JPH05192162A

JPH05192162A - Ｄｎａおよびその用途

Info

Publication number: JPH05192162A
Application number: JP3186222A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Kimura; 宏之木村; Masayuki Kobayashi; 昌行小林; Yasuhiro Sumino; 靖弘隅野
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-07-31
Filing date: 1991-07-25
Publication date: 1993-08-03

Abstract

(57)【要約】【目的】アクレモニウム・クリソゲナム由来のδ−
(Ｌ−α−アミノアジピル)−Ｌ−システィニル−Ｄ−バ
リンシンセターゼ（ＡＣＶＳ酵素）遺伝子をコードす
るＤＮＡ断片およびこれを用いるＡＣＶＳ酵素およびβ
−ラクタム抗生物質の製造法を提供する。【構成】アクレモニウム・クリソゲナム由来のＡＣＶ
Ｓ酵素遺伝子をコードするＤＮＡ断片、これを組み込ん
だベクター、これらで形質転換した微生物および該形質
転換体を用いるＡＣＶＳ酵素およびβ−ラクタム抗生物
質の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アクレモニウム・クリ
ソゲナム(Ａcremonium chrysogenum)のδ−(Ｌ−α−
アミノアジピル)−Ｌ−システィニル−Ｄ−バリンシ
ンセターゼ(δ−(Ｌ−α−aminoadipyl)−Ｌ−cysteiny
l−Ｄ−valine synthetase)遺伝子(以下、ＡＣＶＳ遺
伝子と略する)をコードするＤＮＡ断片に関する。微生
物学的にカビに分類されるアクレモニウム・クリソゲナ
ムは、多くの臨床上重要な半合成セフェム抗生物質の製
造に使用されているセファロスポリンＣや、デアセチル
セファロスポリンＣの生産菌として広く用いられてい
る。このように工業的に重要な微生物であるアクレモニ
ウム・クリソゲナムのＡＣＶＳ遺伝子は、ＡＣＶＳ酵素
の生産のみならず、セファロスポリン類抗生物質の生産
性向上や、新規なペニシリン、セファロスポリン類抗生
物質の生産への利用が期待できる。

【０００２】

【従来の技術】δ−(Ｌ−α−アミノアジピル)−Ｌ−シ
スティニル−Ｄ−バリンシンセターゼ(ＡＣＶＳ)はペ
ニシリンなどのβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素の
一つで、Ｌ−α−アミノアジピン酸、Ｌ−システイン、
Ｌ−バリンからδ−(Ｌ−α−アミノアジピル)−Ｌ−シ
スティニル−Ｄ−バリン (ＬＬＤ−ＡＣＶ)への反応を
触媒するといわれており、アクレモニウム・クリソゲナ
ムにもＡＣＶＳ酵素が存在することが知られている[ジ
ー・バンコおよびエイ・エル・デマイン、ジャーナル・
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ(Ｇ.Ｂanko
and Ａ.Ｌ.Ｄemain,Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.),１０９,２
８５８−２８６０(１９８７)参照]。ＡＣＶＳをコード
するＡＣＶＳ遺伝子は、ペニシリン生産菌、糸状菌ペニ
シリウム・クリソゲナム(Ｐenicillum chrysogenum)
[ディー・ジェイ・スミスら、バイオテクノロジー(Ｄ.
Ｊ.Ｓmith et al.,ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ),
８,３９(１９９０)参照]および糸状菌アスパージーラス
・ニドランス(Ａspergillus nidulans)[エイ・ピィ・
マッケイブら、ＥＭＢＯジャーナル(Ａ.Ｐ.ＭacＣabeet
al.,Ｔhe ＥＭＢＯＪournal),９,２７９(１９９
０)参照]からクローニングされているが、そのＤＮＡ塩
基配列は知られていない。また、セファバシン類抗生物
質を生産するグラム陰性細菌、リゾバクター・ラクタム
ゲヌス(Ｌysobacter lactamgenus)からのＡＣＶＳ遺伝
子の、ＤＮＡ塩基配列とその利用について特許出願がな
されている(特願平２−００３７６２号)。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】アクレモニウム・クリ
ソゲナムのセファロスポリン生合成に関与する生合成酵
素遺伝子のうち、イソペニシリンＮシンセターゼ遺
伝子[エス・エム・サムソンら、ネイチャー(Ｓ.Ｍ.Ｓam
son et al．,Ｎature),３１８,１９１(１９８５)参
照]と、デアセトキシセファロスポリンＣシンセター
ゼ／デアセトキシセファロスポリンＣヒドロキシラー
ゼ遺伝子[エス・エム・サムソンら、バイオテクノロジ
ー(Ｓ.Ｍ.Ｓamson et al．,ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬ
ＯＧＹ),５,１２０７(１９８７)参照]がクローニングさ
れているが、セファロスポリン生合成経路の初発酵素で
あるＡＣＶＳをコードするＡＣＶＳ遺伝子については、
アクレモニウム・クリソゲナムによるセファロスポリン
系抗生物質の生産性向上のために有用であることが期待
されているにもかかわらず、全く知られていない。前記
のように、他の糸状菌由来のＡＣＶＳ遺伝子はクローニ
ングされるているが、アクレモニウム・クリソゲナムに
とっては異種遺伝子であるので、アクレモニウム・クリ
ソゲナムによるセファロスポリン系抗生物質の生産性向
上のためには十分であるとは言いがたい。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アクレモ
ニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮＡからリゾバクター
・ラクタムゲヌスのＡＣＶＳ遺伝子と相同性がある遺伝
子をクローニングし、そのＤＮＡ塩基配列を決定した。
その結果、この遺伝子がリゾバクター・ラクタムゲヌス
のＡＣＶＳのアミノ酸配列と明らかな相同性がある酵素
をコードする遺伝子、すなわちＡＣＶＳ遺伝子であるこ
とを知り、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち本発明は、(１) アクレモニウム
・クリソゲナム由来のＡＣＶＳ遺伝子をコードするＤＮ
Ａ断片、(２) ＤＮＡ断片の塩基配列が配列表の配列番
号１で示されるものである前記(１)のＤＮＡ断片、(３)
前記(１)または(２)のＤＮＡ断片を組み込んだベクタ
ー、(４) 前記(１)のＤＮＡ断片または前記(３)のベク
ターで形質転換した微生物、(５) 前記(４)の形質転換
体を培養し、ＡＣＶＳを培養物中に蓄積させ、それを採
取することを特徴とするＡＣＶＳの製造法、および(６)
β−ラクタム抗生物質を産生する能力を有する、前記
(４)の形質転換体を培養し、β−ラクタム抗生物質を培
養物中に蓄積させ、それを採取することを特徴とするβ
−ラクタム抗生物質の製造法、を提供するものである。

【０００６】本発明において、ＡＣＶＳ遺伝子は、アク
レモニウム・クリソゲナムの菌体から分離することがで
きる。該アクレモニウム・クリソゲナムの具体例として
は、アクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５
０株およびアクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１４
５５３株等が挙げられる。該ＡＣＶＳ遺伝子をコードす
るＤＮＡは、アクレモニウム・クリソゲナムの染色体Ｄ
ＮＡから得ることができる。該染色体ＤＮＡの調製は、
菌体から公知の方法、たとえばピー・エフ・ハムリン
(Ｐ.Ｆ.Ｈamlyn)らの方法[エンザイム・マイクロバイオ
ロジカル・テクノロジー(Ｅnzyme Ｍicrobiological
Ｔechnology),３,３２１(１９８１)参照]あるいはこれ
に準じた方法によりプロトプラストを調製し、該プロト
プラストから公知の方法、たとえばディー・アール・ク
ライアー(Ｄ.Ｒ.Ｃryer)らの方法[メソッド・イン・セ
ル・バイオロジー(Ｍethod in Ｃell Ｂiology),Ｘ
ＩＩ,３９(１９７６)参照]あるいはこれに準じた方法に
より得ることができる。

【０００７】染色体ＤＮＡからＡＣＶＳ遺伝子領域を含
むＤＮＡ断片をクローニングするための、該ＤＮＡの検
出手段としては、ベクタープラスミドに挿入されたＤＮ
Ａ断片上にＡＣＶＳ遺伝子の存在が確認できるものであ
れば、いかなるものであってもよく、たとえば宿主のＡ
ＣＶＳ遺伝子欠損株の相補性を利用する方法、既存の糸
状菌またはバクテリアのＡＣＶＳ遺伝子またはその一部
を放射能ラベルしてプローブとし、ハイブリダイゼーシ
ョンによって検出する方法などを用いることができる。
具体的には、リゾバクター・ラクタムゲヌスのＡＣＶＳ
遺伝子をプローブとして用いることができる。

【０００８】クローニングのための宿主としては、特に
限定されないが、通常、エシェリヒア・コリが用いら
れ、具体的には市販されているエシェリヒア・コリ(Ｅs
cherichia coli)ＬＥ３９２株[ストラタジーン・クロ
ーニング・システム(ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＣloning
Ｓystem)社製、ＵＳＡ]が好ましい。ベクターとして
は、エシェリヒア・コリに導入しうるものであればいか
なるものであってもよく、たとえばpＢＲ３２２、pＵＣ
１８、pＵＣ１９などのプラスミドベクターや、λファ
ージベクターなどが好ましい。具体的には、市販のＬam
bda ＦＩＸ[ストラタジーン・クローニング・システム
(ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＣloning Ｓystem)社製、Ｕ
ＳＡ]などが例示される。

【０００９】染色体ＤＮＡ断片をベクターに挿入するに
は、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素を用いて切断、もし
くは部分切断し、一方、ベクターＤＮＡを、染色体ＤＮ
Ａの切断に用いたものと同じ制限酵素、もしくは切断さ
れた染色体ＤＮＡと連結可能な切断点を生じさせうる制
限酵素を用いて切断した後、両者をＤＮＡリガーゼの作
用により連結して、ベクターＤＮＡに染色体ＤＮＡに染
色体ＤＮＡ断片を挿入した組換え体ＤＮＡとすればよ
い。このような目的に用いられる制限酵素の具体例とし
ては、たとえばマニアティスらのモレキュラー・クロー
ニング[Ｍolecular Ｃloning, Ｍaniatis et al．,
Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌabolatory,Ｎew Ｙork
(１９８２)]第１００〜１０１頁記載の制限酵素などが
単独ないし適宜組み合わされて用いられる。また、必要
に応じてモレキュラー・クローニング第１０７〜１４８
頁記載のＤＮＡ修飾酵素が適宜用いられる。ここで用い
る制限の切断条件、ＤＮＡ修飾酵素の反応条件、および
リガーゼによる連結条件は、特に制限はなく通常の反応
条件でよい。

