JPH06292586A - シスタチオニンγ−リアーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、アクレモニウム・クリソゲナム由
来であり、シスタチオニンγーリアーゼ遺伝子を単離
し、アクレモニウム・クリソゲナムの改良にこれを利用
することを目的とする。 【構成】 シスタチオニンγーリアーゼ遺伝子を含有す
るＤＮＡ断片であり、少なくとも配列表に示されるアミ
ノ酸配列をコードする新規な遺伝子を含有するＤＮＡ断
片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アクレモニウム・クリ
ソゲナム由来であり、システイン生合成酵素の一種であ
るシスタチオニンγ-リアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断
片、および該ＤＮＡ断片を組み込んだ組換え体ＤＮＡで
形質転換され該酵素活性が増強されたアクレモニウム・
クリソゲナムに関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床上重要なセファロスポリン系抗生物
質の出発原料であるセファロスポリンＣは、糸状菌であ
るアクレモニウム・クリソゲナムを用いた発酵法により
製造されている。従来、該菌のセファロスポリンＣ生産
能力を向上させるために用いられてきた技術は、突然変
異生成、それに続く高生産株のランダムスクリーニング
であった。しかし、近年、該菌を宿主とする形質転換系
の開発〔例えば、Queenerら、Microbiology 1985. Amer
ican Society for Microbiology, (1985) 468-472〕、
およびセファロスポリンＣ生合成酵素遺伝子のクローニ
ングが相次いで行われ、優良菌株の育種に遺伝子工学的
アプローチを施す道が開けてきた［例えば、Skatrud
ら、BIO/TECHNOLOGY (1989)7、477 ］。

【０００３】セファロスポリンＣは、アクレモニウム・
クリソゲナムにおいて、３種のアミノ酸（Ｌ−システイ
ン、Ｌ−バリン、Ｌ−リジンの生合成中間体であるＬ−
αーアミノアジピン酸）を出発原料として、５種類の酵
素による６ステップの反応を経て生合成されることが知
られている［例えば、Martinら、Trends in Biotechnol
ogy (1985) 3: 39-44参照］。現在までに、これら生合
成酵素のうち４種の酵素をコードする遺伝子が、それぞ
れアクレモニウム・クリソゲナムよりクローニングされ
［例えば、Samonら、Nature (1985) 318,191、Samson
ら、BIO/TECHNOLOGY (1987) 5,1207、Gutierresら、Jou
rnal of Bacteriology (1991) 173,2354-2365、EP04507
58］、分子育種に応用されつつある。

【０００４】一方、上述のとおりセファロスポリンＣ
は、生産菌の一次代謝産物である３種のアミノ酸を素材
として合成されるので、これらアミノ酸の供給系を強化
することも、抗生物質高生産株創製の一戦略となりう
る。これらアミノ酸の中でシステインに関しては、その
生合成とセファロスポリンＣ発酵との関連において、比
較的多くの研究が行われてきた。パン酵母（S.cerevisi
ae）、アカパンカビ（N.crassa）などと同様に、アクレ
モニウム・クリソゲナムにおいても、システインは通常
２つの経路により生合成されると考えられている。１つ
は、硫化水素によるｏ-アセチルセリンの硫化によりシ
ステインを生成する経路であり、他の１つは、メチオニ
ンの脱メチル化もしくはｏ-アセチルホモセリンの硫化
反応によって生成するホモシステインから、シスタチオ
ニンを経由してシステインへ至る経路である。そして、
アクレモニウム・クリソゲナムにおけるセファロスポリ
ンＣの発酵生産においては、後者、すなわち、シスタチ
オニンを経由する逆硫黄転移経路が重要な役割を担って
いることが明らかとなっている［Treichler et al.(197
9)Genetics of industrisl microorganisms.Proceeding
s of the Third International Symposium on Genetics
of Industrial Microorganisms.American Society for
Microbiology, Washington,D.C.,97-104］。

【０００５】したがって逆硫黄転移経路に関与する２種
の酵素（シスタチオニンγ-リアーゼ、シスタチオニン
β-シンターゼ）の遺伝子は、先述のセファロスポリン
Ｃ生合成遺伝子と同様に、セファロスポリンＣ生産菌の
分子育種に有益な手段を提供すると考えられる。しか
し、未だアクレモニウム・クリソゲナムからこれらの遺
伝子は単離同定されていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、アクレモニ
ウム・クリソゲナム由来であり、逆硫黄転移経路に関与
する酵素の１種であるシスタチオニンγ-リアーゼの遺
伝子を単離し、アクレモニウム・クリソゲナムの改良
に、これを利用することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アクレモ
ニウム・クリソゲナムの遺伝子ライブラリーよりシスタ
チオニンγ-リアーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を単
離し、その塩基配列を一部（コード領域全体と非コード
領域の一部）決定した。さらに、該ＤＮＡ断片の一部を
ベクターに組み込んだ組換え体ＤＮＡを導入したアクレ
モニウム・クリソゲナムのシスタチオニンγ-リアーゼ
活性が親株（非導入株）に比べ、上昇していることを見
いだした。本発明者らは、これらの知見に基づき本発明
を完成するに至った。すなわち、本発明は、 (1)アクレモニウム・クリソゲナム由来のシスタチオニ
ンγ-リアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片。 (2)配列表（配列番号１）に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質をコードする遺伝子を含む請求項１記載のＤ
ＮＡ断片。 (3)図１に示す制限酵素地図により規定される請求項１
または２記載のＤＮＡ断片。 (4)図１におけるＫｐｎＩーＢａｌＩ間の塩基配列
が配列表（配列番号２）で示される請求項１、２または
３記載のＤＮＡ断片。 (5)請求項１、２、３または４記載のＤＮＡ断片全体も
しくはその一部をベクターに組み込んだ組換え体ＤＮ
Ａ。 (6)請求項５記載の組換え体ＤＮＡで形質転換されたア
クレモニウム・クリソゲナム。 に関する。

【０００８】また、本研究の過程で、本発明ＤＮＡ断片
の一部をプローブとして使用することにより、配列表
（配列番号１）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
をコードする cDNA が得られた。その内の１つの塩基配
列を配列表（配列番号１）に示した。これらcDNA化合物
もアクレモニウム・クリソゲナム内で機能するプロモー
ター断片（例えば、特開平４ー５８８９１）と連結させ
ることにより、本発明ＤＮＡ断片と同様、アクレモニウ
ム・クリソゲナムの改良に利用できると考えられる。し
たがって、本発明ＤＮＡ断片から転写されるＲＮＡに由
来する cDNA 化合物群も本発明に包含される。

