの吸光度（４２０ｎｍ）を測定
することによりカルボキシペプチダーゼＹの活性を測定
した。なお、０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．０）に溶
解した１mMＮ−ＣＢＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ １ｍｌに、酵
素液１０μｌを添加して、５分間の吸光度（２２４ｎ
ｍ）の減少を測定するというカルボキシペプチダーゼＹ
の活性測定法も併用して行なった。なお、カルボキシペ
プチダーゼＹ量は、標品のカルボキシペプチダーゼＹ
（ベーリンガーマンハイム山之内製）を用いて同様に活
性を測定し、検量線を作成することにより算出した。培
地中よりチアミンを除くと、菌体の増殖に変化は認めら
れなかったが、菌体外へのカルボキシペプチダーゼＹの
分泌量は著しく低下した（図２）。
Ｎ−ベンゾイル−L-チロシン−ｐ−ニトロアニリド（Ｂ
ＴＰＮＡ）を基質として用いる方法で行なった。すなわ
ち、６mMＢＴＰＮＡ１００μｌおよび０．１Ｍトリス−
塩酸（ｐＨ７．６）４５０μｌを含む溶液に、５０μｌ
の酵素液を添加し、３７℃で２０分間反応させた後に、
沸騰水中で３分間保温することで反応を停止させ、生成
したｐ−ニトロアニリドの吸光度（４２０ｎｍ）を測定
することによりカルボキシペプチダーゼＹの活性を測定
した。なお、０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．０）に溶
解した１mMＮ−ＣＢＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ １ｍｌに、酵
素液１０μｌを添加して、５分間の吸光度（２２４ｎ
ｍ）の減少を測定するというカルボキシペプチダーゼＹ
の活性測定法も併用して行なった。なお、カルボキシペ
プチダーゼＹ量は、標品のカルボキシペプチダーゼＹ
（ベーリンガーマンハイム山之内製）を用いて同様に活
性を測定し、検量線を作成することにより算出した。培
地中よりチアミンを除くと、菌体の増殖に変化は認めら
れなかったが、菌体外へのカルボキシペプチダーゼＹの
分泌量は著しく低下した（図２）。
【００３６】実施例２ チアミン添加によりヒトリゾチ
ームの分泌生産の増大 実施例１に示した方法と同様の方法で、サッカロマイセ
ス・セルビシエＫＳ５８−２Ｄ株に、ＹＥｐ−ＨＬＹＳ
ＩＧプラスミド（ジーン、４３巻、２７３〜２７９頁、
１９８６（Ｇｅｎｅ，４３（１９８６），２７３〜２７
９）：ガラクトースで誘導のかかるＧＡＬ１０プロモー
ターの制御下に化学合成したニワトリ・リゾチームのシ
グナル配列とヒト・リゾチーム構造遺伝子を有する酵母
多コピー型プラスミド）を導入し、サッカロマイセス・
セルビシエＫＳ５８−２Ｄ（ＹＥｐ−ＨＬＹＳＩＧ）株
を得た。このサッカロマイセス・セルビシエＫＳ５８−
２Ｄ（ＹＥｐ−ＨＬＹＳＩＧ）株をＳＤ培地１０ｍｌ
（１００ｍｌ三角フラスコ）に植菌し、３日間、２６℃
にて前培養を行なった後に、その１％を、表１に示した
組成の完全合成培地よりビオチンとチアミン以外の７種
類のビタミンを除いた培地（以下「＋チアミン培地」と
記す）１００ｍｌ（５００ｍｌ三角フラスコ）およびビ
オチン以外の８種類のビタミンを除いた培地（以下「−
チアミン培地」と記す）に植菌し、２８℃で３日間、振
盪培養（２００ｒｐｍ）を行なった。そしてこの培養液
４０ｍｌを、トミー精工（株）製高速遠心機ＲＬ−１３
１（ローター同社ＴＳ−９）にて、3,000 ｒｐｍ、１０
分間遠心して菌体と培養液とを分離した。ヒト・リゾチ
ームの活性測定は以下に示したように行なった。
ームの分泌生産の増大 実施例１に示した方法と同様の方法で、サッカロマイセ
ス・セルビシエＫＳ５８−２Ｄ株に、ＹＥｐ−ＨＬＹＳ
ＩＧプラスミド（ジーン、４３巻、２７３〜２７９頁、
１９８６（Ｇｅｎｅ，４３（１９８６），２７３〜２７
９）：ガラクトースで誘導のかかるＧＡＬ１０プロモー
ターの制御下に化学合成したニワトリ・リゾチームのシ
グナル配列とヒト・リゾチーム構造遺伝子を有する酵母
