JPH0767653A - シスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、アクレモニウム・クリソゲナム由
来のシスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子を単離し、ア
クレモニウム・クリソゲナムの改良にこれを利用するこ
とを目的とする。 【構成】 シスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子を含有
するＤＮＡ断片。 【効果】 シスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子を含有
するＤＮＡ断片で形質転換することにより、シスタチオ
ニンβ−シンターゼ活性が高まったアクレモニウム・ク
リソゲナムが創製できた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アクレモニウム・クリ
ソゲナム（Acremonium chrysogenum）由来であり、シス
テイン生合成酵素の一種であるシスタチオニンβ−シン
ターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を組み
込んだ組換え体ＤＮＡで形質転換され該酵素活性が増強
されたアクレモニウム・クリソゲナムに関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床上重要なセファロスポリン系抗生物
質の出発原料であるセファロスポリンＣは、糸状菌であ
るアクレモニウム・クリソゲナムを用いた発酵法により
製造されている。従来、該菌のセファロスポリンＣ生産
能力を向上させるために用いられてきた技術は、突然変
異生成、それに続く高生産株のランダムスクリーニング
であった。しかし、近年、該菌を宿主とする形質転換系
の開発（例えば、Queener ら、Microbiology 1985. Ame
rican Society for Microbiology, (1985) 468-472）及
びセファロスポリンＣ生合成酵素遺伝子のクローニング
が相次いで行われ、優良菌株の育種に遺伝子工学的アプ
ローチを施す道が開けてきた（例えば、Skatrud ら、BI
O/TECHNOLOGY (1989)7、477）。セファロスポリンＣは、
アクレモニウム・クリソゲナムにおいて、３種のアミノ
酸（Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−リジンの生合成
中間体であるＬ−αーアミノアジピン酸）を出発原料と
して、５種類の酵素による６ステップの反応を経て生合
成される事が知られている（例えば、Martinら、Trends
in Biotechnology (1985) 3: 39-44 参照）。現在まで
に、これら生合成酵素のうち４種の酵素をコードする遺
伝子がそれぞれアクレモニウム・クリソゲナムよりクロ
ーニングされ（例えば、Samon ら、Nature (1985) 318,
191 、Samsonら、BIO/TECHNOLOGY (1987) 5,1207、Guti
erres ら、Journal of Bacteriology (1991) 173,2354-
2365、EP0450758 ）、分子育種に応用されつつある。一
方、上述の通りセファロスポリンＣは生産菌の一次代謝
産物である３種のアミノ酸を素材として合成されるの
で、これらアミノ酸の供給系を強化する事も抗生物質高
生産株創製の一戦略となりうる。これらアミノ酸の中で
システインに関しては、その生合成とセファロスポリン
Ｃ発酵との関連において比較的多くの研究が行われてき
た。S.cerevisiae（以後は単に酵母と略記する）、N.cr
assa（アカパンカビ）などと同様に、アクレモニウム・
クリソゲナムにおいてもシステインは通常２つの経路に
より生合成されると考えられている（例えば、Martin
ら、Microbiological Reviews (1980) 44,230-251 ）。
１つは、硫化水素によるｏ−アセチルセリンの硫化によ
りシステインを生成する経路であり、他の１つはメチオ
ニンの脱メチル化もしくはｏ−アセチルホモセリンの硫
化反応によって生成するホモシステインからシスタチオ
ニンを経由してシステインへ至る経路である。そしてア
クレモニウム・クリソゲナムにおけるセファロスポリン
Ｃの発酵生産においては後者即ち、シスタチオニンを経
由する逆硫黄転移経路が重要な役割を担っている事が明
かとなっている（例えば、Treichler et al.(1979) Gen
etics of industrial microorganisms. Proceedings of
the Third International Symposium on Genetics of
Industrial Microorganisms. American Society for Mi
crobiology, Washington,D.C., 97-104 ）。従って逆硫
黄転移経路に関与する２種の酵素（シスタチオニンγ−
リアーゼ、シスタチオニンβ−シンターゼ）の遺伝子は
先述のセファロスポリンＣ生合成遺伝子と同様にセファ
ロスポリンＣ生産菌の分子育種に有益な手段を提供する
と考えられる。最近本発明者らは、アクレモニウム・ク
リソゲナムよりシスタチオニンγ−リアーゼ遺伝子をク
ローン化し、それを利用する事により該酵素活性が高ま
ったアクレモニウム・クリソゲナム株を創製する事に成
功した（特願平５ー１０１８８２）。しかし、本菌由来
のシスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子は未だ単離同定
されていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、アクレモニ
ウム・クリソゲナム由来であり、逆硫黄転移経路に関与
する酵素の１種であるシスタチオニンβ−シンターゼの
遺伝子を単離し、アクレモニウム・クリソゲナムの改良
に、これを利用する事を目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、まずシス
タチオニンβ−シンターゼ遺伝子に変異を有する酵母の
相補性を利用して、アクレモニウム・クリソゲナムのcD
NAライブラリーよりシスタチオニンβ−シンターゼをコ
ードするcDNAを単離した。次いで該cDNAをプローブとし
て使用し、アクレモニウム・クリソゲナム遺伝子ライブ
ラリーよりシスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子を含有
するＤＮＡ断片を単離し、その塩基配列を一部（コード
領域全体と非コード領域の一部）決定した。更に、該Ｄ
ＮＡ断片をベクターに組み込んだ組換え体ＤＮＡを導入
したアクレモニウム・クリソゲナムのシスタチオニンβ
−シンターゼ活性が親株（非導入株）に比べ、上昇して
いる事を見いだした。本発明者らは、これらの知見に基
づき本発明を完成するに至った。