【００１０】該組換え体ＤＮＡを宿主に導入するために
は、公知の方法を用いればよく、たとえばプラスミドを
ベクターとして用いた場合は、コンピテントセル法を用
いればよく、λファージベクターを用いた場合は、イン
ビトロ・パッケージング法を用いればよい。具体的に
は、染色体ＤＮＡが組み込まれたＬambda ＦＩＸを市
販のインビトロ・パッケージングキット[たとえば、ギ
ガパック・ゴールド(Ｇigapack gold)、ストラタジー
ン・クローニング・システム(ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ
Ｃloning Ｓystem)社製、ＵＳＡ]を用いてインビトロ
・パッケージングした後、エシェリヒア・コリ宿主に感
染させ、プラークを形成させればよい。目的とするＡＣ
ＶＳ遺伝子を含むλファージベクターを検出するには、
前記リゾバクター・ラクタムゲヌス由来のＡＣＶＳ遺伝
子をプローブとするプラークハイブリダイゼーション法
によるのが適切である。この場合、リゾバクター・ラク
タムゲヌスのＡＣＶＳ遺伝子とアクレモニウム・クリソ
ゲナムのＡＣＶＳ遺伝子とは、完全に同一ではないの
で、通常用いられるハイブリダイゼーションの条件(前
記、「モレキューラー・クローニング」、第３８７〜３８
９頁参照)では検出できないこともあるので、相同性の
低いＤＮＡでも検出できうる条件(たとえば、通常のハ
イブリダイゼーション溶液中のホルムアミド濃度(５０
(v／v)％)を約３０(v／v)％に低下させる)を選択する必
要が生じることもある。ハイブリダイズすることが認め
られたプラークからλファージを通常の方法で回収し、
それを用いてプラークハイブリダイゼーションの操作を
数回繰り返すことにより、ＡＣＶＳ遺伝子を含む染色体
ＤＮＡ断片が挿入されたλファージベクターを分離する
ことができる。このλファージからλＤＮＡを分離し、
適当な制限酵素で切断後、ベクタープラスミドにサブク
ローニングすることができる。サブクローニングした染
色体ＤＮＡとリゾバクター・ラクタムゲヌス由来のＡＣ
ＶＳ遺伝子がハイブリダイズするか否かを調べることに
よりＡＣＶＳ遺伝子のおおよその位置を知ることができ
る。

【００１１】これら一連の基本操作は公知であり、文献
に詳細に記載されている[メソッズ・イン・エンザイモ
ロジー(Ｍetods in Ｅnzymology)６８巻、１９７９
年;モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃlonin
g),１９８２年]。リゾバクター・ラクタムゲヌスのＡＣ
ＶＳ遺伝子とハイブリダイズした遺伝子がＡＣＶＳをコ
ードしていることは、ＤＮＡ塩基配列を決定することに
より確認される。ＤＮＡ塩基配列決定の方法としては、
たとえばジデオキシ合成鎖停止法[添田栄一ら著、『核
酸の塩基配列決定法』第６１〜１１３頁、学会出版セン
ター、１９８５年、参照]を用いることがでる。決定し
た塩基配列をＤＮＡシークエンス入力解析システム『Ｄ
ＮＡＳＩＳ』(日立ソフトエンジニアリング製)などを用
いて解析することにより、その塩基配列にコードされて
いる酵素のアミノ酸配列とリゾバクター・ラクタムゲヌ
スのＡＣＶＳのアミノ酸配列に相同性があること、すな
わちＡＣＶＳ遺伝子であることを知ることができる。

【００１２】このようにして分離したアクレモニウム・
クリソゲナムのＡＣＶＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、種
々の宿主で該遺伝子を発現させるためのＤＮＡ断片とし
て用いることができる。この場合、ＤＮＡ断片の大きさ
としては遺伝子の発現に必要な大きさの断片、すなわち
オープン・リーディング・フレーム(ＯＲＦ)の開始コド
ン(ＡＴＧ)から終止コドン(ＴＡＧまたはＴＧＡ)を含む
ものであれば差し支えない。

【００１３】本発明のＡＣＶＳ遺伝子をコードするＤＮ
Ａ断片の代表例の塩基配列を図１〜図１５に示す。本発
明においては、図１〜図１５に示すＤＮＡ塩基配列中の
ＡＣＶＳをコードする構造遺伝子をそのまま用いても差
し支えないが、その機能が失われない限りは、ＤＮＡ塩
基配列を改変して用いてもよい。たとえば、ＤＮＡ塩基
配列の改変法としては、部位特異的変異法(site direc
ted mutagenesis)、化学合成ＤＮＡを用いる方法など
通常の方法が例示される。また異種の宿主で発現させる
場合などに、アミノ酸コドンをその宿主での発現に好都
合なアミノ酸コドンに変化するようにＤＮＡ塩基配列を
改変して用いてもよい。さらにＡＣＶＳ遺伝子のＤＮＡ
塩基配列を改変することにより、アミノ酸を置換させ、
基質特異性、Ｋm値、至適pＨ、至適温度などの酵素の機
能が変化した変異酵素を作製して用いてもよい。これら
はいずれも本発明範囲のものである。

【００１４】本発明の新規ＤＮＡ断片またはそれを組み
込んだベクターは受容菌を形質転換させ、ＡＣＶＳ酵素
やβ−ラクタム系抗生物質の製造に有用な新規微生物の
造成に用いることができる。すなわち、前記のごとく、
ＡＣＶＳ酵素はβ−ラクタム系抗生物質の生合成経路の
初発酵素であり、該酵素の生産はβ−ラクタム系抗生物
質製造の効率向上に有用である。また、β−ラクタム系
抗生物質産生微生物のβ−ラクタム系抗生物質産生能を
増大させるためにβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素
遺伝子のひとつであるＡＣＶＳ遺伝子は有用であり、β
−ラクタム系抗生物質産生能は、β−ラクタム系抗生物
質の生合成酵素に依存しているので、生合成酵素遺伝子
を導入することによる生合成酵素の活性の増加は、β−
ラクタム系抗生物質産生能を増加させうる。受容菌の具
体例としては、たとえばアクレモニウム・クリソゲナム
(Ａcremonium chrysogenum)、ペニシリウム・クリソゲ
ナム(Ｐenicillium chrysogenum)、ストレプトマイセ
ス・クラブリゲルス(Ｓtreptomyces clavuligerus)、
リゾバクター・ラクタムゲヌス(Ｌysobacter lactamge
nus)、キサントモナス・ラクタムゲナ(Ｘanthomonas l
actamgena)、フラボバクテリウム・キチノボラム(Ｆlav
obacterium chitinovorum)などが例示される。これら
の受容菌は必ずしもβ−ラクタム系抗生物質産生能を有
する必要はないが、該産生能を有するものが好ましい。
これらの微生物にＡＣＶＳ遺伝子を導入する方法として
は、通常の形質転換法が用いられる。ＡＣＶＳ遺伝子は
単独でも差し支えないが、さらに複数のβ−ラクタム系
抗生物質の生合成酵素遺伝子を、同時に形質転換しても
よい。

【００１５】このようにして得られた形質転換株が、目
的通りの特徴を有する新規微生物であるか否かは、形質
転換株から無細胞抽出液を調製したのち、ＡＣＶＳ活性
を測定する方法、また形質転換株からＤＮＡを調製した
のち、形質転換に用いたプラスミドＤＮＡをプローブと
するハイブリダイゼーションにより、形質転換株中にＡ
ＣＶＳ遺伝子が導入されたことを確認する方法、さらに
形質転換株のβ−ラクタム系抗生物質の蓄積量の増加を
調べる方法などにより判定できる。このような本発明の
形質転換株の代表的な例としては、後記の実施例で得ら
れた、アクレモニウム・クリソゲナムＴＡ−４(ＩＦＯ
３２３２３、ＦＥＲＭＰ−１１６１７)が挙げられ
る。上記のＩＦＯ番号は、財団法人発酵研究所(Ｉnstit
ute Ｆor Ｆermentation、Ｏsaka;ＩＦＯ)における受
託番号を、またＦＥＲＭＢＰ番号は、通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所(ＦＲＩ)における受託番号
をそれぞれ示す。もちろん、受容菌を選ぶことによっ
て、本明細書に記載の方法に従って、同様に種々の形質
転換株を容易に作出することができる。

【００１６】本発明で得られた形質転換株を用いてＡＣ
ＶＳ酵素やβ−ラクタム系抗生物質を製造するには、公
知の微生物による酵素の生産法、該抗生物質の生産法と
同様の方法が用いられる。すなわち、培地としては、炭
素源、窒素源、金属イオン類のほか、必要に応じてアミ
ノ酸、核酸、ビタミン類などの栄養源を含有する培地が
用いられる。たとえば、炭素源としては、グルコース、
シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉糖化液、糖蜜
などが用いられる。窒素源としては、ペプトン、コーン
スティープリカー、大豆粉、乾燥酵母、尿素などの有機
窒素源のほかに、硫酸、硝酸、塩酸、炭酸などのアンモ
ニウム塩やアンモニアガス、アンモニア水などの無機窒
素源がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。その
他の栄養源としては、菌の生育に必要な各種の無機塩
類、アミノ酸類、ビタミン類などが適宜選択の上、それ
ぞれ単独もしくは混合して用いられる。さらに、培地に
は必要に応じてシリコンオイル、ポリアルキレングリコ
ールエーテルなどの消泡剤や界面活性剤などを添加する
ことができる。

【００１７】培養は、通常、振盪あるいは通気撹拌深部
培養などの好気条件下に行なわれる。培地のpＨは通常
４ないし９の範囲が好ましい。培養中にpＨの変動が観
察される場合は、これを好ましい範囲に修正するために
硫酸、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニア
ガス、アンモニア水などを適宜添加してもよい。培養温
度は通常２０℃ないし４５℃の範囲から、使用される微
生物の生育およびＡＣＶＳ酵素やβ−ラクタム系抗生物
質の蓄積に好適な温度が選択される。培養は実質的にＡ
ＣＶＳ酵素や、目的とするβ−ラクタム系抗生物質の蓄
積量が最大になるまで行なわれるが、通常２４時間ない
し１４４時間の培養で目的を達することができる。培養
物からＡＣＶＳ酵素やβ−ラクタム系抗生物質を分離採
取するには、公知の通常の精製手段、たとえば沈澱法、
イオン交換樹脂や活性炭によるクロマトグラフィー法な
どの分離精製法が用いられる。

【００１８】

【実施例】以下に実施例および参考例を挙げて、本発明
の内容をより具体的に説明するが、これらはいずれも本
発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲を限定
するものではない。なお、％(パーセント)は特にことわ
りのない限り重量／容量パーセントを示すものとする。実施例１アクレモニウム・クリソゲナムのジーンライ
ブラリーの作製１) アクレモニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮＡの
調製アクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０株
の凍結保存菌体をサッカロース３０g／リットル、肉エ
キス１５g／リットル、コーン・ティーブ・リカー５g／
リットルおよびＣaＣＯ₃１.５g／リットルを含む培地(p
Ｈ７.０)に接種し、２８℃で４８時間、回転式振盪機
(２００rpm)上で培養した。培養液１リットルを濾別し
て得られる菌体からＰ.Ｍ.Ｈamlynらの方法[エンザイム
・マイクロバイオロジカル・テクノロジー(Ｅnzyme Ｍ
icrobiological Ｔechnology),３,３２１(１９８１)参
照]にしたがってプロトプラストを調製した。得られた
プロトプラストからディー・アール・クライヤー(Ｄ.
Ｒ.Ｃryer)らの方法[メソッド・イン・セル・バイオロ
ジー(Ｍethod in Ｃell Ｂiology),ＸＩＩ,３９(１９
７５)参照]に従い、約５mgの染色体ＤＮＡを得た。