【０００９】本発明に係るＤＮＡ断片は、大略下記の工
程によって造成することができる。 (1)アクレモニウム・クリソゲナムから染色体ＤＮＡを
抽出し、適当な制限酵素（例えば,MboI等）で部分分解
する。 (2)(1)で得られたＤＮＡ断片を適当なベクターに組み込
み、アクレモニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮＡライ
ブラリーを構築する。 (3)すでに単離され、構造が明らかとなっている他種生
物由来のシスタチオニンγ-リアーゼ遺伝子コード領域
の少なくとも一部を含有するＤＮＡ断片を取得する。 (4)(3)で得たＤＮＡをラベルし、(2)で得られたライブ
ラリーとハイブリダイゼーションを行なわせ、該プロー
ブと相同性を示すクローンを選択分離する。(5)(4)で選
択したクローンよりＤＮＡを抽出し、同上のプローブを
用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、適当なサ
イズの制限酵素断片上に目的の遺伝子を位置づけ、それ
をプラスミドベクターにサブクローンする。 (6)かくして得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、
他種生物由来の相応する遺伝子構造、およびそれより翻
訳されるアミノ酸配列との比較等により、シスタチオニ
ンγ-リアーゼ遺伝子の存在を確認し、そのコード領域
の位置づけを行う。 (7)シスタチオニンγ-リアーゼの全コード領域を含むＤ
ＮＡ断片（該遺伝子のプロモーター、ターミネーター等
の領域も含むことが推定される断片）をアクレモニウム
・クリソゲナム形質転換用ベクターに組み込んで、組換
え体ＤＮＡを作製する。 (8)上記組換え体ＤＮＡを用いて、アクレモニウム・ク
リソゲナムを形質転換する。 (9)(8)により得られた形質転換体のシスタチオニンγ-
リアーゼ活性を測定し、本発明ＤＮＡ断片の導入効果を
確認する。

【００１０】上記の工程中でＤＮＡ，組換え体宿主とし
ての大腸菌等の取扱いに必要な一般的な操作は、当業者
間で通常行われているものであり、例えば、 Maniatis
らの実験操作書 ( T.Maniatis et al., Molecular Clon
ing A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora
tory 1982, 1989 ) に従えば容易に実施できる。使用す
る酵素、試薬類もすべて市販の製品を用いることがで
き、特に断わらない限り、製品で指定されている使用条
件に従えば、完全にそれらの目的を達成することができ
る。

【００１１】上記(1)において、ＤＮＡ抽出源として
は、アクレモニウム・クリソゲナム ATCC11550、アク
レモニウム・クリソゲナムIS-5等の菌株が使用できる。
なお、アクレモニウム・クリソゲナムIS-5株は、平成２
年２月５日付けで通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第11232号の寄託番号で寄託されて
いる。また、該菌からの全ＤＮＡ抽出は、例えば、John
stoneら［Johnstone et al., EMBO Journal(1985)4 130
7-1311］の方法、もしくは、Minuth ら［Minuth etal.,
Current Genetics(1982)5: 227-231 ］の方法に準じて
行うことができる。

【００１２】上記(2)におけるベクターとしては、例え
ば、EMBL3,EMBL4（STRATAGENE社）等のラムダファージ
ベクターもしくは、pHC79（Bethesda Research Laborat
ories＜BRL＞社）等のコスミドベクターを使用すること
ができる。上記(3)における他種生物由来のシスタチオ
ニンγ-リアーゼ遺伝子としては、例えば、パン酵母
（S.cerevisiae）由来のCYS3遺伝子［Ono et al.,Journ
al of Bacteriology,174(1992)3339-3347］が挙げられ
る。該遺伝子は上記文献に記載された方法、もしくは既
に明かとなっている塩基配列に相当するＤＮＡオリゴマ
ーを合成し、該オリゴマーをプローブとして酵母のＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングすることによって容易
に取得することができる。また、遺伝子の両端に相当す
る２種のプライマーを利用したＰＣＲにより、酵母の染
色体ＤＮＡから直接クローン化することも可能である。

【００１３】(6)における既知のシスタチオニンγ-リア
ーゼアミノ酸配列としては上記酵母由来のもの、あるい
はラット由来の配列［Erickson et al.,Biochem.J.(199
0)269,335-340］等が利用できる。また、シスタチオニ
ンγ-リアーゼ遺伝子の存在を確認する他の方法として
は、当該遺伝子欠損酵母を用いた相補性テスト等が挙げ
られる。

【００１４】上記(7)におけるアクレモニウム・クリソ
ゲナム形質転換用ベクターとしては、例えば、ｐＰＧＫ
Ｍ５、ｐＡＣＴＨＹ８３（特開平４ー５８８９１）等を
使用することができる。また、(8)におけるアクレモニ
ウム・クリソゲナムの形質転換は、例えば、Queenerら
の方法［Queener et al.,Microbiology 1985. American
Societyfor Microbiology(1985) 468-472］に準じて実
施することができる。

【００１５】上記(9)におけるシスタチオニンγ-リアー
ゼ活性の測定は、例えば、Treichlerらの方法［Antibio
tics and other secondary metabolites.5th FEMS Symp
osium,Basal,Swizerland,1977.Academic Press,Inc.,Lo
ndon(1978)177-199］に準じて行うことができる。

【００１６】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳述するが、本
発明は、該実施例によって限定されるものではない。な
お、実施例、参考例に記載の略称ないし略号は、以下の
とおりのものである。

【００１７】マニアテイスの実験書：(T.Maniatis et a
l.,Molecular Cloning A LaboratoryManual, Cold Spri
ng Harbor Laboratory 1982 )Ｎ−３シード培地：コー
ンスティープリカー４０ｇ／ビート２０ｇ／酢酸アンモ
ニウム２ｇ／スイトース４０ｇを水１リットルに溶解し
たもの。メイン培地：ビート３０ｇ／脱脂大豆４０ｇ／
コーンスティープリカー１０ｇ／酢酸アンモニウム５ｇ
／硫酸アンモニウム７ｇ／硫酸カルシウム８ｇ／炭酸カ
ルシウム１５ｇ／スイトース６０ｇ／メチルオレイト４
１．５を水１リットルに含むもの。ＣＭ培地：ショ糖２
０ｇ／リン酸二水素カリウム０．５ｇ／リン酸水素二カ
リウム０．５ｇ／塩化カリウム０．５ｇ／硫酸マグネシ
ウム（７水塩）０．５ｇ／硫酸鉄（ＩＩ）（７水塩）
０．０１ｇ／硝酸ナトリウム３ｇ／イーストエキストラ
クト４ｇ／ペプトン１０ｇを水１リットルに溶解したも
の。ＣＭ固形培地：１．５％の寒天を含有するＣＭ培
地。ＧＡＧ培地：グリセロール４０ｇ／アスパラギン４
ｇ／塩化カルシウム０．１ｇ／塩化ナトリウム０．１ｇ
／微量金属溶液[硫酸マグネシウム（７水塩）４ｇ／硫
酸鉄（ＩＩ）（７水塩）０．４ｇ／硫酸マンガン（４水
塩）０．１６ｇ／硫酸亜鉛（７水塩）０．４ｇ／無水硫
酸銅０．０４ｇを水１リットルに溶解したもの]２５ミ
リリットル／０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）
３０ミリリットルを水１リットルに含有する培地。Ｐ−
バッファー：０．６Ｍ塩化カリウム／０．０１Ｍ塩化マ
グネシウム／０．０２５Ｍ塩化カルシウムＰＥＧ溶液：
２５％ポリエチレングリコール（〜４０００）／０．０
１Ｍトリス（ｐＨ８．０）／０．０５Ｍ塩化カルシウム
／０．６Ｍ塩化カリウム。６×ＳＳＣ：０．９Ｍ塩化ナ
トリウム／９０ｍＭクエン酸ナトリウム。２０×ＳＥ
Ｔ：３Ｍ塩化ナトリウム／０．４Ｍトリス（ｐＨ７．
８）／２０ｍＭＥＤＴＡ。２０×ＳＳＰＥ：塩化ナトリ
ウム２１０ｇ／リン酸二水素ナトリウム（２水塩）３
１．２ｇ／０．５Ｍ ＥＤＴＡ ４０ミリリットルを水
１リットルに溶解したもの。５０×デンハルツ：フィコ
ール５ｇ／ポリビニルピロリドン５ｇ／牛血清アルブミ
ン５ｇを水０．５リットルに溶解したもの。ＧＬＹバッ
ファー：１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）／１０
０μＭピリドキサールリン酸／１ｍＭジチオスレイトー
ル。