【０００５】即ち本発明は、 (1) アクレモニウム・クリソゲナム由来のシスタチオニ
ンβ−シンターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片 (2) 配列表（配列番号１）に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質をコードする遺伝子を含む(1) 記載のＤＮＡ
断片 (3) 第１図に示す制限酵素地図により規定される(1) ま
たは(2) 記載のＤＮＡ断片 (4) 第１図におけるＳｔｕＩ−ＳａｃＩ間の塩基配
列が配列表（配列番号２）で示される(1) (2) または
(3) 記載のＤＮＡ断片 (5) (1) (2) (3) または(4) 記載のＤＮＡ断片全体もし
くはその一部をベクターに組み込んだ組換え体ＤＮＡ (6) (5) 記載の組換え体ＤＮＡで形質転換されたアクレ
モニウム・クリソゲナム、に関する。 また、上記の通り本発明者らは、先ずアクレモニウム・
クリソゲナム由来のシスタチオニンβ−シンターゼをコ
ードするｃＤＮＡを単離し、これを本発明ＤＮＡ断片を
得る為のプローブとして使用した。該ｃＤＮＡの塩基配
列をそれによってコードされるアミノ酸配列と共に配列
表（配列番号１）に示した。これらｃＤＮＡ化合物もア
クレモニウム・クリソゲナム内で機能するプロモ−タ−
断片（例えば、特開平４ー５８８９１）と連結させる事
により、染色体ＤＮＡ断片と同様、アクレモニウム・ク
リソゲナムの改良に利用できると考えられる。従って、
配列表（配列番号１）に示すＤＮＡ断片のような、染色
体ＤＮＡ断片から転写されるＲＮＡに由来するｃＤＮＡ
化合物群も本発明に包含される。本発明に係るＤＮＡ断
片は大略下記の工程によって造成する事ができる。 (1) アクレモニウム・クリソゲナムから染色体ＤＮＡを
抽出し、適当な制限酵素（例えば,MboI 等）で部分分解
する。 (2)(1)で得られたＤＮＡ断片を適当なベクターに組み込
み、アクレモニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮＡライ
ブラリーを構築する。 (3) アクレモニウム・クリソゲナム由来のβ−シンター
ゼｃＤＮＡあるいは既に単離され、構造が明かとなって
いる他種生物由来のシスタチオニンβ−シンターゼ遺伝
子コード域の少なくとも一部を含有するＤＮＡあるいは
ｃＤＮＡ断片を取得する。 (4)(3)で得たＤＮＡプロ−ブをラベルし、(2) で得られ
たライブラリーとハイブリダイゼーションを行なわせ、
該プローブと相同性を示すクローンを選択分離する。 (5)(4)で選択したクローンよりＤＮＡを抽出し、同上の
プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行
い、適当なサイズの制限酵素断片上に目的の遺伝子を位
置づけ、それをプラスミドベクターにサブクローンす
る。 (6) かくして得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、
他種生物由来の相応する遺伝子構造及びそれより翻訳さ
れるアミノ酸配列との比較等によりシスタチオニンβ−
シンターゼ遺伝子の存在を確認し、そのコード領域の位
置づけを行う。 (7) シスタチオニンβ−シンターゼの全コード領域を含
むＤＮＡ断片（該遺伝子のプロモ−タ−、タ−ミネ−タ
−等の領域も含む事が推定される断片）をアクレモニウ
ム・クリソゲナム形質転換用ベクターに組み込んで、組
換え体ＤＮＡを作製する。 (7) 上記組換え体ＤＮＡを用いて、アクレモニウム・ク
リソゲナムを形質転換する。 (8)(7)により得られた形質転換体のシスタチオニンβ−
シンターゼ活性を測定し、本発明ＤＮＡ断片の導入効果
を確認する。 上記の工程中でＤＮＡ，組換え体宿主としての大腸菌の
取扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われ
ているものであり、例えば Maniatis らの実験操作書
( T.Maniatis et al., Molecular Cloning A Laborator
y Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982, 1989
) に従えば容易に実施できる。また、組換え体宿主と
しての酵母の取扱いに必要な一般的操作も例えば、Sher
man らの実験（F.Sherman et al., Laboratory Course
Manual for Methods in Yeast Genetics. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1986）に
従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類もすべ
て市販の製品を用いることができ、特に断わらない限
り、製品で指定されている使用条件に従えば、完全にそ
れらの目的を達成することができる。上記(1) におい
て、ＤＮＡ抽出源としては、アクレモニウム・クリソゲ
ナムATCC11550 、アクレモニウム・クリソゲナムIS-5等
の菌株が使用できる。なお、アクレモニウム・クリソゲ
ナムIS-5株は、平成２年２月５日付けで通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第11232 号の
寄託番号で寄託されている。また、該菌からの全ＤＮＡ
抽出は、例えば、Johnstone ら（Johnstone et al., EM
BO Journal(1985)4 1307-1311 ）の方法、もしくは、Mi
nuthら（Minuth et al., Current Genetics(1982)5: 22
7-231 ）の方法に準じて行うことができる。上記(2) に
おけるベクターとしては、例えば、EMBL3,EMBL4 （STRA
TAGENE社）等のラムダファージベクターもしくは、pHC7
9（Bethesda Rese arch Laboratories ＜BRL ＞社）等
のコスミドベクターを使用する事ができる。上記(3) に
おいてアクレモニウム・クリソゲナム由来のβ−シンタ
ーゼｃＤＮＡを単離する方法としては例えば酵母変異株
の機能相補を利用するクローニング方法（例えば、Davi
d らがヒトのプリン生合成に関与するｃＤＮＡを単離す
るのに用いた方法 David et al., Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 87 (1990) 2916-2920）等を採用する事ができ
る。その際必要となる酵母宿主としては例えばJW1-2C株
（YEAST GENETIC STOCK CENTER、この株はβ−シンター
ゼ遺伝子、セリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝
子のいずれにも変異を有しており、その結果システイン
要求性を示す事が明かとなっている。（Ono et al.,Jou
rnalof Bacteriology 170 (1988) 5883-5889 ）及び本
株との遺伝的掛け合わせにより得られる種々の誘導株を
使用する事ができる。更に酵母β−シンターゼ遺伝子
（例えば、Ono et al. Curr Genet (1992) 21,285-289
）を利用して遺伝子破壊を行う事により当該遺伝子欠
損株（最近、実験室で使用されている多くの酵母はセリ
ンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性を欠いており、
該酵母のシステイン合成は逆硫黄転移経路のみに依存し
ている事が明かとなった（Cherest ら、Genetics 130
(1992)51-58）。従ってこれらの株でシスタチオニンβ
−シンターゼ遺伝子の破壊を行えば、破壊株はシステイ
ン要求性を示す）を作製し、それをクローニング宿主と
して使用する事もできる。即ちこれら宿主の機能を相補
（システイン要求性を回復させる）するアクレモニウム
・クリソゲナム由来のｃＤＮＡを単離する事により目的
を達成する事ができる。尚、酵母発現用ｃＤＮＡクロー
ニングベクターとしては例えばｐＹＥＳ２（インビトロ
ジェン社）等を使用する事ができる。また、アクレモニ
ウム・クリソゲナムからのＲＮＡの抽出は、例えばＥＰ
−０４５０７５８記載の方法に準じて行う事ができる。
更に、該ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成、酵母発現ｃＤＮ
Ａライブラリーの構築、該ライブラリーの所望の酵母宿
主への導入等の操作も上記David らの方法に準じて実施
する事ができる。上記(3) における他種生物由来のシス
タチオニンβ−シンターゼ遺伝子としては例えばラット
由来のシスタチオニンβ−シンターゼｃＤＮＡ（Swaroo
p ら、J.Biol.Chem. (1992)267, 11455ー11461 ）が挙げ
られる。該遺伝子は上記文献に記載された方法、もしく
は既に明かとなっている塩基配列に相当するＤＮＡオリ
ゴマーを合成し、該オリゴマーをプローブとしてラット
由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする事に
より容易に取得できる。また、ＲＴＰＣＲ法によりラッ
トのｍ−ＲＮＡから直接クローン化する事も可能であ
る。(4) におけるラベル化は、従来から汎用されている
放射性同位元素あるいはジゴキシゲニン、ビオチン等の
非放射性化合物のいずれも使用可能である。(6) におけ
る既知のシスタチオニンβ−シンターゼのアミノ酸配列
としては上記ラット由来のもの、あるいは酵母由来の配
列（Tezukaら、ASBC(American Society of Brewing Che
mists)Journal(1992)50,130-133 ）等が利用できる。上
記(7) におけるアクレモニウム・クリソゲナム形質転換
用ベクターとしては、例えば、pPGKM5,pACTHY83 等（特
開平４ー５８８９１）を使用する事ができる。また(7)
におけるアクレモニウム・クリソゲナムの形質転換は、
例えば、Queener らの方法（Queener et al:Microbiolo
gy 1985, American Society for Microbiology (1985)
p468-472）に準じて実施する事ができる。上記(8) にお
けるシスタチオニンβ−シンターゼ活性の測定は、例え
ば、Kraus が記載した方法（Jan P. Kraus, Methods in
ENZYMOLOGY 143 (1987) 388-394）に準じて実施する事
ができる。以下、実施例により本発明を詳述するが、本
発明は、該実施例によって限定されるものではない。
尚、実施例、参考例に記載の略称ないし略号は、以下の
通りのものである。

【０００６】マニアテイ スの実験書：(T.Maniatis et a
l.,Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spr
ing Harbor Laboratory 1982 ) Ｎ−３シード培地：コーンスティープリカー４０ｇ／ビ
ート２０ｇ／酢酸アンモニウム２ｇ／スイトース４０ｇ
を水１リットルに溶解したもの。 メイン培地：ビート３０ｇ／脱脂大豆４０ｇ／コーンス
ティープリカー１０ｇ／酢酸アンモニウム５ｇ／硫酸ア
ンモニウム７ｇ／硫酸カルシウム８ｇ／炭酸カルシウム
１５ｇ／スイトース６０ｇ／メチルオレイト４１．５を
水１リットルに含むもの。 ＣＭ培地：ショ糖２０ｇ／リン酸二水素カリウム０．５
ｇ／リン酸水素二カリウム０．５ｇ／塩化カリウム０．
５ｇ／硫酸マグネシウム（７水塩）０．５ｇ／硫酸鉄
（ＩＩ）（７水塩）０．０１ｇ／硝酸ナトリウム３ｇ／
イーストエキストラクト４ｇ／ペプトン１０ｇを水１リ
ットルに溶解したもの。 ＣＭ固形培地：１．５％の寒天を含有するＣＭ培地。 ＧＡＧ培地：グリセロール４０ｇ／アスパラギン４ｇ／
塩化カルシウム０．１ｇ／塩化ナトリウム０．１ｇ／微
量金属溶液[ 硫酸マグネシウム（７水塩）４ｇ／硫酸鉄
（ＩＩ）（７水塩）０．４ｇ／硫酸マンガン（４水塩）
０．１６ｇ／硫酸亜鉛（７水塩）０．４ｇ／無水硫酸銅
０．０４ｇを水１リットルに溶解したもの] ２５ミリリ
ットル／０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）３０
ミリリットルを水１リットルに含有する培地。 Ｐ−バッファー：０．６Ｍ塩化カリウム／０．０１Ｍ塩
化マグネシウム／０．０２５Ｍ塩化カルシウム ＰＥＧ溶液：２５％ポリエチレングリコール（〜４００
０）／０．０１Ｍトリス（ｐＨ８．０）／０．０５Ｍ塩
化カルシウム／０．６Ｍ塩化カリウム。 ６×ＳＳＣ：０．９Ｍ塩化ナトリウム／９０ｍＭクエン
酸ナトリウム。 ２０×ＳＳＰＥ：塩化ナトリウム２１０ｇ／リン酸二水
素ナトリウム（２水塩）３１．２ｇ／０．５Ｍ ＥＤＴ
Ａ ４０ミリリットルを水１リットルに溶解したもの。 ＳＣ−Ｈｉｓ培地：アミノ酸を欠くイーストニトロジェ
ンベース（BACTO YEASTNITROGEN BASE w/o AMINO ACIDS
:DIFCO）６. ７ｇ／ぶどう糖２０ｇ／ウラシル０. ０
２ｇ／リジン塩酸塩０. ０３ｇ／アデニン硫酸塩０. ０
２ｇ／トリプトファン０. ０２ｇ／ロイシン０. ０３ｇ
／システイン塩酸塩０. ０４ｇ／寒天（BACTO-AGAR:DIF
CO）２０ｇを水１リットルに溶解し、調製した固形培
地。 ＳＣ−Ｕｒａ培地：上記ＳＣ−Ｈｉｓ培地からウラシル
を除き、０. ０２ｇのヒスチジン塩酸塩を加えた培地。 ＳＣ−ＨｉｓーＣｙｓ培地：上記ＳＣ−Ｈｉｓ培地から
システインを除いた培地。 ＳＣ−Ｕｒａ−Ｃｙｓ培地：上記ＳＣ−Ｕｒａ培地から
システインを除いた培地。 ＣＢＳバッファー：１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．
５）／１００μＭピリドキサールリン酸／１ｍＭジチオ
スレイトール。 また、以下の実施例において、特に断わらない限り、制
限酵素消化により生ずるＤＮＡ断片のアガロースゲルか
らの分離精製はジーンクリーン（GENE CLEAN^TMフナコシ
社販）を用いてその添付プロトコールに従って行い、サ
ブクローニング、プラスミド構築等における基本操作
（ＤＮＡ断片間の連結反応、該反応により生ずるハイブ
リッドプラスミドによる大腸菌の形質転換、得られた形
質転換体からのプラスミドの調製及びその解析等）はす
べて上記マニアティスの実験書に準じて行った。