【００１９】２) アクレモニウム・クリソゲナムのジ
ーンライブラリーの作製前記１)項で得た染色体ＤＮＡ３０μgに５.４ユニット
の制限酵素ＭboＩを３７℃で２０分間作用させ部分切断
した後、dＡＴＰとdＧＴＰの存在下でＤＮＡポリメレー
スＩラージフラグメント(ＤＮＡ polymerase Ｉ
large frament)(宝酒造製)を作用させた。これとファ
ージベクターλＦixのＸhoＩ切断断片、パーシャル・フ
ィルイン・アーム(partial fill-in arm)(ストラタジ
ーン・クローニング・システム社製、ＵＳＡ)とをＴ４
ＤＮＡリガーゼ(宝酒造製)により連結した。この連結反
応液を、ギガパック・ゴールド(Ｇigapack gold)(スト
ラタジーン・クローニング・システム社製、ＵＳＡ)を
用いて、インビトロ・パッケージング(in vitro pack
aging)を行った。以上のようにして作製したジーンライ
ブラリー(gene library)のタイターは、指示細菌とし
てエシェリヒア・コリＬＥ３９２を用いて、前記「モレ
キュラー・クローニング」、第６４頁記載の方法により
調べた結果、６.５×１０⁶pfu／mlであった。

【００２０】実施例２リゾバクター・ラクタムゲヌス
ＹＫ９０のＡＣＶＳ遺伝子からのプローブの作製リゾバクター・ラクタムゲヌスＹＫ９０のＡＣＶＳ遺伝
子の一部を含むプラスミドpＢＩ７(図１６参照)を制限
酵素ＭluＩで切断した後、１.１kbpのＭluＩ−ＭluＩ断
片(ＭＭ)をアガロースゲル(１.０％)電気泳動(前記、
「モレキュラー・クローニング」、第１５０〜１６５頁参
照)および電気泳動溶出法(高木康敬著、『遺伝子操作マ
ニュアル』第３３頁、講談社サイエンティフィク、１９
８２年参照)により単離した。また、同様な方法で、プ
ラスミドpＢＩ７から１.２５kbpのＳtuＩ−ＥcoＲＩ断
片(ＳＥ)、プラスミドpＢＩ６から１.２kbpのＢamＨＩ
−ＸhoＩ断片(ＢＸ)、pＢＩ５から０.７kbpのＸhoＩ−
ＳacＩ断片(ＸＳ)を単離した。プラスミドpＢＩ５、pＢ
Ｉ６、pＢＩ７に含まれるリゾバクター・ラクタムゲヌ
ス由来のＤＮＡ断片の位置関係と、単離した４種のＤＮ
Ａ断片(ＭＭ,ＳＥ,ＢＸ,ＸＳ)のリゾバクター・ラクタ
ムゲヌスのＡＣＶＳ遺伝子上での位置は図１６に示して
いる。プラークハイブリダイゼーションにおけるプロー
ブとして用いるために単離したＤＮＡ断片をそれぞれマ
ルチプライムＤＮＡ標識システム(アマシャム・ジャパ
ン製)を用いて³²Ｐでラベルした。

【００２１】実施例３ジーンライブラリーからのアク
レモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳ遺伝子のスクリー
ニング実施例１で作製したジーンライブラリーをプレートあた
り６０００個のプラークが出現するようにＳＭ(ＮaＣl
５.８g／リットル、ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２g／リットル、
５０mＭトリス−塩酸(pＨ７.５)、０.０１％ゼラチンを
含む、前記「モレキュラー・クローニング」、第７０頁参
照)で希釈した後、指示細菌としてエシェリヒア・コリ
ＬＥ３９２を用いてプレート上にプラークを出現させ
た。このプレートから前記「モレキュラー・クローニン
グ」、第３２０〜３２１頁に記載の方法にしたがってプ
ラークをニトロセルロースフィルターにリフトした。実
施例２記載の³²Ｐでラベルした４種のＤＮＡ断片(ＭＭ,
ＳＥ,ＢＸ,ＸＳ)をそれぞれ用いてプラークハイブリダ
イゼーション(前記、「モレキュラー・クローニング」、
第３２６〜３２８頁参照)を行った。ハイブリダイズ
は、３０％ホルムアミド、０.７５Ｍ塩化ナトリウム、
０.０７５Ｍクエン酸ナトリウム、０.５％ドデシル硫酸
ナトリウム、５０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.５)およ
び１００μg／ml熱変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリ
ダイゼーション溶液中で４２℃、１６時間行った。それ
ぞれのプローブとハイブリダイズが認められたポジティ
ブプラークを分離した後、その中から４種のプローブす
べてとハイブリダイズが認められるプラークをプラーク
ハイブリダイゼーション法により選択した結果、１個の
λクローン(ポジティブプラーク)を得た。

【００２２】実施例４サブクローニング実施例３記載のλクローンから、ラムダソーブ・ファー
ジ・アドソーベント(Ｌambdasorb Ｐhage Ａdsorben
t、プロメガ(Ｐromega)製)を用いてλＤＮＡを分離し
た。λＤＮＡを制限酵素ＸbaＩで切断し、アガロースゲ
ル(０.８％)電気泳動法を用いて調べた結果、挿入断片
上にＸbaＩ切断部位が存在しないことが明らかとなった
ので、λＦixのクローニング部位の両側に存在するＸba
Ｉ部位を切断することにより挿入断片を切り出しプラス
ミドベクターへのサブクローニングを行った。λＤＮＡ
をＸbaＩで切断した後、９.５kbpのＸbaＩ断片をアガロ
ースゲル(０.８％)電気泳動、および電気泳動溶出法に
より単離した。一方、ベクタープラスミドpＵＣ１８を
ＸbaＩで切断した後、アルカリフォスファターゼ(宝酒
造製、日本)を作用させた。このようにして得られた２
種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(宝酒
造製、日本)を用いて連結反応を行った。この連結反応
液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９を形質転換す
ることにより、pＵＣ１８のＸbaＩ部位に９.５kbpのＸb
aＩ断片が挿入されたプラスミドpＭＫ２−１３を作製し
た。pＭＫ２−１３を分離後、図１７に示す制限酵素切
断地図を作製した。

【００２３】実施例５プラスミドpＭＫ２−１３の挿
入断片と隣接する領域のクローニング実施例４記載のプラスミドpＭＫ２−１３のＸbaＩ−Ｂa
mＨＩ(１.６kbp)断片をプローブとする実施例３記載の
方法と同様のプラークハイブリダイゼーション法を用い
て実施例１−２)で作製したアクレモニウム・クリソゲ
ナムのジーンライブラリーからプラスミドpＭＫ２−１
３との隣接する領域を含むプラークをスクリーニングし
た。得られたポジティブプラークからλＤＮＡを分離し
た後、制限酵素ＸbaＩ切断で得られるＤＮＡ断片をベク
タープラスミドpbluescript ＳＫ＋のＸbaＩ部位に挿
入し、プラスミドpＡＣＶ１とpＡＣＶ５を作製した。プ
ラスミドpＭＫ２−１３、pＡＣＶ１、pＡＣＶ５にサブ
クローニングされたアクレモニウム・クリソゲナムの染
色体ＤＮＡ断片の位置関係および制限酵素切断地図を図
１８に示す。

【００２４】実施例６クローン化したアクレモニウム
・クリソゲナムの染色体ＤＮＡ断片の塩基配列の決定図１８に示したアクレモニウム・クリソゲナムの制限酵
素切断地図上ＮcoＩ部位からＮcoＩ部位までのＤＮＡ断
片(１３０５８bp)の塩基配列をジデオキシ合成鎖停止法
[添田栄一ら著、「核酸の塩基配列決定法」第６１〜１１
３頁、学会出版センター、１９８５年参照]にしたがっ
て決定した。その結果を図１〜図１５に示す。

【００２５】実施例７ＤＮＡ塩基配列の解析図１〜図１５に示したＤＮＡ塩基配列を、ＤＮＡシーク
エンス入力解析システム『ＤＮＡＳＩＳ』(日立ソフト
エンジニアリング製)を用いて解析した結果、図１〜図
１５のＤＮＡ塩基配列中、塩基番号１４５８のＡＴＧ
(開始コドン)から塩基番号１２３７７のＴＧＡ(停止コ
ドン)までの一つの大きなオープンリーディングフレー
ム(ＯＲＦ)が存在していた。このＯＲＦにコードされる
蛋白質はアミノ酸３６３９残基からなりその分子量は、
４０６７３９と計算された。そのアミノ酸配列を図１９
〜図４１に示している。図１９〜図４１のアミノ酸配列
は、リゾバクター・ラクタムゲヌスのＡＣＶＳのアミノ
酸配列と全体にわたり相同性(約４２％)が認められた。

【００２６】実施例８プラスミドpＡＣＶＨ１の作製１)プラスミドpＧＨ２２の作製後記参考例３記載のプラスミドpＧＨ２１を制限酵素Ｈi
ndIIIで切断した後、ｄＮＴＰ存在下でＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼ作用させた。これにＮotＩリンカー[d(pＧＣＧ
ＧＣＣＧＣ)、ニューイングランド・バイオラブス(Ｎew
Ｅngland Ｂiolabs)製]を連結後、制限酵素ＮotＩで
切断した。これをアガロースゲル(１.０％)電気泳動し
た後、電気泳動溶出法により２.９kbpのＮotＩ断片を単
離した。これをベクタープラスミドpbluescript ＳＫ＋
のＮotＩ部位に挿入することにより図４２に示すプラス
ミドpＧＨ２２を作製した。２)プラスミドpＡＣＶＨ１の作製プラスミドpＧＨ２２を制限酵素ＮotＩとＰvuIIで切断
した後、アガロースゲル(１.０％)電気泳動、電気泳動
溶出により２.９kbpのＮotＩ断片を単離した。この断片
を実施例５記載のプラスミドpＡＣＶ５のＮotＩ部位に
挿入することにより図４３に示すプラスミドpＡＣＶＨ
１を作製した。

【００２７】実施例９プラスミドpＡＣＶＨ１による
アクレモニウム・クリソゲナムＣ−２８株のプロトプラ
スト形質転換１)アクレモニウム・クリソゲナムＣ−２８株(ＩＦＯ
９５３７、ＦＥＲＭＰ−１４３０)からのプロトプラ
ストの調製アクレモニウム・クリソゲナムＣ−２８株の凍結保存し
ておいた分生胞子１×１０⁹個を、マンニトール３０g／
リットル、肉エキス１５g／リットル、コーン・スティ
ープ・リカー５g／リットルを含む液体培地(pＨ７.０)
に接種して回転式振盪機(２００rpm)上、２８℃で３９
時間培養した。培養液２５０mlを濾別して得られた菌体
を滅菌水で洗浄した後、０.０１Ｍジチオスレイトール
を含んだマクイルベイン(ＭcＩlvaine)緩衝液(０.１Ｍ
クエン酸０.２Ｍリン酸ナトリウム、pＨ７.３)３０mlに
懸濁し、２８℃で１５分間、穏やかに振盪した。菌体を
濾別、洗浄した後、ノボザイム(Ｎovozyme)２３４(ノボ
・インダストリー、デンマーク)５mg／ml、０.７ＭＮ
aＣl、２０mＭＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを含んだマクイルベ
イン緩衝液６０mlに懸濁した。菌体懸濁液を２８℃で２
時間、穏やかに振盪した後、グラスフィルター(Ｇ−
１、岩城硝子製)により、菌糸とプロトプラストを分離
した。濾液を遠心分離(１０００Ｇ、５分間)することに
より、プロトプラストを沈澱させた後、０.７ＭＮaＣ
lで２回洗浄し、プロトプラストが５×１０⁸個／mlにな
るように０.７ＭＮaＣlに懸濁した。