【００１８】（実施例１） シスタチオニンγーリアーゼ遺伝子の単離 ａ．アクレモニウム・クリソゲナムの遺伝子ライブラリ
ー作製 アクレモニウム・クリソゲナムＩＳ−５株（微工研菌寄
第１１２３２号）の全ＤＮＡを、ジョンストン（I.L.Jo
hnstone）らがアスペルギルス・ニデュランスについて
用いた方法［文献：EMBO J.(1985)4,1307-1311］に準じ
て抽出した。そして、この全ＤＮＡ６０μｇをＭｂｏＩ
で部分消化し、次いで、アルカリホスファターゼで処理
した。一方、ラムダベクターＥＭＢＬ３（プロメガバイ
オテック社）１０μｇをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで完全
に消化し、イソプロパノ−ル沈澱により、短いＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩリンカー部分を除去した。次いで、上記
部分消化ＤＮＡ断片１μｇとＢａｍＨＩ末端を有するベ
クター２μｇとをＴ４・リガーゼを用いて連結せしめ、
ラムダファージ粒子内へ封入した。こうして得た組換え
ファージ懸濁液を適当に希釈し、エシェリシア・コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＭ５３９（プロメガバイオテック
社）に感染させ、出現するプラーク数を計測した。その
結果、この懸濁液は、３×１０⁵個の組換えファージを
含有することが判明した。

【００１９】このファ−ジ液をアクレモニウム・クリソ
ゲナムの遺伝子ライブラリーとし、４℃に保存した。な
お、上述の供与体ＤＮＡおよびベクターの調製、そし
て、両者の結合等に関する詳細な方法、条件は、フリッ
シャオフ（Frischauf）らが記載したものを採用した
［文献：ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオロジー
(J.Mol.Biol)（１９８３）１７０、８２７−８４２］。
また、ＤＮＡのラムダ粒子内への封入は、プロメガバイ
オテック社のパッケイジングエクストラクトを用い、そ
れに添付されたプロトコールに従って行なった。 ｂ．プローブの調製 プラスミド６９−２−１［サッカロミセス.セレビシエ
由来のシスタチオニンγーリアーゼ遺伝子全体を含む
４．０Ｋｂの断片を含むプラスミド:オノら、Journal o
f Bacteriology 174(1992)3339-3347；岡山大学、小野
助教授より入手］１０μｇをＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで消
化後、１％アガロースゲル電気泳動を行なった。そし
て、シスタチオニンγーリアーゼ遺伝子のコード領域を
含む１．０ＫｂのＤＮＡ断片をジーンクリーン（ＧＥＮ
Ｅ．ＣＬＥＡＮ^TM、フナコシ社販）を用いて、その添付
プロトコールに従ってアガロースゲルから回収、精製し
た。次いで、該断片５０ｎｇをマルチプライムＤＮＡラ
ベリングシステム（Multiprime DNAlabelling system:A
mersham）を用い、それに付属するプロトコールに従っ
て、（α−³²Ｐ）デオキシシチジン酸３リン酸５０μＣ
ｉで標識した。次いで、反応液を７０℃で１０分間加温
した後、ファルマシア製ニックカラム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社、Ｎｉｃｋ−ｃｏｌｕｍｎ^TU）を用いて精製し、
約１０⁷ｃｐｍの放射能を持つプローブを得た。以後、
このプローブをＳＧＬＹ−プローブと称する。 ｃ．ハイブリダイゼーションによるスクリーニング ａ．で得られたファージ液（ＤＮＡライブラリー）の一
部をＮＭ５３９に感染させ、４枚のプレート上に計８×
１０³個のプラークを形成させた。これらプラークをベ
ントン（Benton W.D.）らの方法［文献：Science(1977)
196,180-182］に従って、ニトロセルロースフィルター
に転写し、アルカリ変性、中和処理を行い、ＤＮＡを固
定した後、上記ｂ．で得たＳＧＬＹ−プローブとハイブ
リダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは、
３０％ホルムアミド、５×デンハルツ、５×ＳＳＰＥ，
０．１％ＳＤＳ，および終濃度４×１０⁵ｃｐｍ／ｍｌ
でＳＧＬＹ−プローブを含有する溶液を用いて、３７℃
で１５時間行った。次いで、フィルターを０．１％のＳ
ＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液中、室温で１０分間ずつ２回
洗浄し、さらに、０．１％のＳＤＳを含む０．２×ＳＳ
Ｃ溶液中４２℃で３０分間洗浄した。次いで、インテン
シファイヤー・スクリーンを用いて、−８０℃で１８時
間オ−トラジオグラフィ−を行った。

【００２０】その結果、６個の陽性スポットが見い出さ
れた。このうち、５個の陽性スポットに相応する寒天領
域よりファージを抽出し、再度上記の工程に従ってプラ
ークハイブリダイゼーションを行い、５個の純化ポジテ
ィブファ−ジクロ−ンを得た。これらのクロ−ンをそれ
ぞれλ−ＧＬＹ１，２，３，４，５と命名した。 ｄ．シスタチオニンγーリアーゼ遺伝子のサブクローニ
ングおよびその位置の限定 ｃ．で得たファージクローン５種より、グロスバーガー
（Grossberger）記載の方法［文献：Nucleic Acids. Re
search (1987)15,6737］に従ってＤＮＡを抽出した。次
いで、このラムダＤＮＡをＳａｌＩで消化して、アガロ
ースゲル電気泳動を行った後、ＳＧＬＹ−プローブを用
いてサザンハイブリダイゼーション［方法については文
献：サザン(Southern),(J.Mol.Biol.)(1975)98,503-51
7］を行った。なお、ハイブリダイゼーションおよびフ
ィルター洗浄等は、ｃ．に記載したものと同様に行っ
た。その結果、すべてのクローンに存在する、約０．８
ＫｂのＳａｌＩ断片が該プローブとハイブリダイズする
ことが判明した。そこで、この断片をｂ．と同様の方法
で、アガロースゲルから回収、精製した。