多コピー型プラスミド）を導入し、サッカロマイセス・
セルビシエＫＳ５８−２Ｄ（ＹＥｐ−ＨＬＹＳＩＧ）株
を得た。このサッカロマイセス・セルビシエＫＳ５８−
２Ｄ（ＹＥｐ−ＨＬＹＳＩＧ）株をＳＤ培地１０ｍｌ
（１００ｍｌ三角フラスコ）に植菌し、３日間、２６℃
にて前培養を行なった後に、その１％を、表１に示した
組成の完全合成培地よりビオチンとチアミン以外の７種
類のビタミンを除いた培地（以下「＋チアミン培地」と
記す）１００ｍｌ（５００ｍｌ三角フラスコ）およびビ
オチン以外の８種類のビタミンを除いた培地（以下「−
チアミン培地」と記す）に植菌し、２８℃で３日間、振
盪培養（２００ｒｐｍ）を行なった。そしてこの培養液
４０ｍｌを、トミー精工（株）製高速遠心機ＲＬ−１３
１（ローター同社ＴＳ−９）にて、3,000 ｒｐｍ、１０
分間遠心して菌体と培養液とを分離した。ヒト・リゾチ
ームの活性測定は以下に示したように行なった。
【００３７】すなわち、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６．４）に懸濁したマイクロコッカス・リソデ
ィクティカス（シグマ社製、0.15ｍｇ／ｍｌ）８００μ
ｌに、酵素液２００μｌを添加して、５分間の吸光度
（４５０ｎｍ）の減少を測定することでリゾチーム活性
を測定した。なお１ユニットは、１分間の吸光度の減少
で0.001 であり、これは培養液１リットルあたり0.02ｍ
ｇのリゾチーム量となる。この結果、カルボキシペプチ
ダーゼＹを分泌生産させた場合と同様に、菌体の増殖に
は影響が認められなかったが、ヒトリゾチームの菌体外
への分泌量は−チアミン培地で培養した場合に比べて＋
チアミン培地で培養すると顕著に増大していた（図
３）。
液（ｐＨ６．４）に懸濁したマイクロコッカス・リソデ
ィクティカス（シグマ社製、0.15ｍｇ／ｍｌ）８００μ
ｌに、酵素液２００μｌを添加して、５分間の吸光度
（４５０ｎｍ）の減少を測定することでリゾチーム活性
を測定した。なお１ユニットは、１分間の吸光度の減少
で0.001 であり、これは培養液１リットルあたり0.02ｍ
ｇのリゾチーム量となる。この結果、カルボキシペプチ
ダーゼＹを分泌生産させた場合と同様に、菌体の増殖に
は影響が認められなかったが、ヒトリゾチームの菌体外
への分泌量は−チアミン培地で培養した場合に比べて＋
チアミン培地で培養すると顕著に増大していた（図
３）。
【００３８】実施例３ チアミン添加によるイソベルタ
ーゼの分泌生産の増大 ｐＣＹ３０３プラスミドを有する酵母サッカロマイセス
・セルビシエＫＳ５８−２Ｄ株を、１０ｍｌのＳＤ（−
ｌｅｕ）培地で、２６℃、３日間培養後、その１％を同
様のＳＤ（−ｌｅｕ）培地１０ｍｌに植菌して、２６
℃、３日間培養し、前培養液とした。この前培養液１％
を、チアミンを添加した完全合成培地およびチアミンを
添加していない完全合成培地それぞれ１００ｍｌに植菌
し、７日間、２８℃で本培養を行なった。培養液中のイ
ンベルターゼ活性の測定は、次のように行なった。
ーゼの分泌生産の増大 ｐＣＹ３０３プラスミドを有する酵母サッカロマイセス
・セルビシエＫＳ５８−２Ｄ株を、１０ｍｌのＳＤ（−
ｌｅｕ）培地で、２６℃、３日間培養後、その１％を同
様のＳＤ（−ｌｅｕ）培地１０ｍｌに植菌して、２６
℃、３日間培養し、前培養液とした。この前培養液１％
を、チアミンを添加した完全合成培地およびチアミンを
添加していない完全合成培地それぞれ１００ｍｌに植菌
し、７日間、２８℃で本培養を行なった。培養液中のイ
ンベルターゼ活性の測定は、次のように行なった。
【００３９】すなわち、0.1 Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ4.65）１ｍｌと0.3 Ｍショ糖溶液0.5 ｍｌと上記
本培養液0.1 ｍｌを混ぜ合わせ、２５℃で５分間反応さ
せることにより、培養液中のインベルダーゼによりショ
糖をＤ−グルコースとＤ−フラクトースに変化させた。
反応は0.3 Ｍトリス（ハイドロキシメチル）−アミノメ