【００２８】２) プラスミドpＡＣＶＨ１によるプロト
プラスト形質転換０.１mlのプロトプラスト懸濁液に、プラスミドpＡＣＶ
Ｈ１(１０μg、５μl)を加え、軽く混合した後０.７Ｍ
ＮaＣlを０.４mlと３６％ＰＥＧ４０００(和光純薬
製)、１０６mＭＣaＣl₂を含んだ０.０５Ｍグリシン緩衝
液(pＨ７.５)を０.５ml加え、軽く混合した。室温で１
０分間静置した後、０.７ＭＮaＣlを５ml加え、遠心
分離(１０００Ｇ、５分間)した。沈澱となったプロトプ
ラストを０.７ＭＮaＣl １mlに再懸濁した。この形質
転換プロトプラスト懸濁液(０.１ml)をプロトプラスト
再生培地(２３％サッカロースを含んだトリプテイカー
ゼ・ソイ・アガー(ＢＢＬ・Ｍicrobiology systems)、
ベクトン・デキンソン・アンド・カンパニー製、米国３
０mlを含んだプレート上に広げ１５℃で２０時間培養し
た後、ハイグロマイシンＢを５２５μg／ml含んだプロ
トプラスト再生培地を５ml(４５℃に保温)オーバーレイ
した。２８℃で１０〜１４日間培養することにより、ハ
イグロマイシンＢ耐性となった形質転換体アクレモニウ
ム・クリソゲナムＴＡ−４株(ＩＦＯ３２３２３、ＦＥ
ＲＭＰ−１１６１７)を得た。

【００２９】実施例１０形質転換株の培養実施例９で得られた形質転換株をグルコース１％、コー
ン・スティープ・リカー３％、ソルブルスターチ３％、
ＣaＣＯ₃０.５％を含む培地(pＨ７.０)で２８℃、５日
間培養した後分生胞子を集めた。分生胞子をハイグロマ
イシンＢを７５μg／ml含むトリプテイカーゼ・ソイ・
アガー(ベクトン・アンド・カンパニー製)プレートにま
き、ハイグロマイシンＢ耐性株を分離することにより安
定な形質転換株を得た。以上のようにして単胞子分離し
た形質転換株のうち、ＴＡ−４株(ＩＦＯ３２３２３)
を、サッカロース５％、ＤＬ−メチオニン０.５％、ソ
イ・ビーン・フラワー３.２％、チオ硫酸ナトリウム０.
１％、コーン・スティープ・リカー０.５％およびＣaＣ
Ｏ₃０.１５％を含む培地(pＨ６.８)に接種して、回転式
振盪機(２４０rpm)上で、２８℃で５日間培養し培養液
を遠心分離して得られた上清液中のβ−ラクタム抗生物
質の生成量を測定したところ、ＴＡ−４株はアクレモニ
ウム・クリソゲナムＣ−２８をプラスミドpＧＨ２(ハイ
グロマイシンＢ耐性遺伝子を含む)を用いて形質転換す
ることにより得られたＴ１株に比べデアセチルＣＰＣの
蓄積量はほとんど同じであったが、ペニシリンＮの副成
量が１７０％も増加していた。

【００３０】参考例１１)アクレモニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮＡの調
製アクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０株の
凍結保存菌体をサッカロース３０g／リットル、肉エキ
ス１５g／リットル、コーン・スティープ・リカー５g／
リットル、ＣaＣＯ₃１.５g／リットルを含む培地(pＨ
７.０)に接種し、２８℃で４８時間、回転式振盪機(２
００rpm)上で培養する。培養液１リットルを濾別して得
られる菌体から、ピイ・エフ・ハムリン(Ｐ.Ｆ.Ｈamly
n)らの方法[エンザイム・マイクロバイオロジカル・テ
クノロジー(Ｅnzyme Ｍicrobiological Ｔechnolog
y),３,３２１(１９８１)参照]に従ってプロトプラスト
を調製した。得られたプロトプラストからディー・アー
ル・クライヤー(Ｄ.Ｒ.Ｃryer)らの方法[メソッド・イ
ン・セル・バイオロジー(Ｍethod in Ｃell Ｂiolog
y),ＸＩＩ,３９(１９７５)参照]に従い、約５mgの染色
体ＤＮＡを得た。

【００３１】２)アクレモニウム・クリソゲナムのジー
ンライブラリの作製前記１)項で得た染色体ＤＮＡ３０μgに５.４ユニット
の制限酵ＭboＩを３７℃で２０分間作用させ、部分切断
した後、dＡＴＰとdＧＴＰの存在下でＤＮＡポリメラー
ゼＩラージフラグメント[polymerase Ｉ large fragmen
t(宝酒造製、日本)]を作用させた。これとファージベク
ターλＦixのＸhoＩ切断断片、partialfill−inアーム
(ストラタジーン・クローニング・システム社製、ＵＳ
Ａ)とをＴ４ＤＮＡligaseにより連結した。この連結反
応液を、ギガパック・ゴールド[(Ｇigapack gold)、ス
トラタジーン・クローニング・システム社製、ＵＳＡ]
を用いて、インビトロ・パッケージング(in vitro pa
ckaging)を行なった。以上のようにして作製したジーン
ライブラリーのタイターは、指示細菌としてエシェリヒ
ア・コリＬＥ３９２を用いて調べた結果、６.５×１０⁶
pfu／mlであった。

【００３２】３)ジーンライブラリーからのグリセロア
ルデヒド−３−リン酸脱水素酵素(glyceraldehyde−３
−phosphate dehydrogenase)(ＧＬＤ)遺伝子のスクリ
ーニング前記２)項で作製したジーンライブラリーをプレートあ
たり６０００個のプラークが出現するように希釈した
後、指示細菌としてエシェリヒア・コリＬＥ３９２を用
いてプレート上にプラークを出現させた。このプレート
から前記「モレキュラー・クローニング」の第３２０〜３
２１頁に記載の方法に従ってプラークをニトロセルロー
スフィルターにリフトした。ニックトランスレーション
法(前記「モレキュラー・クローニング」、第１０９〜１
１２頁参照)により³²Ｐで放射能ラベルしたプラスミドp
ＧＬＤ１９の２.３kbpのＨindＩＩＩ断片(サッカロミセ
ス・セレビシェのＧＬＤ遺伝子を含む)を、プローブと
して、プラークハイブリダイゼーション(前記、「モレキ
ュラー・クローニング」、第３２６〜３２８頁参照)を３
０％ホルムアミド、０.７５Ｍ塩化ナトリウム、０.０７
５Ｍクエン酸ナトリウム、０.５％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、５０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.５)、１００μg
／ml熱変性サケ精子ＤＮＡ、を含むハイブリダイゼーシ
ョン溶液中で４２℃、１６時間行なった。プローブとハ
イブリダイズが認められたポジティブプラークから前
記、「モレキュラー・クローニング」、第３７１〜３７２
頁記載の方法に従いλＤＮＡを分離した。得られたλＤ
ＮＡを制限酵素ＢamＨＩで切断した後アガロースゲル
(０.８％)電気泳動した。この電気泳動ゲルから、サザ
ン(Ｓouthern)法(前記、「モレキュラー・クローニン
グ」、第３８２〜３８６頁参照)により、ニトロセルロー
スフィルターにＤＮＡを転写した。³²Ｐ放射能ラベルし
たプラスミドpＧＬＤ１９の２.３kbpのＨindＩＩＩ断片
(サッカロミセス・セレビシェのＧＬＤ遺伝子を含む)
と、前記ＤＮＡ結合ニトロセルロースフィルターのサザ
ン雑種形成(前記、「モレキュラー・クローニング」、第
３８７〜３８９頁参照)を、３０％ホルムアミド、０.７
５Ｍ塩化ナトリウム、０.０７５Ｍクエン酸ナトリウ
ム、０.５％ドデシル硫酸ナトリウム、５０mＭトリス塩
酸緩衝液(pＨ７.５)および１００μg／熱変性サケ精子
ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃、
１６時間行なった。その結果、４.５kbpのＢamＨＩ断片
とハイブリダイズが認められた。

【００３３】４)ＧＬＤ遺伝子のサブクローニング前記３)で得たλＤＮＡを制限酵素ＢamＨＩで切断した
後、４.５kbpのＢamＨＩ断片をアガロースゲル(１.０
％)電気泳動(前記、「モレキュラー・クローニング」、第
１５０〜１６２頁参照)および電気泳動溶出法(高木康敬
著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社サイエンテ
ィフィク、１９８２年、参照)により単離した。一方ベ
クタープラスミドpbluescript ＳＫ＋を制限酵素Ｂam
ＨＩで切断した。このようにして得られた２種類のＤＮ
Ａ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結反応を行な
った。この連結反応液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ
１０９株を形質転換することにより、pbluescript ＳＫ
＋のＢamＨＩサイトに４.５kbpのＢamＨＩ断片(アクレ
モニウム・クリソゲナムのＧＬＤ遺伝子を含む)が挿入
された図４４に示すプラスミドpＧＬ１３を得た。

【００３４】参考例２１)プラスミドpＣＨ１の作製ハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子
を含むプラスミドpＧＬ６２「Ｌ.Ｇritz et al.,ジー
ン(Ｇene),２５,１７９(１９８３)参照]からハイグロマ
イシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子のプロモー
ターとアミノ基末端から３個のアミノ酸が欠失したプラ
スミドpＣＨ１(図４５参照)をカスター(Ｋaster)らの方
法[カレント・ジェネティクス(Ｃurrent Ｇenetics),
８,３５３(１９８４)参照]に準じて作製した。