【００２１】一方、ベクターとして用いるｐＵＣ１１８
（宝酒造販）は、ＳａｌＩで切断した後、アルカリホス
ファターゼ処理を行った。次いで、両者をＴ４−リガー
ゼにより連結し、マニアティスの実験書に記載の方法に
準じて、E.coli JM105 に導入した。アンピシリン（１
００μｇ／ｍｌ），５−ブロム−４−クロル−３−イン
ドリル−Ｂ−ガラクトシド（０．００４％）を含有する
Ｌ−ブロス寒天培地上に生育して来た白色コロニーを６
個選び、簡便法（マニアティスの実験書）でプラスミド
ＤＮＡを抽出し、ＳａｌＩ消化による解析を行ったとこ
ろ、すべてのクローン中のプラスミドに、目的の断片が
挿入されていることが判明した。さらに、上記と同様
に、サザンハイブリダイゼーションによる解析を行い、
このインサートが目的の断片であることを確認した。

【００２２】かくして得られたプラスミドの１つをｐＧ
ＬＹＳ１と命名した。次いで、上記５種のラムダＤＮＡ
をＢａｍＨＩで消化し上記と同様のサザンハイブリダイ
ゼーションを行った結果、３種のクローンが約７．５Ｋ
ｂのＢａｍＨＩ断片とハイブリダイズすることが判明し
た。そこで、この断片をｐＵＣ１１８にサブクローニン
グすることによりｐＧＬＹ１を得た。

【００２３】次に、ｐＧＬＹ１を種々の制限酵素で切断
し、アガロースゲル電気泳動により解析した結果、図１
で示される７．５Ｋｂインサートの制限酵素地図が得ら
れた。次いで、この断片中に存在するシスタチオニンγ
ーリアーゼ遺伝子コード領域を限定するために、種々の
制限酵素によるｐＧＬＹ１の消化断片とＳＧＬＹ−プロ
ーブ間で、再度サザンハイブリダイゼーション実験を行
った。その結果、ＢａｍＨＩ７．５Ｋｂ断片のほぼ中央
にシスタチオニンγーリアーゼ遺伝子が位置しているこ
とが明らかとなった。なお、図１において、重複する制
限酵素認識部位に関しては、便宜上図中左から右に通し
番号を付した。また、矢印の下の実線で示す範囲は、塩
基配列を決定した領域を示し、矢印はシスタチオニンγ
−リアーゼ遺伝子の方向を示している。ＫｐｎＩから
ＫｐｎＩまでの間に存在するＫｐｎＩ部位に関して
は、その位置を決定していないので記載していない。 ｅ．シスタチオニンγーリアーゼ遺伝子の塩基配列 まず、シスタチオニンγーリアーゼ遺伝子のコード領域
の一部を含むと推定された０．８ＫｂのＳａｌＩ断片の
全塩基配列を、サンガーらの方法［Pro.Natl.Acad.Sci.
USA,74(1977)5463］に基づき決定した。そして、既知の
シスタチオニンγーリアーゼ遺伝子と比較することによ
り、遺伝子の方向、およびこの領域がシスタチオニンγ
ーリアーゼタンパクのどの部分をコードしているかを推
定した。該領域から上流および下流に向って配列決定を
行い、最終適に図１にアンダーラインで示した全領域を
カバーする２４１４ｂｐの塩基配列を決定した。塩基配
列決定の具体的実験手技は、タカラ（宝酒造社）のシー
クエンシングキットを用いて、その添付プロトコールに
従って行った。なお、決定した全塩基配列及び予想され
る翻訳産物を配列表（配列番号２）に示した。

【００２４】（実施例２） シスタチオニンγーリアーゼｃＤＮＡの単離 ａ．アクレモニウム・クリソゲナムのポリＡ⁺ＲＮＡ抽
出 ＣＭ固形培地上３０℃、３日間生育させたアクレモニウ
ム・クリソゲナムIS-5の菌糸体をＮ３シード培地５０ミ
リリットルに接種し、２５℃で３日間培養した。得られ
た培養液１ミリリットルをメイン培地３０ミリリットル
を含む５００ミリリットルのフラスコに移植し、２５℃
で３日間培養した。該菌液１０ミリリットルから吸引濾
過により集めた菌糸体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢と
乳棒を用いてすりつぶした。かくして得られた菌破砕粉
末から TOTAL RNA ISOLATION KIT（インビトロジェン
社）を用いて、その添付プロトコールに従って全ＲＮＡ
８００μｇを抽出した。次いで、この全ＲＮＡからマニ
アティスの実験書に従って、オリゴ（ｄＴ）セルロース
クロマトグラフィー操作を行うことにより、ポリＡ⁺Ｒ
ＮＡ ２７μｇを得た。 ｂ．ｃＤＮＡライブラリーの作製 ｃＤＮＡ合成システム（アマシャム社）を用い、そのプ
ロトコールに従って、上記ａ．で得たポリＡ⁺ＲＮＡか
ら１本鎖ＤＮＡ、次いで、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。
次いで、ｃＤＮＡクローニングシステム−λｇｔ１０ア
ダプター法（アマシャム社）を用い、そのプロトコール
に従って、２×１０⁵個のアクレモニウム・クリソゲナ
ムのｃＤＮＡライブラリーを作製した。 ｃ．プローブの作製 実施例１ｄ．で作製したｐＧＬＹＳ１のＳａｌＩ０．８
Ｋｂ断片を、実施例１ｂ．と同様の方法で（α−³²Ｐ）
デオキシシチジン酸３リン酸で標識し、以下に述べるハ
イブリダイゼーション実験に使用した。以後、このプロ
ーブをＡＧＬＹ−プローブと称する ｄ．ハイブリダイゼーションによるスクリーニング ｂ．で得られたファージ液の一部をＮＭ５３９に感染さ
せ、８枚のプレート上に計３×１０⁴個のプラークを形
成させた。これらプラークを実施例１ｃ．と同様の方法
でニトロセルロースフィルターに転写し、ＤＮＡを固定
した後、上記ｃ．で得たＡＧＬＹ−プローブとハイブリ
ダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは、５
０％ホルムアミド、５×デンハルツ，５×ＳＳＰＥ，
０．１％ＳＤＳ、および終濃度４×１０⁵ｃｐｍ／ミリ
リットルでＡＧＬＹ−プローブを含有する溶液を用い
て、４２℃で１５時間行った。次いで、フィルターを
０．１％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液中、室温で１０
分間ずつ２回洗浄し、さらに、０．１％のＳＤＳを含む
０．２×ＳＳＣ溶液中５５℃で３０分間洗浄した。次い
で、インテンシファイヤー・スクリーンを用いて、−８
０℃で１５時間オートラジオグラフィーを行った。その
結果、５個の陽性スポットが見い出された。そのスポッ
トに相応する寒天領域よりファージを抽出し、再度上記
の工程に従ってプラークハイブリダイゼーションを行
い、５個の純化ポジティブファージクローンを得た。こ
れらのクローンをそれぞれλ−ＣＧＬＹ１，２，３，
４，５と命名した。 ｅ．シスタチオニンγーリアーゼｃＤＮＡの構造解析 上記ｄ．で得た５種のファージクローンより、実施例１
ｄ．と同様の方法でλＤＮＡを調製し解析した結果、λ
−ＣＧＬＹ３が約１．７ＫｂのｃＤＮＡインサートを含
有していることが明らかとなった。そこで、このｃＤＮ
Ａインサートの全塩基配列を実施例１ｅ．と同様の実験
手法を用いて決定した。かくして得られた１６２８ｂｐ
の塩基配列を配列表（配列番号１）に示す。本ＤＮＡ配
列には１５１番目に始まるＡＴＧから１４０４番で終わ
るＴＡＡまで、４１７個のアミノ酸をコードしうるＯＲ
Ｆが存在していた。該ＯＲＦより翻訳したアミノ酸配列
を配列表（配列番号１）の塩基配列の下段に示した。ま
た、実施例１ｅ．で決定したシスタチオニンγーリアー
ゼ遺伝子の塩基配列と比較することにより、該遺伝子に
はイントロンは存在しないことが明らかとなった。