【０００７】

【実施例】

【０００８】

【実施例１】 シスタチオニンβ−シンターゼｃＤＮＡ
の単離 ａ．アクレモニウム・クリソゲナムのポリＡ⁺ ＲＮＡ抽
出 ＣＭ固形培地上３０℃、３日間生育させたアクレモニウ
ム・クリソゲナムIS-5の菌糸体をＮ３シード培地５０ミ
リリットルに接種し、２５℃で３日間培養した。得られ
た培養液１ミリリットルをメイン培地３０ミリリットル
を含む５００ミリリットルのフラスコに移植し、２５℃
で３日間培養した。該菌液１０ミリリットルから吸引濾
過により集めた菌糸体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢と
乳棒を用いてすりつぶした。かくして得られた菌破砕粉
末から TOTAL RNA ISOLATION KIT（インビトロジェン
社）を用いて、その添付プロトコールに従って全ＲＮＡ
８００μｇを抽出した。次いでこの全ＲＮＡからマニア
ティスの実験書に従って、オリゴ（ｄＴ）セルロースク
ロマトグラフィー操作を行う事によりポリＡ⁺ ＲＮＡ２
７μｇを得た。 ｂ．ｃＤＮＡライブラリーの作製 ｃＤＮＡ合成システム（ベーリンガー）を用い、そのプ
ロトコールに従って上記ａ．で得たポリＡ⁺ ＲＮＡ（４
μｇ）から１本鎖ＤＮＡ、次いで２本鎖ｃＤＮＡを合成
した。次ぎに該ｃＤＮＡの末端にＢｓｔＸＩアダプター
（インビトロジェン社）をＴ４リガーゼの作用により付
着させた後、１．１％アガロースゲル電気泳動（ＬＭＰ
−Ａｇａｒｏｓｅ：ＢＲＬ）に供し、１Ｋｂ以上のサイ
ズを示したｃＤＮＡ画分をゲルから抽出精製した。次い
で、該ｃＤＮＡと、ＢｓｔＸＩで消化後 Size Select 4
00 Spun Columns （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製
した酵母発現用ベクターｐＹＡＣＴＢＸ−Ｉ（５００ｎ
ｇ）とをＴ４リガーゼで連結させた。かくして得られた
反応物を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（ＳＴＲＡＴＡＧＥ
ＮＥ社のＥＰＩＣＵＲＩＡＮ ＣＯＬＩ ＸＬ１−ＢＬ
ＵＥを使用）に導入する事により、約２×１０⁵ 個のク
ローンからなるアクレモニウム・クリソゲナムIS-5株由
来の酵母発現用ｃＤＮＡライブラリーを取得した。尚上
記工程において、アガロースゲルからのｃＤＮＡの回
収、精製はゲラーゼ（ＧＥＬａｓｅ^TM：ＥＰＩＣＥＮＴ
ＲＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を使用し、その添付
プロトコール通りに行った。また、酵母発現用ベクター
として使用したｐＹＡＣＴＢＸ−Ｉは大腸菌と酵母のシ
ャトルベクターであり、酵母での選択マーカーとしてＵ
ｒａ３遺伝子、大腸菌での選択マーカーとしてアンピシ
リン耐性遺伝子を有している。更に酵母アクチン遺伝子
プロモ−タ−、Ｔｒｐ５遺伝子タ−ミネ−タ−がＢｓｔ
ＸＩ部位（上記ｃＤＮＡのクローニング部位）を介して
つながった酵母内での発現カセットも所有している。本
プラスミドの構築は以下の通り実施した。先ずｐＹＥＳ
２（インビトロジェン社）のＸｂａＩ部位を DNA Blunt
ing Kit （宝酒造）とＳｍａＩリンカー（ｄ（ｐＣＣＣ
ＧＧＧ）：宝酒造）を使用する事によりＳｍａＩ部位に
変換して得たプラスミドから２個のＢｓｔＸＩ部位（・
・・ＣＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧ・・・ＣＣＡＧＣＡＣＡ
ＣＴＧＧ・）を含むポリリンカー領域を約８０ｂｐのＢ
ａｍＨＩーＳｍａＩ断片として調製し（該断片のアガロ
ースゲルからの回収、精製は、バイオ１０１社のＭＥＲ
ＭＡＩＤキットを使用し、その添付プロトコールに従っ
て行った）、該断片をｐＹＡＣＴ３［Matsuda etal. Bi
ochem.Biophys.Res.Commun (1992)182,995-1001］上の
酵母アクチン遺伝子プロモ−タ−、ＴＲＰ５遺伝子タ−
ミネ−タ−の連結部分に位置するＢａｍＨＩーＳｍａＩ
間に挿入する事によってｐＢＸ−Ｉを得た。一方、ＹＥ
ｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）のＰｖｕＩＩ部位にＳａ
ｃＩリンカー（ｄ（ｐＣＧＡＧＣＴＣＧ）：ＮＥＢ社）
を挿入する事により得たプラスミドをＳａｃＩで完全分
解、ＳｔｕＩで部分分解し、酵母Ｕｒａ３遺伝子全体を
含む約１. ２Ｋｂの断片を分離精製した。次いで、該断
片と酵母Ｔｒｐ１遺伝子全体を含むｐＢＸ−Ｉ上のＳａ
ｃＩーＳｔｕＩ断片（約８５０ｂｐ）とを置換する事に
より、ｐＹＡＣＴＢＸ−Ｉを得た。 ｃ. β−シンターゼ欠損酵母株の構築 酵母ＹＰＨ５００株（a ura3-52,lys2-801,ade2-101,tr
p1Δ63,his3 Δ200,leu2Δ1 ）のβ−シンターゼ遺伝子
（ＣＹＳ４遺伝子）を破壊する事によって、クローニン
グ宿主として使用するＹＰＨΔＣＹＳ４株（a ura3-52,
lys2-801,ade2-101,trp1Δ63,his3 Δ200,leu2Δ,HIS
3::CYS4 ）を構築した。以下に遺伝子破壊の工程を説明
する。 ｃー1：破壊プラスミドｐΔＣＹＳ４の造成；下記の工程
に従って酵母ＣＹＳ４遺伝子を破壊する為のプラスミド
ｐΔＣＹＳ４を構築した。先ずプラスミドｐ７６（パン
酵母由来のシスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子全体を
含む約７. ６ＫｂのＢａｍＨＩ断片をｐＢＲ３２２のＢ
ａｍＨＩ部位に担うプラスミド：Ono et al. Curr Gene
t(1992)21,285-289;岡山大学、小野助教授より入手）を
ＢａｍＨＩで切断し、ＣＹＳ４遺伝子を含む７. ６Ｋｂ
の断片を分離精製した。該断片と、ＢａｍＨＩで切断
し、アルカリホスファターゼ処理を施したｐＵＣ１１８
（宝酒造）とをＴ４リガーゼで連結する事によりｐＵＣ
ＹＳ４を得た。次いでｐＵＣＹＳ４から約３ＫｂのＳａ
ｌＩ断片を欠失させる事によりｐＵＣＹＳ４△Ｓを取得
した。一方プラスミドＹＥｐ６（ＡＴＣＣ３７０６２）
をＢａｍＨＩで切断し、酵母ＨＩＳ３遺伝子全体を含む
１. ７Ｋｂの断片を分離精製した。次いで該断片と、Ｂ
ｇｌＩＩ（この制限酵素認識部位はｐＵＣＹＳ４△Ｓ上
のＣＹＳ４遺伝子コード領域内に１箇所のみ存在す
る。）で切断し、アルカリホスファターゼ処理を施した
上記ｐＵＣＹＳ４△ＳとをＴ４リガーゼで連結する事に
よりｐΔＣＹＳ４を得た。 ｃ-2：ｐΔＣＹＳ４による形質転換；ＰｖｕＩＩで消化
した上記ｐΔＣＹＳ４を酢酸リチウム法（Ito et al.,
J.Bacteriol(1983)153, 163-168 ）にてＹＰＨ５００株
（フナコシ社販）に導入し、ＳＣ−Ｈｉｓ培地で形質転
換体を選択した。かくして得られた形質転換株の１つを
ＹＰＨ−ΔＣＹＳ４株と名付け、そのβ−シンターゼ活
性を Onoらの方法（Ono et al., J.Bacteriol(1988)17
0,5883-5889）に従って測定した。その結果、この株で
は該活性が失われている事が明かとなった。又、ＹＰＨ
−ΔＣＹＳ４株はＳＣ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ培地で生育不能
である事即ちシステイン要求性を示す事も明かとなっ
た。更に該破壊株及びその親株であるＹＰＨ５００よ
り、Davis らの方法［Davis,R.W.et al Method in Enzy
mology (1980)65:404-411 ］に従って染色体ＤＮＡを抽
出し、サザン解析を行った。その結果ＹＰＨ−ΔＣＹＳ
４株では染色体の正常なＣＹＳ４遺伝子とｐΔＣＹＳ４
上の破壊された遺伝子とが２重交叉により置換されてい
る事が確認された。 ｄ. ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 上記ｂで得たｃＤＮＡライブラリーの約１０⁵ クローン
よりプラスミドを調製し、その２０μｇを上記ｃで得た
ＹＰＨ−ΔＣＹＳ４株に上記ｃ−２と同様の方法で導入
したところＳＣ−Ｕｒａ−Ｃｙｓ培地で生育しうる形質
転換体が一株見いだされた。そこで先ず、該形質転換体
の酵素活性を調べてみた。その結果本株では、シスタチ
オニンβ−シンターゼ活性が回復している事が明かとな
った。次に本株より上記Davis らの方法によりＤＮＡを
抽出し、大腸菌ＤＨ−５α（東洋紡社販）に導入した。
そして、得られた組換え体（大腸菌）よりプラスミドを
調製しそれをｐＣＡＣＹＳ４と命名した。ｐＣＡＣＹＳ
４を用いて上記ＹＰＨ−ΔＣＹＳ４株の形質転換実験を
実施したところ、本プラスミド導入株（ＳＣ−Ｕｒａ培
地に出現したコロニー）はすべてＳＣ−Ｕｒａ−Ｃｙｓ
培地に生育しうる事即ちシステイン要求性を失っている
事が確認された。 ｅ. ｃＤＮＡの構造解析 ｐＣＡＣＹＳ４を数種の制限酵素で消化し、アガロース
ゲル電気泳動で解析したところ、本プラスミドはＢａｍ
ＨＩとＳｍａＩとの同時消化により切り出される約１.
８ＫｂのｃＤＮＡインサートを有する事が判明した。そ
こでこのインサートの全塩基配列を、サンガーらの方法
（Proc.Nat.Acad.Sci.USA(1977)74,5463-）に基づき決
定した。塩基配列決定の具体的実験手技は、タカラのシ
ークエンシングキット（宝酒造販）を用いて、その添付
プロトコールに従って行った。かくして決定された１７
７８ｂｐのＤＮＡ塩基配列を配列表（配列番号１）に示
す。本ＤＮＡ配列には、６９番目に始まるＡＴＧから１
６２８番目で終わるＴＡＡまで、５１９個のアミノ酸を
コードしうるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
が存在していた。該ＯＲＦから翻訳したアミノ酸配列を
配列表（配列番号１）の塩基配列の下段に示した。尚、
コンピュータ検索の結果、本アミノ酸配列はラット由来
のシスタチオニンβ−シンターゼの配列と高い相同性を
示す事が明かとなった。