【００３５】２)プラスミドpＧＬ６の作製(図４６参照)プラスミド pＧＬ１３をＥcoＲＩとＸhoＩで切断した後、アガ
ロースゲル(１.０％)電気泳動(前記、「モレキュラー・
クローニング」、第１５０〜１６２頁参照)および電気泳
動溶出法(高木康敬著「遺伝子操作マニュアル」第３３
頁、講談社サイエンティフィク、１９８２年、参照)に
より単離した。２.０kbpのＥcoＲＩ−ＸhoＩ断片をＳau
３ＡＩで切断した後、アルカリフォスファターゼ(宝酒
造製、日本)を作用させた。これをポリアクリルアミド
ゲル(１０％)電気泳動した後、約８０bpのＥcoＲＩ−Ｓ
au３ＡＩ断片を、前記、「モレキュラー・クローニン
グ」、第１７３頁記載の方法に従って単離した。一方、
２種類の１４mer合成オリゴヌクレオタイド(５'−ＧＡ
ＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＧ、５'−ＧＡＴＣＣＡＴＴＴ
ＴＧＡＴＡ)をそれぞれＴ４ポリヌクレオタイド・キナ
ーゼ(宝酒造製、日本)により、５'末端をリン酸化した
後、アニーリングさせることによりＢglＩＩ−ＢamＨＩ
アダプター(図４６参照)を作製した。次に、ベクタープ
ラスミドpＵＣ１９をＢamＨＩで切断した後、アルカリ
フォスファターゼ(宝酒造製、日本)を作用させ、さらに
ＥcoＲＩで切断した後アガロースゲル(１.０％)電気泳
動(前記、「モレキュラー・クローニング」、第１５０〜
１６２頁参照)および電気泳動溶出法(高木康敬著「遺伝
子操作マニュアル」第３３頁、講談社サイエンティフィ
ク、１９８２年、参照)により、２.７kbpのＥcoＲＩ−
ＢamＨＩ断片を単離した。以上の約８０bpのＥcoＲＩ−
Ｓau３ＡＩ断片、ＢglＩＩ−ＢamＨＩアダプター、およ
び２.７kbpのＥcoＲＩ−ＢamＨＩ断片をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結することにより、プラスミドpＧＬ
６を作製した。

【００３６】３)プラスミドpＧＬ６９の作製(図４７参
照) 前項のプラスミドpＧＬ６をＥcoＲＩとＢamＨＩで切断
した後、ポリアクリルアミドゲル(１０％)電気泳動した
後、約９０bpのＥcoＲＩ−ＢamＨＩ断片を、前記、「モ
レキュラー・クローニング」第１７３頁記載の方法に従
って単離した。一方、参考例１−４)記載のプラスミドp
ＧＬ１３をＥcoＲＩとＰstＩで切断した後、アガロース
ゲル(１.０％)電気泳動(前記、「モレキュラー・クロー
ニング」、第１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶
出法(高木康敬著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講
談社サイエンティフィク、１９８２年、参照)により、
１.２kbpのＥcoＲＩ−ＰstＩ断片を単離した。ベクター
プラスミドpＨＳＧ３９８(宝酒造製、日本)をＰstＩと
ＢamＨＩで切断した後、アガロースゲル(１.０％)電気
泳動(前記、「モレキュラー・クローニング」、第１５０
〜１６２頁参照)および電気泳動溶出法(高木康敬著「遺
伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社サイエンティフ
ィク、１９８２年、参照)により、２.２kbpのＰstＩ−
ＢamＨＩ断片を単離した。以上の約９０bpのＥcoＲＩ−
ＢamＨＩ断片、１.２kbpのＥcoＲＩ−ＰstＩ断片、２.
２kbpのＰstＩ−ＢamＨＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結することにより、プラスミドpＧＬ６９を作
製した。

【００３７】参考例３参考例２−３)で作製したpＧＬ６９をＢamＨＩとＨindI
IIで切断した後、アガロースゲル(１.０％)電気泳動(前
記、「モレキュラー・クローニング」、第１５０〜１６２
頁参照)および電気泳動溶出法(高木康敬著「遺伝子操作
マニュアル」第３３頁、講談社サイエンティフィク、１
９８２年、参照)により、１.３kbpのＢamＨＩ−ＨindII
I断片を単離した。参考例２−１)で作製したプラスミド
pＣＨ１をＨindIIIとＢamＨＩで切断した後、アガロー
スゲル(１.０％)電気泳動(前記、「モレキュラー・クロ
ーニング」、第１５０〜１６２頁参照)および電気泳動溶
出法(高木康敬著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講
談社サイエンティフィク、１９８２年、参照)により、
１.６kbpのＨindIII−ＢamＨＩ断片を単離した。ベクタ
ープラスミドpＨＳＧ３９８(宝酒造製)をＨindIIIで切
断した後、アルカリフォスファターゼ(宝酒造製)を作用
させた。以上の１.３kbpのＢamＨＩ−ＨindIII断片、
１.６kbpのＨindIII−ＢamＨＩ断片、pＨＳＧ３９８の
ＨindIII断片をＴ４リガーゼを用いて連結することによ
りプラスミドpＧＨ２１(図４８参照)を作製した。

【００３８】

【発明の効果】本発明のアクレモニウム・クリソゲナム
由来のδ−(Ｌ−α−アミノアジピル)−Ｌ−システィニ
ル−Ｄ−バリンシンセターゼ合成酵素遺伝子を有する
ＤＮＡ断片は、細菌(例えば、エシェリヒア・コリ)やカ
ビ(例えば、アクレモニウム・クリソゲナム)を宿主とし
て効率的に発現させることができ、この酵素遺伝子を有
するＤＮＡ断片を用いることによって、セファロスポリ
ン系抗生物質の生産性の向上が可能である。