タン溶液0.4 ｍｌを反応中に添加することにより停止さ
せた。次に0.3 Ｍトリエチルアミン緩衝液（ｐＨ7.6 ）
2.5 ｍｌ、0.1 Ｍ、塩化マグネシウム溶液0.1 ｍｌ、１
６mMＡＴＰ溶液0.1 ｍｌ、１１mMＮＡＤＰ溶液0.1 ｍ
ｌ、２８０ｕｎｉｔ／ｍｌのヘキソキナーゼ溶液（メル
ク社製）0.03ｍｌ、７００ｕｎｉｔ／ｍｌのホスホグル
コースイソメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム山之内
社製）0.03ｍｌと上記反応液0.05ｍｌを混ぜ合わせた
後、分光光度計（日立製作所製、分光光度計モデル２０
０−２０）により、３４０ｎｍでの吸光度を測定し、こ
れを吸光度１とした。なお、反応液0.05ｍｌのかわりに
脱イオン水0.05ｍｌを添加したものの吸光度も同様に測
定し、これをブランクの吸光度１とした。次に、３５０
ｕｎｉｔ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ0.01ｍｌを添加し、３７℃で２０分間反応させた後
に沸騰水に５分間つけることで反応を停止させ、分光光
度計（日立製作所製、分光光度計モデル２００−２０）
により、３４０ｎｍでの吸光度を測定し、これを吸光度
２とした。なお、ブランクとして脱イオン水を用いたも
のの吸光度も同様に測定して、これをブランクの吸光度
２とした。培養液中のインベルターゼ活性は、これらの
吸光度１および吸光度２を用いて、以下の計算式より求
めた。
（ｐＨ4.65）１ｍｌと0.3 Ｍショ糖溶液0.5 ｍｌと上記
本培養液0.1 ｍｌを混ぜ合わせ、２５℃で５分間反応さ
せることにより、培養液中のインベルダーゼによりショ
糖をＤ−グルコースとＤ−フラクトースに変化させた。
反応は0.3 Ｍトリス（ハイドロキシメチル）−アミノメ
タン溶液0.4 ｍｌを反応中に添加することにより停止さ
せた。次に0.3 Ｍトリエチルアミン緩衝液（ｐＨ7.6 ）
2.5 ｍｌ、0.1 Ｍ、塩化マグネシウム溶液0.1 ｍｌ、１
６mMＡＴＰ溶液0.1 ｍｌ、１１mMＮＡＤＰ溶液0.1 ｍ
ｌ、２８０ｕｎｉｔ／ｍｌのヘキソキナーゼ溶液（メル
ク社製）0.03ｍｌ、７００ｕｎｉｔ／ｍｌのホスホグル
コースイソメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム山之内
社製）0.03ｍｌと上記反応液0.05ｍｌを混ぜ合わせた
後、分光光度計（日立製作所製、分光光度計モデル２０
０−２０）により、３４０ｎｍでの吸光度を測定し、こ
れを吸光度１とした。なお、反応液0.05ｍｌのかわりに
脱イオン水0.05ｍｌを添加したものの吸光度も同様に測
定し、これをブランクの吸光度１とした。次に、３５０
ｕｎｉｔ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ0.01ｍｌを添加し、３７℃で２０分間反応させた後
に沸騰水に５分間つけることで反応を停止させ、分光光
度計（日立製作所製、分光光度計モデル２００−２０）
により、３４０ｎｍでの吸光度を測定し、これを吸光度
２とした。なお、ブランクとして脱イオン水を用いたも
のの吸光度も同様に測定して、これをブランクの吸光度
２とした。培養液中のインベルターゼ活性は、これらの
吸光度１および吸光度２を用いて、以下の計算式より求
めた。
【００４０】 上記の測定法により求めたチアミンを添加した完全合成
培地（＋チアミン）およびチアミンを添加していない完
全合成培地（−チアミン）で培養した場合の培養液中の
インベルターゼ活性を表４に示した。
培地（＋チアミン）およびチアミンを添加していない完
全合成培地（−チアミン）で培養した場合の培養液中の
インベルターゼ活性を表４に示した。
【００４１】
【表４】
【００４２】この結果、培養液中のインベルターゼ活性
は、チアミンを添加した完全合成培地で酵母サッカロマ
イセス・セルビシエＫＳ５８−２Ｄ／ｐＣＹ３０３株を
培養した方がチアミンを添加していない完全合成培地で
同株を培養するよりも有意に高いことが明らかとなっ