【０００９】

【実施例２】 シスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子の
単離 ａ．アクレモニウム・クリソゲナムの遺伝子ライブラリ
ー作製 アクレモニウム・クリソゲナムＩＳ−５株（微工研菌寄
第１１２３２号）の全ＤＮＡをジョンストン（I.L.John
stone ）らがアスペルギルス・ニデュランスについて用
いた方法（文献：EMBO J.(1985)4,1307-1311）に準じて
抽出した。そしてこの全ＤＮＡ６０μｇをＭｂｏＩで部
分消化し、次いでアルカリホスファターゼで処理した。
一方ラムダベクターＥＭＢＬ３（プロメガバイオテック
社）１０μｇをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで完全に消化
し、イソプロパノ−ル沈澱により、短いＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩリンカー部分を除去した。次いで上記部分消化
ＤＮＡ断片を連結せしめ、ラムダファージ粒子内へ封入
した。こうして得た組換えファージ懸濁液を適当に希釈
し、エシェリシア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＭ５３９
（プロメガバイオテック社）に感染させ、出現するプラ
ーク数を計測した。その結果この懸濁液は、３×１０⁵
個の組換えファージを含有する事が判明した。このファ
−ジ液をアクレモニウム・クリソゲナムの遺伝子ライブ
ラリーとし、４℃に保存した。尚、上述の供与体ＤＮＡ
及びベクターの調製、そして両者の結合等に関する詳細
な方法、条件はフリッシャオフ（Frischauf ）らが記載
したものを採用した。（文献：ジャーナル・オブ・モレ
キュラーバイオロジー(J.Mol.Biol)（１９８３）１７
０、８２７−８４２）。またＤＮＡのラムダ粒子内への
封入は、プロメガバイオテック社のパッケイジングエク
ストラクトを用い、それに添付されたプロトコールに従
って行った。 ｂ．プローブの調製 実施例１で得たｐＣＡＣＹＳ４をＢａｍＨＩとＳｍａＩ
で同時切断し１. ８ＫｂのＤＮＡ断片（アクレモニウム
・クリソゲナム由来のシスタチオニンβ−シンターゼｃ
ＤＮＡ断片）を分離精製した。次いで該断片２００ｎｇ
をノンラジオシステムＤＮＡ標識システム（DNA Labeli
ng Kit:Boehringer ）を用い、それに付属するプロトコ
ールに従って、ジゴキシゲニン標識デオキシウリジン３
リン酸（ＤＩＧ−ｄＵＴＰ）で標識した。以後、このプ
ローブをＣＹＳ４−プローブと称する。 ｃ．ハイブリダイゼーションによるスクリーニング ａで得られたファージ液（ＤＮＡライブラリー）の一部
をＮＭ５３９に感染させ、３枚のプレート上に計６×１
０³ 個のプラークを形成させた。これらプラークをフィ
ルター（Hybond-N:Amersham ）に転写し、アルカリ変
性、中和処理を行い、ＵＶ−照射でＤＮＡを固定した
後、上記ｂで得たＣＹＳ４−プローブとハイブリダイゼ
ーションさせた。ハイブリダイゼーションは、５０％ホ
ルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２％ＳＤＳ、２％ブロ
ッキング剤（Blocking Reagent:Boehringer ）、０．１
％Ｎ−ラウロイルザルコシン及び終濃度１０ｎｇ／ｍｌ
でＣＹＳ４プローブ（１００℃で５分間の熱変性処理後
に添加した）を含有する溶液を用いて、４２℃で１５時
間行った。次いで、フィルターを０．１％のＳＤＳを含
む２×ＳＳＣ溶液中、室温で１０分間ずつ２回洗浄し、
さらに０．１％のＳＤＳを含む０. １×ＳＳＣ溶液中６
５℃で１５分間ずつ２回洗浄した。次いでアルカリホス
ファターゼ標識された抗ジゴキシゲニン抗体及び発光基
質ＡＭＰＰＤを利用した検出キット（DIG Luminescent
Detection Kit:Boehringer）を使用し、その添付プロト
コールに従って、ＣＹＳ４プローブとハイブリダイズし
たクローンの検出を行った。その結果４個の陽性スポッ
トが見い出された。そこで、これら陽性スポットに相応
する寒天領域よりファージを抽出し、再度上記の工程に
従ってプラークハイブリダイゼーションを行い、４個の
純化ポジティブファ−ジクロ−ンを得た。これらのクロ
−ンをそれぞれλ−ＣＢＳ１，２，３，４と命名した。 ｄ．シスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子のサブクロー
ニング及びその位置の限定 ｃで得たファージクローン５種より、グロスバーガー
（Grossberger ）記載の方法（文献：Nucleic Acids. R
esearch (1987)15,6737 ）に従ってＤＮＡを抽出した。
次いでこのラムダＤＮＡをＢａｍＨＩで消化して、アガ
ロースゲル電気泳動を行った後、ＣＹＳ４−プローブを
用いてサザンハイブリダイゼーション（方法については
文献：サザン(Southern),(J.Mol.Biol.)(1975)98,503-5
17）を行った。尚、ハイブリダイゼーション、フィルタ
ー（ハイボンドＮ）の洗浄、シグナルの検出等の操作
は、上記ｃに記載したものと同様に行った。その結果、
上記クローンλ−ＣＢＳ１，２，４に共通に存在する約
６. ３ＫｂのＢａｍＨＩ断片が該プローブとハイブリダ
イズする事が判明した。また、アクレモニウム・クリソ
ゲナムIS-5由来の染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、
同上のサザン解析を行ったところ、この場合も約６. ３
Ｋｂの断片にのみハイブリダイゼーションシグナルが観
察された。そこでクローンλ−ＣＢＳ１由来のＤＮＡを
ＢａｍＨＩで切断後、該６. ３Ｋｂの断片を分離精製
し、ｐＵＣ１１８（宝酒造販）のＢａｍＨＩ部位にサブ
クローニングする事によって、ｐＧＣＹＳ４を取得し
た。尚、ｐＧＣＹＳ４をＢａｍＨＩで切断した後、再度
同上のサザン解析を行い、該プラスミドが所望のインサ
ートを担っているという事を確認した。次に、ｐＧＣＹ
Ｓ４を種々の制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳
動により解析した結果、第１図で示される６. ３Ｋｂイ
ンサートの制限酵素地図が得られた。次いでこの断片中
に存在するシスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子コード
領域を限定するために、種々の制限酵素によるｐＧＣＹ
Ｓ４の消化断片とＣＹＳ４−プローブ間で、再度サザン
ハイブリダイゼーション実験を行った。その結果、該イ
ンサートのほぼ中央に位置する約３. ５ＫｂのＳｔｕＩ
−ＳａｃＩ断片内にシスタチオニンβ−シンターゼ
遺伝子が存在している事が明かとなった。 ｅ．シスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子の塩基配列 上記ＳｔｕＩ−ＳａｃＩ断片の全塩基配列をサンガ
ーらの方法に基づき決定した。そして、該塩基配列と実
施例１で決定したシスタチオニンβ−シンターゼｃＤＮ
Ａの塩基配列とを比較解析した。その結果、該ＳｔｕＩ
−ＳａｃＩ断片はアクレモニウム・クリソゲナム由
来のシスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子の全コード領
域（該コード領域の配列は、１個のイントロンによって
分断されている事を除き、ｃＤＮＡのそれと完全に一致
していた。）をすべて含んでいる事が明かとなった。な
お決定した３４９４ｂｐの配列を予想される翻訳産物と
ともに配列表（配列番号２）に示した。