【００３９】配列番号：１配列の長さ：１３０５８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡ起源生物名：アクレモニウム・クリソゲナム株名：ＡＴＣＣ１１５５０株配列 CCATGGTGAC GGTTTGTCCT GCCTGGTGTA AGATGTGAAA GACGAGATAT GCGTGAGTGA 60 CGATGGCGGA AGGAGAAGCC TCGAAAATCA GAAGAGCGAC CAAAGGGATA TTCAAGTATT 120 CGCCCCTCTT GAAGCTGTTT ATACGGGCGG CTGGGTGTGT GTATGTGTAC TTGAGTACCT 180 ACCTCGTGTC TCCCGTTGCT ATACGATATG AGCTTCCCCA CGACGCGCCT TTATGGCCTG 240 ACCAAGGTCT CGATTATCCG GCTCCTGCGG GTGCACTGCC GAGGGGGGTT ACATACGGTC 300 CAGCAGCGGC GATGGAGTTT GGTCCCTGAA GACTGCATGG CGGGGCCAAG CGATGAGGAA 360 CGCCGTTACA TGCATGTGCA TGTAGACGCC GCCACCCACA TGAGGCCCGG AACAGTCTAT 420 CGAAGCTCAG GGATTGGCCC GGCAACTCGA CGCCCCCGTC GAGCGGCTCA CCGGTAGTCG 480 ACGGCGTCCG TCGGAATCTC GCGCTGCTGC GGGCCACCAC GGCGATGGGC CGTACACACT 540 GCTACTACGG TGTACAATGT ATCATGTACC CGATCGACGA GGAACTCGGG GTAGAGGTAC 600 CCCGTACAAT CCAGTTTCTC AACCCAATGG AACCACACAT ACGGGGTGGC TTTGGGTTCA 660 CGTTGCACTT TAAACTCGCA GACGAGGGAC CGACCTGCAG CGTGGCCCAC TTCTGAAGCC 720 TGCCCAGCTT TCTGCAAGAC GCGGGCCATC GCGCTTGGCC GAGGAGAGAA AGGGTATCCA 780 TGGCGACAAA GGCGGTCCTG GTGGGTTCGG TGCCGGCTTT GGAGTTCACT GGTCTGGGTG 840 GGTGGCCAGC TGGATGCATG CATTGGCCTG TATCAAAGGT CCGGGATTCC CCAGGAGTAT 900 AAGACGTTCG TGCTGGGAGA TCTAGCGACG TGTTGGGAAA TATCGGCCGT AGAGTGCGAA 960 AAAGAACTGG CGGAAATATT TCTCCTTGGA CTCGGTCACA CTCAGTCAGT AGTGGACTGC 1020 CAGTCTATCA TACACCTTTG ATATCAACAT GACTATCCTT ACAGGTGCCG ACGACGCCTC 1080 GTCATACCAC AGGTATGTCT TCACAGCCTC TGGAAAGCGC AGTTGGGAGC TATCTCTAAC 1140 ATTACCACAT CAGGCGCAAT GGAAGCTCTG ATATCCCAAA AGGTGCCATC CACCGCAACG 1200 GCTTCGCAGC CGCAGCCCCT GACTGCTGGA TCCGGTCCGT GGCCCTGGAA CAGTGGAAGA 1260 CTACGGTCCA GTCCGTCTCG GAGCGGTGCG ATCTGAGCGG GCTGAGCCAG CATCCCACCG 1320 ACTACCAGCT GGCCTCTACG GGCGTGAAGG GCGCAGGCGG TAGCAGCATC GAGGAGCGCA 1380 GTGCCATCGT CTCAGACGAG TTGTTCTCGA GTCTGCGAGA CGTGTGCTCA CAGAGACAGC 1440 TGGACCCTCG GTCACTCATG CTGTTTTCCG TGCACCAGAT GCTCAAGAGG TTCGGAAACG 1500 GATCTCACAC CGTCGTGGCG TCACTCGTAA CTTCATCAGA GGGATGCCCT TCAACTTCGG 1560 CCTGGAGGGC CATCCCCTCC GTCATCCATC ATATAGAGGG CGGAGACAAC AACAACACAG 1620 TCGCCTCTGC CGTGGAACAG GCGGCGAATC TCCTGAACTC AGAAGGATCG GGACAGGACC 1680 TTCTGATTCC CATCGGACTC ACTGAGCTCG TCAAGTCGGA GCTGATTGAC CTCCTGGTCA 1740 TCTTCGACGA CGAGACAAAT AACATACGAC TGCCGCAGGA CTTCCCACTT ATCCTGCGGA 1800 TACATCAGCG GCAAGACCAC TGGCAGCTGT CAGTCCGGTA TCCCTCGCCC CTTTTCGACA 1860 CCATGGTCAT CGACAGCTTT CTGAGCGCAC TTCACAACCT GTTGTCCGCG GTGACAAAAC 1920 CCTCCCAGCT CGTGCGCGAC ATCGAGCTGC TCCCAGAATA CCAGGTCGCT CAGCTGGAGA 1980 AGTGGAACAA CACAGACGGC GACTACCCCA CCGAGAAGCG GCTACATCAT CTGTTCGAGG 2040 AGGCAGCAGT GCGTCGTCCC CAACACGTTG CCCTCATCTG CGGCGACAAG CGCATCACCT 2100 ATGAGGAGTT GAATGCTATG GCGAATCGCC TGGCCCACCA TCTGGTATCC TCGGGTATCC 2160 AGACTGAGCA GCTCGTCGGT CTCTTCCTCG ACAAGACCGA GCTCATGATC GCTACTATTC 2220 TGGGCATCTG GAAATCTGGT GCCGCGCATG TACCTATCGA CCCTGGGTAC CCGGACGAGC 2280 GTGTCAAGTT CGTCCTGAAT GATACGAAGG CGCAAGTGGT CATTGCTAGT CAGAGGCACG 2340 TCGATCGACT GCGGGCTGAG GCTGTTGGCG GCCAGCATCT TCGCATCATC GGTCTCGAAT 2400 CTCTGTTCGA CAACCTTGCT CAACAGACAC AACACTCACC AGAGACGTCG GGCAATTTGA 2460 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【００４０】配列番号：２配列の長さ：３６３９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：アクレモニウム・クリソゲナム株名：ＡＴＣＣ１１５５０株配列 ATG CTG TTT TCC GTG CAC CAG ATG CTC AAG AGG TTC GGA AAC GGA TCT 1505 Met Leu Phe Ser Val His Gln Met Leu Lys Arg Phe Gly Asn Gly Ser 1 5 10 15 CAC ACC GTC GTG GCG TCA CTC GTA ACT TCA TCA GAG GGA TGC CCT TCA 1553 His Thr Val Val Ala Ser Leu Val Thr Ser Ser Glu Gly Cys Pro Ser 20 25 30 ACT TCG GCC TGG AGG GCC ATC CCC TCC GTC ATC CAT CAT ATA GAG GGC 1601 Thr Ser Ala Trp Arg Ala Ile Pro Ser Val Ile His His Ile Glu Gly 35 40 45 GGA GAC AAC AAC AAC ACA GTC GCC TCT GCC GTG GAA CAG GCG GCG AAT 1649 Gly Asp Asn Asn Asn Thr Val Ala Ser Ala Val Glu Gln Ala Ala Asn 50 55 60 CTC CTG AAC TCA GAA GGA TCG GGA CAG GAC CTT CTG ATT CCC ATC GGA 1697 Leu Leu Asn Ser Glu Gly Ser Gly Gln Asp Leu Leu Ile Pro Ile Gly 65 70 75 80 CTC ACT GAG CTC GTC AAG TCG GAG CTG ATT GAC CTC CTG GTC ATC TTC 1745 Leu Thr Glu Leu Val Lys Ser Glu Leu Ile Asp Leu Leu Val Ile Phe 85 90 95 GAC GAC GAG ACA AAT AAC ATA CGA CTG CCG CAG GAC TTC CCA CTT ATC 1793 Asp Asp Glu Thr Asn Asn Ile Arg Leu Pro Gln Asp Phe Pro Leu Ile 100 105 110 CTG CGG ATA CAT CAG CGG CAA GAC CAC TGG CAG CTG TCA GTC CGG TAT 1841 Leu Arg Ile His Gln Arg Gln Asp His Trp Gln Leu Ser Val Arg Tyr 115 120 125 CCC TCG CCC CTT TTC GAC ACC ATG GTC ATC GAC AGC TTT CTG AGC GCA 1889 Pro Ser Pro Leu Phe Asp Thr Met Val Ile Asp Ser Phe Leu Ser Ala 130 135 140 CTT CAC AAC CTG TTG TCC GCG GTG ACA AAA CCC TCC CAG CTC GTG CGC 1937 Leu His Asn Leu Leu Ser Ala Val Thr Lys Pro Ser Gln Leu Val Arg 145 150 155 160 GAC ATC GAG CTG CTC CCA GAA TAC CAG GTC GCT CAG CTG GAG AAG TGG 1985 Asp Ile Glu Leu Leu Pro Glu Tyr Gln Val Ala Gln Leu Glu Lys Trp 165 170 175 AAC AAC ACA GAC GGC GAC TAC CCC ACC GAG AAG CGG CTA CAT CAT CTG 2033 Asn Asn Thr Asp Gly Asp Tyr Pro Thr Glu Lys Arg Leu His His Leu 180 185 190 TTC GAG GAG GCA GCA GTG CGT CGT CCC CAA CAC GTT GCC CTC ATC TGC 2081 Phe Glu Glu Ala Ala Val Arg Arg Pro Gln His Val Ala Leu Ile Cys 195 200 205 GGC GAC AAG CGC ATC ACC TAT GAG GAG TTG AAT GCT ATG GCG AAT CGC 2129 Gly Asp Lys Arg Ile Thr Tyr Glu Glu Leu Asn Ala Met Ala Asn Arg 210 215 220 CTG GCC CAC CAT CTG GTA TCC TCG GGT ATC CAG ACT GAG CAG CTC GTC 2177 Leu Ala His His Leu Val Ser Ser Gly Ile Gln Thr Glu Gln Leu Val 225 230 235 240 GGT CTC TTC CTC GAC AAG ACC GAG CTC ATG ATC GCT ACT ATT CTG GGC 2225 Gly Leu Phe Leu Asp Lys Thr Glu Leu Met Ile Ala Thr Ile Leu Gly 245 250 255 ATC TGG AAA TCT GGT GCC GCG CAT GTA CCT ATC GAC CCT GGG TAC CCG 2273 Ile Trp Lys Ser Gly Ala Ala His Val Pro Ile Asp Pro Gly Tyr Pro 260 265 270 GAC GAG CGT GTC AAG TTC GTC CTG AAT GAT ACG AAG GCG CAA GTG GTC 2321 Asp Glu Arg Val Lys Phe Val Leu Asn Asp Thr Lys Ala Gln Val Val 275 280 285 ATT GCT AGT CAG AGG CAC GTC GAT CGA CTG CGG GCT GAG GCT GTT GGC 2369 Ile Ala Ser Gln Arg His Val Asp Arg Leu Arg Ala Glu Ala Val Gly 290 295 300 GGC CAG CAT CTT CGC ATC ATC GGT CTC GAA TCT CTG TTC GAC AAC CTT 2417 Gly Gln His Leu Arg Ile Ile Gly Leu Glu Ser Leu Phe Asp Asn Leu 305 310 315 320 GCT CAA CAG 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2160 TTT CTG CTT CTC TAC GTG TAC ACC AAC CAG CGG GAT ATC ACG ATT GGT 7985 Phe Leu Leu Leu Tyr Val Tyr Thr Asn Gln Arg Asp Ile Thr Ile Gly 2165 2170 2175 ATT CCC GTT GCG CAC CGT AAC CAT CCG GAC TTT GAG TCG GTT GTC GGC 8033 Ile Pro Val Ala His Arg Asn His Pro Asp Phe Glu Ser Val Val Gly 2180 2185 2190 TTC TTT GTC AAC TTG CTC CCT CTG CGG GTC AAC GTG TCT CAG TCG GAC 8081 Phe Phe Val Asn Leu Leu Pro Leu Arg Val Asn Val Ser Gln Ser Asp 2195 2200 2205 ATT CAT GGA CTT ATC CAG GCA GTG CAG AAA GAG CTT GTC GAT GCC CAG 8129 ile His Gly Leu Ile Gln Ala Val Gln Lys Glu Leu Val Asp Ala Gln 2210 2215 2220 ATC CAT CAG GAC TTG CCA TTC CAG GAG ATC ACC AAG CTT CTT CAT GTG 8177 Ile His Gln Asp Leu Pro Phe Gln Glu Ile Thr Lys Leu Leu His Val 2225 2230 2235 2240 CAG CAC GAT CCA AGC CGC CAT CCC CTT CTC CAG GCC GTG TTC AAC TGG 8225 Gln His Asp Pro Ser Arg His Pro Leu Leu Gln Ala Val Phe Asn Trp 2245 2250 2255 GAA AAC GTA CCC GCC AAT GTC CAC GAG GAG CAG CTG CTT CAG GAG TAC 8273 Glu Asn Val Pro Ala Asn Val His Glu Glu Gln Leu Leu Gln Glu Tyr 2260 2265 2270 AAG CCG CCC TCG CCT CTG CCT TCG GCG GCC AAG TTT GAT CTC AAC GTC 8321 Lys Pro Pro Ser Pro Leu Pro Ser Ala Ala Lys Phe Asp Leu Asn Val 2275 2280 2285 ACG GTG AAA GAG AGC GTC AAT TCG CTC AAC GTC AAC TTC AAC TAT CCT 8369 Thr Val Lys Glu Ser Val Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Asn Tyr Pro 2290 2295 2300 ACC AGC CTC TTC GAG GAG GAG ACC GTT CAG GGG TTC ATG GAA ACC TTC 8417 Thr Ser Leu Phe Glu Glu Glu Thr Val Gln Gly Phe Met Glu Thr Phe 2305 2310 2315 2320 CAT CTC CTT CTT CGA CAA CTG GCC CAC AAC AAG GCT AGC ACA AGC CTC 8465 His Leu Leu Leu Arg Gln Leu Ala His Asn Lys Ala Ser Thr Ser Leu 2325 2330 2335 TCG AAG CTG TCG GTT GAA GAT GGA GTG TTG AAT CCA GAG CCG ACT AAC 8513 Ser Lys Leu Ser Val Glu Asp Gly Val Leu Asn Pro Glu Pro Thr Asn 2340 2345 2350 CTT CAG CCC TCA AGC CGG GAC AGC GGA AAT TCA CTC CAT GGG CTC TTC 8561 Leu Gln Pro Ser Ser Arg Asp Ser Gly Asn Ser Leu His Gly Leu Phe 2355 2360 2365 GAG GAC ATC GTG GCC TCG ACC CCG GAC CGC ATC GCA ATT GCT GAC GGC 8609 Glu Asp Ile Val Ala Ser Thr Pro Asp Arg Ile Ala Ile Ala Asp Gly 2370 2375 2380 ACC AGG AGT CTC TCG TAC TCC GAA CTC AAC GAG CGG GCA AAC CAG CTG 8657 Thr Arg Ser Leu Ser Tyr Ser Glu Leu Asn Glu Arg Ala Asn Gln Leu 2385 2390 2395 2400 GTA CAT TTG ATC ATC TCT TCT GCC AGT ATT GTA GCA GAC GAC CGC ATC 8705 Val His Leu Ile Ile Ser Ser Ala Ser Ile Val Ala Asp Asp Arg Ile 2405 2410 2415 GCT CTT CTT TTG GAC AAG AGC ATC GAT ATG GTG ATT GCT CTC CTG GCA 8753 Ala Leu Leu Leu Asp Lys Ser Ile Asp Met Val Ile Ala Leu Leu Ala 2420 2425 2430 GTT TGG AAG GCC GGT GCC GCA TAT GTG CCC CTT GAC CCG ACA TAT CCG 8801 Val Trp Lys Ala Gly Ala Ala Tyr Val Pro Leu Asp Pro Thr Tyr Pro 2435 2440 2445 TCG CAG AGG ACT GAG CTC ATC TTG GAG GAA TCT AGT GCC AGG ACG CTC 8849 Ser Gln Arg Thr Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ser Ser Ala Arg Thr Leu 2450 2455 2460 ATC ACC ACT AGA AAG CAC ACG CCG AGG GGA GGA ACA GTC GCA AAT GTT 8897 Ile Thr Thr Arg Lys His Thr Pro Arg Gly Gly Thr Val Ala Asn Val 2465 2470 2475 2480 CCA TCC GTG GTC CTT GAC AGC CCC GAG ACC CTA GCC TGC CTC AAC CAG 8945 Pro Ser Val Val Leu Asp Ser Pro Glu Thr Leu Ala Cys Leu Asn Gln 2485 2490 2495 CAG TCA AAG GAA AAC CCG ACA ACG TCA ACG CAG AAA CCG TCC GAC CTC 8993 Gln Ser Lys Glu Asn Pro Thr Thr Ser Thr Gln Lys Pro Ser Asp Leu 2500 2505 2510 GCA TAT GTC ATC TTC ACC TCG GGA ACC ACA GGC AAG CCC AAG GGG GTT 9041 Ala Tyr Val Ile Phe Thr Ser Gly Thr Thr Gly Lys Pro Lys Gly Val 2515 2520 2525 CTG GTG GAG CAC CAG AGC GTA GTC CAG CTG CGC AAT TCC CTC ATC GAG 9089 Leu Val Glu His Gln Ser Val Val Gln Leu Arg Asn Ser Leu Ile Glu 2530 2535 2540 CGA TAC TTC GGC GAG ACC AAC GGG TCT CAC GCC GTG CTC TTC CTG TCC 9137 Arg Tyr Phe Gly Glu Thr Asn Gly Ser His Ala Val Leu Phe Leu Ser 2545 2550 2555 2560 AAC TAC GTC TTC GAC TTC TCT CTT GAA CAG CTC TGT CTC TCA GTC TTG 9185 Asn Tyr Val Phe Asp Phe Ser Leu Glu Gln Leu Cys Leu Ser Val Leu 2565 2570 2575 GGT