【００２５】（実施例３） ｐＴＧＬＹ１の構築 図２に示す工程に従って、シスタチオニンγーリアーゼ
遺伝子の付加コピ−をアクレモニウム・クリソゲナムに
導入するためのプラスミドｐＴＧＬＹ１を構築した。以
下に該工程を説明する。

【００２６】まず、実施例１ｄ．で得たプラスミドｐＧ
ＬＹ１をＸｂａＩで消化した後、アガロースゲル電気泳
動に供し、シスタチオニンγーリアーゼ遺伝子の全コー
ド領域を含む約９Ｋｂの断片をゲルから回収、精製し
た。一方、ｐＡＣＴＨＹ８３をＳｐｅＩとＸｂａＩで二
重切断し、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子発現単位を含有する約３．１Ｋｂ断片を分離精
製した。次いで、この両者をＴ４−リガーゼで連結する
ことによりｐＴＧＬＹ１を得た。

【００２７】なお、上記工程において、制限酵素消化に
より生ずるＤＮＡ断片の分離精製、ＤＮＡ断片間の結合
反応、該反応により生ずるプラスミドによる大腸菌の形
質転換、得られた形質転換体からのプラスミドの調製お
よびその解析等の基本操作は、実施例１ならびにマニア
ティスの実験書に記載された方法に準じて行った。ま
た、本実施例において使用したプラスミドｐＡＣＴＨＹ
８３は、アクレモニウム・クリソゲナム内で機能しうる
ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ発現単位
（アクレモニウム・クリソゲナム由来アクチン遺伝子の
プロモーターおよびターミネーター、細菌由来のハイグ
ロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子が発現に
好適な配置で結合した発現単位）を有するアクレモニウ
ム・クリソゲナム形質転換用ベクターであり、その造成
法は、特開平４−５８８９１号に記載されている。

【００２８】（実施例４） ｐＴＧＬＹ１によるアクレモニウム・クリソゲナムの形
質転換 ｐＴＧＬＹ１をアクレモニウム・クリソゲナムＩＳ−５
株に導入することにより、シスタチオニンγーリアーゼ
合成能が強化された形質転換体を取得した。以下にその
詳細を説明する。 ａ．プロトプラストの調製 ＣＭ固形培地上で３０℃、５日間生育させたアクレモニ
ウム・クリソゲナムＩＳ−５の菌糸体をＣＭ培地５０ミ
リリットルに接種し、回転式振とう機（２５０ｒ.ｐ.
ｍ）上、３０℃で３日間培養した。さらに該菌液１ミリ
リットルを５０ミリリットルのＧＡＧ培地に接種して、
３０℃で２０時間培養した。得られた培養液５０ミリリ
ットルを３５００ｒ.ｐ.ｍで１０分間遠心し、菌糸体を
沈澱させた後、０．９％のＮａＣｌ溶液で洗浄し、０．
０１Ｍジチオスレイトールを含んだマクイルベイン緩衝
液（０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．３）２０ミリリットルに懸濁し、３０℃で１時間
おだやかに振とうした。

【００２９】次いで、菌糸体を３２００ｒ.ｐ.ｍ、１０
分間の遠心で沈澱させ、Ｐ−バッファーで洗浄した後、
ノボザイム（Ｎｏｖｏ社）を１０ｍｇ／ミリリットルの
濃度で含有するＰ−バッファー１０ミリリットルに懸濁
し、３０℃で１時間おだやかに振とうした。該反応液を
８００ｒ.ｐ.ｍで３０秒間遠心して得た上清を、濾紙
（ＴＯＹＯ ＦＩＬＴＥＲ ＰＡＰＥＲ ５Ａ）を用い
て濾過することにより、菌糸体とプロトプラストを分離
した。次いで、該濾液を３０００ｒ.ｐ.ｍで５分間遠心
し、プロトプラストを沈澱させた後、Ｐ−バッファーで
１回洗浄し、プロトプラストが３×１０⁸個／ミリリッ
トルの濃度となるようにＰ−バッファーに懸濁した。 ｂ．ｐＴＧＬＹによるプロトプラスト形質転換 上記ａ．で得られたプロトプラスト懸濁液０．１ミリリ
ットルに、ｐＴＧＬＹ１を５μｇ（１０マイクロリット
ル）加えた後、０．０５ミリリットルのＰＥＧ溶液を加
え、かるく混合した。該混合液を氷上に２５分間静置し
た後、同上のＰＥＧ溶液を１ミリリットル加えて、室温
でさらに３０分間静置した。かくして得られた形質転換
プロトプラスト懸濁液を０．２ミリリットルずつ、プロ
トプラスト再生培地[ 文献（イソガイら: Agric.Biol.C
hem.51(1987)2321-2329）に記載されているＢＲＭ培地]
を２５ミリリットル含有するプレート上に広げ、１５
℃で２０時間培養した。次いで、該プレートに４．５ｍ
ｇのハイグロマイシンＢを含み、５０℃に保温した同上
のＢＲＭ培地５ミリリットルを重層した後、２８℃で１
４日間培養した。その結果、ハイグロマイシンＢに耐性
となった形質転換体（以下、ＨＹＢ形質転換体と略す）
が数十株出現した。また、対照プラスミドとしてｐＡＣ
ＴＨＹ８３を用いて同上のプロトプラスト形質転換操作
を行い、数十株のＨＹＢ形質転換体を得た。 ｃ．シスタチオニンγーリアーゼ活性の測定 上記ｂ．で得たｐＴＧＬＹ１によるＨＹＢ形質転換体よ
り６株（各々ＴＧＬＹ１，２，３，４，５，６と命
名）、ｐＡＣＴＨＹ８３によるＨＹＢ形質転換体より２
株（Ｃ１，Ｃ２と命名）をランダムに選択し、その各々
をＮ３−シード培地５０ミリリットルに接種し、２５℃
で３日間振とう培養した（２２０ｒ.ｐ.ｍ）。該培養液
１ミリリットルを、メイン培地３０ミリリットルを含む
５００ミリリットルのフラスコに移し、２５℃でさらに
３日間振とう培養した（２２０ｒ.ｐ.ｍ）。