【００１０】

【実施例３】 ｐＴＣＹＳ４の構築 第２図に示す工程に従って、シスタチオニンβ−シンタ
ーゼ遺伝子の付加コピ−をアクレモニウム・クリソゲナ
ムに導入する為のプラスミドｐＴＣＹＳ４を構築した。
以下に該工程を説明する。まず実施例２で得たプラスミ
ドｐＧＣＹＳ４をＸｂａＩとＳｐｅＩで二重切断した
後、アガロースゲル電気泳動に供し、シスタチオニンβ
−シンターゼ遺伝子の全コード領域を含む約４．２Ｋｂ
の断片をゲルから回収、精製した。一方、ｐＡＣＴＨＹ
８３をＸｂａＩで切断しハイグロマイシンＢホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子発現単位を含有する約５．８Ｋｂ
断片のベクターを分離精製した。次いでこの両者をＴ４
−リガーゼで連結する事によりｐＴＣＹＳ４を得た。
尚、本実施例において使用したプラスミドｐＡＣＴＨＹ
８３は、アクレモニウム・クリソゲナム内で機能しうる
ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ発現単位
（アクレモニウム・クリソゲナム由来アクチン遺伝子の
プロモーター及びターミネーター、細菌由来のハイグロ
マイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子が発現に好
適な配置で結合した発現単位）を有するアクレモニウム
・クリソゲナム形質転換用ベクターであり、その造成法
は、特開平４−５８８９１に記載されている。

【００１１】

【実施例４】 ｐＴＣＹＳ４によるアクレモニウム・ク
リソゲナムの形質転換 ｐＴＣＹＳ４をアクレモニウム・クリソゲナムＩＳ−５
株に導入することにより、シスタチオニンβ−シンター
ゼ合成能が強化された形質転換体を取得した。以下にそ
の詳細を説明する。 ａ．プロトプラストの調製 ＣＭ固形培地上で３０℃、５日間生育させたアクレモニ
ウム・クリソゲナムＩＳ−５の菌糸体をＣＭ培地５０ミ
リリットルに接種し、回転式振とう機（２５０ｒ. ｐ.
ｍ）上、３０℃で３日間培養した。更に該菌液１ミリリ
ットルを５０ミリリットルのＧＡＧ培地に接種して、３
０℃で２０時間培養した。得られた培養液５０ミリリッ
トルを３５００ｒ. ｐ. ｍで１０分間遠心し、菌糸体を
沈澱させた後、０．９％のＮａＣｌ溶液で洗浄し、０．
０１Ｍジチオスレイトールを含んだマクイルベイン緩衝
液（０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍリン酸ナトリウム、 ｐ
Ｈ７．３）２０ミリリットルに懸濁し、３０℃で１時間
おだやかに振とうした。次いで菌糸体を３２００ｒ.
ｐ. ｍ、１０分間の遠心で沈澱させ、Ｐ−バッファーで
洗浄した後、ノボザイム（Ｎｏｖｏ社）を１０ｍｇ／ミ
リリットルの濃度で含有するＰ−バッファー１０ミリリ
ットルに懸濁し、３０℃で１時間おだやかに振とうし
た。該反応液を８００ｒ. ｐ. ｍで３０秒間遠心して得
た上清を、濾紙（ＴＯＹＯ ＦＩＬＴＥＲ ＰＡＰＥＲ
５Ａ）を用いて濾過する事により、菌糸体とプロトプ
ラストを分離した。次いで該濾液を３０００ｒ. ｐ. ｍ
で５分間遠心し、プロトプラストを沈澱させた後、Ｐ−
バッファーで１回洗浄し、プロトプラストが３×１０⁸
個／ミリリットルの濃度となるようにＰ−バッファーに
懸濁した。 ｂ．ｐＴＣＹＳ４によるプロトプラスト形質転換 上記ａで得られたプロトプラスト懸濁液０．１ミリリッ
トルに、ｐＴＣＹＳ４を５μｇ（１０マイクロリット
ル）加えた後、０．０５ミリリットルのＰＥＧ溶液を加
え、かるく混合した。該混合液を氷上に２５分間静置し
た後、同上のＰＥＧ溶液を１ミリリットル加えて、室温
で更に３０分間静置した。かくして得られた形質転換プ
ロトプラスト懸濁液を０．２ミリリットルずつプロトプ
ラスト再生培地[ 文献（イソガイら: Agric.Biol.Chem.
51(1987)2321-2329 ）に記載されているＢＲＭ培地] を
２５ミリリットル含有するプレート上に広げ、１５℃で
２０時間培養した。次いで、該プレートに４．５ｍｇの
ハイグロマイシンＢを含み、５０℃に保温した同上のＢ
ＲＭ培地５ミリリットルを重層した後、２８℃で１４日
間培養した。その結果、ハイグロマイシンＢに耐性とな
った形質転換体（以下、ＨＹＢ形質転換体と略す）が数
十株出現した。 ｃ．シスタチオニンβ−シンターゼ活性の測定 ＩＳ−５株と、上記ｂで得たｐＴＣＹＳ４によるＨＹＢ
形質転換体よりランダムに選択した５株（各々ＴＣＹＳ
４−１、２、３、４、５と命名）を、Ｎ３−シード培地
５０ミリリットルに接種し、２５℃で３日間振とう培養
した（２２０ｒ. ｐ. ｍ）。該培養液１ミリリットル
を、メイン培地３０ミリリットルを含む５００ミリリッ
トルのフラスコに移し、２５℃で更に３日間振とう培養
した（２２０ｒ. ｐ. ｍ）。かくして得られた各々の培
養液１ミリリットルを遠心分離により集菌し、１ミリリ
ットルのＣＢＳバッファ−に懸濁した後、超音波破砕機
により細胞を破砕した。該破砕液を遠心分離して得られ
る上清を細胞粗抽出液とした。該抽出液０．３ミリリッ
トルと、０．０７５ｍＭピリドキサールリン酸、２ｍＭ
ジチオスレイトール、２ｍＭのＬ−セリン、２ｍＭのＤ
Ｌ−ホモシステインを含む０．１モルトリス（ｐＨ８．
０）溶液０．７ミリリットルを混合し、３０℃で６０分
間反応させた後、０．２ミリリットルの３０％トリクロ
ロ酢酸を加えて反応を停止させた。該液を遠心分離して
得られる上清をニンヒドリン反応に供し、反応生成物で
あるシスタチオニンを定量する事によりシスタチオニン
β−シンターゼ活性を求めた。ニンヒドリン反応による
シスタチオニンの定量は、Krausが記載した方法［Jan
P. Kraus, Methods in ENZYMOLOGY 143 (1987) 388-39
4］に従った。すなわち、反応液上清０．２ミリリット
ルとニンヒドリン液３．３ミリリットルを混和し、１０
０℃で５分間反応させた後、氷水浴につけ（２分間）反
応を停止し、２０分間室温で放置した後、４５３ｎｍの
吸光度を測定した。その結果、第１表に示す通り、ｐＴ
ＣＹＳ４によるＨＹＢ形質転換体は、ＩＳ−５株より２
〜９倍高いシスタチオニンβ−シンターゼ活性を示し
た。即ちこの結果は、本発明のＤＮＡ断片を使用する事
によりアクレモニウム・クリソゲナム内のシスタチオニ
ンβ−シンターゼ活性を上昇させる事が可能となる事を
示している。また該結果は、上記４．２ＫｂのＸｂａＩ
−ＳｐｅＩ断片上にシスタチオニンβ−シンターゼ遺伝
子のプロモーター並びにターミネーターが含まれている
事を示唆している。尚、反応１分間に１ナノモルのシス
タチオニンを生成する酵素量を１単位と定め、粗抽出液
中のタンパク１ｍｇ当りの単位数をシスタチオニンβ−
シンターゼ活性として第１表に表示した。