GGA AAC AAG CTC ATC ATT CCA CCA GAG GAG GGT CTC ACG CAC GAG 9233 Gly Gly Asn Lys Leu Ile Ile Pro Pro Glu Glu Gly Leu Thr His Glu 2580 2585 2590 GCA TTC TAC GAC ATC GGC CGC AGG GAG AAG CTA TCC TAT CTC AGC GGG 9281 Ala Phe Tyr Asp Ile Gly Arg Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Leu Ser Gly 2595 2600 2605 ACG CCC TCG GTG CTG CAG CAG ATT GAG CTC TCC CGT CTG CCG CAT CTT 9329 Thr Pro Ser Val Leu Gln Gln Ile Glu Leu Ser Arg Leu Pro His Leu 2610 2615 2620 CAC ATG GTC ACC GCT GCG GGC GAG GAG TTC CAC GCT AGT CAG TTT GAG 9377 His Met Val Thr Ala Ala Gly Glu Glu Phe His Ala Ser Gln Phe Glu 2625 2630 2635 2640 AAG ATG CGC TCC CAG TTC GCG GGC CAG ATC AAC AAC GCC TAT GGT ATC 9425 Lys Met Arg Ser Gln Phe Ala Gly Gln Ile Asn Asn Ala Tyr Gly Ile 2645 2650 2655 ACT GAG ACG ACC GTG TAC AAC ATC ATC ACC ACG TTC AAG GGC GAT GCC 9473 Thr Glu Thr Thr Val Tyr Asn Ile Ile Thr Thr Phe Lys Gly Asp Ala 2660 2665 2670 CCC TTT ACC AAG GCA CTC TGC CAC GGG ATC CCC GGA AGT CAC GTC TAC 9521 Pro Phe Thr Lys Ala Leu Cys His Gly Ile Pro Gly Ser His Val Tyr 2675 2680 2685 GTC CTG AAC GAC CGA CTT CAG CGT GTT CCT TTC AAC GCT GTT GGC GAG 9569 Val Leu Asn Asp Arg Leu Gln Arg Val Pro Phe Asn Ala Val Gly Glu 2690 2695 2700 CTC TAC TTG GGC GGT GAC TGC CTT GCT CGC GGG TAC CTC AAC CAG GAT 9617 Leu Tyr Leu Gly Gly Asp Cys Leu Ala Arg Gly Tyr Leu Asn Gln Asp 2705 2710 2715 2720 GCC CTG ACC AAC GAG CGA TTC ATC CCC AAC CCT TTC TAC GAG CCG AAA 9665 Ala Leu Thr Asn Glu Arg Phe Ile Pro Asn Pro Phe Tyr Glu Pro Lys 2725 2730 2735 CAG GCA AGT GAC AGT CGT CCC CAG AGA CTC TAC AAG ACT GGA GAT CTG 9713 Gln Ala Ser Asp Ser Arg Pro Gln Arg Leu Tyr Lys Thr Gly Asp Leu 2740 2745 2750 GTG CGC TTC CGT GGA CCC CAC CAT CTC GAG TAT CTC GGC CGC AAG GAC 9761 Val Arg Phe Arg Gly Pro His His Leu Glu Tyr Leu Gly Arg Lys Asp 2755 2760 2765 CAG CAG GTC AAG CTG AGG GGC TTC CGC ATC GAG CTC TCC GAG GTG CGG 9809 Gln Gln Val Lys Leu Arg Gly Phe Arg Ile Glu Leu Ser Glu Val Arg 2770 2775 2780 GAT GCC GTC CTA GCC ATC TCT GCT GTT AAG GAG GCT GCC GTC ATC CCC 9857 Asp Ala Val Leu Ala Ile Ser Ala Val Lys Glu Ala Ala Val Ile Pro 2785 2790 2795 2800 AAG TAT GAC GAG GAT GGC TCC GAT TCA CGA AGG GTC AGC GCC ATC GTC 9905 Lys Tyr Asp Glu Asp Gly Ser Asp Ser Arg Arg Val Ser Ala Ile Val 2805 2810 2815 TGC TAC TAC ACG CTC AAC GCC GGA ACT GTG TGC GAA GCA TCG AGT ATC 9953 Cys Tyr Tyr Thr Leu Asn Ala Gly Thr Val Cys Glu Ala Ser Ser Ile 2820 2825 2830 CGT GAC CAC CTG CAC GCC AAC CTT CCC CCG TAC ATG GTC CCA AGT CAG 10001 Arg Asp His Leu His Ala Asn Leu Pro Pro Tyr Met Val Pro Ser Gln 2835 2840 2845 ATC CAC CAG TTG GAG GGA TCT CTC CCC GTG ACC GTC AAT GGG AAG CTC 10049 Ile His Gln Leu Glu Gly Ser Leu Pro Val Thr Val Asn Gly Lys Leu 2850 2855 2860 GAC CTG AAC AGG CTC TCC ACA ACT CAA GTC TCG CAG CCA GAG CTT TAC 10097 Asp Leu Asn Arg Leu Ser Thr Thr Gln Val Ser Gln Pro Glu Leu Tyr 2865 2870 2875 2880 ACC GCT CCA CGA AAT TCG ACA GAG GAA ACC TTG TGC CAG CTT TGG GCA 10145 Thr Ala Pro Arg Asn Ser Thr Glu Glu Thr Leu Cys Gln Leu Trp Ala 2885 2890 2895 TCT CTC CTA GGC GTC GAC CAC TGC GGC ATT GAC GAC GAC CTG TTT GCC 10193 Ser Leu Leu Gly Val Asp His Cys Gly Ile Asp Asp Asp Leu Phe Ala 2900 2905 2910 CGA GGC GGC GAC AGC ATC TCC TCT CTC CGA CTA GTG GGT GAC ATC TAC 10241 Arg Gly Gly Asp Ser Ile Ser Ser Leu Arg Leu Val Gly Asp Ile Tyr 2915 2920 2925 CGC GCG CTA GGA CGC AAG GTC ACC GTC AAG GAC ATC TAC CTC CAC CGC 10289 Arg Ala Leu Gly Arg Lys Val Thr Val Lys Asp Ile Tyr Leu His Arg 2930 2935 2940 AGC GTC CGA GCC CTA AGC GAA AAT GTC CTG ACC GAC CAG AAG GAT AAG 10337 Ser Val Arg Ala Leu Ser Glu Asn Val Leu Thr Asp Gln Lys Asp Lys 2945 2950 2955 2960 GGT ACT CTG CCA GCG TCT CCT CCC CTC CAG CGA GCG GAG CAG GGC CAG 10385 Gly Thr Leu Pro Ala Ser Pro Pro Leu Gln Arg Ala Glu Gln Gly Gln 2965 2970 2975 GTT GAG GGC GAC GCA CCG CTT CTC CCC ATC CAG GAC TGG TTC CTT TCC 10433 Val Glu Gly Asp Ala Pro Leu Leu Pro Ile Gln Asp Trp Phe Leu Ser 2980 2985 2990 AAG CCC CTG GAT AAC CCC GCT TAC TGG AAC CAC TGC TTC ACC ATT CGA 10481 Lys Pro Leu Asp Asn Pro Ala Tyr Trp Asn His Cys Phe Thr Ile Arg 2995 3000 3005 ACC GGG GCA CTC TCC GTC GAA GGG CTC CGG GGT GCT CTG AAG CTG CTG 10529 Thr Gly Ala Leu Ser Val Glu Gly Leu Arg Gly Ala Leu Lys Leu Leu 3010 3015 3020 CAG GAG CGC CAG CAC GTG CTG CGT CTG AGA CTG CAA CGC CGG GAC GAA 10577 Gln Glu Arg Gln His Val Leu Arg Leu Arg Leu Gln Arg Arg Asp Glu 3025 3030 3035 3040 GGT CGC CAT GTT CAG ACC TTT GCG CGT GAC TGC GCG CAA CCT CGC TTG 10625 Gly Arg His Val Gln Thr Phe Ala Arg Asp Cys Ala Gln Pro Arg Leu 3045 3050 3055 ACT GTG CTA GAC CGA CGA AGC TTC GAG GAC GCA GAG GAT GTA CAG GAG 10673 Thr Val Leu Asp Arg Arg Ser Phe Glu Asp Ala Glu Asp Val Gln Glu 3060 3065 3070 GCT CTC TGC GAG ATC CAA TCT CAT TTC GAC CTC GAG AAT GGA CCC CTC 10721 Ala Leu Cys Glu Ile Gln Ser His Phe Asp Leu Glu Asn Gly Pro Leu 3075 3080 3085 TAC ACA GTG GCG TAC ATC CAC GGT TAC GAG GAC GGC TCC GCC CGA GTG 10769 Tyr Thr Val Ala Tyr Ile His Gly Tyr Glu Asp Gly Ser Ala Arg Val 3090 3095 3100 TGG TTT GCC TGC CAT CAC GTC ATG GTC GAC ACT GTG AGC TGG AAC ATT 10817 Trp Phe Ala Cys His His Val Met Val Asp Thr Val Ser Trp Asn Ile 3105 3110 3115 3120 ATA CTG CAA GAC CTG CAG GCT CTC TAT CAT GGA GAC AGC CTT GGT CCC 10865 Ile Leu Gln Asp Leu Gln Ala Leu Tyr His Gly Asp Ser Leu Gly Pro 3125 3130 3135 AAG AGC AGC AGC GTG CAG CAG TGG TCG CTA GCT GTC AGC GAC TAC AAA 10913 Lys Ser Ser Ser Val Gln Gln Trp Ser Leu Ala Val Ser Asp Tyr Lys 3140 3145 3150 ATG CCA CTG TCG GAG AGG GCG CAT TGG AAT GTG CTC AGG AAG ACA GTC 10961 Met Pro Leu Ser Glu Arg Ala His Trp Asn Val Leu Arg Lys Thr Val 3155 3160 3165 GCC CAG AGC TTC GAG ACC CTG CCT ATC TGC ATG GGC GGC GTG CTC CAG 11009 Ala Gln Ser Phe Glu Thr Leu Pro Ile Cys Met Gly Gly Val Leu Gln 3170 3175 3180 TGC CAG GAG AAG TTC TCG AGG GAA ACG ACA ACA GCT CTG CTC TCC AAG 11057 Cys Gln Glu Lys Phe Ser Arg Glu Thr Thr Thr Ala Leu Leu Ser Lys 3185 3190 3195 3200 GCC TGC CCT GCC TTG GAC TCC GGT ATG CAT GAG ATC CTT CTC ATG GCC 11105 Ala Cys Pro Ala Leu Asp Ser Gly Met His Glu Ile Leu Leu Met Ala 3205 3210 3215 GTG GGC TCC GCG CTG CAG AAG GCG GCA GGG GAT GTC CCT CAG GTC GTC 11153 Val Gly Ser Ala Leu Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Pro Gln Val Val 3220 3225 3230 ACG ATA GAG GGT CAC GGG CGC GAA GAT ACT ATC GAC GCA ACT CTG GAC 11201 Thr Ile Glu Gly His Gly Arg Glu Asp Thr Ile Asp Ala Thr Leu Asp 3235 3240 3245 GTC AGC CGG ACA GTC GGC TGG TTC ACG AGC ATG TAC CCC TTC GAG ATC 11249 Val Ser Arg Thr Val Gly Trp Phe Thr Ser Met Tyr Pro Phe Glu Ile 3250 3255 3260 CCC AAA GTG ACC GAC CCC GCT CAG GGC GTC GTC GAT GTC AAG GAG GCG 11297 Pro Lys Val Thr Asp Pro Ala Gln Gly Val Val Asp Val Lys Glu Ala 3265 3270 3275 3280 ATG CGT CGC GTG CCG AAT AGG GGT GTC GGT TAC GGT CCA GCC TAC GGA 11345 Met Arg Arg Val Pro Asn Arg Gly Val Gly Tyr Gly Pro Ala Tyr Gly 3285 3290 3295 TAC GGC GGA TCG TCG CTG CCC GCG GTG AGC TTC AAC TAC CTT GGT CGC 11393 Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Pro Ala Val Ser Phe Asn Tyr Leu Gly Arg 3300 3305 3310 CTG GAC CAG GCT TCC TCG GGG GCT CAA AGG GAC TGG ACG CTG GTC ATG 11441 Leu Asp Gln Ala Ser Ser Gly Ala Gln Arg Asp Trp Thr Leu Val Met 3315 3320 3325 GAT GAA GAC GAG TAT CCG GTC GGA CTG TGC ACC AGC GCT GAG GAC TCG 11489 Asp Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Leu Cys Thr Ser Ala Glu Asp Ser 3330 3335 3340 GGA CGA AGC TCC TCC ATG GTG GAT TTC ACC TTC TCT ATC TCT GGC GGC 11537 Gly Arg Ser Ser Ser Met Val Asp Phe Thr Phe Ser Ile Ser Gly Gly 3345 3350 3355 3360 CAG CTT GTC ATG GAT ATG AGT AGC AGC TGG GGC CAC GGC GCA GCA AAT 11585 Gln Leu Val Met Asp Met Ser Ser Ser Trp Gly His Gly Ala Ala Asn 3365 3370 3375 GAA TTC GTT CGC ACA GTT CGT AAC ACA CTA GAT GAC TTG ATC AAA ACA 11633 Glu Phe Val Arg Thr Val Arg Asn Thr Leu Asp Asp Leu Ile Lys Thr 3380 3385 3390 ACG AGC AGC AGG GAC TTC AGC GCA CCT CTG CCT CCG TCG GAT CAG GAG 11681 Thr Ser Ser Arg Asp Phe Ser Ala Pro Leu Pro Pro Ser Asp Gln Glu 3395 3400 3405 TCC AGC TTC ACC CCT TAT TTT GTC TTC GAA GAG GGC GAG CGA CAC GGC 11729 Ser Ser Phe Thr Pro Tyr Phe Val Phe Glu Glu Gly Glu Arg His Gly 3410 3415 3420 GCT CCG CTC TTC CTG CTC CCA CCT GGC GAA GGC GGA GCG GAG AGC TAC 11777 Ala Pro Leu Phe Leu Leu Pro Pro Gly Glu Gly Gly Ala Glu Ser Tyr 3425 3430 3435 3440 TTC CAC AAC ATT GTC AAG GGT CTC CCG AAC CGC AAT CTT GTC GTG TTC 11825 Phe His Asn Ile Val Lys Gly Leu Pro Asn Arg Asn Leu Val Val Phe 3445 3450 3455 AAC AAT CAT TAC CGC GAG GAG AAG ACG CTC CGG ACC ATC GAG GCG CTG 11873 Asn Asn His Tyr Arg Glu Glu Lys Thr Leu Arg Thr Ile Glu Ala Leu 3460 3465 3470 GCC GAG TAC TAC CTG TCG CAC ATC CGA TCC ATC CAG CCG GAG GGG CCA 11921 Ala Glu Tyr Tyr Leu Ser His Ile Arg Ser Ile Gln Pro Glu Gly Pro 3475 3480 3485 TAC CAC ATC CTC GGC TGG AGT TTC GGA GGC ATC CTC GGT CTC GAG GCG 11969 Tyr His Ile Leu Gly Trp Ser Phe Gly Gly Ile Leu Gly Leu Glu Ala 3490 3495 3500 GCA AAG CGA TTG ACT GGC GAG GGT CAC AAG ATT GCC ACG CTG GCA CTT 12017 Ala Lys Arg Leu Thr Gly Glu Gly His Lys Ile Ala Thr Leu Ala Leu 3505 3510 3515 3520 ATC GAT CCG TAC TTT GAC ATC CCG TCC GCG TCC AAG GCC ATC GGC CAA 12065 Ile Asp Pro Tyr Phe Asp Ile Pro Ser Ala Ser Lys Ala Ile Gly Gln 3525 3530 3535 CCT GAC GAT GCC TGC GTC TTG GAC CCC ATA TAC CAC GTC TAC CAC CCG 12113 Pro Asp Asp Ala Cys Val Leu Asp Pro Ile Tyr His Val Tyr His Pro 3540 3545 3550 TCG CCG GAG AGC TTC AGG ACG GTG TCA TCT CTC ACT AAT CAC ATA GCC 12161 Ser Pro Glu Ser Phe Arg Thr Val Ser Ser Leu Thr Asn His Ile Ala 3555 3560 3565 CTG TTC AAG GCT ACC GAG ACG AAT GAC CAG CAT GGC AAT GCC ACG CAG 12209 Leu Phe Lys Ala Thr Glu Thr Asn Asp Gln His Gly Asn Ala Thr Gln 3570 3575 3580 CAG GCC CTG TAT GAG TGG TTT GCC ACG TGC CCT TTG AAC AAC CTG GAC 12257 Gln Ala Leu Tyr Glu Trp Phe Ala Thr Cys Pro Leu Asn Asn Leu Asp 3585 3590 3595 3600 AAG TTT TTG GCG GCC GAC ACG ATC AAG GTG GTT CCT CTG GAG GGT ACA 12305 Lys Phe Leu Ala Ala Asp Thr Ile Lys Val Val Pro Leu Glu Gly Thr 3605 3610 3615 CAT TTT ACC TGG GTG CAC CAC CCG GAG CAG GTG CGC TCA ATG TGC ACT 12353 His Phe Thr Trp Val His His Pro Glu Gln Val Arg Ser Met Cys Thr 3620 3625 3630 ATG CTG GAT GAA TGG CTT GGG TGA 12377 Met Leu Asp Glu Trp Leu Gly *** 3635