【００３０】かくして得られた各々の培養液１ミリリッ
トルを遠心分離により集菌し、１ミリリットルのＧＬＹ
バッファ−に懸濁した後、超音波破砕機により細胞を破
砕した。該破砕液を遠心分離して得られる上清を細胞粗
抽出液とした。該抽出液０．３ミリリットルと、０．０
７５ｍＭピリドキサールリン酸，２ｍＭのＬ−シスタチ
オニンを含む０．１モルリン酸カリウム（ｐＨ８．０）
溶液０．７ミリリットルを混合し、３０℃で１０分間反
応させた後、０．２ミリリットルの３０％トリクロロ酢
酸を加えて反応を停止させた。該液を遠心分離して得ら
れる上清をニンヒドリン反応に供し、反応生成物である
システインを定量することによりシスタチオニンγーリ
アーゼ活性を求めた。ニンヒドリン反応によるシステイ
ンの定量はガイトーンの方法（M.Gaitonde,Biochem.J.
104(1967)626）に従った。すなわち、反応液上清０．５
ミリリットルとニンヒドリン液０．５ミリリットルを混
和し、１００℃で５分間反応させた後、エタノールを１
ミリリットル加え、５６０ｎｍの吸光度を測定した。

【００３１】その結果、表１に示すとおり、ｐＴＧＬＹ
１によるＨＹＢ形質転換体は、対照プラスミドであるｐ
ＡＣＴＨＹ８３によるＨＹＢ形質転換体より、２〜１０
倍高いシスタチオニンγーリアーゼ活性を示した。すな
わち、この結果は、本発明のＤＮＡ断片を使用すること
により、アクレモニウム・クリソゲナム内のシスタチオ
ニンγーリアーゼ活性を上昇させることが可能となるこ
とを示している。また、該結果は、上記５．９ＫｂのＸ
ｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片上にシスタチオニンγーリアー
ゼ遺伝子のプロモーターならびにターミネーターが含ま
れている事を示唆している。なお、反応１分間に１ナノ
モルのシステインを生成する酵素量を１単位と定め、粗
抽出液中のタンパク１ｍｇ当りの単位数をシスタチオニ
ンγーリアーゼ活性として表１に表示した。

【００３２】

【表１】 ──────────────────────────────── 菌株 プラスミド シスタチオニンγーリアーゼ活性 ──────────────────────────────── Ｃ１ ｐＡＣＴＨＹ８３ ０．６２ Ｃ２ ｐＡＣＴＨＹ８３ ０．５３ ＴＧＬＹ１ ｐＴＧＬＹ１ ６．４４ ＴＧＬＹ２ ｐＴＧＬＹ１ ３．６８ ＴＧＬＹ３ ｐＴＧＬＹ１ ０．７６ ＴＧＬＹ４ ｐＴＧＬＹ１ ３．４６ ＴＧＬＹ５ ｐＴＧＬＹ１ １．３２ ＴＧＬＹ６ ｐＴＧＬＹ１ ４．３０ ────────────────────────────────

【００３３】

【発明の効果】実施例に開示したとおり、本発明のＤＮ
Ａ断片を利用することにより、シスタチオニンγーリア
ーゼ活性が高まった新規アクレモニウム・クリソゲナム
を創製することが可能になった。したがって、該遺伝子
断片または該遺伝子に対応するｃＤＮＡ化合物を単独
で、あるいはセファロスポリンＣ生合成遺伝子と組み合
わせて増強することにより、セファロスポリンＣ発酵能
が向上したアクレモニウム・クリソゲナム株の創製が期
待できる。また、本発明のプロモーターならびにターミ
ネーター部分は、アクレモニウム・クリソゲナム用発現
ベクターの構成要素として利用することができる。