【００１２】

【表１】

【００１３】

【発明の効果】実施例に開示した通り、本発明のＤＮＡ
断片を利用することにより、シスタチオニンβ−シンタ
ーゼ活性が高まった新規アクレモニウム・クリソゲナム
を創製することが可能になった。従って、該遺伝子断片
または該遺伝子に対応するｃＤＮＡ化合物を単独で、あ
るいはセファロスポリンＣ生合成遺伝子と組み合わせて
増強することにより、セファロスポリンＣ発酵能が向上
したアクレモニウム・クリソゲナム株の創製が期待でき
る。また、本発明のプロモーターならびにターミネータ
ー部分は、アクレモニウム・クリソゲナム用発現ベクタ
ーの構成要素として利用することができる。

【００１４】

【配列表】 配列番号：1 配列の長さ：1778 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：アクレモニウム クリソゲナム（Acremonium c
hrysogenum） 株名：IS5 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：69..1628 特徴を決定した方法：E 配列 TTTTTTCTTC CCTTCCATCT CCTACCACAT CATCACCCCT CCCAATCTTC GCCCAGCATC 60 CCACAATA ATG GCC GAG TCA ACG CTA CCC CAC GTA CCT CCC AGG GCG GCA 110 Met Ala Glu Ser Thr Leu Pro His Val Pro Pro Arg Ala Ala 1 5 10 ACC GTC CTC GCA GCC ACG GAG CTC ATC GGT AAC TCG CCC CTC GTT CGC 158 Thr Val Leu Ala Ala Thr Glu Leu Ile Gly Asn Ser Pro Leu Val Arg 15 20 25 30 CTC AAC AAG CTG CCC CAG TCG CTG GGC ATC GAG TGC GAT GTC TAC GTC 206 Leu Asn Lys Leu Pro Gln Ser Leu Gly Ile Glu Cys Asp Val Tyr Val 35 40 45 AAG GCC GAG TTC TTC AAC GCC GGC GGC AGC GTC AAG GAC AGG ATA GCC 254 Lys Ala Glu Phe Phe Asn Ala Gly Gly Ser Val Lys Asp Arg Ile Ala 50 55 60 CTG CGC ATG ATC GAG GAG GCT GAG AAG AGC GGC CGC ATC AAG CCT GGC 302 Leu Arg Met Ile Glu Glu Ala Glu Lys Ser Gly Arg Ile Lys Pro Gly 65 70 75 GAC ACT CTC ATT GAA CCC ACC AGC GGC AAC ACT GGT ATC GGC CTT GCC 350 Asp Thr Leu Ile Glu Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Gly Leu Ala 80 85 90 CTC GTC GGC GCG ATC AAG GGC TAC AAG ACC ATC ATC ACC CTC CCC GAG 398 Leu Val Gly Ala Ile Lys Gly Tyr Lys Thr Ile Ile Thr Leu Pro Glu 95 100 105 110 AAG ATG TCC GCC GAA AAG GTC TCC GTC CTC CGC GCC CTG GGC GCC ACC 446 Lys Met Ser Ala Glu Lys Val Ser Val Leu Arg Ala Leu Gly Ala Thr 115 120 125 ATC ATT CGG ACA CCC ACC CAG GCC GCA TGG GAC AGC CCC GAG TCC CAC 494 Ile Ile Arg Thr Pro Thr Gln Ala Ala Trp Asp Ser Pro Glu Ser His 130 135 140 ATC GGT GTC GCC CGC CGC CTC GAG AAG GAG ATC CCC AAC GCC CAC ATC 542 Ile Gly Val Ala Arg Arg Leu Glu Lys Glu Ile Pro Asn Ala His Ile 145 150 155 CTC GAC CAG TAC TCC AAC GAG AAC AAC CCG CTA GCC CAC GAG CTT GGC 590 Leu Asp Gln Tyr Ser Asn Glu Asn Asn Pro Leu Ala His Glu Leu Gly 160 165 170 ACC GCA GAG GAG ATC TGG GAG CAG ACT GCC GGC AAA ATC ACC GCT GTT 638 Thr Ala Glu Glu Ile Trp Glu Gln Thr Ala Gly Lys Ile Thr Ala Val 175 180 185 190 GTC GCC GGT GCA GGC ACT GGT GGC ACT ATC ACG GGC CTG GCC AAG GGT 686 Val Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Leu Ala Lys Gly 195 200 205 CTG AGG AAG CAC AAG CAG GAT ATC AAG GTC ATC GCC GCC GAT CCC CAG 734 Leu Arg Lys His Lys Gln Asp Ile Lys Val Ile Ala Ala Asp Pro Gln 210 215 220 GGC AGT GTC CTC GCT CTG CCC GAG GTT CTC AAC GAA GAG CAC ATG AAC 782 Gly Ser Val Leu Ala Leu Pro Glu Val Leu Asn Glu Glu His Met Asn 225 230 235 GCC TCG TAC AAG GTA GAG GGC ATA GGA TAC GAT TTC ATC CCC GAC GTC 830 Ala Ser Tyr Lys Val Glu Gly Ile Gly Tyr Asp Phe Ile Pro Asp Val 240 245 250 CTT GAC CGC GAG CTC GTG GAC AAG TGG TAC AAG ACG GCC GAC AGG GAG 878 Leu Asp Arg Glu Leu Val Asp Lys Trp Tyr Lys Thr Ala Asp Arg Glu 255 260 265 270 TCC TTC TAC CTC GCC CGC CAA TTG ATC TCC GAA GAG GGC CTC CTC GTC 924 Ser Phe Tyr Leu Ala Arg Gln Leu Ile Ser Glu Glu Gly Leu Leu Val 275 280 285 GGC GGT AGC TCT GGC TCC GCC ATG GCC GCG ATG GTC GAG GCT GTT AAG 974 Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala Met Ala Ala Met Val Glu Ala Val Lys 290 295 300 GAC TTT GGG TTC AAG AAG GGC GAC GTG GTC GTG GTG ATC CTC CCC GAT 1022 Asp Phe Gly Phe Lys Lys Gly Asp Val Val Val Val Ile Leu Pro Asp 305 310 315 AGC ATC CGC AGC TAC CTC ACC AAG TTT GCC GAT GAC GAC TGG CTG GCT 1070 S er Ile Arg Ser Tyr Leu Thr Lys Phe Ala Asp Asp Asp Trp Leu Ala 320 325 330 GCG AAT AAC CTG ATC TCC GCC AAC AGC GTC GAA GCT GCC GCC GCA GAT 1118 A la Asn Asn Leu Ile Ser Ala Asn Ser Val Glu Ala Ala Ala Ala Asp 335 340 345 350 CAG AGC AAG AAC TCC GAC CCT TAC AGC GGC GCC ACC ATC GCA TCC CTC 1166 G ln Ser Lys Asn Ser Asp Pro Tyr Ser Gly Ala Thr Ile Ala Ser Leu 355 360 365 CGC CTC AAG CCC GTC ACT TCC ATC TCC GCC ACG GCC ACC TGC TCA GAG 1214 A rg Leu Lys Pro Val Thr Ser Ile Ser Ala Thr Ala Thr Cys Ser Glu 370 375 380 GCC ATC GAG ACC ATG CGT GAC AAG GGC TTC GAC CAG CTG CCC GTC CTA 1262 A la Ile Glu Thr Met Arg Asp Lys Gly Phe Asp Gln Leu Pro Val Leu 385 390 395 TCC GCG TCG TCG CCC TCC AGG CTC GTC GGC CTC GTC ACC CTC GGC AAC 1310 S er Ala Ser Ser Pro Ser Arg Leu Val Gly Leu Val Thr Leu Gly Asn 400 405 410 CTC CTC AGC TAC ATC TCC CGT GGG CGC GCC ACC GCC GAG AGC CCG GTC 1358 L eu Leu Ser Tyr Ile Ser Arg Gly Arg Ala Thr Ala Glu Ser Pro Val 415 420 425 430 AAG GAG GTC ATG TTC GAC TTT GCC CAC ATT GAC GAG ATC ATC ACC GAC 1406 L ys Glu Val Met Phe Asp Phe Ala His Ile Asp Glu Ile Ile Thr Asp 435 440 445 CCC CGT CAG GGC GCC GCC CTG GGC CAG GGC AAG AAG GCC GGC AAG CGC 1454 P ro Arg Gln Gly Ala Ala Leu Gly Gln Gly Lys Lys Ala Gly Lys Arg 450 455 460 AAG TTT GTC CAG ATC ACA AAG GAC ACC ACC CTC GCG GAG CTT AGC AAG 1502 L ys Phe Val Gln Ile Thr Lys Asp Thr Thr Leu Ala Glu Leu Ser Lys 465 470 475 TTC TTT GAG TGG AAC AGC GCT GCC GTC GTG ACG GAG GCC AGC AGC GAC 1550 P he Phe Glu Trp Asn Ser Ala Ala Val Val Thr Glu Ala Ser Ser Asp 480 485 490 TCG TCG ACG CTG TCG AAG CCA GTC GCC ATT GTG ACC AAG GTG GAT CTC 1598 S er Ser Thr Leu Ser Lys Pro Val Ala Ile Val Thr Lys Val Asp Leu 495 500 505 510 CTG ACA TGG TTG GTT AAC AAG AAG CTC TAAGCGGTCG AGATGAGTGT 1645 Leu Thr Trp Leu Val Asn Lys Lys Leu 515 GGTATAAAAG AGCTGTTGTT TTTGTTGCCG GACTTGGTGC ATGCGGTCTG GAACGGCGTT 1705 TGATTCAACG TGTTGTTGTT GGATGGTTAT CACAGCGAAT ATATGATGAT ATAGACGAAA 1765 AAAAAAAAAA AAA 1778 配列番号：2 配列の長さ：3494 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アクレモニウム クリソゲナム（Acremonium c