た。
は、チアミンを添加した完全合成培地で酵母サッカロマ
イセス・セルビシエＫＳ５８−２Ｄ／ｐＣＹ３０３株を
培養した方がチアミンを添加していない完全合成培地で
同株を培養するよりも有意に高いことが明らかとなっ
た。
【００４３】ｐＣＹ３０３プラスミドを有するＫＳ５８
−２Ｄ株を、ロイシン以外のアミノ酸を添加したＳＤ培
地５０ｍｌに植菌し、２６℃で３日間振盪培養して前々
培養を行なった。次に、前々培養液0.5 ｍｌを同様の組
成のＳＤ培地５０ｍｌに添加し、２６℃で３日間振盪培
養することで前培養を行なった。この菌培養液１ｍｌ
を、ビタミンとしてビオチンだけを添加した完全合成培
地およびビオチンとチアミンだけを添加した完全合成培
地それぞれ１００ｍｌに添加し、２８℃で振盪培養を行
なった。培養開始３日目、５日目、７日目にそれぞれ５
ｍｌずつサンプリングした。このサンプリング液をトミ
ー精工製冷却遠心機（ＲＬ−１３１）にて3,000 ｒｐ
ｍ、５分間遠心分離することで遠心上清と菌体を分離し
た。
−２Ｄ株を、ロイシン以外のアミノ酸を添加したＳＤ培
地５０ｍｌに植菌し、２６℃で３日間振盪培養して前々
培養を行なった。次に、前々培養液0.5 ｍｌを同様の組
成のＳＤ培地５０ｍｌに添加し、２６℃で３日間振盪培
養することで前培養を行なった。この菌培養液１ｍｌ
を、ビタミンとしてビオチンだけを添加した完全合成培
地およびビオチンとチアミンだけを添加した完全合成培
地それぞれ１００ｍｌに添加し、２８℃で振盪培養を行
なった。培養開始３日目、５日目、７日目にそれぞれ５
ｍｌずつサンプリングした。このサンプリング液をトミ
ー精工製冷却遠心機（ＲＬ−１３１）にて3,000 ｒｐ
ｍ、５分間遠心分離することで遠心上清と菌体を分離し
た。
【００４４】このようにして得られた菌体を、５ｍｌの
滅菌水に懸濁して洗浄後、湿菌体重量の４倍量のトリス
−温酸液（ｐＨ7.5 、0.1 Ｍ）に再度懸濁し、さらに湿
菌体重量の５倍量のガラスビーズを添加してカイザー社
製細胞破砕装置にて菌体を破砕した。この菌体破砕液１
ｍｌを、トミー精工製冷却遠心機（ＭＲＸ−１５０）に
て15,000ｒｐｍ、１０分間遠心分離した遠心上清を菌体
内酵素サンプルとして、またサンプリング液の遠心上清
を菌体外酵素サンプルとしてカルボキシペプチダーゼ酵
素活性を測定した。
滅菌水に懸濁して洗浄後、湿菌体重量の４倍量のトリス
−温酸液（ｐＨ7.5 、0.1 Ｍ）に再度懸濁し、さらに湿
菌体重量の５倍量のガラスビーズを添加してカイザー社
製細胞破砕装置にて菌体を破砕した。この菌体破砕液１
ｍｌを、トミー精工製冷却遠心機（ＭＲＸ−１５０）に
て15,000ｒｐｍ、１０分間遠心分離した遠心上清を菌体
内酵素サンプルとして、またサンプリング液の遠心上清
を菌体外酵素サンプルとしてカルボキシペプチダーゼ酵
素活性を測定した。
【００４５】ＫＳ５８−２Ｄ株、ＫＳ５８−２Ｄ株とＫ
Ｓ７７−５Ｄ株との交配株、ＳＡＮＫ50182 株（Ｐ
株）、ＫＳＭ−Ｉ６９株およびＫＫ４株を５０ｍｌのロ
イシンを含むアミノ酸を添加したＳＤ培地に植菌し、２
６℃で３日間振盪培養して前々培養を行なった。また、
プラスミドｐＣＹ３０３を有するＫＳ５８−２Ｄ株は、
ロイシン以外のアミノ酸を添加したＳＤ培地にて、２６
℃で３日間前々培養を行なった。次に、前々培養液0.5
ｍｌをそれぞれ同様の組成のＳＤ培地５０ｍｌに加え、
２６℃で３日間振盪培養し、前培養液とした。この前培
養液１ｍｌを、チアミン添加および無添加の完全合成培
地１００ｍｌにそれぞれ添加し、２８℃で７日間振盪培
養して本培養を行なった。この本培養液を用いて、菌体
外のインベルターゼ活性を測定した。
Ｓ７７−５Ｄ株との交配株、ＳＡＮＫ50182 株（Ｐ
株）、ＫＳＭ−Ｉ６９株およびＫＫ４株を５０ｍｌのロ
イシンを含むアミノ酸を添加したＳＤ培地に植菌し、２
６℃で３日間振盪培養して前々培養を行なった。また、
プラスミドｐＣＹ３０３を有するＫＳ５８−２Ｄ株は、
ロイシン以外のアミノ酸を添加したＳＤ培地にて、２６
℃で３日間前々培養を行なった。次に、前々培養液0.5