【００３４】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：1628 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：アクレモニウム クリソケ゛ ナム(Acremonium chrysogenum) 株名：IS5 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置：151..1404 特徴を決定した方法：P 配列 CCTCTCAAGA GTGCGCCTGT TCTTGCTTCG ACCGGTTCCT GCGAGGGGCA CGAAAAAAAA 60 AACAAGAGGA GGGGCAAGAG AAGCGCGGGT CACATTCCAT CGAACGAACC CGTCAACACA 120 AACCAAAGAA CAAATACCTT CACACAGACC ATG TCT CCT ACA GCG GCA CCC GCC 174 Met Ser Pro Thr Ala Ala Pro Ala 1 5 ATT GAC GGC GCC GTC GTC GAG ACG CCT CCG CGC CCT CCT ACT CCT GTC 222 Ile Asp Gly Ala Val Val Glu Thr Pro Pro Arg Pro Pro Thr Pro Val 10 15 20 CAC AAC TTC GGC ACC CTC GCC GTC CAC GCG GGC TCG CCG CAC GAT GCC 270 His Asn Phe Gly Thr Leu Ala Val His Ala Gly Ser Pro His Asp Ala 25 30 35 40 GCC ACC GGT GCC GTT ATC GAG TCC ATC TCG CTG TCT ACC ACC TTT GCC 318 Ala Thr Gly Ala Val Ile Glu Ser Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Ala 45 50 55 CAG ACC GCC GTC GGC AAA CCC GTA GGT GAC TAC GAG TAC TCG CGC TCC 366 Gln Thr Ala Val Gly Lys Pro Val Gly Asp Tyr Glu Tyr Ser Arg Ser 60 65 70 GCC AAC CCC AAC CGC ACC AAC TTC GAG ACG GCC GTC GCG GCC CTC GAA 414 Ala Asn Pro Asn Arg Thr Asn Phe Glu Thr Ala Val Ala Ala Leu Glu 75 80 85 CAC GCC CGC TAC GCC CTC GCC TTC TCC AGT GGT AGC GCC ACC ACC GCC 462 His Ala Arg Tyr Ala Leu Ala Phe Ser Ser Gly Ser Ala Thr Thr Ala 90 95 100 ACC ATC CTC CAG AGC CTT GCC GCC GGC TCC CAC GTT ATC TCA GTC TCC 510 Thr Ile Leu Gln Ser Leu Ala Ala Gly Ser His Val Ile Ser Val Ser 105 110 115 120 GAC GTT TAC GGC GGC ACC CAC CGC TAC TTC ACC CAG GTT GCC AAG GCC 558 Asp Val Tyr Gly Gly Thr His Arg Tyr Phe Thr Gln Val Ala Lys Ala 125 130 135 CAC GGT GTC AAG GTC ACA TTC ACT CCG GAA ATT GAA GTC GAC GTC AGT 606 His Gly Val Lys Val Thr Phe Thr Pro Glu Ile Glu Val Asp Val Ser 140 145 150 GAG CAC ATC ACC GAC CAA ACC CGC CTC ATC TGG ATC GAG ACC CCT AGC 654 Glu His Ile Thr Asp Gln Thr Arg Leu Ile Trp Ile Glu Thr Pro Ser 155 160 165 AAC CCC ACC CTG CGT CTT GTC GAC ATC CGC GCC GTT GTC TCC GTC GCC 702 Asn Pro Thr Leu Arg Leu Val Asp Ile Arg Ala Val Val Ser Val Ala 170 175 180 CAC AAG CAT GGT GTC CTC GTT GTC GTC GAC AAT ACC TTC CTC TCA CCT 750 His Lys His Gly Val Leu Val Val Val Asp Asn Thr Phe Leu Ser Pro 185 190 195 200 TAT GTG CAG AAC CCG CTC GAC CTC GGC GCC GAC ATT GTC GTC CAC AGC 798 Tyr Val Gln Asn Pro Leu Asp Leu Gly Ala Asp Ile Val Val His Ser 205 210 215 GTC ACC AAG TAC ATT AAC GGC CAC AGC GAC GTC GTC ATG GGC GTT GCC 846 Val Thr Lys Tyr Ile Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Val Ala 220 225 230 GCT TTC AAC TCC CCG GAA TTG AAG GAC CGC CTC GGC TTC CTC CAG AAC 894 Ala Phe Asn Ser Pro Glu Leu Lys Asp Arg Leu Gly Phe Leu Gln Asn 235 240 245 GCC ATT GGC GCC GTC CCC TCC GCC TTC GAC AGC TGG CTC GCC CAC CGC 942 Ala Ile Gly Ala Val Pro Ser Ala Phe Asp Ser Trp Leu Ala His Arg 250 255 260 GGC CTC AAG ACC CTC CAC CTC CGC GCC CGC GAG GCG TCG CGC AAC GCC 990 Gly Leu Lys Thr Leu His Leu Arg Ala Arg Glu Ala Ser Arg Asn Ala 265 270 275 280 GCC GCT GTC GCC GCT GCC CTC GAG GCC TCC CCT AAT GTC ATC TCC GTC 1038 Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Glu Ala Ser Pro Asn Val Ile Ser Val 285 290 295 AAC TAC CCT GGC CTT GAC TCG CAC CCT CAT CGC CAC ATC GCC CTC AAG 1086 Asn Tyr Pro Gly Leu Asp Ser His Pro His Arg His Ile Ala Leu Lys 300 305 310 CAG CAC CGC GAC GGC ATG GGC GGC GGC ATG CTC TCC TTC CGC ATT CGC 1134 Gln His Arg Asp Gly Met Gly Gly Gly Met Leu Ser Phe Arg Ile Arg 315 320 325 GGT GGC CAC GAC GCC GCC GAG CGC TTC TGC CAG CAG ACC CGA ATC TTC 1182 Gly Gly His Asp Ala Ala Glu Arg Phe Cys Gln Gln Thr Arg Ile Phe 330 335 340 ACC CTA GCC GAG TCC CTT GGC GGC GTT GAG TCG CTC GTC GAG TTG CCC 1230 Thr Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro 345 350 355 360 AGC AGC ATG ACC CAT GCC GGT ATC CCC CGC GAC CAG CGC GAG GCC GTC 1278 Ser Ser Met Thr His Ala Gly Ile Pro Arg Asp Gln Arg Glu Ala Val 365 370 375 GGC GTC TTT GAC GAC CTG GTC CGC GTG AGC TGC GGT GTT GAG GAT GCC 1326 Gly Val Phe Asp Asp Leu Val Arg Val Ser Cys Gly Val Glu Asp Ala 380 385 390 GAG GAC CTG AAG AAT GAC GTG CTC CGC GCC GTG GAG AAG GCC GTG GAG 1374 Glu Asp Leu Lys Asn Asp Val Leu Arg Ala Val Glu Lys Ala Val Glu 395 400 405 TTG TCA AAG AAT GGT GTC AAG GGC CAA TAACGCCGAC CTACCTCCCC 1421 Leu Ser Lys Asn Gly Val Lys Gly Gln 410 415 TGACCCCGAT TTATATACAC ACATAAGGAG TTCCTAGACG CACGAGGTAA TATCACTGCC 1481 TCCTGACGAA ACACAAAAAG TTAGTAGAAG ATGAAAGCAA GACAGAAAAA AAAAGGCATA 1541 GCATTCAAAA CGAGTACGTA GAAAGAGGAT TCAGAGTCAT GAGAAATGAT ATTTCATTCC 1601 TGTAATGGGA ATTAGAGGTT TCACGCA 1628