hrysogenum） 株名：IS5 配列の特徴 特徴を表す記号：intron 存在位置：1229..1291 特徴を決定した方法：E 配列 AGGCCTTTTG CGCGTGATGA AGCGGGACAG GATGCATGTG CCGTGATATC AAGATATCGA 60 ATGCCGACCC ACTGTCCAGC TTGGCGAACG CGATTCTGGT AAATGAGGTC GGACCCTTTG 120 TCAACAGTTC TTGGCGTTGT GATTATGGGG TAAAGGGAGG AGGTGATCAA TAAGCGTTCA 180 AGCTGGTTGT CGCCAACAGT TCGCATATCA AATGCGTCGG GAAGAAGCTG CCCACGCGAA 240 GCAATTGCAG ACCTTGAGGC GATCCGAACG GTGCCACCAT CTCGAAGACA CCAAATCGCT 300 GGTTTCGTTG GCCCATCGCA TCGGCCGTGT CTGCAGGTTG GGCTGGTGGA GTGGTTGGTG 360 GCTAGTGGCT AGCACATGTC AGGCTGTATT GCAACTGGCT TCACCCAGAT GGTTCTTCCC 420 TGACAGGCCG AAGAGAGGCA AAATAGCAGC AACGCATTGA TCACATCCTG TTGGCATCGA 480 CTGGATTCAT GATGGTGATT GATGACAGTG GAAGTGATGC CATCATTAGA TCTTAGTATG 540 GCGGGTGACA AATGACGAGC AGACAAACAT GCCCCTTGGG GAAGGAGCCC CTCCGGTTGC 600 CCGAACGCCG CCGCTGACTC AGCAACCATT AGGCCAGCCC CATCATCCCC TGGAGAAGGC 660 GGATACAGGG CACCGGGCAC CGGCACCCCC AGCCTGCATC GGCCGGTGCC GTCAATGATC 720 GCCCCTCGCC GTCGGTGGCT CTGTGCAGCG CGTATCTTCG GCACAGCGCG CGGGGCATTT 780 TCTACAGTGA GGGGTGAGCA GTGAGGACAT GGTCTCATTG CCACTCGCAA TTGCGCCAAA 840 CTAGGTTTTC GCCCCGGGCT CTTCGAGTTT GCTGGTGCTC CCCAAGGTTC TTCTTTTTTT 900 CTTCCCTTCC ATCTCCTACC ACATCATCAC CCCTCCCAAT CTTCGCCCAG CATCCCACAA 960 TA ATG GCC GAG TCA ACG CTA CCC CAC GTA CCT CCC AGG GCG GCA ACC 1007 Met Ala Glu Ser Thr Leu Pro His Val Pro Pro Arg Ala Ala Thr 1 5 10 15 GTC CTC GCA GCC ACG GAG CTC ATC GGT AAC TCG CCC CTC GTT CGC CTC 1055 Val Leu Ala Ala Thr Glu Leu Ile Gly Asn Ser Pro Leu Val Arg Leu 20 25 30 AAC AAG CTG CCC CAG TCG CTG GGC ATC GAG TGC GAT GTC TAC GTC AAG 1103 Asn Lys Leu Pro Gln Ser Leu Gly Ile Glu Cys Asp Val Tyr Val Lys 35 40 45 GCC GAG TTC TTC AAC GCC GGC GGC AGC GTC AAG GAC AGG ATA GCC CTG 1151 Ala Glu Phe Phe Asn Ala Gly Gly Ser Val Lys Asp Arg Ile Ala Leu 50 55 60 CGC ATG ATC GAG GAG GCT GAG AAG AGC GGC CGC ATC AAG CCT GGC GAC 1199 Arg Met Ile Glu Glu Ala Glu Lys Ser Gly Arg Ile Lys Pro Gly Asp 65 70 75 ACT CTC ATT GAA CCC ACC AGC GGC AAC AC GTGAGAATCC CTCCATTCCC 1248 Thr Leu Ile Glu Pro Thr Ser Gly Asn Th 80 85 CCGGCCGATA ACGAGGCCTC GCCATGTACT GACACACGAG CAG T GGT ATC GGC CTT 1304 r Gly Ile Gly Leu 90 GCC CTC GTC GGC GCG ATC AAG GGC TAC AAG ACC ATC ATC ACC CTC CCC 1352 Ala Leu Val Gly Ala Ile Lys Gly Tyr Lys Thr Ile Ile Thr Leu Pro 95 100 105 GAG AAG ATG TCC GCC GAA AAG GTC TCC GTC CTC CGC GCC CTG GGC GCC 1400 Glu Lys Met Ser Ala Glu Lys Val Ser Val Leu Arg Ala Leu Gly Ala 110 115 120 125 ACC ATC ATT CGG ACA CCC ACC CAG GCC GCA TGG GAC AGC CCC GAG TCC 1448 Thr Ile Ile Arg Thr Pro Thr Gln Ala Ala Trp Asp Ser Pro Glu Ser 130 135 140 CAC ATC GGT GTC GCC CGC CGC CTC GAG AAG GAG ATC CCC AAC GCC CAC 1496 His Ile Gly Val Ala Arg Arg Leu Glu Lys Glu Ile Pro Asn Ala His 145 150 155 ATC CTC GAC CAG TAC TCC AAC GAG AAC AAC CCG CTA GCC CAC GAG CTT 1544 Ile Leu Asp Gln Tyr Ser Asn Glu Asn Asn Pro Leu Ala His Glu Leu 160 165 170 GGC ACC GCA GAG GAG ATC TGG GAG CAG ACT GCC GGC AAA ATC ACC GCT 1592 Gly Thr Ala Glu Glu Ile Trp Glu Gln Thr Ala Gly Lys Ile Thr Ala 175 180 185 GTT GTC GCC GGT GCA GGC ACT GGT GGC ACT ATC ACG GGC CTG GCC AAG 1640 Val Val Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Leu Ala Lys 190 195 200 205 GGT CTG AGG AAG CAC AAG CAG GAT ATC AAG GTC ATC GCC GCC GAT CCC 1688 Gly Leu Arg Lys His Lys Gln Asp Ile Lys Val Ile Ala Ala Asp Pro 210 215 220 CAG GGC AGT GTC CTC GCT CTG CCC GAG GTT CTC AAC GAA GAG CAC ATG 1736 Gln Gly Ser Val Leu Ala Leu Pro Glu Val Leu Asn Glu Glu His Met 225 230 235 AAC GCC TCG TAC AAG GTA GAG GGC ATA GGA TAC GAT TTC ATC CCC GAC 1784 Asn Ala Ser Tyr Lys Val Glu Gly Ile Gly Tyr Asp Phe Ile Pro Asp 240 245 250 GTC CTT GAC CGC GAG CTC GTG GAC AAG TGG TAC AAG ACG GCC GAC AGG 1832 Val Leu Asp Arg Glu Leu Val Asp Lys Trp Tyr Lys Thr Ala Asp Arg 255 260 265 GAG TCC TTC TAC CTC GCC CGC CAA TTG ATC TCC GAA GAG GGC CTC CTC 1880 Glu Ser Phe Tyr Leu Ala Arg Gln Leu Ile Ser Glu Glu Gly Leu Leu 270 275 280 285 GTC GGC GGT AGC TCT GGC TCC GCC ATG GCC GCG ATG GTC GAG GCT GTT 1928 Val Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala Met Ala Ala Met Val Glu Ala Val 290 295 300 AAG GAC TTT GGG TTC AAG AAG GGC GAC GTG GTC GTG GTG ATC CTC CCC 1976 Lys Asp Phe Gly Phe Lys Lys Gly Asp Val Val Val Val Ile Leu Pro 305 310 315 GAT AGC ATC CGC AGC TAC CTC ACC AAG TTT GCC GAT GAC GAC TGG CTG 2024 Asp Ser Ile Arg Ser Tyr Leu Thr Lys Phe Ala Asp Asp Asp Trp Leu 320 325 330 GCT GCG AAT AAC CTG ATC TCC GCC AAC AGC GTC GAA GCT GCC GCC GCA 2072 Ala Ala Asn Asn Leu Ile Ser Ala Asn Ser Val Glu Ala Ala Ala Ala 335 340 345 GAT CAG AGC AAG AAC TCC GAC CCT TAC AGC GGC GCC ACC ATC GCA TCC 2120 Asp Gln Ser Lys Asn Ser Asp Pro Tyr Ser Gly Ala Thr Ile Ala Ser 350 355 360 365 CTC CGC CTC AAG CCC GTC ACT TCC ATC TCC GCC ACG GCC ACC TGC TCA 2168 Leu Arg Leu Lys Pro Val Thr Ser Ile Ser Ala Thr Ala Thr Cys Ser 370 375 380 GAG GCC ATC GAG ACC ATG CGT GAC AAG GGC TTC GAC CAG CTG CCC GTC 2216 Glu Ala Ile Glu Thr Met Arg Asp Lys Gly Phe Asp Gln Leu Pro Val 385 390 395 CTA TCC GCG TCG TCG CCC TCC AGG CTC GTC GGC CTC GTC ACC CTC GGC 2264 Leu Ser Ala Ser Ser Pro Ser Arg Leu Val Gly Leu Val Thr Leu Gly 400 405 410 AAC CTC CTC AGC TAC ATC TCC CGT GGG CGC GCC ACC GCC GAG AGC CCG 2312 Asn Leu Leu Ser Tyr Ile Ser Arg Gly Arg Ala Thr Ala Glu Ser Pro 415 420 425 GTC AAG GAG GTC ATG TTC GAC TTT GCC CAC ATT GAC GAG ATC ATC ACC 2360 Val Lys Glu Val Met Phe Asp Phe Ala His Ile Asp Glu Ile Ile Thr 430 435 440 445 GAC CCC CGT CAG GGC GCC GCC CTG GGC CAG GGC AAG AAG GCC GGC AAG 2408 Asp Pro Arg Gln Gly Ala Ala Leu Gly Gln Gly Lys Lys Ala Gly Lys 450 455 460 CGC AAG TTT GTC CAG ATC ACA AAG GAC ACC ACC CTC GCG GAG CTT AGC 2456 Arg Lys Phe Val Gln Ile Thr Lys Asp Thr Thr Leu Ala Glu Leu Ser 465 470 475 AAG TTC TTT GAG TGG AAC AGC GCT GCC GTC GTG ACG GAG GCC AGC AGC 2504 Lys Phe Phe Glu Trp Asn Ser Ala Ala Val Val Thr Glu Ala Ser Ser 480 485 490 GAC TCG TCG ACG CTG TCG AAG CCA GTC GCC ATT GTG ACC AAG GTG GAT 2552 Asp Ser Ser Thr Leu Ser Lys Pro Val Ala Ile Val Thr Lys Val Asp 495 500 505 CTC CTG ACA TGG TTG GTT AAC AAG AAG CTC TAAGCGGTCG AGATGAGTGT 2602 Leu Leu Thr Trp Leu Val Asn Lys Lys Leu 510 515 GGTATAAAAG AGCTGTTGTT TTTGTTGCCG GACTTGGTGC ATGCGGTCTG GAACGGCGTT 2662 TGATTCAACG TGTTGTTGTT GGATGGTTAT CACAGCGAAT ATATGATGAT ATAGACGAGG 2722 AAATGGTCAC GACAGCGCCA CCGCTAGACT CAACATCTAG GGACCATGAG CTTTGAAATC 2782 CGGGGGTGAT TAAAAAAAGA AAGAAAGAAA AAGGAAGAAG AACGAGTCTG ACCAAGAATT 2842 AATATTATCC TTGTAAAATC TCTTTCCCCC GTCGCATTTA TATCTTTTGA GCGATCCACC 2902 ACCACCACTT ATCCGCACCC GGCCCGTCAC CCGTGACGTT ACCAGGAAGA ACCTCGACGT 2962 CAATGTCAAA CTCCTGCATC TGCTTAAACG AGAACTTCTC AGACCCGTAC TCCCCCAGCC 3022 AGCCATCCTG CTCCTCGCTG CCAACCTCGT CCATGCCGAC GCCCGAGTCG AGCAGGCCCT 3082 TGCTGCGCGT GGCGCGGATG CGTGTCAGCT CCGCCTCGAG GTTTGTCTTG ACCAGCGTCG 3142 AGGGCAGCGC GGTGAAGAGG TCCATCTTGT TGGCGGCGAT CAGCACTGGT ATGCGGCCTG 3202 CCTTGGCGGC GCCGCTCTTT TGGTCTGTGG CGCGCTTCTG TAGGAAGAGG AGCACGTCGT 3262 GTAGGTATCC CGCGGTCTGG GCTAGGACAT CCTGCTCGCC CAGGGCTGCG GCGTCGACGA 3322 CGAAGACGAG GGCGCGCAGC TTCTCCGTGC GGGCGAGCTT GCCCATGGCT ACATTACGGA 3382 GCTTGCCATG ACCGGGGGTG TCGACCATGA GGAACTTGGT ATGCGTACCA CTCGTGTCAT 3442 CATGGTTCCG GAAGCTAGTG CGCGATTCAG AGTCGACCGA GGCGCTGAGC TC 3494