ｍｌをそれぞれ同様の組成のＳＤ培地５０ｍｌに加え、
２６℃で３日間振盪培養し、前培養液とした。この前培
養液１ｍｌを、チアミン添加および無添加の完全合成培
地１００ｍｌにそれぞれ添加し、２８℃で７日間振盪培
養して本培養を行なった。この本培養液を用いて、菌体
外のインベルターゼ活性を測定した。
【００４６】
【発明の効果】本発明により、他のビタミン類を有しな
い完全合成培地（基本培地）にチアミンを添加した培地
を用いて酵母を培養した場合、チアミンを添加しない場
合に比較して、酵母由来又は外来性の蛋白質の分泌が著
しく増大することが確認された。従って、これらの蛋白
質の分泌生産に最低限必須な培地成分が明らかとなり、
より安価な培地を使用して、酵母により蛋白質を大量に
生産することが可能になった。
い完全合成培地（基本培地）にチアミンを添加した培地
を用いて酵母を培養した場合、チアミンを添加しない場
合に比較して、酵母由来又は外来性の蛋白質の分泌が著
しく増大することが確認された。従って、これらの蛋白
質の分泌生産に最低限必須な培地成分が明らかとなり、
より安価な培地を使用して、酵母により蛋白質を大量に
生産することが可能になった。
【００４７】
配列番号：１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TGTTCCAGCT ACCATTTATT 20 配列番号：２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 ACTTAAAGTA TACATACGCT 20 配列番号：３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TGATGATACA TATGTTA 17 配列番号：４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 ATGCTTGTCC TCGTCTTCCA C 21 配列番号：５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TTTGGTTGAA CGGGGGTC 18 配列番号：６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GTTTCCAACA CTGTCGCC 18 配列番号：７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CCCTTGTTGA CGTATTCAGG G 21 配列番号：８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TGTTCCAGCT ACCATTTATT 20 配列番号：９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TCCTGATATC GTAAACGTTT 20 配列番号：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGTGATTGGA TGAAGCCTTA 20 配列番号：１１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CTTATTACCC AACCAGTT 18 配列番号：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TTCTTCGTCG TACTTCC 17 配列番号：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 ACACATACAC GCTTTATAAG G 21 配列番号：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GATAATAAAA ACGGTATGCC T 21 配列番号：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CAGCTGATTT TGTAGTTATG 20