【００３５】配列番号：2 配列の長さ：2414 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アクレモニウム クリソケ゛ ナム(Acremonium chrysogenum) 株名：IS5 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：647..1900 特徴を決定した方法：P 配列 GGTACCTTGG CTCTTTCCTA TACCTGTAGG TACTACCTAC TTAGTACTCA ACGTGATCAC 60 CATCAGGTCA CTCACCCCTT CCCTGTTTGA TCTTTCCCTT GGCCTTTTTA CCTCCTGACC 120 TCTCCTCTTC CTCCTCCTCC TTCCCTCCTC GCCCTTGCAT CCCGACCACC ACCATCTTGG 180 AAGGTCCAAA CGCAGACGAG CCAAACCCCA GTGTCCACCA CTCGCTAGTC TCCACAGCAC 240 CCACCGCCTC AACAGTCGAC CCTTGGATCT TCAGCCGGGG CTGGCCGGTC CATTACTTTA 300 AAAGATCCCT CCTCGCAATC ACAACTTCAA TCCCGAAAGC CGCGAACGGG TCTCGATAGG 360 ATTTCCCGGC CCTACCTTAA TTAGACCACC TCCTCTCCAA TTCGAGCCAC CGCATCCACC 420 GAGACACCAA CAACAGGTCG GCACTGAATC CTCGTGCACC CTCCTACCAT CCATCGCACG 480 CAAATCCCAA GCGCATCCTC TCAAGAGTGC GCCTGTTCTT GCTTCGACCG GTTCCTGCGA 540 GGGGCACGAA AAAAAAAACA AGAGGAGGGG CAAGAGAAGC GCGGGTCACA TTCCATCGAA 600 CGAACCCGTC AACACAAACC AAAGAACAAA TACCTTCACA CAGACC ATG TCT CCT 655 Met Ser Pro 1 ACA GCG GCA CCC GCC ATT GAC GGC GCC GTC GTC GAG ACG CCT CCG CGC 703 Thr Ala Ala Pro Ala Ile Asp Gly Ala Val Val Glu Thr Pro Pro Arg 5 10 15 CCT CCT ACT CCT GTC CAC AAC TTC GGC ACC CTC GCC GTC CAC GCG GGC 751 Pro Pro Thr Pro Val His Asn Phe Gly Thr Leu Ala Val His Ala Gly 20 25 30 35 TCG CCG CAC GAT GCC GCC ACC GGT GCC GTT ATC GAG TCC ATC TCG CTG 799 Ser Pro His Asp Ala Ala Thr Gly Ala Val Ile Glu Ser Ile Ser Leu 40 45 50 TCT ACC ACC TTT GCC CAG ACC GCC GTC GGC AAA CCC GTA GGT GAC TAC 847 Ser Thr Thr Phe Ala Gln Thr Ala Val Gly Lys Pro Val Gly Asp Tyr 55 60 65 GAG TAC TCG CGC TCC GCC AAC CCC AAC CGC ACC AAC TTC GAG ACG GCC 895 Glu Tyr Ser Arg Ser Ala Asn Pro Asn Arg Thr Asn Phe Glu Thr Ala 70 75 80 GTC GCG GCC CTC GAA CAC GCC CGC TAC GCC CTC GCC TTC TCC AGT GGT 943 Val Ala Ala Leu Glu His Ala Arg Tyr Ala Leu Ala Phe Ser Ser Gly 85 90 95 AGC GCC ACC ACC GCC ACC ATC CTC CAG AGC CTT GCC GCC GGC TCC CAC 991 Ser Ala Thr Thr Ala Thr Ile Leu Gln Ser Leu Ala Ala Gly Ser His 100 105 110 115 GTT ATC TCA GTC TCC GAC GTT TAC GGC GGC ACC CAC CGC TAC TTC ACC 1039 Val Ile Ser Val Ser Asp Val Tyr Gly Gly Thr His Arg Tyr Phe Thr 120 125 130 CAG GTT GCC AAG GCC CAC GGT GTC AAG GTC ACA TTC ACT CCG GAA ATT 1087 Gln Val Ala Lys Ala His Gly Val Lys Val Thr Phe Thr Pro Glu Ile 135 140 145 GAA GTC GAC GTC AGT GAG CAC ATC ACC GAC CAA ACC CGC CTC ATC TGG 1135 Glu Val Asp Val Ser Glu His Ile Thr Asp Gln Thr Arg Leu Ile Trp 150 155 160 ATC GAG ACC CCT AGC AAC CCC ACC CTG CGT CTT GTC GAC ATC CGC GCC 1183 Ile Glu Thr Pro Ser Asn Pro Thr Leu Arg Leu Val Asp Ile Arg Ala 165 170 175 GTT GTC TCC GTC GCC CAC AAG CAT GGT GTC CTC GTT GTC GTC GAC AAT 1231 Val Val Ser Val Ala His Lys His Gly Val Leu Val Val Val Asp Asn 180 185 190 195 ACC TTC CTC TCA CCT TAT GTG CAG AAC CCG CTC GAC CTC GGC GCC GAC 1279 Thr Phe Leu Ser Pro Tyr Val Gln Asn Pro Leu Asp Leu Gly Ala Asp 200 205 210 ATT GTC GTC CAC AGC GTC ACC AAG TAC ATT AAC GGC CAC AGC GAC GTC 1327 Ile Val Val His Ser Val Thr Lys Tyr Ile Asn Gly His Ser Asp Val 215 220 225 GTC ATG GGC GTT GCC GCT TTC AAC TCC CCG GAA TTG AAG GAC CGC CTC 1375 Val Met Gly Val Ala Ala Phe Asn Ser Pro Glu Leu Lys Asp Arg Leu 230 235 240 GGC TTC CTC CAG AAC GCC ATT GGC GCC GTC CCC TCC GCC TTC GAC AGC 1423 Gly Phe Leu Gln Asn Ala Ile Gly Ala Val Pro Ser Ala Phe Asp Ser 245 250 255 TGG CTC GCC CAC CGC GGC CTC AAG ACC CTC CAC CTC CGC GCC CGC GAG 1471 Trp Leu Ala His Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Leu Arg Ala Arg Glu 260 265 270 275 GCG TCG CGC AAC GCC GCC GCT GTC GCC GCT GCC CTC GAG GCC TCC CCT 1519 Ala Ser Arg Asn Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Glu Ala Ser Pro 280 285 290 AAT GTC ATC TCC GTC AAC TAC CCT GGC CTT GAC TCG CAC CCT CAT CGC 1567 Asn Val Ile Ser Val Asn Tyr Pro Gly Leu Asp Ser His Pro His Arg 295 300 305 CAC ATC GCC CTC AAG CAG CAC CGC GAC GGC ATG GGC GGC GGC ATG CTC 1615 His Ile Ala Leu Lys Gln His Arg Asp Gly Met Gly Gly Gly Met Leu 310 315 320 TCC TTC CGC ATT CGC GGT GGC CAC GAC GCC GCC GAG CGC TTC TGC CAG 1663 Ser Phe Arg Ile Arg Gly Gly His Asp Ala Ala Glu Arg Phe Cys Gln 325 330 335 CAG ACC CGA ATC TTC ACC CTA GCC GAG TCC CTT GGC GGC GTT GAG TCG 1711 Gln Thr Arg Ile Phe Thr Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser 340 345 350 355 CTC GTC GAG TTG CCC AGC AGC ATG ACC CAT GCC GGT ATC CCC CGC GAC 1759 Leu Val Glu Leu Pro Ser Ser Met Thr His Ala Gly Ile Pro Arg Asp 360 365 370 CAG CGC GAG GCC GTC GGC GTC TTT GAC GAC CTG GTC CGC GTG AGC TGC 1807 Gln Arg Glu Ala Val Gly Val Phe Asp Asp Leu Val Arg Val Ser Cys 375 380 385 GGT GTT GAG GAT GCC GAG GAC CTG AAG AAT GAC GTG CTC CGC GCC GTG 1855 Gly Val Glu Asp Ala Glu Asp Leu Lys Asn Asp Val Leu Arg Ala Val 390 395 400 GAG AAG GCC GTG GAG TTG TCA AAG AAT GGT GTC AAG GGC CAA 1897 Glu Lys Ala Val Glu Leu Ser Lys Asn Gly Val Lys Gly Gln 405 410 415 TAACGCCGAC CTACCTCCCC TGACCCCGAT TTATATACAC ACATAAGGAG TTCCTAGACG 1957 CACGAGGTAA TATCACTGCC TCCTGACGAA ACACAAAAAG TTAGTAGAAG ATGAAAGCAA 2017 GACAGAAAAA AAAAGGCATA GCATTCAAAA CGAGTACGTA GAAAGAGGAT TCAGAGTCAT 2077 GAGAAATGAT ATTTCATTCC TGTAATGGGA ATTAGAGGTT TCACGCATGC TATTGAGTGC 2137 CGATCATCTA TGGCAGCCTT CCCAGAATCA GAGTGCAGGC TATATTAAAG AAAAGGAATA 2197 TCATATCCCT TCAGAGCCCC AAGGTTGCCG CTCCCTTCAG CGTCCGTTAG AAATGAAGGC 2257 GCATGCTTCC ACCAACCGTC ACACGTTGGA AATGAACGGG ACGAAGGTGT CCATTAGCGG 2317 CCCATAATCC CATACTACTA CTAGTCCGCA TCATCTAGCG GCTCCGCCTC GTCCAGTCCA 2377 GGTATATTGA ACAGGTTGTC CGTGTACTCA TTGGCCA 2414

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明ＤＮＡ断片の部分制限酵素地図を示す。

【図２】プラスミドｐＴＧＬＹ１の作製過程を示す。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アクレモニウム・クリソゲナム由来のシ
   スタチオニンγ- リアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 配列表（配列番号１）に示すアミノ酸配
   列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む請求項
   １記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 図１に示す制限酵素地図により規定され
   る請求項１または２記載のＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 図１におけるＫｐｎＩーＢａｌＩ間
   の塩基配列が配列表（配列番号２）で示される請求項
   １、２または３記載のＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】 請求項１、２、３または４記載のＤＮＡ
   断片全体もしくはその一部をベクターに組み込んだ組換
   え体ＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項５記載の組換え体ＤＮＡで形質転
   換されたアクレモニウム・クリソゲナム。