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明ＤＮＡ断片の部分制限酵素地図を示す。
重複する制限酵素認識部位に関しては、便宜上図中左か
ら右に通し番号を付した。図中―は塩基配列を決定した
領域を示し、→はシスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子
の方向を示している。

【図２】プラスミドｐＴＣＹＳ４の作製過程を示す。な
お、図２中で使用した略称ないし略号は以下のとうりの
ものである。ＣＹＳ４：シスタチオニンβ−シンターゼ
遺伝子、ＡＣＴＰ：アクレモニウム・クリソゲナム由来
アクチン遺伝子のプロモーター、ＡＣＴＴ：アクレモニ
ウム・クリソゲナム由来アクチン遺伝子のターミネータ
ー、ＨＹＢ：ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アクレモニウム・クリソゲナム由来のシ
   スタチオニンβ−シンターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 配列表（配列番号１）に示すアミノ酸配
   列を有するタンパク質をコードする請求項１記載のＤＮ
   Ａ断片。
3. 【請求項３】 第１図に示す制限酵素地図により規定さ
   れる請求項１または２記載のＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 第１図におけるＳｔｕＩ−ＳａｃＩ
   間の塩基配列が配列表（配列番号２）で示される請求項
   １、２または３記載のＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】 請求項１、２、３もしくは４記載のＤＮ
   Ａ断片全体またはその一部をベクターに組み込んだ組換
   え体ＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項５記載の組換え体ＤＮＡで形質転
   換されたアクレモニウム・クリソゲナム。