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（その
１）。

【図２】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（その
２）。

【図３】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（その
３）。

【図４】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（その
４）。

【図５】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（その
５）。

【図６】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（その
６）。

【図７】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（その
７）。

【図８】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（その
８）。

【図９】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（その
９）。

【図１０】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（そ
の１０）。

【図１１】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（そ
の１１）。

【図１２】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（そ
の１２）。

【図１３】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（そ
の１３）。

【図１４】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（そ
の１４）。

【図１５】実施例６で決定されたＤＮＡ塩基配列（そ
の１５）。

【図１６】リゾバクター・ラクタムゲヌスＹＫ９０の
ＡＣＶＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素切断地図と
実施例２で作成した４種のプローブ(ＭＭ,ＳＥ,ＢＸ,Ｘ
Ｓ)のリゾバクター・ラクタムゲヌスＹＫ９０のＡＣＶ
Ｓ遺伝子上での位置。

【図１７】プラスミドpＭＫ２−１３の制限酵素切断
地図。

【図１８】プラスミドpＭＫ２−１３,pＡＣＶ５,ＰＡ
ＣＶ１に含まれるアクレモニウム・クリソゲナムの染色
体ＤＮＡ断片の位置関係と塩基配列を決定した領域。

【図１９】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その１）。

【図２０】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その２）。

【図２１】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その３）。

【図２２】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その４）。

【図２３】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その５）。

【図２４】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その６）。

【図２５】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その７）。

【図２６】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その８）。

【図２７】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その９）。

【図２８】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その１０）。

【図２９】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その１１）。

【図３０】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その１２）。

【図３１】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その１３）。

【図３２】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その１４）。

【図３３】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その１５）。

【図３４】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その１６）。

【図３５】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その１７）。

【図３６】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その１８）。

【図３７】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その１９）。

【図３８】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その２０）。

【図３９】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その２１）。

【図４０】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その２２）。

【図４１】実施例７においてＤＮＡ塩基配列から予想
されたアクレモニウム・クリソゲナムのＡＣＶＳのアミ
ノ酸配列（その２３）。

【図４２】実施例８−１)で得られたプラスミドpＧＨ
２２の制限酵素切断地図。

【図４３】実施例８−２)で得られたプラスミドpＡＣ
ＶＨ１の制限酵素切断地図。

【図４４】参考例１−４)で得られたプラスミドpＧＬ
１３の制限酵素切断地図。

【図４５】参考例２で得られたプラスミドpＣＨ１の
制限酵素切断地図。

【図４６】プラスミドpＧＬ６９の調製法。

【図４７】プラスミドpＧＨ２の調製法。

【図４８】参考例３で得られたプラスミドpＧＨ２１
の制限酵素切断地図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 37/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アクレモニウム・クリソゲナム由来のδ
−(Ｌ−α−アミノアジピル)−Ｌ−システィニル−Ｄ−
バリンシンセターゼ(ＡＣＶＳ酵素)遺伝子をコードす
るＤＮＡ断片。
【請求項２】ＤＮＡ断片の塩基配列が配列表の配列番
号１で示されるものである請求項１記載のＤＮＡ断片。
【請求項３】請求項１または２記載のＤＮＡ断片を組
み込んだベクター。
【請求項４】請求項１記載のＤＮＡ断片または請求項
３記載のベクターで形質転換した微生物。
【請求項５】請求項４記載の形質転換体を培養し、Ａ
ＣＶＳ酵素を培養物中に蓄積させ、それを採取すること
を特徴とするＡＣＶＳ酵素の製造法。
【請求項６】 β−ラクタム抗生物質を産生する能力を
有する、請求項４記載の形質転換体を培養し、β−ラク
タム抗生物質を培養物中に蓄積させ、それを採取するこ
とを特徴とするβ−ラクタム抗生物質の製造法。