【図１】 pCY303 プラスミドの構築図
【図２】チアミンの添加の有無による酵母菌体外に分泌
されてくるカルボキシペプチダーゼＹ量の測定図
されてくるカルボキシペプチダーゼＹ量の測定図
【図３】チアミンの添加の有無による酵母菌体外に分泌
されてくるヒト・リゾチーム量の測定図
されてくるヒト・リゾチーム量の測定図
Claims (3)
- 【請求項１】炭素源としてグルコース、シュクロース又
はマンノース 窒素源として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ト
リプトファン、ウラシル、ヒスチジン、リジン、アルギ
ニン、スレオニン、メチオニン、チロシン、フェニルア
ラニン、イソロイシン、アデニン、グルタミン酸、アス
パラギン酸、セリン又はバリン、 ビタミンとしてビオチン、 無機栄養塩類として、ほう酸、硫酸銅、ヨウ化カリウ
ム、塩化第二鉄、硫酸マンガン、モリブデン酸ナトリウ
ム、硫酸亜鉛、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム又は塩化カルシウムを含む培地中で酵母
を培養する場合において、 培地中にチアミンを含有せしめることにより酵母由来又
は外来性蛋白質を菌体外培養液に分泌させ、培養液から
該蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質の製造法。 - 【請求項２】請求項１記載の製造法において、培地中の
チアミンの濃度が少なくとも 10 μg/L 以上である製造
法。 - 【請求項３】請求項１又は２記載の製造法において、酵
母がサッカロミセス・セルビシエである製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5017132A JPH06225784A (ja) | 1993-02-04 | 1993-02-04 | 蛋白質の高分泌生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5017132A JPH06225784A (ja) | 1993-02-04 | 1993-02-04 | 蛋白質の高分泌生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06225784A true JPH06225784A (ja) | 1994-08-16 |
Family
ID=11935512
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5017132A Pending JPH06225784A (ja) | 1993-02-04 | 1993-02-04 | 蛋白質の高分泌生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06225784A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014030774A1 (ja) * | 2012-08-24 | 2014-02-27 | 国立大学法人山口大学 | 酵母用培地 |
-
1993
- 1993-02-04 JP JP5017132A patent/JPH06225784A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014030774A1 (ja) * | 2012-08-24 | 2014-02-27 | 国立大学法人山口大学 | 酵母用培地 |
| JPWO2014030774A1 (ja) * | 2012-08-24 | 2016-08-08 | 国立大学法人山口大学 | 酵母用培地 |
| US10023836B2 (en) | 2012-08-24 | 2018-07-17 | Yamaguchi University | Medium for yeasts |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040212 |